Hintergrund der Erfindung
1. Gebiet der Erfindung
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Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren und Vorrichtungen zum Mischen und
Handhaben kleiner Flüssigkeitsvolumina. Wie hierin und in der gesamten Beschreibung
sowie den Ansprüchen der Erfindung verwendet, umfasst der Begriff "Flüssigkeiten"
sowohl Flüssigkeiten allein als auch Flüssigkeiten, die Teilchenmaterial beliebiger Art
enthalten.
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Die Vorrichtungen und Verfahren gemäß vorliegender Erfindung sind insbesondere in
Situationen einsetzbar, wo kleine Flüssigkeitsvolumina eingesetzt und verarbeitet
werden. Ein Beispiel dafür ist das klinische Labor, in dem chemische Analyzer für
Flüssigkeitsproben verwendet werden, die Reagenzien zugegeben und in eigenen
Reaktionsschalen gemischt werden. Diese Reaktionsschalen sind typischerweise geformte
Kunststoffe, die in etwa die Größe und Form eines Fingerhutes haben. Manchmal haben sie
eine spezielle Form, so dass sie mehrere Abteile oder Sichtfenster für optische Geräte
umfassen oder eine zum Zentrifugieren geeignete Form aufweisen. Sie werden
üblicherweise händisch in irgendeine Art von automatisiertem Mechanismus geladen, es sind
jedoch auch automatische Ladeeinrichtungen konstruiert worden. Es wurden
komplizierte Mechanismen gebaut, um die Schalen zwischen verschiedenen Positionen zu
bewegen, so dass verschiedene Arbeiten durchgeführt werden können, wie sie das
Analyseverfahren verlangt. Am Ende der Analyse müssen sie vorsichtig herausgenommen
werden, um ein Verschütten von Materialien zu verhindern, die eine biologische Gefahr
darstellen könnten. Die Volumina der Schalen sind üblicherweise ziemlich groß und
liegen im Bereich hunderter Mikroliter. Das Mischen von Proben und Reagenzien kann
auf mehrere Arten erfolgen: durch den Einsatz von Zentrifugalkräften, Wirbel aufgrund
hydraulischer Entspannung, magnetische Rührstäbchen oder Mischerschaufeln oder -
blätter, wobei Reinigung zwischen aufeinanderfolgenden Proben erforderlich ist.
Einzelne Kunststoffschalen weisen mäßig dicke Wände auf und haben geringe
Wärmeleitfähigkeit, wodurch rascher Temperaturausgleich auch im Wasserbad schwierig ist.
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Außerdem können diskrete Schalen mit einem Preis von einem bis mehreren Cents pro
Stück relativ teuer sein.
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Wie nachstehend detaillierter beschrieben sind verschiedene Ansätze entwickelt
worden, um die Verwendung der oben beschriebenen Behälter zu vermeiden. Eines der
schwierigeren Probleme, die bei Vermeidung solcher Behälter auftreten, besteht darin,
für gründliche Vermischung Sorge zu tragen, wenn Flüssigkeiten kombiniert werden.
Bei einem Ansatz werden kleine Flüssigkeitsvolumina auf einem verformbaren Träger
angeordnet, der zu einem Hohlraum verformt werden kann, wodurch das Mischen der
Flüssigkeiten erreicht wird, die im kleinen Volumen enthalten sind. Gemäß einem
weiteren Ansatz werden Flüssigkeiten in kleinen Pools auf einen Träger aufgebracht, um ein
Gemisch zu bilden, das durchmischt wird, indem ein Gas auf die Flüssigkeit gerichtet
wird.
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Wie aus der nachstehenden Beschreibung der Erfindung deutlicher hervorgehen wird,
stellt die vorliegende Erfindung ein System zur Handhabung von Flüssigkeiten bereit,
das Probleme, die Vorrichtungen nach dem Stand der Technik aufweisen, minimiert,
umgeht oder vollständig überwindet.
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Beispielsweise ist es möglich, sehr kleine Flüssigkeitsvolumina zu bearbeiten, sogar
Probenvolumina unter 50 ul. Die Vorrichtung fördert das Mischen der Flüssigkeitsprobe in
sich selbst oder, wenn sie mit einem oder mehreren Reagenzien gemischt wird, ohne
Verwendung eines von außen mit dem Reaktionsgemisch in Kontakt befindlichen
Mischers. Außerdem ergibt das System eine Vorrichtung, die gute Wärmeleitfähigkeit
fördert, so dass Temperaturgradienten durch das gemischte System minimiert werden. Das
System ermöglicht weiters die einfache und sichere Entsorgung verwendeter Materialien
und ermöglicht geringere Kosten durch die Verwendung von Einwegartikeln und
verringerte Kosten für Arbeitskraft und Maschinen, da keine einzelnen Reaktionsschalen
vorhanden sind.
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Die heutigen Anlagen für klinische Tests erfordern zahlreiche Einwegkomponenten,
relativ große Mengen an Reagenzien, mehrere Schritte, um zu gewährleisten, dass alle
wiederverwendeten Komponenten gewaschen werden, und relative große
Probenmengen. Der Zweck der vorliegenden Erfindung besteht darin, den Einsatz von Reagenzien
und Probe zu minimieren, Puffer, Waschlösungen und die meisten Einwegartikel
überflüssig zu machen, die Größe, Komplexität und Kosten der Instrumente zu verringern
und das Abfallvolumen zu verkleinern, ohne die Testleistung zu beeinträchtigen. All das
wird ohne Verdampfen der Flüssigkeiten oder Verwendung eines verformbaren Trägers
erreicht.
2. Beschreibung des Standes der Technik
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US-Patent Nr. 3.854.703 (Gibbs et al.) offenbart ein Verfahren und eine Vorrichtung
zum Fördern einer Reaktion zwischen einer flüssigen Probe und einem flüssigen
Reagens. Eine solche Reaktion wird gefördert, indem die Flüssigkeiten auf eine flüssigkeits-
undurchlässige Trägerfläche aufgetragen wird, um ein Gemisch darauf zu bilden. Das
Flüssigkeitsgemisch wird gerührt, indem ein gasförmiger Fluidstrahl von einem
Zufuhrleitungsauslass darauf gerichtet wird, um darauf aufzutreffen, wodurch eine
Relativbewegung zwischen dem Auslass und der Trägeroberfläche hervorgerufen wird.
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Ein Flüssigkeitshandhabungssystem wird im US-Patent Nr. 4.676.656 (Cook et al.)
beschrieben. Ein kleines Flüssigkeitsvolumen wird auf einen reversibel verformbaren
Träger aufgebracht, der verformt wird, um einen Hohlraum zu bilden. Da die Flüssigkeit an
der Oberfläche des Trägers haftet, wird sie auf physikalischem Weg gerührt und
durchmischt, wenn der Träger verformt wird. Der verformbare Träger kann eingesetzt werden,
um Flüssigkeitsbehälter unterschiedlicher Größen bereitzustellen, um unterschiedliche
Flüssigkeitsvolumina aufzunehmen, und als Transportmechanismus, um Flüssigkeit von
einer Position zu einer anderen zu bewegen.
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US-Patent Nr. 3.479.141 (Smythe et al.) offenbart ein Transportsystem für eine
automatische Analysenvorrichtung für eine Reihe wässriger Flüssigkeitsproben, die ohne oder
mit minimaler Verunreinigung zwischen den Proben als fließender Strom verarbeitet
werden. Es werden eine Leitung aus Fluorkohlenwasserstoff und Segmente aus Silikon
zwischen den Proben eingesetzt. Das Silikon wird benetzt und haftet an der Leitung aus
Fluorkohlenwasserstoff, während das bei den wässrigen Flüssigkeitsproben nicht der Fall
ist. Wenn Benetzung und In-Kontakt-Bringen der Leitung mit den Proben erforderlich
ist, sowie bei der Dialyse, werden Glas und/oder Cellophan verwendet, die - anders als
das Silikon - von den wässrigen Flüssigkeitsproben benetzt werden.
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Eine Dosiervorrichtung wird in US-Patent Nr. 4.121.466 (Reichler et al.) geoffenbart.
Die Vorrichtung ist entweder als Spender oder Probenehmer einsetzbar, wobei die
Oberfläche der Ansaugsonde mit einem dünnen Flüssigkeitsfilm beschichtet ist, der mit
den anzusaugenden Flüssigkeiten nicht mischbar ist. Der dünne nicht-mischbare Film
verhindert Verunreinigungen zwischen den Segmenten nacheinander angesaugter
Flüssigkeiten und auch ihrer jeweiligen Quellen. Weiters können Segmente der
nichtmischbaren Flüssigkeit so zwischen aufeinanderfolgenden Flüssigkeitssegmenten angesaugt
werden, dass solche Flüssigkeitssegmente diskret bleiben.
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Smith et al. erörtern "eine innovative Technologie zur 'willkürlichen' Probennahme" in
Clin. Chem. 28(9), 1867-1872 (1982). Eine nicht-mischbare, nicht-reaktive Flüssigkeit
wird als feste Barriere zwischen der Flüssigkeitsprobe und dem Reagens sowie den
Innen- und Außenflächen ihrer jeweiligen Sonden verwendet, wodurch eine inerte,
verformbare Oberfläche bereitgestellt wird, die sowohl ein Verschleppen verhindert als
auch präzise Abgabe gewährleistet.
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US-Patent Nr. 3.526.480 offenbart einen automatischen chemischen Analyzer, worin
dosierte Teilmengen von Probenmaterial von einem Probenträger zu diskretes Reagens
enthaltenden Stellen auf einem Analysenstreifen transportiert werden. Die Vorrichtung
ist insbesondere für die Übertragung einer Vielzahl unterschiedlicher diskreter Reagens
enthaltender Stellen ausgebildet. Es sind mit Öffnungen versehene Analysenstreifen
so
wie Reagens enthaltende Stellen geoffenbart, in denen die Reagenzien chemisch
adsorbiert sind.
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US-Patent Nr. 4.575.485 (Sizto et al.) beschreibt durch Ultraschall beschleunigte
Immunreaktionen. Die Bindungsraten zwischen Elementen eines spezifischen
Bindungspaares, z. B. Ligand-Rezeptor, werden durch kurzzeitige Ultraschall-Beschallung eines
wässrigen Mediums verstärkt, welches das spezifische Bindungspaar enthält. Die
erhöhten Raten finden insbesondere in Tests auf spezifische Bindungsproteine Anwendung.
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US-Patent Nr. 4.930.898 (Miller-Ihli) beschreibt eine Vorrichtung und ein Verfahren
zum direkten Ultraschallmischen einer Probe unter Verwendung einer Ultraschallsonde,
die direkt in die Probe eingeführt wird.
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Ein erster Aspekt der vorliegenden Erfindung besteht in einem Verfahren zum
Vermischen zweier oder mehrerer Flüssigkeiten. Das Verfahren umfasst:
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(a) das Ausbilden von Flüssigkeitströpfchen, welche die beiden oder mehrere
Flüssigkeiten enthalten, auf einer Oberfläche, wobei die Flüssigkeitströpfchen behälterlos von der
Oberfläche getragen werden, wobei die Oberfläche im Wesentlichen undurchlässig für
die Flüssigkeitströpfchen und damit nicht-reaktiv ist, sowie
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(b) die Zufuhr elektrostatischer Energie, akustischer Energie oder mechanischer
Schwingungsenergie zu den Tröpfchen, wodurch die Flüssigkeiten vermischt werden, dadurch
gekennzeichnet, dass die Oberfläche im Wesentlichen eben und im Wesentlichen
unelastisch ist und dass die elektrostatische, akustische oder mechanische
Schwingungsenergie den Tröpfchen zugeführt wird, ohne dass ein anderer physischer Kontakt mit
den Tröpfchen als jener durch die Oberfläche gegeben ist.
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Die Tröpfchen können in einer im Wesentlichen von Luftströmungen freien Umgebung
verformt werden.
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Ein zweiter Aspekt der vorliegenden Erfindung besteht in einer Vorrichtung zum
Vermischen zweier oder mehrerer Flüssigkeiten. Die Vorrichtung umfasst:
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(a) eine Oberfläche, die im Wesentlichen undurchlässig für die Flüssigkeiten und damit
nicht-reaktiv ist,
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(b) einen Spender zum Abgeben der Flüssigkeiten auf die Oberfläche, um Tröpfchen zu
bilden, wobei die Tröpfchen behälterlos von der Oberfläche getragen werden, und
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(c) Mittel, um zu bewirken, dass sich die Tröpfchen verformen, ohne die Oberfläche zu
verformen, wodurch die Flüssigkeiten vermischt werden, wobei das Mittel aus der aus
akustischer Energie, elektrostatischer Energie und mechanischer Schwingungsenergie
bestehenden Gruppe ausgewählt ist, dadurch gekennzeichnet, dass die Oberfläche (12)
im Wesentlichen eben und im Wesentlichen unelastisch ist und dass die Mittel zum
Bewirken der Verformung der Tröpfchen (14) in der Lage sind, das Verformen der
Tröpfchen ohne anderen physischen Kontakt mit den Flüssigkeiten als durch die Oberfläche
zu bewirken.
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Ein weiteres Verfahren gemäß vorliegender Erfindung betrifft das Transportieren flüssiger
Proben und Reagenzien durch eine automatische Analysevorrichtung sowie das
Vermischen der flüssigen Proben und Reagenzien während des Transports. Ein im
Wesentlichen unelastischer und im Wesentlichen ebener Träger wird an einer oder mehreren
Sonden vorbei bewegt, die Probe und Reagenzien auf den Träger abgeben, um
Tröpfchen zu bilden, die jeweils Probe und Reagenzien umfassen. Elektrostatische Energie,
akustische Energie oder mechanische Schwingungsenergie wird den Tröpfchen ohne
physischen Kontakt mit den Tröpfchen zugeführt, wodurch die Probe und die
Reagenzien gemäß dem ersten Aspekt der Erfindung vermischt werden.
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Die Tröpfchen können dann zu einer Detektionszone bewegt werden. Die Tröpfchen
können sich zumindest während der Schritte des Bildens und Vermischens in einer im
Wesentlichen von Luftströmungen freien Umgebung befinden.
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Eine automatische Analysevorrichtung gemäß vorliegender Erfindung zum Vermischen
zweier oder mehrerer Flüssigkeiten und zum automatischen Analysieren einer Vielzahl
von Proben umfasst eine Vorrichtung zum Vermischen zweier oder mehrerer
Flüssigkeiten gemäß dem zweiten Aspekt der Erfindung und einen Analzyer zum Analysieren der
Tröpfchen, worin ein starrer Träger für die im Wesentlichen ebene Oberfläche
vorhanden ist und die Oberfläche beweglich ist; der Spender umfasst eine oder mehrere
Flüssigkeitsabgabesonden, um eine Probe und Reagenzien auf die Oberfläche abzugeben,
um ein oder mehrere solcher Tröpfchen zu bilden, wobei die Oberfläche im
Wesentlichen undurchlässig für die Probe und die Reagenzien und damit nicht-reaktiv ist und
das Mittel zum Herbeiführen der Tröpfchenverformung nicht-verdampfend ist und die
Oberfläche nicht nennenswert dehnt.
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Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung besteht in einem Verfahren zum
Vermischen zweier oder mehrerer Flüssigkeiten und zum Testen bezüglich des
Vorhandenseins oder der Menge eines Analyten in einer flüssigen Probe, von der vermutet wird,
dass sie den Analyten enthält. Das Verfahren umfasst das Vorbeibewegen einer im
Wesentlichen ebenen Oberfläche an einer oder mehreren Sonden, die Probe und
Reagenzien auf die Oberfläche abgeben, um Tröpfchen zu bilden. Jedes Tröpfchen umfasst
Probe und Reagenzien, wobei eines der Reagenzien ein markiertes Reagens oder ein
markierbares Reagens ist. Elektrostatische Energie, akustische Energie oder mechanische
Schwingungsenergie wird den Tröpfchen ohne physischen Kontakt damit zugeführt,
wodurch die Probe und die Reagenzien gemäß dem ersten Aspekt der Erfindung vermischt
werden. Als nächstes werden die Tröpfchen auf der Oberfläche inkubiert, und die Stärke
des Signals, das vom markierten Reagens erzeugt wird, wird bestimmt, ohne die
Tröpfchen von der Oberfläche zu entfernen. Die Stärke eines solchen Signals wird mit dem
Vorhandensein oder der Menge des Analyten in der Probe in Beziehung gesetzt.
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Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zum Vermischen
zweier oder mehrerer Flüssigkeiten und zum Detektieren von Licht, das von einem
Photoaktivierung unterzogenen flüssigen Medium ausgesandt wird. Das flüssige Medium
umfasst zwei oder mehrere Flüssigkeiten, die gemäß dem ersten Aspekt der vorliegenden
Erfindung vermischt werden. Das Verfahren umfasst:
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(a) das Aufbringen des flüssigen Mediums auf einen im Wesentlichen ebenen und im
Wesentlichen unelastischen transparenten Träger, wobei das flüssige Medium
behälterlos von der Oberfläche getragen wird, wobei der Träger im Wesentlichen undurchlässig
für das flüssige Medium und damit nicht-reaktiv ist,
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(b) das Anordnen des Trägers auf solche Weise, dass sich das flüssige Medium und der
Träger zwischen zwei reflektierenden Oberflächen befinden, die das flüssige Medium
im Wesentlichen umgeben, wobei zumindest eine der Oberfläche eine Öffnung für
Licht aufweist, das vom flüssigen Medium ausgesandt wird, um auf einen Photodetektor
aufzutreffen, der eine Photomultiplierröhre mit einem Verschluss umfasst,
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(c) das Unterziehen des flüssigen Mediums der Photoaktivierung bei geschlossenem
Verschluss, und
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(d) das Öffnen des Verschlusses und Detektieren von Licht, das vom flüssigen Medium
ausgesandt wird, durch die Photomultiplierröhre.
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Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung besteht in einer Vorrichtung zum
Vermischen zweier oder mehrerer Flüssigkeiten und zum Detektieren von Licht, das von
einem Photoaktivierung unterzogenen flüssigen Medium ausgesandt wird. Die
Vorrichtung umfasst eine Anordnung zum Vermischen zweier oder mehrerer Flüssigkeiten
gemäß dem zweiten Aspekt der Erfindung, worin die Oberfläche transparent ist und die
Vorrichtung (a) einen Photodetektor, der eine Photomultiplierröhre mit einem
Ver
schluss umfasst, und (b) zwei reflektierende Oberflächen aufweist, die in Bezug auf die
transparente Oberfläche so angeordnet sind, dass ein auf die transparente Oberfläche
aufgebrachtes Medium zwischen den reflektierenden Oberflächen liegt, die das
Medium im Wesentlichen umgeben, wobei zumindest eine der reflektierenden
Oberflächen eine Öffnung für vom Medium ausgesandtes Licht aufweist, damit dieses auf den
Photodetektor auftrifft, wobei das Medium behälterlos von der transparenten Oberfläche
getragen wird.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
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Fig. 1 ist eine Draufsicht einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung.
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Fig. 2 ist eine Seitenansicht der Ausführungsform aus Fig. 1 ohne das schlangenförmige
Band, das die Probenküvetten enthält.
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Fig. 3 ist eine Draufsicht einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung.
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Fig. 4 ist eine Darstellung von Tröpfchen, die während eines Tests auf Digoxin unter
Verwendung einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung gebildet werden.
Beschreibung der spezifischen Ausführungsformen
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Die vorliegende Erfindung sorgt für das effiziente Vermischen sehr kleiner
Flüssigkeitsvolumina, wie beispielsweise 50 ul oder weniger. Die Erfindung findet insbesondere in
automatisierten Analysevorrichtungen wie jenen Anwendung, die eingesetzt werden,
um automatisierte Tests durchzuführen. Gemäß diesem Aspekt ermöglicht die Erfindung
willkürlichen Zugang zu flüssigen Proben und Reagenzien durch Durchführung
derartiger Assays und für den Transport solcher Proben und Reagenzien durch die Vorrichtung,
während die Proben und Reagenzien gleichzeitig vermischt werden und für die
Detektion eines Signals gesorgt wird. Alle obigen Ziele werden unter Einsatz
verdampfungsfreier Techniken erreicht, ohne dass ein Behälter oder ein verformbarer Träger
erforderlich ist. Die Vorteile der vorliegenden Erfindung werden erzielt, indem
Flüssigkeitströpf
chen, die zwei oder mehr Flüssigkeiten enthält, auf einer im Wesentlichen ebenen
Oberfläche ausgebildet wird und das Verformen der Tröpfchen in einer im
Wesentlichen von Luftströmungen freien Umgebung herbeigeführt wird, ohne die Oberfläche zu
verformen. Besonders bevorzugte Ansätze zum Verformen der Tröpfchen bestehen in
der Zufuhr elektrostatischer Energie oder akustischer Energie zu den Tröpfchen. Die
vorliegende Erfindung macht es möglich, die Verwendung von Reagenzien und Probe zu
minimieren, Puffer, Waschlösungen und die meisten Einwegartikel wegzulassen, die
Größe, Komplexität und Kosten der Instrumente zu verringern und das Abfallvolumen
zu reduzieren, ohne die Testleistung zu beeinträchtigen.
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Nun werden zur Veranschaulichung, nicht jedoch zur Einschränkung, spezifische
Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung im Detail unter Bezugnahme auf die
beiliegenden Zeichnungen beschrieben. Eine spezielle Ausführungsform der Erfindung wird
in Fig. 1 und Fig. 2 dargestellt. Eine Flüssigkeits-Handhabungsvorrichtung 10 umfasst
einen ersten Träger 12 zum Aufbringen von Flüssigkeitströpfchen 14 darauf. Träger 12 ist
im Wesentlichen eben, im Wesentlichen unelastisch und allgemein undurchlässig für
die darauf aufgebrachten Flüssigkeiten. Der Begriff "im Wesentlichen eben" bedeutet,
dass die Ebene von Oberfläche 12 eine solche ist, dass darauf befindliche
Flüssigkeitströpfchen nicht durch Schwerkrafteinwirkung in einem nennenswerten Ausmaß vom
Punkt der Aufbringung wegbewegt werden. Bei der Ausführungsform verbleiben die
Flüssigkeitströpfchen vorzugsweise am Punkt der Ablagerung.
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Weiters ist Träger 12 im Wesentlichen frei von Bindungselementen, d. h. Elementen
spezifischer Bindungspaare, die einen Bereich an der Oberfläche oder in einem
Hohlraum aufweisen, der spezifische Bindung zeigt, und die daher als komplementär mit
einer bestimmten räumlichen und polaren Organisation der anderen Elemente der Paare
definiert sind. Die Elemente des spezifischen Bindungspaares werden als Ligand und
Rezeptor (Antiligand) bezeichnet. Dabei kann es sich um Elemente eines immunologen
Paares, wie z. B. Antigen-Antikörper, oder um Elemente von Paaren wie
Operator-Re
pressor, Nuklease-Nukleotid, Biotin-Avidin, Homone-Hormonrezeptoren, Nukleinsäure-
Duplices, IgG-Protein A und dergleichen handeln.
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Träger 12 ist aus einem Material hergestellt, das relativ unelastisch und undurchlässig
für aufgebrachte Flüssigkeiten und nicht-reaktiv damit ist. Der Träger ist so konstruiert,
dass er nicht leicht in einem größeren Ausmaß gedehnt oder verformt wird, als
erforderlich ist, um ihn in einer Ausführungsform, bei welcher der Träger in einer Kassette
untergebracht ist, auf eine Spule aufzuwickeln. Weiters sorgt Oberfläche 12 für keinerlei
spezifische chemische Wechselwirkung, wie z. B. Antigen-Antikörper-Wechselwirkungen,
einer solchen Oberfläche mit den Komponenten der flüssigen Probe oder flüssigen
Reagenzien und kann von den Flüssigkeiten benetzt werden oder nicht. Geeignete
Materialien für Träger 12 sind, zur Veranschaulichung und nicht als Einschränkung, Polystyrol,
Polyurethan, Nylon, Polyester, Polymethacrylat, Polyethylen, Polypropylen,
Polyfluorkohlenstoffe, Nitrocellulose, Celluloseacetat usw. Das Material ist vorzugsweise
transparent und farblos, oder es kann undurchsichtig sein und ist in diesem Fall üblicherweise
schwarz oder weiß. Bei bestimmten Verfahren ist es wünschenswert, einen Träger zu
verwenden, der beschichtet, beispielsweise auf einer oder beiden Seiten metallisiert ist.
Ein solcher Überzug kann verwendet werden, um das Reflexionsvermögen,
elektrostatische Phänomene usw. zu steuern, oder es können Muster vorgesehen werden, die zu
elektrischen Kontakten mit der Probe führen, die ein elektrolytisches Verfahren oder
eine photoakustische Messung oder die Erzeugung von Beugungsmustern zulassen.
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Die Dicke des Trägers 12 beträgt üblicherweise etwa 0,05 bis 1 mm, vorzugsweise 0,1
bis 0,5 mm. Die jeweils eingesetzte Dicke hängt von der Festigkeit des gewählten
Materials und auch von der Fähigkeit des Materials ab, Wärme und elektrostatische oder
akustische Energie zu leiten. Es ist klar, dass die Dicke des Trägers eine solche sein
sollte, dass der Träger während der Verwendung gemäß vorliegender Erfindung seine
Integrität beibehalten kann. Die Breite des Trägers ist allgemein durch die jeweilige
Anwendung bestimmt, bei der die Erfindung eingesetzt wird, wie z. B. in einer automatisierten
Analysevorrichtung. In letzterem Fall kann der Träger als Faser, flexibles Band, Bahn
oder Streifen vorliegen, die/das/der zu einer Rolle aufgewickelt oder als Kassette
bereitgestellt ist, um die Ausgabe zu erleichtern. Bei diesem Ansatz kann Träger 12 am
Ausgang der Vorrichtung auf einer Rolle aufgenommen sein. Die Breite des Bandes beträgt
in einem solchen Fall 0,1 bis 250 mm, vorzugsweise 10 bis 125 mm. Im Allgemeinen
ist es vorzuziehen, dass die Dicke und Breite des Bandes relativ gleichmäßig sind.
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Es kann in manchen Fällen wichtig sein zu gewährleisten, dass Träger 12 im
Wesentlichen frei von elektrostatischen Ladungen ist. Zu diesem Zweck kann die Oberfläche mit
ionischen Tensiden beschichtet oder metallisiert sein, oder die Ladung kann durch
Erdung, Bestreichen mit einem leitenden Material oder Unterziehen einer
α-Teilchen-Bestrahlung reguliert werden.
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In Fig. 1 hat Träger 12 die Form eines flexiblen Bandes, das sich in Kassette 1b befindet
und von Kassette 18 aufgenommen ist. Das Band sorgt für den Transport durch
Vorrichtung 10. Es können herkömmliche Mechanismen zum Antreiben der Bänder eingesetzt
werden, wie die Verwendung von Zahnrädern und Perforationen im Band,
Reibungsantriebe, Drehung der Aufnahmespule in der Kassette usw. Außerdem kann eine
Steuerung solcher Antriebsmechanismen unter Einsatz von Mikroprozessoreinheiten und
-techniken auf herkömmliche Weise angewandt werden, um automatisierte Systeme
bereitzustellen. Auf diese Weise wird problemlose Bewegung des Trägers durch die
Vorrichtung beibehalten. Diese spezielle Ausführungsform ermöglicht es, dass die gesamte
Flüssigkeit auf der Oberfläche des Trägers sowie die benutzten Abschnitte des Trägers
auf sichere Weise in der Kassette aufgenommen werden, um sie am Ende zu entsorgen.
Es versteht sich, dass der einzige Einwegartikel bei der obigen Ausführungsform die
Kassette ist, die den/die benutzten Träger und Flüssigkeiten enthält. Es sind keine
speziellen Waschlösungen notwendig, um irgendwelche der Komponenten der
erfindungsgemäßen Vorrichtung zu reinigen, jegliche Proben oder Reagenzien, die an der Pipette
haften bleiben könnten, werden unter Einsatz einer äußerst geringen Menge an
nichtmischbarer Flüssigkeit entfernt, und wie oben erwähnt werden alle Flüssigkeiten in der
Kassette aufgenommen. Selbstverständlich liegt es im Schutzumfang der vorliegenden
Erfindung, Träger 12 durch eine Entsorgungsstation zu bewegen, um die Flüssigkeit
durch Absaugen oder auf andere Weise vom Träger zu entfernen. Gegebenenfalls kann
der Abschnitt des Trägers, der bereits benutzt wurde, dann abgeschnitten und in einem
geeigneten Behälter zur sicheren Entsorgung entsorgt werden.
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Der Einfachkeit halber wird in Fig. 1 nur ein Träger gezeigt; es versteht sich, dass in
einer Analysevorrichtung gemäß vorliegender Erfindung eine Vielzahl von Trägern
vorhanden sein kann. Träger 12 wird gegebenenfalls vom starren Träger 20 (in Fig. 1
angedeutet und in Fig. 2 vollständig gezeigt) gehalten, der aus jedem Material bestehen
kann, das für Starrheit sorgt, wie z. B. starrem Kunststoff, Metall, Keramikmaterial und
dergleichen. Der starre Träger 20 kann die gleiche Breite wie Träger 12 haben oder
breiter oder schmäler als Träger 12 sein, üblicherweise nicht mehr als 50% kleiner oder
größer. Alternativ dazu ist der starre Träger 20 mit aufgerollten Rändern, Wülsten,
Rippen oder verdickten Abschnitten versehen, um dem Träger 12 Starrheit zu verleihen,
wenn Träger 12 nicht aus einem starren Material besteht. Es ist zu berücksichtigen, dass
die Starrheit des Trägers 12 - entweder die eigene Starrheit oder die durch die
Verwendung eines starren Trägers 20 verliehene - für die Art des Zufuhrmechanismus geeignet
sein muss. Abdeckung 15 kann verwendet werden, um den Träger 12 und seinen Inhalt
während der Verwendung zu schützen. Die Öffnungen 17 ermöglichen den Zugang von
Pipetten 22 und 24 zum Träger 12. Abdeckung 15 kann aus jedem geeigneten Material
bestehen, das seiner Verwendung entspricht, wie z. B. Kunststoff, Metall wie Aluminium
usw.
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Es liegt ebenfalls im Schutzumfang der vorliegenden Erfindung, dass Träger 12 nicht
beweglich ist, obwohl das weniger bevorzugt wird. Die verschiedenen Vorrichtungen, die
mit dem Träger in Wechselwirkung stehen müssen, sind dann beweglich. Alternativ
dazu kann Träger 12 eine Einwegscheibe oder -platte sein, die auf einem Transportsystem,
wie z. B. einem Karussell, montiert sein kann. Bei einer weiteren Ausführungsform kann
Träger 12 eine diskrete Platte sein, die groß genug ist, um Flüssigkeitstropfen für einige
wenige, z. B. ein bis drei, Tests aufzunehmen. Gemäß einem Aspekt dieser letzteren
Ausführungsform ist die Trägerplatte in einen Transportmechanismus eingefügt, der dem
starren Träger 20 zugeordnet ist, und umfasst anstelle von Küvetten 28 einen
einstückigen Behälter für eine einzige Probe.
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Vorrichtung 10 umfass weiters Flüssigkeitsabgabemittel; wie z. B. Pipetten 22 und 24,
zum Abgeben von flüssiger Probe und flüssigen Reagenzien auf die Oberfläche von
Träger 12 in Form von Tröpfchen 14. Die Pumpen 23 und 25, die beispielsweise
peristaltische Dosierpumpen oder Spritzen sein können, wirken über Leitungen 46 und 47 mit
Pipetten 22 bzw. 24 zusammen, wodurch das Ansaugen und Abgeben von Flüssigkeit
auf Träger 12 ermöglicht wird. Beispiele für andere Pumpen, die gemäß vorliegender
Erfindung verwendet werden können, sind Kapillarpumpen, piezoelektrische Pumpen,
Kompressionspumpen und dergleichen. Das Gesamtflüssigkeitsvolumen in den
Tröpfchen 14 aus Probe und Reagenzien beträgt üblicherweise etwa 1 bis 100 ul,
vorzugsweise weniger als 50 ul, üblicherweise etwa 15 bis 40 ul. Die Pipetten, einschließlich
ihrer Spitzen, sind üblicherweise zur mehrmaligen Verwendung bestimmt. Derartige
Pipetten sind nach dem Stand der Technik bekannt. Pipette 22 kommuniziert mit
Flüssigkeitsprobenspendern oder Küvetten 28, die zu testende Proben enthalten, die auf dem
sich bewegenden schlangenförmigen Band 26 an Pipette 22 vorbei transportiert werden.
Die Bewegung von Band 26 erfolgt ruckweise, so dass jede Probe in einem
vorbestimmten Intervall präsentiert wird. Das Weiterrücken des sich bewegenden Bands ist mit dem
Weiterrücken von Träger 12 koordiniert, der mit einer vorbestimmten Geschwindigkeit
weitergerückt werden kann, um angemessene Inkubationszeiträume zu ermöglichen,
die auf einem bestimmten Protokoll für einen Test basieren. Die verschiedenen Teile
von Vorrichtung 10 können einzeln oder gemeinsam weitergerückt werden, so dass die
Flüssigkeitsabgabe als Reaktion auf die Position 12 von Träger erfolgt, wie durch das
Weiterrückmittel angezeigt. Beispielsweise kann die Bewegung von Träger 12 bei
typischen Assays mit einer Rate von 1 bis 10 Mal pro Minute weitergerückt werden.
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Die Pipetten 22 und 24 werden durch (nicht gezeigte) Betätigungsarme nach allgemein
bekannter Praxis horizontal und vertikal bewegt.
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Vorrichtung 10 weist auch Reagenskassetten 30 und 32 auf, die flüssige Reagenzien
enthalten, um einen Test durchzuführen. Normalerweise sind die flüssigen Regenzien auf
eine bestimmte vorgegebene Konzentration vorverdünnt. Die Kassetten 30 und 32
befinden sich auf Plattform 33, die nach hinten und vorne schwingt, so dass die Pipetten
22 und 24 mit den Kassetten 30 und 32 kommunizieren können, um den Tröpfchen 13
flüssige Reagenzien zuzusetzen. Die Bewegung von Plattform 33 erfolgt ruckweise, so
dass sie mit der Bewegung von Träger 12 koordiniert ist, wodurch gewährleistet ist, dass
die Tests wie gewünscht ablaufen.
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Die Pipetten 22 und 24 werden üblicherweise so behandelt, dass die Innenseite und die
Außenseite der Einlassenden oder Spitzen 19 bzw. 21 solcher Pipetten mit einer
Flüssigkeit benetzt bleiben, die mit der abzugebenden Flüssigkeit nicht mischbar ist. Die
nichtmischbare Flüssigkeit ist in Behälter 27 enthalten. Kommunikation der Pipetten 22 und
24 mit Reservoir 27 ist über Leitungen 29 bzw. 31 gegeben. Eine solche Möglichkeit,
die Pipetten mit der nicht-mischbaren Flüssigkeit benetzt zu halten, wird von Reichler
(oben) erörtert. In Hinblick darauf wird ein dünner Flüssigkeitsfilm, der als
nichtmischbar mit den abzugebenden Flüssigkeiten charakterisiert wird, über die Umfangs- und
Innenflächen der Pipetten 22 und 24 vorgesehen. Der dünne Film ist üblicherweise etwa
0,001 bis 1 mm, vorzugsweise 0,01 bis 0,1 mm, dick. Der dünne Film benetzt
vorzugsweise die Innen- und Umfangsflächen der Pipette, um die abzugebenden Flüssigkeiten
auszuschließen. Um diese Wirkung zu erzielen, kann die nicht-mischbare Flüssigkeit an
der Innenfläche vorbei fließen, wobei die Umfangsfläche durch die Oberflächenhaftung
benetzt werden kann, oder über die Umfangsflächen strömen, und der Überlauf kann
von der Pipette aufgesaugt werden, oder die Pipette kann in einen Behälter mit einer
solchen nicht-mischbaren Flüssigkeit eingetaucht werden. Die nicht-mischbare
Flüssigkeit kann der Spitze einer Pipette von einer anderen Öffnung als jener zugeführt
werden, durch die die Probe und/oder die Reagenzien der Pipette zugeführt werden. Die
nicht-mischbare Flüssigkeit kann jedoch auch durch die gleiche Öffnung zugeführt
wer
den. Die spezifische Dichte der nicht-mischbaren Flüssigkeit kann größer oder geringer
als jene der abzugebenden Flüssigkeiten sein.
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Die Beschaffenheit der nicht-mischbaren Flüssigkeit hängt vom Material ab, das die
Oberflächen der Pipetten 22 und 24 bildet. Die Flüssigkeit muss das Material benetzen
können, das üblicherweise relativ hydrophob ist, d. h. es wird vorzugsweise leichter
durch die Flüssigkeit benetzt als durch die normalerweise wässrigen Proben. Zu den
nicht-mischbaren Flüssigkeiten gehören Silikonöle, Mineral- oder Pflanzenöle,
Fluorkohlenstofföle usw., wobei die primäre Anforderung darin besteht, dass sie relativ unlöslich
in Wasser sind und unter 50ºC geringe Flüchtigkeit aufweisen. Da es vorzuziehen ist,
dass Komponenten der Testlösung eine geringe Affinität für Öl aufweisen, werden
üblicherweise Fluorkohlenstoff- und Silikonöle bevorzugt. Vorzugsweise hat die
nichtmischbare Flüssigkeit eine Viskosität von 1 · 10&supmin;&sup7; - 5 · 10&supmin;&sup4; m²/s (0,1-500 Centistoke),
vorzugsweise 1 · 10&supmin;&sup6; bis 1 · 10&supmin;&sup4; m²/s (1-100 Centistoke), wobei die eingesetzte Viskosität
von der jeweiligen nicht-mischbaren Flüssigkeit abhängt, d. h. es kann ein
Fluorkohlenstoff mit geringerer Viskosität in Bezug auf die Viskosität von Silikonöl eingesetzt
werden. Nicht-mischbare Flüssigkeiten mit einer Viskosität am unteren Ende des obigen
Bereichs können eine stärkere Reinigung der Spitzen erfordern als jene am oberen Ende
des obigen Bereichs. Weiters Details zu dieser Frage sind im US-Patent Nr. 4.121.466
(Reichler) zu finden, dessen Offenbarung in Ihrer Gesamtheit durch Verweis hierin
aufgenommen ist. In keinem Fall darf es eine chemische Wechselwirkung der
nichtmischbaren Flüssigkeit an der Pipettenspitze mit der flüssigen Probe oder den flüssigen
Reagenzien geben. Die Tröpfchen 134 enthalten üblicherweise nicht nur flüssige Probe und
flüssige Reagenzien, sondern auch etwas nicht-mischbare Flüssigkeit.
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Die Tröpfchen 14 werden behälterlos auf der Oberfläche von Träger 12 getragen. Der
Begriff "behälterlos getragen" bedeutet, dass die Tröpfchen 13 nicht in diskreten
Behältern mit Wänden oder physischen Barrieren eingeschlossen sind, welche die Flüssigkeit
eingrenzen. Die Tröpfchen 14 werden primär durch andere Mittel als die Schwerkraft
auf der Oberfläche von Träger 12 gehalten, wie z. B. durch elektrostatische
Wechselwir
kungen und Oberflächenspannung. Der an die Abgabestellen der Flüssigkeiten
angrenzende Bereich weist vorzugsweise keine mechanische Barriere auf, die mit dem
Tröpfchen in Kontakt kommt. Wenn eine solche Barriere verwendet wird, besteht ihre
Hauptfunktion darin, zu verhindern, dass das Tröpfchen die Oberfläche entlang gleitet. Für
diesen Zweck ist die Oberfläche mit seichten Vertiefungen oder leicht hochgezogenen
Elementen versehen, und daher stehen die Tröpfchen auf weniger als 50% ihrer Höhe,
normalerweise weniger als 10% ihrer Höhe, mit der Oberfläche in Kontakt. Es liegt im
Schutzumfang der vorliegenden Erfindung, eine Oberfläche zu verwenden, die eine
andere Affinität für die Flüssigkeiten aufweist als der Abschnitt der Oberfläche, auf den die
Tröpfchen 14 aufgetragen werden, um dazu beizutragen, dass die Tröpfchen als diskrete
Einheiten bestehen bleiben. Ein anderes Mittel wäre das Aufbringen eines Rings aus
Material (einer sehr dünnen Schicht), welches ein Benetzen mit Öl oder Wasser verhindert,
wodurch die Tröpfchen dazu gezwungen werden, an Ort und Stelle zu bleiben.
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Das Verfahren zum Vermischen gemäß vorliegender Erfindung nutzt das Wechselspiel
zwischen einer von außen ausgeübten Verformungskraft und wiederherstellenden
Kohäsivkräften (Oberflächenspannung) des Tropfens. Die äußere Kraft ist gepulst, so dass
eine rasche, oszillierende Verformung des Tropfens auftritt. Es sind viele Modi
oszillierender Verformung möglich, und sie unterscheiden sich durch die Muster der
Relativbewegung der verschiedenen Bereiche der Oberfläche des Tröpfchens. Die Frequenz,
Wellenform und Amplitude der gepulsten äußeren Kraft gemeinsam mit den
Oberflächen- und Substanzeigenschaften des Tröpfchens bestimmen den Modus der
oszillierenden Verformung. Rasches und effizientes Vermischen erfordert die richtige Wahl dieser
die äußere Kraft regulierenden Parameter.
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Die äußere Kraft kann elektrostatisch oder mechanisch sein. Eine gepulste
elektrostatische Kraft oder ein elektrisches Wechselfeld kann angelegt werden, indem Elektroden in
einer Anordnung in der Nähe des Tröpfchens abwechselnd geladen und entladen
werden. Eine gepulste mechanische Kraft kann ausgeübt werden, indem das Trägerband
durch einen Vibrationsmischer ersetzt wird, der von einer Schwingspule, einer
piezo
elektrischen Membran oder einem anderen elektromechanischen Schwingungswandler
angetrieben wird.
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Die flüssige Probe und die flüssigen Reagenzien werden in einer im Wesentlichen von
Luftströmungen freien Umgebung vermischt, um Verdampfen und Bewegung der
Tröpfchen auf andere Weise, als es in Einklang mit der vorliegenden Erfindung steht, zu
vermeiden. Mit dem Begriff "Umgebung im Wesentlichen ohne Luftströmung" ist gemeint,
dass die Luftbewegung in Vorrichtung 10 in dem Bereich, in dem die Flüssigkeiten
vermischt werden sollen, nicht ausreicht, um Bewegung oder Verformung der
Flüssigkeitströpfchen 14 zu bewirken. Weiters ist Oberfläche 12, um Verdampfung zu vermeiden,
üblicherweise abgeschlossen, wodurch ein minimaler Luftraum über den Tröpfchen
bereitgestellt wird, während immer noch Zugang bleibt, um Probe und Reagenzien
aufzubringen.
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Vorrichtung 10 umfasst auch Mittel 36 und 38 zum Vermischen der flüssigen Probe und
der flüssigen Reagenzien in Tröpfchen 14 gemäß vorliegender Erfindung. Im
Allgemeinen werden die Flüssigkeiten vermischt, indem Tröpfchen 14 verformt werden, und das
wird üblicherweise ohne jegliche nennenswerte Dehnung von Träger 12 erreicht.
Demgemäß sollte, obwohl Träger 12 dünn und unter manchen Umständen flexibel sein
sollte, Träger 12 im Wesentlichen unverformt bleiben, so dass die Abmessungen jedes
Segments von Träger 12 im Wesentlichen unverändert bleiben, üblicherweise weniger
als 10% vorzugsweise weniger als 1%, Änderung jeder Abmessung während des
Vermischens der Probe auftritt.
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Beispiele für Mittel 36 sind Mittel zum Zuführen elektrostatischer Energie oder
akustischer Energie zu Tröpfchen 14. Elektrostatische Energie kann zugeführt werden, indem
Tröpfchen 14 einem variablen elektrischen Feld ausgesetzt werden, was Polarisation der
Tröpfchen 14 herbeiführt und zu deren Verformung führt. Das variable elektrische Feld
kann erzeugt werden, indem die Polarität eines Kondensators abwechselnd geändert
werden. Die Verformung der Tröpfchen 14 führt zu einem Vermischen der flüssigen
Probe und flüssigen Reagenzien. Es ist kein physischer Kontakt mit den Tröpfchen 14
erforderlich. Die Frequenz und Feldstärke des elektrischen Feldes hängt von der Größe,
Viskosität und Oberflächenspannung des Tröpfchens, den Eigenschaften der Oberfläche
12 und dergleichen ab und wird üblicherweise empirisch bestimmt. Normalerweise
beträgt die Frequenz des elektrischen Feldes etwa 5 bis 50.000 Hz, vorzugsweise 15 bis
1.000 Hz, mehr bevorzugt etwa 20 bis 500 Hz. Die Feldstärke des elektrischen Feldes
beträgt üblicherweise etwa 500 bis 20.000 V/cm, vorzugsweise etwa 1.000 bis 10.000
V/cm. Die Dauer der Zufuhr der elektrischen Feldenergie kann, je nach Frequenz und
Feldstärke, von etwa 1 bis 60 s, vorzugsweise von etwa 5 bis 20 s, variieren. Die
Frequenz, Feldstärke und Zeit werden so gewählt, dass sie keine nachteilige Wirkung auf
die Probe, die Reagenzien oder die Genauigkeit des Tests haben.
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Wenn den Tröpfchen akustische Energie zugeführt wird, um die Flüssigkeiten zu
vermischen, sind die oben in Bezug auf die Nutzung eines elektrischen Feldes angeführten
Faktoren ebenfalls anwendbar. Normalerweise kann die zum Vermischen notwendige
Vibration durch Verwendung von Energie im Schall- oder Infraschallbereich erzielt
werden. Zu diesem Zweck können die Tröpfchen 14 einer Frequenz von etwa 20 bis
20.000 Hz, vorzugsweise 20 bis 2.000 Hz ausgesetzt werden. Die Leistung hängt im
Allgemeinen von mehreren Faktoren ab, einschließlich der Frage, wie die Leistung auf
das Tröpfchen und den Träger übertragen wird. Demgemäß wird die Leistung für jede
spezielle Anwendung unter Verwendung der obigen Parameter und Richtlinien
bestimmt. Die Dauer des Zuführens akustischer Energie kann je nach Frequenz und
Leistung von etwa 0,5 bis 30 s, vorzugsweise von etwa 1 bis 10 s, variieren. Die Leistung,
Frequenz und Dauer werden so gewählt, dass sie keine nachteilige Wirkung auf die
Probe, die Reagenzien oder die Genauigkeit des Tests haben. Akustische Energie wird den
Tröpfchen 14 in Vorrichtung 10 durch einen akustischen Wellengenerator, Lautsprecher
oder dergleichen zugeführt.
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Vorrichtung 10 umfasst auch Mittel zum Messen des Signals, das in Tröpfchen 14 im
Verlauf des Tests erzeugt wird. Ein solches Mittel zur Signalmessung oder Analyzer
hängt von der Art des im Test erzeugten Signals ab, das nachstehend detaillierter
beschrieben wird. Kurz zusammengefasst besteht das Signal üblicherweise aus
elektromagnetischer Strahlung oder wird durch diese erzeugt und resultiert aus
Licht-Absorptionsvermögen und Streuung, Fluoreszenz, Chemolumineszenz, Raman-Resonanz,
Photoakustik-Spektroskopie, Elektrolumineszenz, Magnetisierung und dergleichen. Ein
solches Mittel zur Signalmessung ist Lesekopf 34, der in Vorrichtung 10 so angeordnet ist,
dass er Tröpfchen 26 auf das Vorhandensein eines Signals untersuchen kann. Lesekopf
34 kann eine Lichtquelle, einen Photodetektor, einen akustischen Wellendetektor, ein
Magnetometer, ein Mittel zum Herbeiführen von Elektrolyse der Probe und einen
Photodetektor, einen Szintillationszähler oder dergleichen umfassen.
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In den Fig. 1 und 2 umfasst Lesekopf 34 einen oberen Abschnitt oder parabolischen
Reflektor 35, der direkt über einem Abschnitt von Träger 12 sitzt und die reflektierende
Oberfläche 44 umfasst. Ein Laser 42 kommuniziert über Lichtleiter 43 mit dem oberen
Abschnitt 35. Lesekopf 34 umfasst auch die Photomultiplierröhre 40 mit Verschluss 41.
Die Bewegung des oberen Abschnitts 35 vertikal zu und vom Träger 12 weg wird durch
Arm 37 gesteuert, der wiederum beispielsweise durch einen (nicht dargestellten)
Solenoid gesteuert wird.
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Vorzugsweise wird das Signal abgelesen, ohne dass die Tröpfchen 14 weiter kontaktiert
werden. Die Messung des Signals kann jedoch erfolgen, indem ein Teil von Tröpfchen
14 in eine Lesekammer gezogen wird, die mit einer nicht-mischbaren Flüssigkeit
beschichtet ist, wie oben beschrieben. Wenn das Signal Licht ist, kann eine geeignete
Linse oder ein Lichtleitersystem enthalten sein, um das von einem Tröpfchen ausgesandte
Licht mit hoher Effizienz aufzufangen.
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Bei den Proben handelt es sich, ohne dass dies eine Einschränkung darstellt, häufig um
Proben mit biologischen Ursprung, und sie umfassen Körperflüssigkeiten, die
üblicherweise vom Körper eines Säugetiers stammen. Die Körperflüssigkeiten sind im
Allgemeinen flüssiges oder halbfestes Material und können steril oder nicht-steril sein und Zellen
enthalten. Die Körperflüssigkeit kann ohne weitere Behandlung eingesetzt werden, oder
sie kann behandelt werden, um Zellen, Bruchstücke und dergleichen zu beseitigen.
Beispiele für Körperflüssigkeiten sind Gesamtblut, Lymphflüssigkeit, Serum, Plasma,
Speichel, Samen und Zerebrospinalflüssigkeit. Körperflüssigkeit kann von einem Patienten
beispielsweise durch eine Injektionsspritze oder Nadel oder durch natürliche
Austreibung entnommen werden. Andere flüssige Proben können von halbfestem oder festem
Material durch Extraktion nach bekannten Verfahren erhalten werden.
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Proben, die nach dem Verfahren gemäß vorliegender Erfindung analysiert werden
sollen, können vorbehandelt werden, um Zellen abzutrennen oder Lyse durchzuführen;
Proteine zu fällen, zu hydrolysieren oder zu denaturieren; Lipide zu hydrolysieren;
Analyten zu solubilisieren; oder dergleichen. Eine solche Vorbehandlung kann ohne
Einschränkung umfassen: Zentrifugation; Behandlung der Probe mit einem organischen
Lösungsmittel, beispielsweise einem Alkohol, vorzugsweise einem Alkohol mit weniger
als etwa 7 Kohlenstoffatomen, wie z. B. Methanol; und Behandlung mit Tensiden,
chaotropen Mitteln; Natriumhydroxid usw. Demgemäß umfasst der Begriff "flüssige Probe"
die obigen gemeinsam mit jeglichem flüssigen Medium, das als Ergebnis einer solchen
Vorbehandlung erhalten wird und von dem vermutet wird, dass es einen Analyten oder
eine Komponente von Interesse enthält. Solche Analyten oder Komponenten von
Interesse sind Drogen, therapeutische Arzneimittel, Pestizide, Proteine, wie
Immunglobuline, Nukleinsäuren usw. Die Analyten werden detaillierter im US-Patent Nr. 5.248.619
in Spalt 6, Zeile 27, bis Spalte 8, Zeile 6 beschrieben, deren Offenbarung durch Verweis
hierin eingeschlossen ist.
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Die Reagenzien in den Küvetten 30 und 32 sind auf Basis der Art des durchzuführenden
Tests ausgewählt. Die Darstellung von nur zwei Reagenzien erfolgt nur als Beispiel und
soll keine Einschränkung darstellen. Die Anzahl der Reagenzien kann mehr oder
weniger vom jeweils eingesetzten Testformat abhängen. Die Vorrichtungen gemäß
vorliegender Erfindung können für die meisten Tests adaptiert werden, die elektromagnetische
Strahlung zur Detektion erfordern, einschließlich Tests, die spezifische Bindungspaar-
(sbp-) Elemente umfassen. Die Tests können kompetitiv oder Sandwichassays sein,
erfordern jedoch nicht, dass in Vorrichtung 10 Trennungen durchgeführt werden. Die
immunologische Reaktion für den Test vom Sandwichtyp umfasst üblicherweise ein
spb-Element, das an eine Markierung und an die Probe gebunden ist. Bei einem kompetitiven
Protokoll kann die Markierung mit einem sbp-Element verbunden sein, das zum
Analyten analog ist, der in der Probe bestimmt werden soll. Das Reagens, das die Markierung
enthält, z. B. an eine Markierung gebundenes sbp-Element, wird als markiertes Reagens
bezeichnet. Die Markierung kann auch nicht an ein sbp-Element gebunden sein, das zu
einem Analyten komplementär ist. Statt dessen kann das Reagens ein sbp-Element
aufweisen, das ermöglicht, dass die Markierung an das an einen Analyten gebundene sbp-
Element gebunden wird, der daher markiert werden kann.
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Verschiedene Hilfsmaterialien werden bei einem Test unter Anwendung der
vorliegenden Erfindung häufig eingesetzt. Demgemäß können die flüssigen Reagenzien
gegebenenfalls Puffer sowie Stabilisatoren für das Testmedium und Testkomponenten und für
Waschschritte enthalten. Häufig können zusätzlich zu diesen Additiven zusätzliche
Proteine enthalten sein, wie z. B. Albumine, oder Tenside, insbesondere nicht-ionogerie
Tenside, Bindungsförderer, z. B. Polyalkylenglykole oder dergleichen.
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Nachdem die Probe und die Reagenzien kombiniert worden sind, können sie
gegebenenfalls inkubiert werden. Die sbp-Elemente werden darin aktiviert, und das
resultierende Signal wird gemessen. Wenn beispielsweise die sbp-Elemente eine
Enzymmarkierung und deren Substrat sind, wird Substrat zugegeben und das erzeugte Signal wird mit
der Analytmenge in der getesteten Probe in Beziehung gesetzt.
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Eine detailliertere Erörterung der Immungssaytechniken, auf die die vorliegende
Erfindung angewandt werden kann, ist "Enzyme-Immunoasssay" von Edward T. Maggio,
CRC Press, Inc., Boca Rato, Florida, 1980, zu entnehmen. Siehe beispielsweise auch die
US-Patente Nr. 3.690.834; 3.7919342; 3.817.837; 3.850.578; 3.853,987; 3.867.517;
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3,901.654; 3.935.074; 3.984.533; 3.996.345; und 4.098.876, wobei für diese Liste kein
Anspruch auf Vollständigkeit erhoben wird.
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Das Signal von der Markierung kann direkt detektierbar sein, wie z. B. eine
Radiomarkierung. Andererseits kann die Markierung Teil eines signalerzeugenden Systems (signal
producing system, "sps") sein, das eine oder mehrere Komponenten aufweisen kann,
wobei zumindest eine Komponente die Markierung ist. Das sps erzeugt ein
detektierbares Signal, das mit der Menge an gebundener und/oder ungebundener Markierung in
Beziehung steht, d. h. der Menge der an den Analyten, der detektiert wird, oder an einen
Antikörper gegen einen solchen Analyten gebundenen oder nicht-gebundenen
Markierung. Auf diese Weise wird die Stärke des erzeugten Signals mit dem Vorhandensein
oder der Menge an Analyt in der Probe in Beziehung gesetzt. Kalibratoren oder
Vergleiche, die vorbestimmte Analytmengen enthalten, können eingesetzt werden, um das In-
Beziehung-Setzen der Signalstärke mit dem Vorhandensein oder der Menge an Analyt
zu erleichtern. Das "sps" umfasst alle Reagenzien, die erforderlich sind, um ein
detektierbares Signal zu erzeugen. Es gibt zahlreiche Verfahren, mit denen die Markierung
ein detektierbares Signal erzeugen kann, beispielsweise durch elektromagnetische
Strahlung, Wärme, Reagenzien und dergleichen.
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Die Markierung kann direkt ein Signal erzeugen, d. h. es sind keine zusätzlichen
Reagenzien erforderlich, um ein Signal zu erzeugen. Beispielsweise können zahlreiche
organische Moleküle Licht im UV- und im sichtbaren Bereich absorbieren, wobei die
Lichtabsorption Energie auf diese Moleküle überträgt und sie in einen angeregten
Energiezustand hebt. Diese absorbierte Energie wird dann durch die Aussendung von Licht
mit einer zweiten Wellenlänge abgegeben. Beispielsweise können fluoreszierende
Moleküle Licht mit einer Wellenlänge absorbieren und Licht mit einer zweiten
Wellenlänge aussenden. Geeignete fluoreszierende Moleküle sind Fluorescein, Isothiocyanat,
Rhodamin, Phycoerythrin, Phycocyanin, Allophycocyanin, o-Phthalaldehyd und
Fluorescamin. Eine große Anzahl veranschaulichender Fluoreszenzmittel wird von Litman et
al., US-Patent Nr. 4.275.149, Spalten 30 und 31, angeführt, dessen Offenbarung durch
Verweis hierin aufgenommen ist. Andere Beispiele für Markierungen, die direkt ein
Signal erzeugen können, sind radioaktive Isotope, wie z. B. ¹²&sup5;I, ¹³¹I, ¹&sup4;C, ³H, &sup5;&sup7;Co, &sup7;&sup5;Se,
³²P, ³&sup5;S und dergleichen; sowie Farbstoffe, wie sie nach dem Stand der Technik
allgemein bekannt sind.
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Alternativ dazu kann die Markierung auch andere Reagenzien erfordern, um ein Signal
zu erzeugen. Daher umfasst das signalerzeugende System alle Reagenzien, die
erforderlich sind, um ein messbares Signal zu erzeugen. Andere Komponenten des
signalerzeugenden Systems sind Substrate, Coenzyme, Verstärker, zweite Enzyme, Aktivatoren,
Kofaktoren, Inhibitoren, Fänger, Metallionen, spezifische Bindungssubstanzen, die zum
Binden von signalerzeugenden Substanzen erforderlich sind, und dergleichen. Einige
der chemischen Reagenzien, wie z. B. Coenzyme, Substanzen, die mit Enzymprodukten
reagieren, andere Enzyme, Katalysatoren und dergleichen, können an andere Moleküle
oder an einen Träger gebunden sein.
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Eine große Vielzahl nicht-enzymatischer Katalysatoren, die eingesetzt werden können,
sind bei Ullman, US-Patent Nr. 4.160.645, geoffenbart, dessen entsprechende
Abschnitte durch Verweis hierin aufgenommen sind.
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Es kann ein Enzym oder Coenzym eingesetzt werden, das für die gewünschte
Amplifizierung sorgt, indem ein Produkt erzeugt wird, das bei Bestrahlung Licht absorbiert, z. B.
ein Farbstoff, oder Licht aussendet, z. B. ein Fluoreszenzmittel. Alternativ dazu kann die
katalytische. Reaktion zur direkten Lichtaussendung, z. B. Chemolumineszenz, führen.
Eine große Anzahl von Enzymen und Coenzymen zur Bereitstellung solcher Produkte ist
bei Litman et al., US-Patent Nr. 4.275.149, Spalten 19 bis 23, und Boguslaski et al., US-
Patent Nr. 4.318.980, Spalten 10 bis 14, angeführt, deren Offenbarungen durch Verweis
hierin aufgenommen sind.
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Chemolumineszierende Verbindungen sind ebenfalls als Markierungen geeignet, wobei
zur Veranschaulichung, nicht jedoch zur Einschränkung Luminol, Isoluminol,
aromati
sche Acridiniumester, Imidazol, Acridiniumsalz, Oxalatester und dergleichen genannt
werden können. Zahlreiche Chemolumineszenzmittel sind bei Litman et al., US-Patent
Nr~ 4.27.149, Spalte 31, angeführt, dessen Offenbarung durch Verweis hierin
aufgenommen ist. Chemolumineszenzmittel können auch in Verbindung mit Photosensibilatoren
verwendet werden, wie in US-Dokument Seriennummer 07/704.569, eingereicht am
22. Mai 1991, mit dem Titel "Assay Method Utilizing Induced Luminescence"
beschrieben, dessen Offenbarung durch Verweis hierin aufgenommen ist.
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Ein spezielles Verfahren zum Erzeugen eines Signals in Tests, die gemäß vorliegender
Erfindung durchgeführt werden, wird im US-Patent mit der Anmeldungsnummer
07/704.569, Einreichdatum 22. Mai 1991 (Ullman et al.), beschrieben, dessen relevante
Offenbarung durch Verweis hierin aufgenommen ist. Das Verfahren umfasst das
Behandeln eines Reaktionsgemisches, von dem vermutet wird, das es den Analyten enthält,
unter solchen Bedingungen, dass der Analyt, wenn er vorhanden ist, bewirkt, dass ein
Photosensibilisator und eine chemolumineszierende Verbindung in große Nähe
gelangen.
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Der Photosensibilisator erzeugt Singulett-Sauerstoffatome und aktiviert die
chemolumineszierende Verbindung, wenn sie sich in großer Nähe befindet. Die aktivierte
chemolumineszierende Verbindung erzeugt in der Folge Licht. Die erzeugte Lichtmenge steht
mit der Analytmenge im Medium in Beziehung. Im Speziellen, wie auf die vorliegende
Erfindung angewandt, umfasst eine Ausführungsform des Verfahrens als ersten Schritt
das Bereitstellens einer Kombination, die das obengenannte Medium, von dem vermutet
wird, das es Analyt enthält, an ein Teilchen gebunden, umfasst, wobei auch eine
chemolumineszierende Verbindung, die an das Teilchen gebunden vorliegt, ein
Photosensibilisator, der mit einem spezifischen Bindungspaar- (sbp-) Element verbunden ist, das
fähig ist, sich an den Analyten zu binden. Die Kombination wird üblicherweise durch
Bestrahlung mit Licht behandelt, um den Photosensibilisator anzuregen, der in seinem
angeregten Zustand fähig ist, Sauerstoff in den Singulettzustand zu aktivieren.
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Die Kombination wird dann auf das Ausmaß an Lumineszenz oder Licht, das ausgesandt
wird, untersucht. Das Ausmaß einer solchen Lumineszenz wird mit der Menge an
Analyt im Medium in Beziehung gesetzt. Alternativ dazu ist die chemolumineszierende
Verbindung mit einem spb-Element verbunden, das fähig ist, den Analyten zu binden, und
das Teilchen, an das der Analyt gebunden ist, wird mit einem Photosensibilisator
verbunden.
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Nach geeigneten Inkubationen gehen Tröpfchen 14 durch den Lesekopf 34, wo das
erzeugte Signal gemessen wird.
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Die Vorrichtung gemäß vorliegender Erfindung kann in ein Gehäuse eingeschlossen
sein, um sie während der Verwendung und Lagerung zu schützen. Solche Gehäuse sind
nach dem Stand der Technik allgemein bekannt und können jede Konstruktion
aufweisen, die mit der Funktion und Verwendung der erfindungsgemäßen Vorrichtung in
Einklang steht. Außerdem werden die Arbeitsteile der Vorrichtung im Allgemeinen durch
verschiedene Arten von Software gesteuert, um die erforderlichen Funktionen
bereitzustellen, wie z. B. Weiterrücken von Träger 12, Absaugen und Abgeben von
Flüssigkeiten, Koordination anderer Teile von Vorrichtung 10 und dergleichen. Die
erfindungsgemäße Vorrichtung kann Mittel zum Regulieren der Innentemperatur umfassen, so dass
geeignete Inkubationstemperaturen und dergleichen erreicht werden. Solche Mittel
können verschiedene Heiz- und Kühlmechanismen umfassen, die nach dem Stand der
Technik bekannt sind.
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Bei einer bevorzugten Vorschrift für Assays, die gemäß vorliegender Erfindung
durchgeführt werden und bei denen ein Gesamtflüssigkeitsvolumen von weniger als 50 ul
eingesetzt wird, wird die Spitze von Pipette 22 zunächst benetzt, indem wenige Mikroliter
einer nicht-mischbaren Flüssigkeit durch die Spitze gedrängt werden. Die
nichtmischbare Flüssigkeit wird in Behälter 27 gehalten und an Pipette 22 durch ein Ventil in
Leitung 29 abgegeben. Jegliche überschüssige nicht-mischbare Flüssigkeit kann an die
Oberfläche von Träger 12 abgegeben werden. Als nächstes wird die nicht-mischbare
Flüssigkeit nachgefüllt, um die Spitze der Pipette zu benetzen, und mehrere Mikroliter
eines flüssigen Reagens von Küvette 32 werden aufgezogen, gegebenenfalls gefolgt von
Absaugen einiger weniger Mikroliter einer flüssigen Probe von Küvette 28 oder eines
zweiten flüssigen Reagens von Küvette 32. Üblicherweise wird, wenn ein zweites
Reagens oder die Probe angesaugt wird, ein kleiner Luftraum zwischen den beiden
Flüssigkeiten eingebracht, indem eine kleine Luftmenge angesaugt wird. Die beiden
Flüssigkeiten werden dann auf die Oberfläche von Träger 12 abgegeben. Alternativ dazu wird das
kleinere zu verwendende Flüssigkeitsvolumen direkt auf die Oberfläche abgegeben,
und die zweite Flüssigkeit wird in der Folge angesaugt und oben auf den Tropfen der
ersten Flüssigkeit aufgebracht. Im Allgemeinen werden die Spitzen der Pipetten 22 und
24 mit der nicht-mischbaren Flüssigkeit vor jedem Ansaugen und Abgeben von
Flüssigkeit benetzt, indem die nicht-mischbare Flüssigkeit von Behälter 27 aufgenommen wird.
Die Tropfen können auf Träger 12 an jeder Position angeordnet werden, solange die
Ränder des Trägers das behälterlose Tragen der Tropfen weder vor, noch während oder
nach dem Mischen der Flüssigkeiten gemäß vorliegender Erfindung beeinträchtigen. Es
kann manchmal vorgezogen werden, die Tropfen so auf dem Träger anzuordnen, dass
die Einheitlichkeit der Ergebnisse eines Tests maximiert wird und abnormale Ergebnisse
vermieden werden.
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Als nächstes wird ein elektrisches Feld aktiviert, um die Flüssigkeit in Tröpfchen 14 zu
vermischen. Nach dem Vermischen der Flüssigkeit wird das Testgemisch 0,5 bis 30 min
inkubieren gelassen. Andere flüssige Reagenzien können während dieser Zeit
zugegeben werden, oder ein Aliquot des Gemisches kann durch eine Pipettenspitze
hochgezogen und an einen anderen Abschnitt der Oberfläche abgegeben werden. Ein weiteres
Reagens kann dann auf die Oberseite dieses neue Tröpfchens abgeben werden, und die
Kombination wieder vermischt werden, wie oben beschrieben. Während dieser
gesamten Zeit bewegt sich Träger 12 schrittweise von einem Ende, das zu Kassette 16
benachbart ist, zum anderen Ende, das zu Kassette 18 benachbart ist. Alle obigen Schritte
werden in geeigneter Weise zeitlich abgestimmt. Nach allen Misch- und
Inkubationsschritten wird Signal, das während des Tests als Ergebnis des Vorhandenseins oder Fehlens
von Analyt in der flüssigen Probe erzeugt wird, von Lesekopf 34 abgelesen.
Beispielsweise wird, wenn das Signal elektromagnetische Strahlung ist, wie bei einer
fluoreszierenden oder chemolumineszierenden Markierung, allgemein das Testgemisch bestrahlt,
und die ausgesandte Lichtmenge wird gemessen. Für diesen Zweck ist es manchmal
nützlich, dass die Oberfläche des Trägers eine reflektierende Beschichtung aufweist, um
das Sammeln des Lichts zu unterstützen. Eine solche reflektierende Beschichtung kann
beispielsweise im Handel erhältliches aluminisiertes Mylar sein.
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Träger 12 bewegt sich weiter, so dass er zum Entsorgen in Kassette 18 aufgenommen
wird. Wie oben erwähnt, liegt es im Schutzumfang der vorliegenden Erfindung, einen
Träger zu verwenden, der auf sichere Weise abgeschnitten, zurückgehalten oder
abgegeben werden kann. Es sind zwar getrennte Mittel zum Ausgeben flüssiger Probe,
Reagensabgabemittel und Mittel zum Beseitigen von Flüssigkeit beschrieben worden, diese
Funktionen können jedoch auch je nach spezieller Anwendung auf herkömmliche
Weise unterschiedlich kombiniert werden. Beispielsweise kann ein einziger
Pipettiermechanismus dazu dienen, um flüssige Probe und Reagenzien nach Bedarf abzugeben, und
gegebenenfalls auch, um am Ende des Tests Flüssigkeit vom Träger 12 zu entfernen. Es
sind verschiedene Modifikationen dieses veranschaulichenden Systems für spezielle
Anwendungen und Instrumente vorstellbar; und diese umfassen eine Vielzahl von
Substanzdetektionssystemen für die Detektion und/oder Messung von Materialien in
Flüssigkeiten.
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Eine weitere Vorrichtung gemäß vorliegender Erfindung wird in Fig. 3 gezeigt.
Vorrichtung 50 umfasst einen Träger 52 zum Aufbringen von Flüssigkeitströpfchen 54 darauf.
Träger 52 ist im Wesentlichen eben und allgemein undurchlässig für die aufgebrachten
Flüssigkeiten. In Fig. 3 hat Träger 52 die Form eines flexiblen Bandes, das sich in einer
Kassette 56 befindet und von Kassette 58 aufgenommen wird, wodurch für den
Transport durch die Vorrichtung gesorgt wird. Vorrichtung 50 umfasst weiters
Flüssigkeitsabgabemittel, wie z. B. die Pipetten 62 und 64, zum Abgeben von flüssiger Probe und
flüssigen Reagenzien auf die Oberfläche von Träger 52 in Form von Tröpfchen 54. Wie
bei der in Fig. 1 beschriebenen Vorrichtung ist es wünschenswert, die Spitzen der
Pipetten 62 und 64 mit einer Flüssigkeit benetzt zu halten, die mit der abzugebenden
Flüssigkeit nicht mischbar ist. Die Pipetten 62 und 64 kommunizieren mit Behälter 67 über die
Leitungen 82 und 84 mittels Unterstützung durch die Pumpen 63 und 65. Behälter 67
enthält eine Flüssigkeit die mit der abzugebenden Flüssigkeit nicht mischbar ist. Pipette
62 kommuniziert mit den Küvetten 68, die zu testende Proben enthalten, die an der
Pipette 62 vorbeitransportiert werden. Die Küvetten 68 werden auf Karussell 66 getragen,
das intermittierend gedreht oder nachgerückt werden kann, um jede Probe in einem
vorbestimmten Intervall zu präsentieren. Das Weiterrücken von Karussell 66 ist mit dem
Weiterrücken von Träger 52 koordiniert, der weitergerückt werden kann, wie oben für
Fig. 1 beschrieben. Vorrichtung 50 weist auch Einweg-Reagensbehälter 70 und 72 auf,
die Reagenzien zur Durchführung eines Tests enthalten. Pipette 64 kommuniziert mit
dem Reagensbehälter 72 über Leitung 71 und Pumpe 80. Die Kommunikation ist
zeitlich abgestimmt, um sie mit dem Weiterrücken der Bewegung von Träger 52 zu
koordinieren.
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Die Zahlen 1-4 in den Tröpfchen 54 in Fig. 3 bezeichnen Tröpfchen, die Reagens 1
(Tropfen Nr. 1), Reagens 2 (Tropfen Nr. 3), Probe und Reagens (Tropfen Nr. 2) und eine
Kombination der Reagenzien 1 uns 2 mit Probe (Tropfen Nr. 4) enthalten. In Fig. 3
geben die Pipetten 62 und 64 nicht nur Probe und Reagenzien als Tröpfchen 54 ab, wie
oben erwähnt, sondern sie nehmen präzise Aliquote jedes Tropfens 1-3 auf und geben
diese Aliquote ab, um Tropfen Nr. 4 zu bilden. Alternativ dazu können die Pipetten 62
und 64 präzise Aliquote von Reagenzien und Probe direkt abgeben, um Tropfen Nr. 4
zu bilden (Ausführungsform nicht gezeigt). Bei einer typischen Vorrichtung gemäß
vorliegender Erfindung sind die Behälter 70 und 72 nur zwei von einer Vielzahl solcher
Behälter, wobei diese Vielzahl beispielsweise die Form eines Rades, einer sich hin- und
herbewegenden Platte oder dergleichen hat, um alle Reagenzien bereitzustellen, die
notwendig sind, um Assays auf eine Vielzahl von Analyten durchzuführen.
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Es liegt natürlich im Schutzumfang der vorliegenden Erfindung, dass die Behälter 70 und
72 direkt Reagenzien als Tröpfchen Nr. 1 bzw. 3 auf Träger 52 abgeben. Bei diesem
Ansatz ist jeder der Behälter 70 und 72 mit Pipettiermitteln ausgestattet, um seinen
jeweiligen Inhalt als Tropfen auf Träger 52 abzugeben.
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Vorrichtung 50 umfasst auch Mittel 76 zum Mischen der flüssigen Probe und flüssigen
Reagenzien in Tröpfchen 54 (Tropfen Nr. 4) gemäß vorliegender Erfindung. Bei dieser
Ausführungsform ist das Mittel 76 ein Akustikwellengenerator zum Zuführen akustischer
Energie zu Tröpfchen 54. Lesekopf 74 ist in Vorrichtung 50 so angeordnet, dass er die
Tröpfchen 54 (Tropfen Nr. 4) auf das Vorliegen eines Signals untersuchen kann.
BEISPIELE
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Die Erfindung wird durch das folgende veranschaulichende Beispiel näher erklärt, das
nicht als Einschränkung für den Schutzumfang der vorliegenden Erfindung angesehen
werden soll. Teile und Prozentsätze sind, falls nicht anders angegeben, Gewichtsteile
und Gew.-%.
Beispiel 1
Digoxintest
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Im vorliegenden Beispiel ist das Verfahren ein homogenes Immungssay für
Human-Blutserum auf das Vorhandensein des Arzneimittels Digoxin. Das Verfahren, das gemäß
vorliegender Erfindung automatisiert wurde, war dem in US-Patent Anmeldenummer
081156.181, eingereicht am 22. November 1993 (Sing et al.) ähnlich, dessen relevante
Abschnitte durch Verweis hierin aufgenommen sind, insbesondere jene, welche die
Herstellung von Chemolumineszenzmittel und Photosensibilisator und von Latexkugeln,
die entweder ein Chemolumineszenzmittel oder einen Photosensibilisator enthalten,
betreffen, und jene, die die Art der Durchführung eines Assays unter Einsatz solcher
Kugeln betreffen.
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Auf die Fig. 1, 2 und 4 Bezug nehmend wurden zwei Reagenzien vorbereitend in ein
Paar Behälter in Kassette 30 geladen, die auf Plattform 33 so angeordnet waren, dass
Pipette 22 die Reagenzien in diesen Behältersen erreichte. Reagens A bestand aus einem
Puffer mit pH 8,2 (0,1M TRIS-HCL, 0,3M NaCl, 25 mM Ethylendiamintetraacetat
(EDTA), 0,% Rinderserumalbumin (BSA), 0,1% Dextran T-500 (R), 0,12% Kathon (R)
(von Rohm und Haas vertriebenes Konservierungsmittel) und1/320 Verdünnung von
Heterophilic Blocking Reagent 1 (hergestellt von Scantibodies Laboratory, Santee, CA,
USA)), in dem 120 pl/nil Latexteilchen suspendiert waren. Diese Teilchen enthielten ein
Chemolumineszenzmittel (Thioxen C-26 von Singh et al., oben) und ein
Europiumchelat, nämlich Eu(TTA), von Singh et al., oben, und wiesen Antikörper für Digoxin durch
eine Biotin-Streptavidin-Bindung an ihre Oberfläche gebunden auf. Reagens B bestand
aus einem Puffer (der gleiche wie für Reagens A), in dem 24 ug/ml Latexteilchen
suspendiert waren. Diese Latexteilchen wurden auf ähnliche Weise hergestellt, wie von
Singh et al., oben, beschrieben, und enthielten den Photosensibilisator
Tetradecylsquarat (TDS) (auf ähnliche Weise hergestellt, wie in US-Patent Nr. 4.830.786 beschrieben),
und hatten Digoxinmoleküle an ihre Oberfläche gebunden. Die Serumprobe war in
Behälter 28 enthalten, das ebenfalls für Pipette 22 zugänglich war.
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Der starre Träger 20 und seine Abdeckung 15 (siehe Fig. 2) sowie die Reagenzien in
Kassette 30 wurden bei 32ºC gehalten. Die Pipettenspitzen 19 und 21 wurden mit
Silikonöl von Behälter 27 mit einer Viskosität von 5 · 10&supmin;&sup5; m²/s (50 Centistoke) gefüllt. Die
Spitzen waren im Wesentlichen Polypropylenzylinder mit einem Innendurchmesser von
1 mm, einem Außendurchmesser von 2 mm und einer Länge von 50 mm. Die Wand
der Pipettenspitzen waren nach unten über die letzten 4,5 mm ihrer Länge zu einem
Außendurchmesser von 1,5 mm verjüngt. Die Pipettenspitze wurde für
Flüssigkeitstransfers vorbereitet, indem 1 bis 2 ul Silikonöl zu Träger 12 abgegeben wurden, der die
Form eines Bandes hatte. Dieser Schritt war nur am Beginn eines automatisierten
Durchgangs notwendig. Das Silikonöl wurde durch Kapillarkräfte die Außenseite der
Pipettenspitze entlang bis in eine Höhe von zumindest 3 mm über dem offenen Ende der Spitze
hinaufgezogen.
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Die Abfolge der Vorgänge im Assay war folgende: Pipette 22 wurde betätigt, um 2 pl
Luft in ihre Spitze zu ziehen, die dann 2 mm unterhalb de Oberfläche der Flüssigkeit im
Kassettenbehälter angeordnet wurde, das Reagens A enthielt, und 20 pl dieser
Flüssigkeit wurden abgesaugt. Die Pipettenspitze wurde dann aus der Flüssigkeit gezogen und
über Position 101 (siehe Fig. 4) auf dem Träger 12 angeordnet, ausgerichtet mit der
Reagenskassette 30 und Probenbehälter 28. Die Pipettenspitze wurde auf eine Höhe 1,5
mm über Träger 12 gesenkt, und die Flüssigkeit, der Luftspalt und eine kleine Menge
Silikonöl wurden an Position 101 auf die Oberfläche von Träger 12 abgegeben. Das
Gesamtvolumen, das aus der Pipette ausgestoßen wurde, betrug 23 ul. Die Pipette führte
dann die gleiche Abfolge von Schritten durch, uni einen Tropfen von Reagens B an
Position 102 abzugeben. Der Träger 12 war ein Film aus transparentem Mylar D, der 0,127
mm (0,005 Zoll) dick und 49,8 mm (1,96 Zoll) breit war.
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Die Pipette zog 2 Pl Luft auf und wurde dann so angeordnet, dass ihr offenes Ende in
den Tropfen an Position 101 eindrang und sich in einer Höhe von 0,5 mm über dem
Träger 12 befand. Die Pipette zog 15 ul der Flüssigkeit im Tropfen ein. Die Spitze
wurde dann aus dem Tropfen zurückgezogen, und 2 ul Luft wurden angesaugt. Die Pipette
wurde dann zum Serumprobenbehälter 28 bewegt und wurde 2 mm unter die
Flüssigkeitsoberfläche eingetaucht, und 3 ul Serum wurden angesaugt. Die Pipette wurde zu
Position 103 bewegt und 1,5 mm über der Trägeroberfläche angeordnet, und 23 Pl
Volumen wurden abgegeben. Die beiden Flüssigkeitsvolumina wurden zu einem Tropfen
vereint, und sie wurden auf den Träger abgegeben, die Luftspalten wurden ausgestoßen,
und 1 ul überschüssiges Silikonöl wurde über den Tropfen abgegeben. Ein
Vibrationsmischer war unmittelbar unterhalb und in Kontakt mit Träger 12 an Position 103
angeordnet. Der Mischer wurde dazu gebracht, etwa 0,25 mm vertikal in einem quadratischen
Wellenmuster mit 800 Hz zu schwingen. Die Schwingung wurde 6 s lang beibehalten,
so dass der Tropfeninhalt durch die Schwingbewegung der Tropfenoberfläche gründlich
vermischt wurde. Die Reaktion zwischen dem Serumdigoxin und den Reagens
A-Teilchen begann an diesem Punkt.
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Der Träger wurde dann vorwärts bewegt, ebenso wie die Kette von Proben, und eine
zweite Reaktion wurde vorbereitet. Wenn das erste Reaktionsgemisch die Position von
Pipette 24 erreichte, wurde der zweite Teil der immunologischen Reaktion in Gang
gesetzt. In einer Abfolge von Schritten, die jenen ähnlich war, die den ersten Schritt in
Gang setzten, und unter Verwendung von Pipette 24 und nur der bereits in Tropfen auf
Träger 12 vorhandenen Flüssigkeiten wurden 3 ul des Gemisches aus Serum und
Reagens A (von Position 103) und 15 ul Reagens B vom Tropfen, die ursprünglich an
Position 102 abgegeben wurden, an Position 104 relativ zu den ursprünglichen drei Tropfen
angeordnet. Ein zweiter Vibrationsmischer mischte den Tropfen so, dass die Reaktion
zwischen den Reagens B-Teilchen und Reagens A-Teilchen beginnen konnte.
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Während sich der Träger in einem zeitlich präzise abgestimmten Zyklus
vorwärtsbewegte, erreichte das Gemisch an Position 104 den Lesekopf 34. Der Signalablesevorgang
begann mit einem Solenoidbetätigungsarm 37 und Senken über den Tropfen eines
reflektierenden Gehäuses 35, dessen Ränder den Träger im Wesentlichen
lichtundurchlässig abgeschirmt kontaktierten. Unter dem Tropfen und dem Träger befanden sich ein
hohler, reflektierender Zylinder, ein elektromechanischer Verschluss 41 und eine
Photomultiplierröhre 40. Der Verschluss war zunächst geschlossen. An der Oberseite des
reflektierenden Gehäuses befand sich die Endfläche eines Lichtleiters 43, der Licht von
einem Diodenlaser 42 abgab. Der Diodenlaser wurde durch Computersteuerung durch
eine extern modulierte Stromzufuhr (in den Fig. 1, 2 oder 4 nicht gezeigt) eingeschaltet.
Der Laser wurde 1 s lang eingeschaltet. 10 Millisekunden, nachdem der Laser
ausgeschaltet worden war, wurde der Verschluss für 1 s geöffnet, und vom Reaktiongemisch
ausgesandtes Licht wurde gemessen. 10 Millisekunden, nachdem der Verschluss
geschlossen worden war, wurde der Laser wieder eingeschaltet, und der Vorgang wurde
wiederholt.
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Die über sechs Zyklen aus Beleuchtung und Detektion gemessene Lichtgesamtmenge
bildete das Signal für diese Probe. Das Signal wurde mit jenem verglichen, das unter
Einsatz von Vergleichen mit vorbestimmten Digoxinmengen erhalten wurde. Auf diese
Weise wurde die Digoxinmenge in unbekannten Proben ermittelt.
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Fig. 4 zeigt die relativen Stellen der vier Tropfen 101-104, die bei der Analyse jeder
Probe in einem Beispiel für den Einsatz des Verfahrens geschaffen wurden. Diese Stellen
befinden sich auf dem beweglichen Träger 12 und ändern ihre Position in Bezug auf
den feststehenden Träger 20, wenn der Träger 12 vorwärts bewegt wird.