DE69520284T3

DE69520284T3 - Mikropartikel-trennvorrichtung mit einem magnetischen stab

Info

Publication number: DE69520284T3
Application number: DE69520284T
Authority: DE
Inventors: Jukka Tuunanen
Original assignee: THERMA ELECTRON Oy
Current assignee: THERMA ELECTRON Oy
Priority date: 1994-10-20
Filing date: 1995-10-20
Publication date: 2008-01-24
Also published as: US6448092B1; EP0787296A1; DE69520284D1; FI944937A0; NO317400B1; JP4250168B2; NO971804D0; DE69520284T8; JPH10508098A; US6207463B1; WO1996012958A1; EP0787296B1; DE69520284T2; JP2006153887A; EP0787296B2; JP2007033457A; JP3781775B2; RU2138801C1; NO971804L

Description

Technischer Bereich
Die Erfindung bezieht sich auf das Trennen magnetischer Partikel von einer Stoffzusammensetzung. Die Erfindung kann auf unterschiedliche Weise angewendet werden, insbesondere im Bereich der Biotechnik, der Biochemie und der Biomedizin.
Technischer Hintergrund
Magnetische Mikropartikel werden als feste Phase vielfach angewendet, um Biomaterial zu binden. Ein Vorteil der Mikropartikel ist der große Bereich der Festphase und die kurze Diffusionszeit. Die Größe der Mikropartikel liegt im allgemeinen im Bereich von 0,05 bis 10 μm, sie sind aus unterschiedlichen Materialien bestehend verfügbar und sie sind bereits für viele Anwendungsfälle aktiviert worden. Die Bewegung magnetischer Partikel ist mit einem Magneten möglich.
Die gegenwärtig verwendeten Verfahren zum Trennen magnetischer Partikel schließen den Einsatz eines Reaktionsbehälters in einem Magnetfeld derart ein, dass die Partikel zu sogenannten Tabletten geformt auf dem Behälterboden niedergeschlagen werden. Danach wird die keine Partikel mehr enthaltende Flüssigkeit dekantiert oder abgesaugt. Die Flüssigkeit muß jedoch sehr achtsam aus dem Behälter entfernt werden, um nicht mit ihr auch Partikel aus dem Behälter zu entfernen.
Die Patentpublikation WO-86/06493 schlägt ein beim Immunisieren einzusetzendes Verfahren vor, bei dem magnetische Partikel und ihnen angelagerte markierte Komplexe von einer Flüssigkeit dadurch abgetrennt werden, dass ein Stangenmagnet zum Einsatz kommt und sie anschließend einer Messung unterzogen werden. Der Spitze der Stange ist ein Magnet fest zugeordnet und es ist ihr eine entfernbare Schutzschicht zugeordnet, auf deren Oberfläche die Partikel haften. Vorzugseweise wird der Schutzschicht nach dem Niederschlag der Partikel und vor dem Meßvorgang eine weitere Abdeckung zugeordnet. Nach dem Meßvorgang werden Schutzschicht und Abdeckung zusammen mit den Partikeln abgenommen und entfernt und für einen folgenden Abtrennvorgang kommen neue Abdeckschichten zur Anwendung. Gemäß der Patentpublikation kann der Magnet auch ein Elektromagnet sein, wobei das magnetische Feld gegebenenfalls eliminiert werden kann.
Die Patentpublikation WO-87/05536 schlägt eine Vorrichtung zum Separieren von Magnetpartikeln vor, in der eine Stange in einer senkrechten Bohrung verstellbar ist, deren unterem Ende ein Magnet zugeordnet ist. Befindet sich der Magnet in seiner unteren Endstellung, so wird die Vorrichtung in eine Partikel enthaltende Flüssigkeit eingeführt, wobei die Partikel am unteren Stangenende gesammelt werden. Ist der Magnet in seine obere Endstellung gelangt, so können die Partikel von der Stange entfernt werden. Auf diese Weise können Partikel gesammelt und aus einer Flüssigkeit entfernt und in eine andere übertragen werden.
Es ist nicht möglich, die erläuterten Vorrichtungen und Verfahren dann im Fall magnetischer Partikel sonderlich erfolgreich einzusetzen, wenn Partikel gesammelt werden sollen, um aus einer ziemlich großvolumigen Umgebung in eine wesentlich kleinervolumige Umgebung übertragen zu werden.
Beschreibung der Erfindung
Grundsätzliche Beschreibung
Es wurde nun ein Trennverfahren gemäß Anspruch 1 erfunden. Die anderen Ansprüche geben einige bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung wider.
Die Vorrichtung gemäß der Erfindung schließt eine langgestreckte Schutzhülle ein, die einen verstellbaren Stab umschließt, der einen in der Längsrichtung der Schutzhülle sich erstreckenden Magnetstab aufweist. Das Verhältnis von Länge des Magnetstabes zu seiner Dicke beträgt zumindest 2:1 und ist zumindest etwa 3:1 und nochmals bevorzugter Weise zumindest etwa 12:1. Sowohl die Intensität als auch der Gradient des so sich ausbildenden Magnetfeldes sind am Ende der Stange am stärksten, wenn sich der Magnet in seiner unteren Endstellung befindet. Die aus der Stoffzusammensetzung abzusondernden Partikel werden unmittelbar an der Spitze der Schutzhülle niedergeschlagen. Die Partikel können von der Spitze der Schutzhülle in ein Volumen freigegeben werden, das um ein Vielfaches kleiner ist als das Volumen der Ausgangsflüssigkeit.
Der Magnetstab ist vorzugsweise ein Permanentmagnet, der sich in einem ferromagnetischen Arm fortzsetzt.
Der Magnetstab ist ausreichend lang, so dass das obere Ende seines Dipols sich stets oberhalb der Oberfläche der Stoffzusammensetzung befindet. Falls Partikel aus einer säulenförmigen Stoffzusammensetzung herausgesammelt werden sollen, die höher als der Dipol ist, muß darauf geachtet werden, dass die Partikel im oberen Säulenbereich zuerst an der Spitze niedergeschlagen werden, sodass das obere Ende des Dipols sich stets oberhalb des Partikelbereichs befindet.
Weil das obere Ende des Magneten sich oberhalb der Stoffzusammensetzung befinden kann, kann ein bezüglich des Volumens der Stoffzusammensetzung wirksamerer Magnet verwendet werden, um das Sammeln der Partikel zu beschleunigen und zu erleichtern.
Die Vorrichtung gemäß der Erfindung bildet, im Bereich der Spitze der Schutzhülle, ein intensives Magnetfeld in der Richtung der Schutzhülle aus. Dies ist insbesondere dann vorteilhaft, wenn Partikel aus einer Partikelanhäufung einzusammeln sind, die zunächst auf andere Weise erzeugt worden ist. Ein zusätzlicher Vorteil besteht darin, dass im unmittelbaren Bereich der Spitze eine besonders hohe Rückhaltekraft ausgebildet werden kann, wo beim Herausbringen der Schutzhülle aus der Flüssigkeit in besonderem Maße eine Rückhaltekraft die Partikel in der Flüssigkeit zurückzuhalten sucht.
Die Spitze der Schutzhülle ist vorzugsweise mit einem scharfen, nach unten gerichteten Vorsprung versehen. Diese minimiert das Zurückbleiben von Fluid im Spitzenbereich. Soll die Partikelübertragung in einen sehr kleinen Behälter erfolgen, so ist die Spitze vorzugsweise als Kegel mit konkaver Oberfläche ausgebildet.
Wird der ferromagnetische Arm im Magneten verwendet, so wirken der Magnet und der magnetisierte Arm zusammen als ein langer Magnetstab. Der Arm löst den Gradienten des oberen Poles des Feldes auf, wobei der obere Pol nicht das Ansammeln von Partikeln ausführt. Auf diese Weise kann der lange Magnetstab mit geringen Kosten ausgeführt werden. Trotz der Verwendung eines ferromagnetischen Armes ist es vorteilhaft, als Magneten selbst einen relativ langen Magneten zu verwenden (in einer Länge von etwa dem 1,5 bis 10 fachen der Dicke). Die Länge des Magneten selbst ist vorzugsweise so gewählt, dass für den in Frage stehenden Magneten eine maximale interne Permanentfeldintensität geliefert wird.
Die Verbindung zwischen dem Magneten und seinem Arm wird vorzugsweise so bewirkt, dass Magnet und Arm auf einer geringen Länge ineinanderstecken. Dadurch wird die Ausbildung starker Gradienten im Bereich der Verbindung vermieden, wodurch möglicherweise die Anlagerung von Partikeln bewirkt werden könnte.
Der Querschnitt des Magnetstabes kann beispielsweise kreisförmig oder rechteckig sein. Im Hinblick sowohl auf seine Fertigung als auch auf seinen Gebrauch ist ein Magnetstab mit kreisförmigem Querschnitt am vorteilhaftesten. Tatsächlich hat beispielsweise eine Drehung des Magneten um seine Längsachse bei diesem Querschnitt keinen Einfluß auf die Wirksamkeit. Grundsätzlich kann der Stab gebogen sein, um den Verstellmechanismus einfacher zu machen.
Die Form der Schutzhülle auf dem Stab kann entsprechend der Verwendung unterschiedlich sein. Auch hier ist üblicherweise sowohl im Hinblick auf die Herstellung als auch im Hinblick auf die Verwendung die Kreisform am vorteilhaftesten. Um eine möglichst hohe Festigkeit zu haben, kann die Schutzhülle kegelförmig ausgebildet sein, was auch die Herstellung der Schutzhülle im Spritzgußverfahren vereinfacht. Vorzugsweise besteht die Schutzhülle aus Polypropylen.
Die Erfindung ist am besten für Partikel um etwa 1 bis 10 μm zu verwenden.
Zeichnungen
Einige vorzugsweise Anwendungen der Erfindung werden nachfolgend als Beispiele beschrieben. In den Zeichnungen gemäß der Beschreibung sind
1 eine Trennvorrichtung gemäß der Erfindung,
2 ein Anwendungsfall der Vorrichtung gemäß 1 zum Einsammeln von in einer Suspension befindlichen Partikeln,
3 ein Anwendungsfall der Vorrichtung gemäß 1, um eingesammelte Partikel in sehr kleine Behälter hineinzugeben,
4 die Anwendung einer anderen Vorrichtung gemäß der Erfindung zum Einsammeln von Partikeln, die sich auf der Innenwand eines Prüfrohres niedergeschlagen haben,
5 die Anwendung einer dritten Vorrichtung gemäß der Erfindung zum Einsammeln von Partikeln aus einer kleinen Flüssigkeitsmenge und
6 die Verwendung der Vorrichtung gemäß 5 zur Freigabe der eingesammelten Partikel in eine kleine andere Flüssigkeitsmenge.
Beispiele
Der Trennstab gemäß 1 schließt eine langgestreckte Schutzhülle 1 ein, die eine innere Längsbohrung 2 umschließt. Die unteren Enden von Schutzhülle und Bohrung sind schwach konisch. Am oberen Ende ist das Gehäuse mit einem Flansch 3 versehen, um die Handhabung zu erleichtern.
In die Bohrung 2 ragt frei ein magnetischer Stab 4 hinein. Dieser besteht aus dem stabförmigen Magneten 5 selbst und einem verlängernden Arm 6 aus ferromagnetischem Material, dessen unterem Ende der Magnet 5 zugeordnet ist. Dem oberen Ende des Armes ist ein knopfförmiger Griff 7 zugeordnet.
Das untere Ende der Schutzhülle läuft kegelförmig, konkav in einer scharfen Spitze 8 aus. Die Länge des Spitzenabschnitts entspricht etwa der Dicke der Schutzhülle an deren unterem Ende vor Beginn des Spitzenabschnitts.
2 zeigt das Einsammeln von Partikeln aus einem Prüfrohr, in dem sie Teile einer Suspension 9 sind. Der Trennstab wird in das Prüfrohr eingeführt und in diesem nach oben und unten bewegt. Auf diesem Wege schlagen sich Partikel auf der Spitze nieder und bilden eine diese ringförmig umgebende Masse 10. Befindet sich der Magnet 5 im Bereich des unteren Endes der Bohrung, so bleiben die Partikel der Spitze zugeordnet. Sollen die Partikel freigegeben werden, so wird der Magnet nach oben verstellt.
Die Spitze 8 ist insbesondere gut dazu geeignet, Partikel in sehr kleine Behälter einzubringen, wie sie die einzelnen Näpfe einer in 3 dargestellten und im Englischen HLA-Platte 11 genannten Platte ("Tüpfelplatte") bilden (3). Die Spitze ist etwas länger als die Plattennäpfe tief sind. Wird die Spitze in einen der Näpfe eingeführt, so steigt die darin befindliche Flüssigkeit infolge der Oberflächenspannung entlang der Oberfläche des Spitzenbereichs nach oben. Hierdurch werden die im Spitzenbereich auf diesem niedergeschlagenen Partikel abgespült und in die Flüssigkeit integriert. Der Übergang der Partikel von der Spitze in die Flüssigkeit des jeweiligen Napfes kann durch leichtes Rühren mit dem Stab begünstigt werden. Entsprechend wird sich beim Herausnehmen der Spitze aus dem Napf die Flüssigkeit mit den Partikeln zum spitzen Ende des Spitzenabschnittes hin bewegen, als geschlossener Film vom Spitzenabschnitt und der eigentlicher Spitze vollständig freikommen und Flüssigkeit und Partikel gelangen zur Gänze in das von dem jeweiligen Napf gebildete kleinvolumige Gefäß und bleiben dort.
Die Partikel werden vorzugsweise einer Flüssigkeit derart entnommen, dass sie zunächst in einem kleinen Bereich des Gefäßes unter Nutzung der Schwerkraft konzentriert werden, von wo sie dann unter Verwendung des Stabes eingesammelt werden. Die Konzentration der Partikel in einem kleinen, so nahe wie möglich der Punktausdehnung angenäherten Bereich des Behälters, kann durch Absetzen unter Ausnutzung der Schwerkraft, durch Zentrifugieren oder dadurch bewirkt werden, dass auf der Behälterwand ein elektrisches Feld ausgebildet wird, durch das die Partikel auf die Behälterwand angezogen werden.
4 zeigt das Sammeln von Partikeln durch Entfernen von der Wand eines Testrohres, auf der sie zunächst unter Nutzung von Magnetkraft in der Form eines vertikalen Streifens 9 niedergeschlagen worden waren. Durch das Bewegen des Stabes mit seiner Spitze entlang dem streifenförmigen Niederschlag, werden die Partikel veranlaßt, sich von der Rohrwand zu lösen und sich im Spitzenbereich der Schutzhülle 1 des Stabes niederzuschlagen und dort die Anhäufung 10 zu bilden. In diesem Bereich ist die Spitze der Schutzhülle 1 etwa als Kegelstumpf ausgebildet. Dies macht die Vorrichtung gut dazu geeignet, Partikel in einen Behälter zu überführen, in dessen Inhaltsflüssigkeit die Spitze gut eindringen kann.
Das Verhältnis der Länge des Magneten 5 zu seinem Durchmesser beträgt etwa 5:1. Der Arm ist geringfügig dicker als der Magnet, und das obere Ende des Magneten ist im unteren Ende des Armes auf einer Länge eingebettet, die etwa dem doppelten Durchmesser entspricht.
5 und 6 zeigen eine Trennvorrichtung, die einen Magnetstab 4' einschließt, der nur einen Permanentmagneten 5' aufweist, der mit einer geeigneten Schutzuschicht beschichtet ist, ohne dass jedoch auch ein ferromagnetischer Arm vorgesehen ist, Das obere Ende der Schutzhülle 1' ist mit einem Griffteil 3' mit zwei Flanschen versehen, das eine einfache Überwachung der Vorrichtung möglich macht, wenn diese beispielsweise in automatischen Trenn- oder Analyseeinrichtungen verwendet wird. Das Verhältnis zwischen der Länge des Magneten zu seinem Durchmesser liegt bei etwa 7:1. Die Spitze der Schutzhülle ist wiederum etwa als Kegelstumpf geformt (die Höhe des Kegels beträgt etwa 1/3 seiner Dicke).
5 zeigt das Trennen von Partikeln aus einem im Vergleich zum Trennstab relativ engen Behälter (der Innendurchmesser des Behälters beträgt etwa 70% des Stabdurchmessers) und aus einer relativ geringen Flüssigkeitsmenge. Die untere Linie 11 steht für die freie Oberfläche der Flüssigkeit und die obere Linie 12 für die Oberfläche der Flüssigkeit, nachdem die Trennvorrichtung in die Flüssigkeit eingeführt worden ist. Magnetpartikel werden auf der Spitze der Schutzhülle versammelt, um die Anhäufung 10 zu bilden, die in eine relativ kleine Flüssigkeitsmenge überführt werden soll (6).
Die Vorrichtung gemäß 5 und 6 ist gut geeignet, um bei Microtitrationsplatten mit Durchmessern von etwa 7 mm verwendet zu werden.

Claims

Verwendung einer Einrichtung zum Trennen magnetischer Mikropartikel von einer Zusammensetzung, wobei die Größe der Partikel 0,05–10 μm ist und welche Partikel verwendet werden, um Biomaterial zu binden, dadurch gekennzeichnet, dass die Vorrichtung enthält: – eine längliche Schutzhülle (1; 1') mit einem oberen Ende und einem unteren Ende mit einer Spitze, – wobei die Schutzhülle eine Ausnehmung (2) enthält, die vom oberen Ende zum unteren Ende davon verläuft, – wobei die Ausnehmung zum Sammeln der Partikel an der Spitze der Hülle einen verstellbaren Stabmagneten (4; 4') enthält, der in der Längsrichtung der Ausnehmung verläuft, wobei das Verhältnis der Länge des Stabmagneten zu seiner Dicke wenigstens ungefähr 2:1, vorzugsweise wenigstens ungefähr 3:1, ist.
Verwendung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Stabmagnet (4) einen Magneten (5) am unteren Ende davon und einen ferromagnetischen Arm (6) enthält, der am oberen Ende des Magneten angebracht ist.
Verwendung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Verhältnis der Länge des Stabmagneten (4) zu seiner Dicke wenigstens ungefähr 12:1 ist.
Verwendung nach Anspruch 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, dass das obere Ende des Magneten (5) und das untere Ende des Armes (6) ineinander sind.
Verfahren zum Trennen magnetischer Mikropartikel von einer sie enthaltenden Zusammensetzung, wobei die Größe der Partikel 0,05–10 μm ist und welche Partikel verwendet werden, um Biomaterial zu binden, dadurch gekennzeichnet, dass Trenneinrichtungen in die Zusammensetzung geschoben werden, welche Trenneinrichtungen eine längliche Schutzhülle (1; 1') mit einem oberen Ende und einem unteren Ende mit einer Spitze enthalten, wobei die Schutzhülle eine Ausnehmung (2) enthält, die vom oberen Ende zum unteren Ende verläuft, wobei die Ausnehmung zum Sammeln der Partikel an der Spitze der Hülle einen verstellbaren Stabmagneten (4; 4') enthält, der in der Längsrichtung der Ausnehmung verläuft, wobei das Verhältnis der Länge des Stabmagneten zu seiner Dicke wenigstens ungefähr 2:1, vorzugsweise wenigstens ungefähr 3:1, ist.
Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Trenneinrichtungen so in die Zusammensetzung geschoben werden, dass das obere Ende des Stabmagneten über der Oberfläche der Zusammensetzung bleibt.