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DE69512912T2 - Oligosid-derivate, verfahren zu ihrer herstellung und ihre verwendung - Google Patents

Oligosid-derivate, verfahren zu ihrer herstellung und ihre verwendung

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Publication number
DE69512912T2
DE69512912T2 DE69512912T DE69512912T DE69512912T2 DE 69512912 T2 DE69512912 T2 DE 69512912T2 DE 69512912 T DE69512912 T DE 69512912T DE 69512912 T DE69512912 T DE 69512912T DE 69512912 T2 DE69512912 T2 DE 69512912T2
Authority
DE
Germany
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group
molecule
carbon atoms
gal
derivative
Prior art date
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DE69512912T
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DE69512912D1 (de
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Roger Mayer
Michel Monsigny
Annie-Claude Roche
Nadia Sdiqui
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IDM Immuno Designed Molecules
Original Assignee
IDM Immuno Designed Molecules
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Publication date
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Publication of DE69512912T2 publication Critical patent/DE69512912T2/de
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Description

  • Die Erfindung bezieht sich auf neue Oligosid-Derivate, Verfahren zu deren Herstellung und ihre Verwendung.
  • Natürliche Oligoside können in freiem Zustand hergestellt werden aus verschiedenen physiologischen Flüssigkeiten wie Milch oder Extrakten aus natürlichen oder transformierten Produkten (Honig, Bier, etc.). Natürliche Oligoside können gleichfalls erhalten werden durch Spaltung einer glykosidischen Bindung eines Kohlenhydratteils von Glykoverbindungen (Glykolipide, Glykoproteine, Polyoside, Proteoglykane, etc.) durch Hydrolyse mit Enzymen oder durch chemische Katalyse der Glykoverbindungen.
  • Die natürlichen Oligoside können als Substrate, als Inhibitoren, als Erkennungssignale, etc. verwendet werden. Meist ist es zweckmäßig, das Oligosid an einem Molekül, einer Matrix oder einem Partikel zu befestigen, welche ausgewählt sein können aus:
  • - einer Matrix als Träger für die Affinitätschromatografie;
  • - einer Gold- oder Latexkugel für die Histologie und die Zytologie;
  • - einem Protein für die Sichtbarmachung, die Reinigung etc. insbesondere (1) von speziellen Rezeptoren von Osiden, Rezeptoren, die man Lektine, Adhesine, Agglutinine etc. nennt, oder auch (2) von Proteinen mit oder ohne enzymatischer Aktivität, welche eine Affinität für die Oside besitzen, insbesondere Glykosyltransferasen, wie Sialyltransferase, Sulfotransferasen, Phosphotransferasen, Exoglykosidasen und Endoglykosidasen;
  • - einem Lipid für die Charakterisierung der vorstehenden Rezeptoren;
  • - Oligonukleotiden für die selektive Erhöhung ihrer Bindung durch die Zielzellen;
  • - einem Protein oder Polymeren für die Zielerkennung von Medikamenten, Oligonukleotiden oder Genen oder zur Darstellung von intramolekularen Inhibitoren.
  • Die Synthese von Oligosid-Derivaten, die kovalent an ein Protein, eine Matrix, ein Oligonukleotid gebunden sein können oder allgemein an ein organisches Molekül oder ein Partikel gebunden sein können, während sie die Unversehrtheit der Struktur und der Funktionen jedes Ose-Bestandteils aufrechterhalten, was für die Aufrechterhaltung der funktionellen Kapazität des Oligosids nötig ist, kann im wesentlichen auf zwei Wegen durchgeführt werden: die Totalsynthese de novo und die intermediäre Transformation in Glykosylamin. Ein dritter Weg führt zu einem gleichfalls brauchbaren Derivat aber zerstört die terminale reduzierende Ose, dies ist die Aminierung in reduzierendem Medium.
  • Die Totalsynthese erfordert einen selektiven Schutz der Hydroxylgruppen, die nicht an einer glykosidischen Bindung teilnehmen, Kondensationsschritte, selektive Entschützungsschritte und einen abschließenden Entschützungsschritt. Selbst wenn im Verlauf der letzten Jahrzehnte die Ausbeuten einiger dieser Schritte verbessert werden konnten, ist dies eine lange Verfahrensfolge und die Gesamtausbeute bleibt bescheiden und dies um so mehr, je komplexer das zu synthetisierende Oligosid ist.
  • Die Ausbeuten für jeden Schritt liegen zwischen 20 und 95% je nach betreffendem Schritt.
  • Die Synthese eines para-Nitrophenylderivats eines Pentasaccharids wie die Determinante Lewis x:
  • Galβ3(Fucα4)GlcNAcβ3Galβ4Glcβ-O-p-C&sub6;H&sub4;-NO&sub2;
  • erfordert z. B. insgesamt einige zehn Schritte. Jeder Schritt besitzt eine Ausbeute im Bereich zwischen 50 und 95%, im allgemeinen 80%. Insgesamt liegt die Ausbeute des erwarteten Produkts bei einigen %.
  • Die erhöhte Anzahl der Schritte kommt daher, dass die alkoholische Funktion jeder Ose unterschiedlich geschützt werden muss, je nach dem, ob die betreffende Hydroxylgruppe an einer Kondensationsreaktion teilnimmt oder nicht.
  • Eine Ose wie GlcNAc, die zweimal substituiert wird, erhält zur Zeit drei unterschiedliche Substituenten, um eine selektive Substitution des 3-Hydroxyls durch Galactose, des 4-Hydroxyls durch Fucose zu ermöglichen, wobei das 6-Hydroxyl bis zur abschließenden Entschützung geschützt bleibt.
  • In jedem Kondensationsschritt wird die Ausbeute dadurch beeinträchtigt, dass das gebildete Produkt im allgemeinen eine Mischung zweier anomeren α- oder β-Formen ist.
  • Darüber hinaus muss bemerkt werden, dass die Zwischenprodukte entweder durch Kristallisation oder durch Chromatografie gereinigt werden müssen, was ein wichtiger Grund für die Dauer der Totalsynthese ist. Schließlich muss bemerkt werden, dass die Ausbeuten in einigen Schritten aufgrund sterischer Hinderung sehr schlecht sein können, was insbesondere bei einer Verzweigung der Fall ist, bei der zwei Osen die gleiche Ose substituieren.
  • Jedenfalls ist diese Totalsynthese sehr kostspielig und sehr langwierig.
  • Was die Bildung eines Glykosylamins gefolgt von der Acylierung betrifft, so beruht dieser Weg auf einer Ende des letzten Jahrhunderts beschriebenen Reaktion: ein Osid, das eine reduzierende Ose besitzt, wird in Gegenwart einer erhöhten Konzentration von Ammoniak, eines Ammoniaksalzes oder eines aromatischen Amins inkubiert und reversibel in Glykosylamin übergeführt.
  • Beispielsweise ergibt Lactose ein Lactosylamin mit Ammoniak:
  • Galβ4Glc + NH&sub3; → Galβ4Glcβ-NH&sub2; + H&sub2;O
  • oder mit Anilin:
  • Galβ4Glc + NH&sub2;-C&sub6;H&sub5; → Galβ4Glcβ-NH-C&sub6;H&sub5; + H&sub2;O
  • Diese Reaktion ist jedoch reversibel, d. h. das in einem Puffer gelöste, isolierte Produkt hydrolysiert und ergibt wieder die Ausgangsprodukte.
  • Das Glykosylamin kann jedoch durch Acylierung, bspw. durch selektive N-Acetylierung stabilisiert werden:
  • Galβ4Glcβ-NH&sub2; + (CH&sub3;-CO)&sub2;-O → Galβ4Glcβ-NH-CO-CH&sub3; + CH&sub3;-CO&sub2;H
  • Auf dieser Grundlage wurde kürzlich vorgeschlagen, das Amin der Oligosylamine durch eine organische Verbindung zu substituieren, welche eine reaktive funktionelle Gruppierung besitzt. Manger et al., 1992, Biochemistry 31, 10724 und 31, 10733.
  • Dieser Weg umfasst die Abfolge der folgenden Schritte:
  • 1) Inkubation des Osids, das eine terminale reduzierende Ose besitzt in Gegenwart eines Ammoniumsalzes in sehr hoher Konzentration.
    • Beispielsweise,
  • Galβ4Glc + NH&sub4; + Galβ4Glcβ-NH&sub3;+ + H&sub2;O
  • C&sub1;&sub2;H&sub2;&sub2;O&sub1;&sub1; + NH&sub4; + C&sub1;&sub2;H&sub2;&sub4;O&sub1;&sub0;N + H&sub2;O
  • 2) Reinigung des Glykosylamins durch Säulenchromatografie zur Entfernung des überschüssigen Ammoniumsalzes.
  • 3) Substitution des Amins des Glykosylamins durch Reaktion mit einem aktivierten Derivat von Monochloressigsäure in alkalischem Medium.
    • Beispielsweise,
  • Galβ4GlcβNH&sub2; + (Cl-CH&sub2;-CO)&sub2;-O → Galβ4Glc-NH-CO-CH&sub2;-Cl
  • 4) Transformation der Chloracetylreste in Glycylreste.
  • Das Chloracetylglycosylamid wird in Gegenwart eines sehr konzentrierten Ammoniumsalzes inkubiert, was die Einführung einer Aminfunktion ermöglicht.
    • Beispielsweise,
  • Galβ4Glcβ-NH-CO-CH&sub2;-Cl + NH&sub4; + → Galβ4Glcβ-NH-CO-CH&sub2;-NH&sub3;+, Cl&supmin;H&spplus;
  • 5) Reinigung des Glycyl-Glykosylamids durch Säulenchromatografie zur Entfernung des Ammoniumsalzes.
  • 6) Kondensation des Glycyl-Glykosylamids mit einer Verbindung, die selektiv mit einer aminierten Gruppierung des Glycylrestes reagieren kann.
    • Beispielsweise,
  • Galβ4Glcβ-NH-CO-CH&sub2;-NH&sub2; + R-CO-G → Galβ4Glcβ-NH-CO-CH&sub2;-NH-CO-R + HG
  • wobei G ein Aktivator der Carboxylfunktion ist.
  • Dieser Weg mit sechs Schritten beinhaltet zwei intermediäre Reinigungsschritte und den Einsatz eines toxischen Produkts: des aktivierten Derivats der Chloressigsäure.
  • Die Ausbeute jedes Schrittes ist variabel und schwankt zwischen 50 und 95%; die Gesamtausbeute liegt unter etwa 60%.
  • Ein weiterer Weg wurde gleichfalls vorgeschlagen, aber er bringt die Transformation der reduzierenden Ose in Polyol mit sich; dieser Weg wurde 1974 von Gray (Arch. Biochem. Biophys., 163, 426-428) vorgeschlagen.
  • Das Oligosid wird mit einer Verbindung kondensiert, welche eine Aminfunktion (oder mehrere) umfasst, in Gegenwart von Natriumcyanoborhydrid in alkalischem Medium; das zwischen der reduzierenden Ose und dem Amin gebildete Imin wird mit Natriumcyanoborhydrid zu einem sekundären Amin reduziert.
    • Zum Beispiel:
  • Galβ4Glc + NH&sub2;-R → Galβ4-O-CH(CHOH-CH&sub2;OH)-CHOH-CHOH-CH=N-R + NaBH&sub3;CN → Galβ4-O-CH(CHOH-CH&sub2;OH)-CHOH-CHOH-CH&sub2;-NH-R
  • Die Ausbeute dieser Reaktion variiert je nach Menge der Reaktionspartner und liegt gewöhnlich zwischen 5 und 70%.
  • Hierbei tritt eine Zerstörung der reduzierenden Ose auf, was nicht wünschenswert ist.
  • Das französische Patent Nr. 2 277 823 betrifft N-Oside von L-2- Pyrrolidon-5-carbonsäure, Derivate von diesen und das Verfahren zu ihrer Herstellung, das aus der Kondensation der L-2- Pyrrolidon-5-carbonsäure und/oder L-Glutaminsäure und/oder eines Salzes dieser Säuren mit einer Ose oder einem Osid unter reduzierenden oder nichtreduzierenden Bedingungen besteht.
  • Gemäß den Beispielen sind die reduzierenden Zucker alle Monosaccharide (Ketosen oder Aldosen), wogegen die nichtreduzierenden Zucker bspw. Saccharosen sind; unter Berücksichtigung der Reaktionsbedingungen hydrolysiert die Saccharose zu Glucose und Fructose.
  • Es sei gleichfalls bemerkt, dass gemäß dem Verfahren des genannten französischen Patents Nr. 2 277 823 die Kondensation vorzugsweise in wässrigem Medium und bei einer Temperatur von 50 bis 150ºC, vorzugsweise bei etwa 105ºC abläuft.
  • Diese Betriebsbedingungen machen das Arbeiten mit sehr konzentrierten Lösungen der Ose oder der Säure nötig, so dass diese zur Herstellung eines Oligosids nicht anwendbar sind; die Löslichkeit der Oligoside nimmt entsprechend der wachsenden Anzahl der Osen schnell ab.
  • Die Kondensationsreaktion zwischen der Ose und der Säure, die eine thermische Dehydratation ist, ist außerdem nicht anwendbar auf die Herstellung von Oligosiden aufgrund der Instabilität der osidischen Bindungen, die leicht in der Wärme hydrolysiert werden (siehe bspw. den Fall der Saccharose).
  • Die thermische Kondensation bringt darüber hinaus den Nachteil mit sich, dass sie zu gefärbten Produkten führt, was Zersetzungsreaktionen anzeigt und einen weiteren Reinigungsschritt nötig macht.
  • Dieses Verfahren ermöglicht daher nicht den Erhalt von Monosaccharid-Derivaten und ist nicht für die Herstellung von Oligosid-Derivaten geeignet.
  • Die PCT-Anmeldung WO 93/04701 beschreibt Molekülkomplexe für die Zielerkennung von Oligonukleotiden. Ein ein- oder mehrsträngiges Oligonukleotid wird mit einem Konjugat zwischen einem spezifischen Bindungsmittel einer Zelle wie ein Asialoglykoprotein und einem Mittel mit Bindungsfähigkeit gegenüber einem Poly- oder Oligonukleotid komplexiert, wobei das Bindungsmittel bspw. ein Polykation wie Polylysin ist. Das beschriebene Verfahren ermöglicht nicht die Herstellung eines kovalenten Derivats zwischen einem Oligonukleotid und einem Oligosid. Tatsächlich wurde vorgeschlagen, Arabinogalactan- oder Lactosefragmente zur Bildung von Konjugaten mit einem Transportvehikel (Protein oder Polylysin) durch reduktive Lactosaminierung zu verwenden; in diesem Fall wird die reduzierende Ose zu einem aminierten Polyol reduziert, d. h. sie wird geöffnet und ist keine Ose mehr.
  • Das US Patent 5,028,594 beschreibt cytotoxische Mittel, die einen spezifischen Zellliganden, eine Bindungsgruppe und eine toxische Verbindung umfassen, wobei der Ligand ein Saccharid- oder Polysaccharidmolekül, bspw. Mannose sein kann und die Bindungsgruppe eine aminierte Säure oder ein Oligopeptid sein kann. Beim Herstellungsverfahren wird das Saccharid oder Polysaccharid kovalent mit der Bindungsgruppe verknüpft, die Saccharidmoleküle sind kovalent mit der ε-Aminogruppe der Bindungsgruppe verknüpft. Das Verfahren ermöglicht nicht die Überführung eines natürlichen Oligosids in ein funktionalisiertes Derivat unter Beibehaltung der Unversehrtheit des Oligosids. Es gibt keinen Hinweis auf ein neues Kondensationsverfahren zwischen einem Kohlenhydratteil und einem peptidischen Teil oder Proteinteil.
  • Gemäß einem Gesichtspunkt der Erfindung werden neue Oligosid- Derivate vorgeschlagen, bei denen die Oligoside mit wenigstens einem Molekül, einer Matrix oder einem Partikel verknüpft sind.
  • Gemäß einem weiteren Gesichtspunkt der Erfindung werden Glykosylamin-Derivate vorgeschlagen, die in wässrigem Medium stabil sind und an wenigstens einem Molekül, einer Matrix oder einem Partikel befestigt werden können.
  • Es ist ein Ziel der Erfindung, ein Verfahren zur Herstellung von Oligosiden bereitzustellen, welche an wenigstens einem Molekül, einer Matrix oder einem Partikel befestigt sind, wobei das Verfahren einfach durchzuführen ist und eine verringerte Anzahl von Schritten beinhaltet und den Erhalt einer Ausbeute von praktisch 100% ermöglicht.
  • Gemäß einem weiteren Gesichtspunkt der Erfindung können Oligoside kovalent mit wenigstens einem Molekül, einer Matrix oder einem Partikel verknüpft werden, wobei die funktionelle Kapazität der Oligoside vollständig konserviert wird.
  • Es ist ein Ziel der Erfindung, neue Verbindungen bereitzustellen, die ein oder mehrere Oligoside umfassen, wobei jedes Oligosid kovalent mit einem oder mehreren, insbesondere einem, zwei oder drei Molekülen, Matrizen oder Partikeln, durch ein intermediäres Molekül verknüpft ist, welches ein Stickstoffatom an einem Kohlenstoff in α-Stellung einer C=O- Gruppe und eine oder mehrere funktionelle Gruppen, insbesondere eine, zwei oder drei umfasst, und die kovalente Bindung zwischen dem intermediären Molekül und dem Oligosid durch die Verbindung über das Stickstoffatom vorliegt und die kovalente Bindung zwischen dem intermediären Molekül und dem Molekül, der Matrix, dem Partikel oder den Molekülen, den Matrizen und den Partikeln über die Verbindung der funktionellen Gruppe(n) des intermediären Moleküls und den zweckmäßigen funktionellen Gruppen an dem/den Molekül(en) der(den) Matrix(Matrizen) oder dem(den) Partikel(n) stattfindet.
  • Der Ausdruck 'Oligosid' entspricht der Gegenwart wenigstens zweier und vorteilhafterweise mehr als zwei Osen und vorteilhafterweise wenigstens vier.
  • Die Oligoside, die den Aufbau der erfindungsgemäßen Verbindungen ausmachen, sind so wie vor der Bindung mit dem intermediären Molekül, sie besitzen eine terminale reduzierende Ose. Daher ergibt sich die kovalente Bindung zwischen dem intermediären Molekül und dem Oligosid durch die Verbindung des Stickstoffatoms des intermediären Moleküls und dem anomeren Kohlenstoff der terminalen reduzierenden Ose des Oligosids, d. h. des Kohlenstoffs in Position 1 der terminalen reduzierenden Ose der Aldosereihe oder des Kohlenstoffs in Position 2 der terminalen reduzierenden Ose der Ketosereihe.
  • Gegenstand der Erfindung sind Verbindungen der allgemeinen Formel (I):
  • in der:
  • a = 0 oder 1,
  • j = 0 oder 1,
  • b = 0 oder 1,
  • p = 2 bis 4, insbesondere 2, ist,
  • mit der Maßgabe, dass
  • a = b = 0 ist, falls j = 1 ist, was das Vorliegen eines zyklischen Moleküls bedeutet, bzw. dass a = b = 1 ist, falls j = 0 ist, was die Abwesenheit der (CH&sub2;)p- Gruppe impliziert,
  • D einen Rest einer organischen Säure der Formel D(CO&sub2;)H, insbesondere H oder eine Alkylkette mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen, insbesondere CH&sub3;, darstellt,
  • Z darstellt:
  • B, wobei B H, eine Alkylgruppe mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen oder eine Seitenkette einer natürlichen oder synthetischen α- Aminosäure, wie CH(CH&sub3;)&sub2;, CH&sub2;OH, CH&sub3;, und vorzugsweise H ist, oder
  • B'-P', wobei B' eine Alkylidenkette mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen oder eine Seitenkette einer natürlichen oder synthetischen α-Aminosäure ist, wobei die Ketten eine freie oder geschützte, vorzugsweise geschützte Gruppe enthalten, die von einer funktionellen Gruppe abgeleitet ist, die aktiviert sein kann, wie Carboxyl, SH, OH oder Amin, und P' die nachstehend gezeigten Bedeutungen besitzt,
  • X darstellt:
  • die Gruppe
  • oder die Gruppe
  • oder die Gruppe
  • m eine Zahl von 0 bis 10, vorzugsweise von 0 bis 5 und vorteilhaft 1 oder 2 ist, k = 0 oder 1 ist, Q OH, OCH&sub3;, OCH2-C&sub6;H&sub5;, O-C&sub6;H&sub5;, O-C&sub6;F&sub5;, O-pC&sub6;H&sub4;-NO&sub2;,
  • darstellt,
  • R eine Gruppe, umfassend eine Alkohol-, Phenol-, Thiol- oder Amin-Funktion, darstellt,
  • P wie nachstehend definiert ist,
  • Ai ein organischer Rest, wie eine Alkylidenkette mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen, insbesondere (CH&sub2;)n-W-(CH&sub2;)n, darstellt, wobei n + n' eine ganze Zahl von 0 bis 10 darstellt, W CHY darstellt, Y H, eine lineare oder verzweigte Alkylgruppe mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, ein Rest einer natürlichen oder synthetischen α-Aminosäure ist oder W eine aromatische Verbindung, insbesondere Phenol, darstellt,
  • P, P' und P" identisch oder verschieden sind und darstellen:
  • - eine Matrix als Träger für die Affinitätschromatographie;
  • - eine Gold-, Latexkugel für die Histologie und Zytologie;
  • - ein Protein für die Sichtbarmachung, die Reinigung, insbesondere 1) von spezifischen Osidrezeptoren, die Lectine, Adhesine, Agglutinine usw. genannt werden, oder auch 2) von Proteinen mit oder ohne enzymatischer Aktivität, die Affinität für die Oside aufweisen, insbesondere Glykosyltransferasen wie die Sialyltransferase, Sulfotransferasen, Phosphotransferasen, Exoglykosidasen oder Endoglykosidasen;
  • - ein Lipid für die Charakterisierung der vorstehenden Rezeptoren;
  • - Oligonukleotide für die selektive Erhöhung ihrer Bindung durch die Zielzellen;
  • - ein Protein oder Polymere für die Zielerkennung von Medikamenten, Oligonukleotiden oder Genen, wobei P, P' und P" mindestens eine Funktion besitzen, die eine Kondensationsreaktion durch Umsetzen mit einem Oligopeptid erlaubt, bspw.
  • - eine Aminfunktion (-NH&sub2;), die die Bildung eines Amids mit einem aktiven Ester, eines Amidins mit einem Imidat, eines Thioharnstoffs mit einem Isothiocyanat erlaubt,
  • - eine Thiolfunktion (-SH), die die Bildung einer Disulfidbrücke mit einem ein Thiol enthaltenden Oligopeptid, eines Thioethers mit einem eine Maleinimid- oder eine Halogenalkyl- oder eine Halogenalkanylgruppe enthaltenden Oligopeptid erlaubt, oder
  • - ein Phenol (-C&sub6;H&sub4;OH), das die Bildung einer Azoverbindung mit einem eine Diazogruppe enthaltenden Oligopeptid erlaubt, mit der Maßgabe, dass Z B'-P' darstellt und/oder X P und/oder P" in seiner Formel enthält.
  • In der Formel (I) und in den nachfolgenden Formeln stammt die Oligosidylgruppe aus einem Oligosid, dessen terminale Ose reduzierend ist.
  • Man erkennt, dass in der Definition der Verbindungen der vorstehend angegebenen allgemeinen Formel (I) das erwähnte intermediäre Molekül in seiner Struktur die folgende chemische Einheit umfasst:
  • in der D, a, b, j und p wie vorstehend definiert sind, Z&sub1; und X&sub1; eine oder mehrere funktionelle Gruppen umfassen, die wenigstens eine Bindung mit einem (oder mehreren) Molekül(en), Partikel(n) oder einer (oder mehreren) Matrix (Matrizen) bilden können, von denen vorstehend die Rede war, und Z&sub1; und X&sub1; sind im folgenden genauer definiert (bspw. Produkte der nachstehend definierten Formel Ia).
  • In den vorstehenden Definitionen besitzen die betreffenden Aminosäuren eine L- oder D-Konfiguration und vorzugsweise eine L-Konfiguration.
  • Die erfindungsgemäßen Verbindungen bestehen somit aus einem oder mehreren Oligosiden (identisch oder einige von ihnen ggf. unterschiedlich), wobei jedes dieser Oligoside verknüpft ist mit:
  • - einem Molekül, einer Matrix oder einem Partikel durch die Verbindung entweder einer funktionellen Gruppe X oder einer funktionellen Gruppe Z,
  • - oder mit zwei Molekülen, Matrizen oder Partikeln durch die Verbindung von entsprechenden funktionellen Gruppen X und Z oder durch die Verbindung von zwei funktionellen Gruppen X oder mit drei Molekülen, Matrizen oder Partikeln durch die Verbindung von funktionellen Gruppen X und Z.
  • Es sei bemerkt, dass die allgemeine Formel (I) nur die folgenden Möglichkeiten darstellt:
  • - ein einzelnes Oligosid, das mit einem Molekül, einer Matrix oder einem Partikel P verknüpft ist,
  • - ein einzelnes Oligosid, das mit einem Molekül, einer Matrix oder einem Partikel P' verknüpft ist,
  • - ein einzelnes Oligosid, das mit einem Molekül, einer Matrix oder einem Partikel P" verknüpft ist,
  • - ein einzelnes Oligosid, das mit zwei Molekülen, Matrizen oder Partikeln, jeweils P und P' oder P' und P" oder P und P" verknüpft ist,
  • - ein einzelnes Oligosid, das mit drei Molekülen, Matrizen oder Partikeln P, P' und P" verknüpft ist.
  • Eine derartige Darstellung bezweckt, das Verständnis der allgemeinen Formel (I) nicht zu komplizieren. Aber es ist vorstellbar, dass mehrere Oligoside (identische oder von denen einige ggf. unterschiedlich sind) entweder mit einem Molekül, einer Matrix oder einem Partikel P, oder einem Molekül, einer Matrix oder einem Partikel P', oder mit einem Molekül, einer Matrix oder einem Partikel P" verknüpft sind oder dass mehrere Oligoside (identisch oder von denen einige ggf. unterschiedlich sind) mit zwei Molekülen, Matrizen oder Partikeln P und P' oder P und P" oder P' und P" verknüpft sind oder dass mehrere Oligoside (identisch oder von denen einige ggf. unterschiedlich sind) mit drei Molekülen, Matrizen oder Partikeln P, P' und P" verknüpft sind.
  • Als Beispiel von B' kann aufgeführt werden:
  • -CH&sub2;-S-
  • oder
  • oder -(CH&sub2;)&sub3;-NH
  • oder -(CH&sub2;)&sub4;-NH-.
  • Als Beispiel für P oder P' oder P" können Polylysin, insbesondere gluconoyliertes Polylysin genannt werden.
  • Gemäß einer vorteilhaften Ausführungsform der Erfindung sind ein oder mehrere Oligoside mit dem gleichen Molekül, der gleichen Matrix oder dem gleichen Partikel P verknüpft, wobei Verbindungen aufgebaut werden, die durch die allgemeine Formel (II) dargestellt werden können:
  • in der:
  • *a = 0 oder 1,
  • *j = 0 oder 1,
  • *b = 0 oder 1,
  • *p = 2 bis 4, insbesondere 2,
  • * mit der Maßgabe, dass
  • **a = b = 0, wenn j = 1, was die Gegenwart eines zyklischen Moleküls mit sich bringt,
  • ** oder a = b = 1, wenn j = 0, was die Abwesenheit der Gruppe (CH&sub2;)p mit sich bringt,
  • *D einen organischen Säurerest der Formel DCO&sub2;H, insbesondere H oder eine Alkylgruppe mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen, insbesondere CH&sub3; darstellt,
  • *B H oder eine Alkylgruppe mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen oder eine Seitenkette einer α-Aminosäure, wie CH(CH&sub3;)&sub2;, CH&sub2;OH, CH&sub3; und vorzugsweise H darstellt,
  • *X stellt dar:
  • entweder die Gruppe [NH-(Ai)-CO]n-P, oder
  • die Gruppe [NH-(Ai)-CO]m-R-P
  • wobei m eine ganze Zahl von 0 bis 10, vorzugsweise von 0 bis 5 und vorteilhafterweise 1 oder 2 darstellt, R und P wie vorstehend definiert sind,
  • *Ai einen organischen Rest wie eine Alkylidengruppe mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen, insbesondere (CH&sub2;)n-W-(CH&sub2;)n' darstellt, n und n' eine ganze Zahl von 0 bis 10 darstellen, W CHY darstellt, wobei Y H, eine geradkettige oder verzweigte Alkylgruppe mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, einen natürlichen oder synthetischen α-Aminosäurenrest darstellt oder W eine aromatische Verbindung, insbesondere Phenyl darstellt,
  • *R eine Gruppe darstellt, die eine Alkohol-, Phenol-, Thiol-, oder Aminfunktion besitzt,
  • *P stellt dar:
  • - eine Matrix als Träger für die Affinitätschromatografie;
  • - eine Gold-/Latexkugel für die Histologie und die Zytologie;
  • - ein Protein für die Sichtbarmachung, Reinigung, etc.,
  • - spezielle Rezeptoren von Osiden, Rezeptoren, die man Lectine, Adhesine, Agglutinine etc. nennt;
  • - ein Lipid für die Charakterisierung der vorstehenden Rezeptoren;
  • - Oligonukleotide zur selektiven Erhöhung ihrer Bindung durch Zielzellen;
  • - ein Protein oder Polymere für die Zielerkennung von Medikamenten, Oligonukleotiden oder Genen.
  • Eine vorteilhafte Klasse von erfindungsgemäßen Verbindungen entspricht der allgemeinen Formel (III)
  • in der X[NH-(Ai)-CO]m-P oder [NH-(Ai)-CO]m-R-P darstellt und Ai, m, P und R die vorstehend angegebenen Bezeichnungen haben.
  • Eine vorteilhafte Klasse von erfindungsgemäßen Verbindungen entspricht der Formel (III):
  • in der X darstellt:
  • oder
  • und Ai, m, P, R und P" die vorstehend angegebenen Bezeichnungen haben.
  • Eine weitere vorteilhafte Klasse von erfindungsgemäßen Verbindungen besitzt die allgemeine Formel (IV):
  • in der D und B die vorstehend angegebenen Bezeichnungen besitzen und X[NH-(Ai)-CO]m-P oder [NH-(Ai)-CO]m-R-P darstellt, Ai, m, R und P die vorstehend angegebenen Bezeichnungen besitzen.
  • Eine weitere vorteilhafte Klasse von erfindungsgemäßen Verbindungen entspricht der Formel (IV):
  • in der D und B die vorstehend angegebenen Bezeichnungen besitzen und X darstellt:
  • oder
  • Ai, m, R, P und P" die vorstehend angegebenen Bezeichnungen besitzen.
  • Eine weitere vorteilhafte Klasse von erfindungsgemäßen Verbindungen besitzt die allgemeine Formel (V):
  • in der X[NH-(Ai)-CO]m-P oder [NH-(Ai)-CO]m-R-P darstellt, P, Ai, m und R die vorstehend angegebenen Bezeichnungen besitzen.
  • Gegenstand der Erfindung sind gleichfalls neue Produkte, die insbesondere als Zwischenprodukte für die Herstellung der erfindungsgemäßen Verbindungen dienen können, die Produkte umfassen ein Oligosid, das mit einem Molekül verbunden ist, welches ein Stickstoffatom an einem Kohlenstoffatom in α- Stellung zu einer C=O-Gruppe und wenigstens eine funktionelle Gruppe, insbesondere eine, zwei oder drei funktionelle Gruppen besitzt, wobei die kovalente Bindung zwischen dem Oligosid und dem Molekül durch Verbindung des Stickstoffatoms vorliegt.
  • Die erfindungsgemäßen Produkte entsprechen vorteilhafterweise der allgemeinen Formel (Ia):
  • in der:
  • *a = 0 oder 1,
  • *j = 0 oder 1,
  • *b = 0 oder 1,
  • *p = 2 bis 4, insbesondere 2,
  • * mit der Maßgabe, dass
  • **a = b = 0, wenn j = 1, was die Gegenwart eines zyklischen Moleküls mit sich bringt,
  • ** oder a = b = 1, wenn j = 0, was die Abwesenheit der Gruppe (CH&sub2;)p mit sich bringt,
  • *D einen organischen Säurerest der Formel DCO&sub2;H, insbesondere H oder eine Alkylgruppe mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen; insbesondere CH&sub3; darstellt,
  • *Z&sub1; stellt dar:
  • *B', wobei B ausgewählt ist aus: H, einer Alkylgruppe mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen oder einer Seitenkette einer α-Aminosäure wie CH(CH&sub3;)&sub2;, CH&sub2;OH, CH&sub3; und vorzugsweise H, oder
  • *B', wobei B' ausgewählt ist aus: einer Alkylidenkette mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen oder einer Seitenkette einer α- Aminosäure, wobei die Ketten eine funktionelle Gruppe wie eine Carboxyl-, SH-, OH- oder Aminogruppe enthalten, die frei oder geschützt ist,
  • *X&sub1; darstellt:
  • die Gruppe [NH-(Ai)-CO]m-R,
  • oder die Gruppe [NH-(Ai)-CO]m-Q
  • *R eine Verbindung darstellt, die eine Alkohol-, Phenol-, Thiol- oder Aminofunktion besitzt,
  • *Q folgende Gruppen darstellt:
  • OH, OCH&sub3;, OCH&sub2;-C&sub6;H&sub5;, O-C&sub6;H&sub5;, O-C&sub6;H&sub5;, O-PC&sub6;H&sub4;-NO2,
  • *m eine ganze Zahl von 0 bis 10, vorzugsweise 0 bis 5 und vorteilhafterweise 1 oder 2 ist,
  • *A&sub1; einen organischen Rest wie einen Alkylidenrest mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen, insbesondere (CH&sub2;)n-W-(CH&sub2;)n, darstellt, n und n' eine ganze Zahl von 0 bis 10 darstellen, W CHY darstellt, wobei Y H, eine geradkettige oder verzweigte Alkylgruppe mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, ein natürlicher oder synthetischer α-Aminosäurerest ist, oder W eine aromatische Verbindung, insbesondere Phenyl darstellt.
  • Diese Gruppen sind von acylierten Glykosylaminen abgeleitet. Die acylierten Glykosylamine sind in wässrigem Medium in einem weiten pH-Bereich auf beiden Seiten des Neutralitätspunkts stabil. Das bedeutet, dass bei pH von 5 bis 8 eine geringe Hydrolyse von 1% während 24 Stunden bei einer Temperatur zwischen 0 bis 95ºC abläuft.
  • Die Produkte der Formel (Ia) können so wie sie sind eingesetzt werden.
  • Die Produkte der Formel (Ia) können gleichfalls zur Herstellung der erfindungsgemäßen Verbindungen der Formel (I) eingesetzt werden.
  • Eine vorteilhafte Klasse von erfindungsgemäßen Produkten entspricht der allgemeinen Formel (IIa)
  • in der
  • a = 0 oder 1,
  • j = 0 oder 1,
  • b = 0 oder 1,
  • p = 2 bis 4, insbesondere 2, ist,
  • mit der Maßgabe, dass a = b = 0 ist, falls j = 1 ist, was das Vorliegen eines zyklischen Moleküls bedeutet, oder a = b = 1 ist, falls j = 0 ist, was die Abwesenheit der (CH&sub2;)p- Gruppe impliziert,
  • D einen Rest einer organischen Säure der Formel D(CO&sub2;)H, insbesondere H oder eine Alkylkette mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen, insbesondere CH&sub3;, darstellt,
  • B H, eine Alkylkette mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen oder eine Seitenkette einer α-Aminosäure wie CH(CH&sub3;)&sub2;, CH&sub2;OH, CH&sub3;, und vorzugsweise H darstellt,
  • m eine ganze Zahl von 0 bis 10, vorzugsweise von 0 bis 5 und vorteilhafterweise 1 oder 2 ist,
  • Ai einen organischen Rest wie eine Alkylidenkette von 1 bis 10 Kohlenstoffatomen, insbesondere (CH&sub2;)n-W-(CH&sub2;)n, darstellt, wobei n + n' eine ganze Zahl von 0 bis 10 darstellen, wobei W CHY darstellt, Y H, eine lineare oder verzweigte Alkylgruppe mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, ein Rest einer natürlichen oder synthetischen α-Aminosäure ist oder W eine aromatische Verbindung, insbesondere Phenyl, darstellt,
  • R eine Gruppe, umfassend eine Alkohol-, Phenol-, Thiol- oder Amin-Funktion, darstellt.
  • Die Produkte der Formel (IIa) können zur Herstellung der Verbindungen der Formel (II) eingesetzt werden.
  • Eine weitere vorteilhafte Klasse von erfindungsgemäßen Produkten entspricht der allgemeinen Formel (IIIa)
  • in der Ai, m und R die vorstehend angegebenen Bezeichnungen besitzen.
  • Die vorstehenden Produkte der Formel (IIIa) können zur Herstellung der Verbindungen der Formel (III) eingesetzt werden.
  • Eine weitere vorteilhafte Klasse von erfindungsgemäßen Produkten entspricht der allgemeinen Formel (IVa)
  • in der D, B, m, Ai und R die vorstehend angegebenen Bezeichnungen besitzen.
  • Die vorstehenden Produkte der Formel (IVa) können zur Herstellung der Verbindungen der Formel (IV) eingesetzt werden.
  • Eine weitere vorteilhafte Klasse von erfindungsgemäßen Produkten entspricht der allgemeinen Formel (Va)
  • in der Ai, m und R die vorstehend angegebenen Bezeichnungen besitzen.
  • Die vorstehenden Produkte der Formel (Va) können zur Herstellung der Verbindungen der Formel (V) eingesetzt werden.
  • Die Produkte der Formel (VI)
  • in denen B, Ai, m und R die vorstehend angegebene Bezeichnung besitzen, sind Zwischenprodukte, die erhalten werden im Verlauf der Herstellung der vorstehend definierten Produkte und sind neu.
  • Die Produkte der Formel (VII)
  • in denen p, Ai, R und m die vorstehend angegebene Bezeichnung besitzen, sind Zwischenprodukte, die erhalten werden im Verlauf der Herstellung der vorstehend definierten Produkte und sind neu.
  • In allen Verbindungen oder Produkten der Erfindung kann R die folgenden Reste darstellen:
  • OH, O-CH&sub2;-C&sub6;H&sub5;, O-C&sub6;H&sub5;, O-C&sub6;F&sub5;, O-pC&sub6;H&sub4;-NO&sub2;,
  • -NH-pC&sub6;H&sub4;-N=C=S und dessen Vorläufer
  • -NH-pC&sub6;H&sub4;-NO&sub2;
  • -NH-pC&sub6;H&sub4;-NH&sub2;
  • -NH-CH&sub2;-(CH&sub2;)m-C(=NH&sub2;&spplus;)OCH&sub3;
  • -NH-CH&sub2;-(CH&sub2;)m-CN
  • -NH-CH&sub2;-(CH&sub2;)m-CH&sub2;-NH-CO-CH&sub2;-(CH&sub2;)m-C(=NH&sub2;&spplus;)OCH&sub3;
  • -NH-CH&sub2;-(CH&sub2;)m-CH&sub2;-NH-CO-CH&sub2;-(CH&sub2;)m-CN
  • wobei die Verbindungen eine Addition an eine Aminoverbindung ermöglichen.
  • R kann gleichfalls darstellen: Maleinimid-Derivat Benzoyl-m-maleinimid-Derivat Cyclohexylcarboxyl-N-methylmaleinimid-Derivat
  • -NH-CH&sub2;-(CH&sub2;)m-CH&sub2;-NH-CO-CH&sub2;-T T = Br, I, Cl Halogenacetyl-Derivat
  • -NH-CH&sub2;-CH&sub2;-NH-CO-CH&sub2;-(CH&sub2;)m-S-S-Pyr Dithiopyridin-Derivat
  • N. B.: -Pyr: -2-Pyridin -NH-CH&sub2;-(CH&sub2;)m-CHrS-S-Pyr Dithiopyridin-Derivat Diese Verbindungen ermöglichen eine Addition an ein Thiol.
  • R kann gleichfalls darstellen: Biotin-Derivat
  • Diese Verbindung umfasst einen Biotinrest, der die Bildung eines Komplexes mit Avidin oder Streptavidin ermöglicht.
  • R kann gleichfalls darstellen: 4-Azidobenzoyl-Derivat 4-Azido-2-nitrobenoyl-Derivat 4-Azido-2-nitroanilin-Derivat 3-Acetyl-7-azido-4-methylcumarin-Derivat 4=Azidosalicylsäure- oder 2-Hydroxy-4-azidobenzol-Derivat
  • Diese Verbindungen ermöglichen eine kovalente Bindung an einen Rezeptor, ein Enzym, einen Antikörper, speziell des Kohlenhydratteils durch Photonenaktivierung.
  • R kann gleichfalls darstellen:
  • -NH-(CH&sub2;)m-pC&sub6;H&sub4;OH
  • -NH-CH&sub2;-(CH&sub2;)m-CH&sub2;-NH-CO-(CH&sub2;)m-pC&sub6;H&sub4;OH
  • Diese Verbindungen ermöglichen die Verknüpfung eines oder zweier Iodatome, insbesondere eines radioaktiven Iodatoms.
  • R kann gleichfalls darstellen: Fluorescein-Derivat Dansyl-Derivat 3-Acetyl-7-amino-4-methylcumarin-Derivat Aminofluorescein-Derivat Nitrobenzoxadiazol-Derivat
  • Diese fluoreszierenden Verbindungen ermöglichen die Sichtbarmachung der Position des Oligosidylpeptids in einer Zelle, einem Gewebe, einem Organ, auf einem Gel oder in einer Elektrophoresebande, etc.
  • In den erfindungsgemäßen Verbindungen kann P ein Oligopeptid oder ein Polypeptid, insbesondere gluconoyliertes Polylysin darstellen und P' oder P" können ein Oligonukleotid darstellen oder R kann Fluorescein oder eines seiner Derivate oder ein weiteres fluoreszierendes Derivat darstellen und P' oder P" können ein Oligonukleotid darstellen. P kann gleichfalls ein therapeutisches Mittel oder jedes Zielmolekül darstellen.
  • In den erfindungsgemäßen Verbindungen und Produkten umfasst der oligosidische Rest 2 bis 50 Osen und wird insbesondere ausgewählt aus:
  • Lacto-N-tétraose Galβ3GlcNAcβ3Galβ4Glc
  • Neolacto-N-tétraose Galβ4GlcNAcβ3Galβ4Glc
  • H-Rest Fucα2Galβ3Galβ4Glc
  • Lewisa Galβ3GlcNAcβ3Galβ4Glc Fucα4 - - -↑
  • Lewisx Galβ4GlcNAcβ3Galβ4Glc Fucα3---↑
  • Lewisb Fucα2Galβ3GlcNAcβ3Galβ4Glc Fucα4- - - - - - - -↑
  • Lewisy Fucα2Galβ4GlcNAcβ3Galβ4Glc Fucα3--------↑
  • Disialolacto-N-tétraose Neu 5 Acα3Galβ3GlcNAcβ3Galβ4Glc Neu 5 Acα6-------------↑ Komplexer Typ mit 3 Antennen
  • 3-Sialylactose Neu5Acα3Gal4Glc
  • 6-Sialylactose Neu5Acα6Galβ4Glc
  • 3-Disialylactose Neu5Acα8Neu5Acα3Galβ4Glc
  • - einfache Oside oder von Membranlectinen erkannte Komplexe, ausgewählt aus: a. Asialo-Oligosid vom Lactosamintyp mit 3 Antennen: Asialoglykoprotein-Rezeptor b. Asialo-Oligosid vom Lactosamintyp mit 4 Antennen: Asialoglykoprotein-Rezeptor c. Lewisx: LECAM 2/3 d. Sialyl-Lewisx: LECAM 2/3 e. Lewisx-Sulfat-Derivat (HNK1): LECAM 1 f. Oligomannosid: Mannoserezeptor g. Phosphoryliertes Oligomannosid: Mannose-6-phosphat- Rezeptor h. Oligosaccharid vom Typ des Lactosaminsulfats: GalNAc-4- Sulfat-Rezeptor
  • Zur Herstellung der erfindungsgemäßen Verbindungen müssen zunächst die Produkte (acylierte Glykosylamin-Derivate) hergestellt werden, die insbesondere als Zwischenprodukte zur Herstellung der erfindungsgemäßen Verbindungen dienen.
  • Die Erfindung betrifft gleichfalls ein Verfahren zur Herstellung der vorstehend definierten Produkte (acylierte Glykosylamin-Derivate), dadurch gekennzeichnet, dass:
  • - ein Oligosid mit einer freien reduzierenden Ose mit einem Stickstoffatom eines Zwischenmoleküls kondensiert wird, wobei dieses Stickstoffatom zu einer Amino-Gruppe gehört, die an ein Kohlenstoffatom in α-Stellung einer C=O-Gruppe gebunden ist, wobei das Zwischenmolekül ggfs. eine Seitenkette besitzt, die eine freie oder geschützte funktionelle Gruppe wie OH, SH, NH&sub2; oder COOH enthält, wobei dieses Zwischenmolekül aus den folgenden Zwischenmolekülen ausgewählt ist: natürliche oder synthetische α-Aminosäure, Derivat einer α-Aminosäure, Aminosäure in N-terminaler Position eines Peptids oder eines peptidischen Derivats ggfs. in Gegenwart eines Katalysators wie Imidazol in einem geeigneten Lösungsmittel, um ein Glykosylamin-Derivat zu erhalten, in dem die terminale Ose des Oligosids ihre zyklische Struktur beibehält und in dem das semiacetalische Hydroxyl durch das α-Amin eines der vorstehenden Ausgangsmoleküle ersetzt ist,
  • - falls das Zwischenmolekül keine Seitenkette besitzt, die eine wie vorstehend definierte funktionelle Gruppe enthält, oder eine Seitenkette besitzt, in der die funktionelle Gruppe ggfs. geschützt ist, das am Ende des vorstehenden Schritts erhaltene Glykosylaminderivat durch Zugabe einer durch einen klassischen Aktivator, wie Carbonyldiimidazol, BOP (Benzotriazolyl-N- oxytris(dimethylamino)-phosphoniumhexafluorphosphat) oder HBTU (O-Benzotriazol-1-yl-N,N,N',N'- tetramethyluraniumhexafluorphosphat), aktivierten organischen Säure acyliert wird, um ein N-acyliertes Glykosylaminderivat zu erhalten, ggfs. gefolgt von einer Entschützung der funktionellen Gruppe der Seitenkette im Hinblick auf eine optionale Substitution,
  • - falls das Zwischenmolekül eine eine Carboxylgruppe enthaltende Seitenkette besitzt, die Carboxylgruppe aktiviert wird, um sie intramolekular mit dem α-Amin umzusetzen, was eine Zyklisierung innerhalb des Zwischenmoleküls zur Folge hat, um ein Derivat des N-acylierten Glykosylamin-Derivats zu erhalten,
  • - falls das Zwischenmolekül eine eine Carboxylgruppe enthaltende Seitenkette besitzt, ein Acylierungsmittel in Form eines aktiven Esters zugegeben werden kann.
  • Das erfindungsgemäße Herstellungsverfahren der Glykosylamin- Derivate umfasst somit zwei Schritte, einen Schritt der Kondensation eines Oligosids mit einem intermediären Molekül unter Erhalt eines Glykosylamin-Derivats und einen Schritt der Acylierung des Glykosylamin-Derivats.
  • In dem beabsichtigtem Acylierungsschritt im erfindungsgemäßen Verfahren verwendet man immer einen Aktivator, ob das intermediäre Molekül nun eine eine funktionelle Gruppe enthaltende Seitenkette besitzt oder nicht.
  • Außerdem wird genauer gesagt der Kondensationsschritt des Oligosids mit dem intermediären Molekül unter Erhalt eines Glykosylamin-Derivats ebenso wie der Acylierungsschritt des Glykosylamin-Derivats in Gegenwart von zweckmäßigen organischen Lösungsmitteln durchgeführt.
  • Einer der Vorteile der Verwendung eines organischen Lösungsmittels ist insbesondere die Möglichkeit, Peptide und schlecht oder sehr schlecht in Wasser lösliche Derivate mit Oligosiden zu verknüpfen.
  • Diese Fälle können auf folgende Weise schematisiert werden:
  • 1) Das intermediäre Molekül besitzt keine Seitenkette mit einer funktionellen Gruppe
  • wobei R&sub1;, das einen Rest eines organischen Moleküls darstellt, keine geschützte funktionelle Gruppe umfasst oder R&sub1; gleichfalls H darstellen kann;
  • R&sub2;, das einen Rest eines organischen Moleküls wie -CO-R&sub2; darstellt, entweder ein Ester oder ein Amid ist:
  • R&sub3;, das einen Rest eines organischen Moleküls darstellt, vorzugsweise keine freie funktionelle Gruppe umfasst.
  • Die Einheit R&sub3;-CO&sub2;H + Aktivator kann ersetzt werden durch das aktivierte Produkt oder durch ein Anhydrid.
  • Aufgrund des Vorstehenden kann auch der Fall eingeschlossen sein, in dem R&sub3; eine funktionelle Gruppe besitzt und in diesem Zusammenhang sei auf den nachstehenden Absatz 1 bis verwiesen.
  • 1 bis) Das intermediäre Molekül besitzt keine Seitenkette, die eine funktionelle Gruppe enthält, aber das Acylierungsmittel ist bifunktionell,
  • R&sub3;, das ein organisches Molekül darstellt, umfasst eine zweite, funktionelle Gruppe wie insbesondere freies oder geschütztes SH oder -CO&sub2;H.
  • Alternativ kann die Einheit R&sub3;-CO&sub2;H + Aktivator ersetzt werden durch das Aktivierungsprodukt: R&sub3;-CO-aktiviert.
  • Beispielsweise R&sub3;-CO-Cl, (R&sub3;-CO)&sub2;O oder
  • oder auch ein zyklisches Anhydrid:
  • wobei n z. B. eine ganze Zahl von 1, 2, 3 oder 4 ist; oder auch ein Thioester:
  • wobei n eine ganze Zahl von 1, 2, 3, oder 4, vorzugsweise 2 ist.
  • Wenn die Acylierung des mit dem Oligosid verbundenen Stickstoffs mit einem zyklischen Anhydrid durchgeführt wird, ist das erhaltene Produkt vom Typ: Oligosyl-N-(CO-CH&sub2;-(CH&sub2;)n- CO&sub2;H)-CH(R&sub1;)-CO-R&sub2;
  • Die Carboxylgruppe ist für eine Kopplungsreaktion mit einem organischen Molekül oder einer Matrix oder einem Partikel verwendbar, welches eine funktionelle Gruppe (Hydroxyl oder Amin bspw.) besitzt.
  • Wenn die Acylierung des mit dem Oligosid verknüpften Stickstoffs durch einen zyklischen Thioester durchgeführt wird, ist das erhaltene Produkt vom Typ: Oligosyl-N-(CO-CH&sub2;-(CH&sub2;)n- SH)-CH(R&sub1;)-CO-R&sub2;
  • Die Thiolgruppe ist für eine Kopplungsreaktion mit einem löslichen oder nicht-löslichen Molekül verwendbar, welches durch ein Thiol substituiert werden kann, bspw. ein Dithiopyridin oder ein Maleinimid-Derivat.
  • 2) Das intermediäre Molekül besitzt eine funktionelle Seitenkette und man führt keine Zyklisierung durch.
  • R&sub2; und R&sub3; besitzen die vorstehend angegebenen Bezeichnungen und R&sub4; stellt einen Rest eines organischen Moleküls dar, welches eine funktionelle Gruppe besitzt, insbesondere eine Carboxylgruppe, R&sub4; stellt insbesondere CH&sub2;-CH&sub2;-CO&sub2;H dar.
  • In diesem Fall verwendet man vorzugsweise ein Aktivierungsprodukt von R&sub3;-CO&sub2;H, wie es vorstehend definiert ist.
  • Die funktionelle Gruppe, die in R&sub4; enthalten ist, ist einsetzbar für eine Kondensationsreaktion oder eine Substitutionsreaktion mit einem löslichen oder nicht-löslichen Molekül oder mit einer Matrix oder einem Partikel, welche(s) eine Gruppe umfasst, die eine kovalente Bindung mit der funktionellen Gruppe R&sub4; ergeben kann, bspw. eine Aminogruppe, wenn R&sub4; eine Carboxylgruppe umfasst.
  • 3) Das intermediäre Molekül besitzt eine Seitenkette, die eine funktionelle Carboxylgruppe enthält und man führt eine Zyklisierung durch und man kann das Molekül mit einem oder zwei Molekül(en), einer Matrix (mehreren Matrizen) oder einem Partikel (mehreren Partikeln) verknüpfen,
  • R&sub2; besitzt die vorstehend angegebene Bezeichnung,
  • R&sub5;-CO&sub2;H ist ein Rest eines organischen Moleküls wie -(CH&sub2;)n-CO&sub2;H n ist eine ganze Zahl von 1 bis 10, vorzugsweise 2 oder 3.
  • Das so erhaltene Glykopeptid kann eingesetzt werden durch Umsetzung von R&sub2; mit einer funktionellen Gruppe, die in freiem Zustand oder transformiert zu einer aktiven Gruppe vorliegt. Wenn R&sub2; z. B. die Gruppe Paranitroanilin darstellt, wird die Gruppe NO&sub2; zu NH&sub2; reduziert, dann in Isothiocyanat -N=C=S übergeführt, das ein herausragendes Reagenz gegenüber Aminen und Alkoholen ist.
  • Als Beispiele für intermediäre Moleküle können genannt werden:
  • mit n = 1 bis 10.
  • Die Erfindung betrifft gleichfalls die Herstellung von erfindungsgemäßen Verbindungen, dadurch gekennzeichnet, dass man ein oder mehrere Produkte (acylierte Glykosylamin-Derivate) der Erfindung umsetzt, die entweder aufweisen eine aktivierte oder aktivierbare Gruppe R, wie vorstehend definiert, oder eine Gruppe B', die eine aktivierte oder aktivierbare funktionelle Gruppe enthält, oder eine Gruppe Ai, die eine funktionelle Gruppe enthält, welche mit einem eine funktionelle Gruppe enthaltenden Molekül, einer Matrix oder einem Partikel P, P' oder P" reagieren können, um ein Produkt des folgenden Typs zu erhalten:
  • (Glykopeptidyl-R)n-P, (Glykopeptidyl-B')n-P' oder (Glykopeptidyl-Ai)n-P", wobei n größer oder gleich 1 ist.
  • Die Erfindung betrifft gleichfalls die Herstellung von erfindungsgemäßen Verbindungen, dadurch gekennzeichnet, dass man ein oder mehrere Produkte der Erfindung (acylierte Glykosylamin-Derivate), die sowohl eine aktivierte oder aktivierbare Gruppe R, wie vorstehend definiert, als auch eine Gruppe B', die eine aktivierte oder aktivierbare Gruppe enthält oder eine Gruppe Ai tragen, die eine funktionelle Gruppe enthält, mit Molekülen, Matrizen oder Partikeln P und P' oder Molekülen, Matrizen oder Partikeln P und P" umsetzt.
  • Die Erfindung betrifft gleichfalls die Herstellung von erfindungsgemäßen Verbindungen, dadurch gekennzeichnet, dass man ein oder mehrere Produkte der Erfindung (acylierte Glykosylamin-Derivate), die sowohl eine aktivierte oder aktivierbare Gruppe R, wie vorstehend definiert, als auch eine Gruppe B', die eine aktivierte oder aktivierbare Gruppe enthält und eine Gruppe Ai tragen, die eine funktionelle Gruppe enthält jeweils mit Molekülen, Matrizen oder Partikeln P, P' und P" umsetzt.
  • Die Moleküle, Matrizen oder Partikel, die bei der Herstellung der erfindungsgemäßen Verbindungen verwendet werden, können vorteilhafterweise ein natürliches oder synthetisches Molekül sein, das in einem organischen, wässrigen oder wässrigorganischen Lösungsmittel löslich oder unlöslich ist, ein Nanopartikel, ein Lipidvesikel, eine in einem organischen, wässrigen oder wässrig-organischen Lösungsmittel unlösliche Matrix, ein Protein, ein Lipid, eine Nukleinsäure, eine Oligonukleotid, ein Polylysin, ein in einem organischen, wässrigen oder wässrig-organischen Lösungsmittel unlösliches Polymer, eine Latex- oder Goldkugel, etc.
  • Genauer gesagt wird bei dem erfindungsgemäßen Verfahren das Oligosid, das eine freie reduzierende Ose aufweist, in ein zweckmäßiges Lösungsmittel, Dimethylsulfoxid, N- Methylpyrrolidon oder Dimethylformamid bspw. in Gegenwart einer äquivalenten Menge oder zweier äquivalenter Mengen eines Ausgangsmoleküls, ausgewählt aus einer natürlichen oder synthetischen Aminosäure, einem Peptid, einem Aminosäuren- Derivat oder einem Peptid-Derivat gegeben.
  • Als zweckmäßiges Lösungsmittel bezeichnet man ein solches, das einerseits die zu kondensierenden Verbindungen lösen kann und andererseits die kondensierten Verbindungen lösen kann.
  • Das Hauptprodukt der Reaktion ist ein Kondensationsprodukt vom Typ Glykosylamin-Derivat: die reduzierende terminale Ose konserviert dessen zyklische Struktur, die Hydroxylgruppe des Semiacetals wird ersetzt durch das α-Amin der Aminosäure des Aminosäuren-Derivats oder der Aminosäure in N-terminaler Position eines Peptids oder eines Peptid-Derivats.
  • Zu einem zweiten Zeitpunkt wird das so gebildete Glykosylamin- Derivat durch Addition einer aktivierten organischen Säure oder im Fall einer α-Aminosäure mit einer eine funktionelle Gruppe enthaltenden Seitenkette wie einer Carboxyl-Seitenkette wie im Fall der Glutaminsäure oder seiner Homologen durch Zugabe eines Aktivators der Carboxylgruppe acyliert.
  • Das so gebildete Produkt ist ein N-acyliertes Glykosylamin- Derivat.
  • Die acylierten Glykosylamin-Derivate werden durch Molekularsiebohromatografie oder jede andere klassische Reinigungstechnik, die dem Fachmann bekannt ist, isoliert.
  • Die acylierten Glykosylamin-Derivate werden dann für die Substitution einer Verbindung (Protein, Lipid, Nukleinsäure, Oligonukleotid, Polylysin, unlösliches Polymer, Latexkugel, Goldkugel, etc.) eingesetzt.
  • Man zieht einen Teil der Aminosäurenfraktion oder des Peptids oder eines Peptidsubstituenten heran, um die Kondensationsreaktion durchzuführen, so dass das Oligosid seine gesamten Eigenschaften und seine Verfügbarkeit als Substrat oder als Erkennungssignal beibehält.
  • Gemäß dem folgenden allgemeinen Schema:
  • Beispielsweise verläuft die Kondensation von Lactose mit Glycylparanitroanilin wie folgt:
  • Galβ4Glc + NH&sub2;-CH&sub2;-CO-NH-pC&sub6;H&sub4;-NO&sub2; Galβ4Glcβ-NH-CH&sub2;-CO-NH-pC&sub6;H&sub4;-NO&sub2;
  • Die Zugabe der Essigsäure und eines Aktivators der organischen Säure führt zu:
  • In dem gewählten Beispiel kann die Nitrogruppe quantitativ zu Amin reduziert werden, dann wird das Amin quantitativ in Isothiocyanat übergeführt (gemäß Roche et al. 1983, G. Cell Biochem. 22, 131-140, Monsigny et al. 1984, Biol. Cell 21, 187-196).
  • Die so aktivierte Verbindung kann in leicht alkalischem Medium mit einem Amin eines Proteins, eines Lipids, eines Polymers (Polylysin bspw.), eines Aminogruppen umfassenden festen Trägers oder eines mit einem Amin substituierten Oligonukleotids oder auch mit einem Amin eines Moleküls oder eines zweckmäßigen Körpers wie NH&sub2;P umgesetzt werden.
  • Man kann bspw. das folgende Reaktionsschema aufstellen:
  • Wenn die Aminosäure oder das Derivat eine α-Aminosäure ist, die eine eine Carboxylgruppe enthaltende Seitenkette besitzt, wie im Fall von Glutamat, verläuft bspw. folgende Reaktion:
  • Die Zugabe eines Aktivators der Carboxylgruppe führt zum beabsichtigten Produkt:
  • Analog könnte diese Verbindung aktiviert und mit einem Amin NH&sub2;-P umgesetzt werden, um das Endprodukt zu ergeben:
    • Beispiele Beispiel 1 Herstellung eines acylierten Glykosylamin-Derivats: N- Acetyllactosyl-β-glycyl-pNA.
  • Das Glycylparanitrophenylamid (0,1 mmol) und Lactose (0,1 mmol) werden in ein 1 ml Dimethylsulfoxid gelöst.
  • Die Lösung wird 48 Stunden lang bei 50ºC gehalten. Man gibt 0,1 mmol Gly-pNA (pNA = Paranitroanilin) in 0,5 ml Dimethylsulfoxid nach 12 h, 24 h und 36 h zu. Man kühlt auf 25ºC ab.
  • Dann werden 0,44 mmol an BOP, Benzotriazolyl-1-yltris(dimethylamino)phosphoniumhexafluorphosphat und 0,44 mmol Diisopropylethylaminacetat zugegeben und 3 Stunden bei 25ºC gerührt.
  • Das erhaltene Produkt wird durch ein Molekularsieb auf einer Ultrogelsäule GF05 (90 cm · 2,3) gereinigt, wobei man 0,1 M Essigsäure, die 3% n-Butanol enthält, als Lösungsmittel einsetzt; vor der Injektion löst man die Reaktionsprodukte durch Zugabe von 7,5 ml Chromatografie-Lösungsmittel.
  • Das erhaltene Produkt verlässt den Kopf, gefolgt von überschüssigem Reaktanten und Dimethylsulfoxid.
  • Das Produkt N-Acetyl(lactosylβ)-gly-pNA wird durch Lyophilisierung der von der Kolonne eluierten Lösung erhalten.
    • Beispiel 2 Herstellung eines intramolekular acylierten Glykosylamin- Derivats: N-Lactosylβ-pyroglu-pNA.
  • α-Glutamylparanitroanilin (Glu-pNA) (0,1 mmol) und Lactose (0,1 mmol) werden in 1 ml Dimethylsulfoxid gelöst. Die Lösung wird 48 Stunden lang bei 50ºC gehalten. Dann werden 0,1 mmol Glu-pNA gelöst in 0,5 ml Dimethylsulfoxid nach 12 h, 24 h und 36 h zugegeben. Dann kühlt man auf 25ºC ab.
  • Nun werden 0,44 ml BOP zugegeben und 3 h bei 25ºC gerührt.
  • Das erhaltene Produkt wird bei den gleichen Bedingungen wie in dem vorstehenden Beispiel gereinigt.
    • Beispiel 3
  • Herstellung einer organischen Verbindung, deren Amino- Seitenkette eine funktionelle Gruppe enthält und Verwendung der funktionellen Gruppe zur Bildung eines Konjugats mit einem Oligonukleotid. Das Oligosid wird in Gegenwart von 2 bis 4 Äquivalenten des S- (Thio-2-pyridin)cysteinyl-paranitroanilin-Derivats
  • gelöst in N-Methylpyrrolidon (oder in Dimethylsulfoxid oder N- Dimethylformamid) und in Gegenwart von 4 Äquivalenten Imidazol während 20 h bei 50ºC inkubiert. Die Lösung wird auf 25ºC abgekühlt. Dann werden 10 Äquivalente Essigsäure, Imidazol und BOP zugegeben. Die Acylierungsreaktion wird eine halbe Stunde lang durchgeführt.
  • Das Glykopeptid wird durch Molekularsiebohromatografie (bspw. Ultrogelsäule GF05) in 0,1 M Essigsäure isoliert. Die das gereinigte Glykopeptid enthaltende Fraktion wird eingefroren und lyophilisiert.
  • Das in einem 0,1 M Natriumacetatpuffer mit pH 6 gelöste Glykopeptid wird durch Zugabe eines Äquivalents TCEP (Tris- Carboxyethylphosphin) 30 Minuten lang bei 25ºC reduziert (siehe K. Arar et al., 1993, Tetrahedron Letters 34, 8087-8090, J. A. Burns et al., 1991, J. Org. Chem., 56, 2648-2650). Dann wird ein Äquivalent eines Oligonukleotids zugegeben, das an seinem 5'-Ende durch einen Substituenten mit terminaler Dithio-2- pyridin-Gruppe substituiert ist.
  • Das gebildete Konjugat aus Glykopeptid und Oligonukleotid besitzt die folgende allgemeine Struktur:
  • in der X NH-p-C&sub6;H&sub4;-NO&sub2; darstellt und 5' den Arm darstellt, der das erste S des Dithio-2-pyridins mit dem primären Hydroxyl des ersten Nukleotids des Oligonukleotids verbindet.
    • Beispiel 4 Herstellung von Lactosyl-pyroglutamyl-paranitroanilin (in Dimethylsulfoxid).
  • Die Lactose Galβ4Glc (0,15 mmol) wird in 1,25 ml Dimethylsulfoxid (CH&sub3;-SO-CH&sub3;) gelöst. 0,30 mmol Glu-pNA in 1,25 ml Dimethylsulfoxid enthaltend 0,6 mmol Imidazol (pNA = Paranitroanilin) werden zugegeben. Die Lösung wird 20 h lang bei 50ºC gehalten, dann auf 25ºC abgekühlt. Mehr als 95% der Lactose wird in Glykopeptid übergeführt: Lactosyl-Glu-pNA.
  • 0,33 mmol BOP und 0,6 mmol Imidazol werden zugegeben. Die Lösung wird 30 Minuten lang bei 25ºC gerührt. Mehr als 95% des Glykopeptids wird zu Lactosyl-pyroglutamyl-paranitroanilin zyklisiert: Galβ4GlcβpGlu-pNA pGlu: Pyroglutamyl-Rest
    • Beispiel 5 Herstellung von Lactosyl-pyroglutamyl-p-nitroanilin (in N- Methylpyrrolidon).
  • Die Lactose Galβ4Glc (0,15 mmol) wird in 1,25 ml N- Methylpyrrolidon der Formel:
  • gelöst.
  • Man gibt 0,3 mmol Glu-pNA in 1,25 mmol N-Methylpyrrolidon enthaltend 0,6 mmol Imidazol zu. Die Lösung wird 20 h lang bei 50ºC gehalten, dann auf 25ºC abgekühlt. Mehr als 95% der Lactose wird in Glykopeptid übergeführt: Lactosyl-glu-pNA. Man gibt 0,33 mmol BOP und 0,6 mmol Imidazol zu. Die Lösung wird 30 Minuten lang bei 25ºC gerührt. Mehr als 95% des Glykopeptids wird zu Lactosyl-pyroglutamyl-p-nitroanilin zyklisiert.
  • Die Analysen werden mit Hochdrucksäulenchromatografie in einem Dionex-Gerät, ausgestattet mit einem amperometrischen Detektor durchgeführt. Die Ausbeuten werden in Bezug auf einen internen Standard (Sorbitol) berechnet, der der ursprünglichen Lösung der Lactose zugegeben wurde.
  • Die Retentionszeiten der Verbindungen bei den Standardbedingungen, ausgedrückt in Minuten, sind:
  • Lactose: 9,9 ± 0,1
  • Lactosyl-Glu-pNA: 21,4 ± 0,1
  • Lactosyl-p-Glu-p-NA: 16,2 ± 0,1
  • Imidazol: 4,3 ± 0,1
  • Sorbitol: 2,7 ± 0,1 Beispiel 6 Herstellung einer Verbindung der Formel:
  • Die Herstellung kann gemäß dem folgenden Reaktionsschema durchgeführt werden.
  • Das nachstehend angegebene Ausgangsprodukt kann erhalten werden wie vorstehend im Zusammenhang mit der Herstellung der erfindungsgemäßen Produkte angegeben wurde.
  • n stellt eine ganze Zahl größer oder gleich 0 dar und
  • Ri: Aminosäuren-Seitenkette
  • Das gewählte Beispiel entspricht der Herstellung eines Oligonukleotid-Derivats, wobei das Derivat eine biologische Aktivität in Bezug auf die gewählte Oligonukleotidsequenz besitzt (das Oligonukleotid in Leserichtung, in Gegenrichtung, Antigen, Fänger, etc. ist spezifisch für ein zelluläres oder virales Element vom Nukleinsäure- oder Proteintyp), das Oligosid ermöglicht die selektive Wiedererkennung des Derivats durch bestimmte Zellen, die einen Membranrezeptor (Lectin) besitzen und der eine Affinität für das gewählte Oligosid besitzt, das Peptid ermöglicht es dem Derivat, wenn es einmal in das Innere der Endosomen (intrazelluläre Vesikel) aufgrund des Endocytose-Mechanismus, der den Membranlectinen eigen ist, vorgedrungen ist, in die Zytosolkompartimente und schließlich in den Zellkern einzudringen.
  • Das Oligonukleotid ist ein Oligomer, das zwischen 10 und 40 Nukleotide, vorzugsweise 20 bis 25 Nukleotide umfasst. Das Oligopeptid ist ein Oligomer, das zwischen 20 und 40 Aminosäuren, vorzugsweise 20 bis 25 Aminosäuren umfasst. Diese Art der Derivate entspricht einer Reihe von Verbindungen, die als Medikamente verwendet werden können. Beispiel 7 Herstellung einer Verbindung der Formel:
  • Die Herstellung der Verbindung kann gemäß dem folgenden Reaktionsschema ablaufen:
  • Das gewählte Beispiel entspricht der Herstellung eines fluoreszierenden Glykopeptid-Derivats mit allgemeiner Verwendung.
  • Der Fluoresceinrest ermöglicht die Verwendung der Glykopeptide zum Zwecke der Lokalisierung, Visualisierung, in allgemeiner Art, für analytische Zwecke, insbesondere für die Fluoreszenzmikroskopie.
  • Das fluoreszeierende Glykopeptid-Derivat, das an ein Oligonukleotid gebunden ist, kann gleichfalls als antivirales Mittel oder Anti-Krebsmittel verwendet werden, um gleichzeitig eine Untersuchung der biologischen Aktivität des Derivats und seiner intrazellulären Zirkulation ebenso wie dessen Pharmakokinetik im Tier zu ermöglichen.
  • In diesem Beispiel ist die Disulfidbrücke in der Ausgangsverbindung in einem Rest Ai der allgemeinen Formel vorhanden. Beispiel 8 Herstellung einer Verbindung der Formel:
  • Das im Zusammenhang mit dem Glykopeptid-Derivat des Beispiels 7 Gesagte trifft auch auf dieses Beispiel zu. Es sei bemerkt, dass in dem hier betrachteten Beispiel 8 die Disulfidbrücke in der Ausgangsverbindung in der Z-Kette der allgemeinen Formel vorliegt.
    • Beispiel 9 Herstellung von glykosylierten Derivaten von gluconoyliertem Polylysin.
  • Das gluconoylierte Polylysin wird verwendet, um Gene in tierische Zellen überzuführen. Die Substitution des gluconoylierten Polylysin durch ein oder mehrere Glykopeptide ermöglicht den Transfer von ausgewählten Genen.
  • Die glykosylierten Derivate des gluconoylierten Polylysins dringen vorzugsweise (100 bis 1.000 mal) in Zellen ein, die auf ihrer Oberfläche ein Lectin (Oligosid-Rezeptor) exprimiert haben, der das Oligosid des Glykopeptids, welches mit dem gluconoylierten Polylysin verbunden ist, spezifisch erkennt.
    • a) Bindung eines Glykopeptids an das gluconoylierte Polylysin über eine Disulfidbrücke.
  • Das gluconoylierte Polylysin (Polymerisationsgrad 190; Gehalt 60 gluconoylierte Reste) wird durch ein Dithiopyridin-Derivat substituiert; das Polymer (20 mg; 0,33 umol) wird in 0,5 ml Dimethylsulfoxid gelöst.
  • 1 umol (312 ug) N-Succinimidyl-3-(2-pyridyldithio)propionat und 20 umol (3,6 ul) Diisopropylethylamin werden zugegeben. Die Lösung wird 15 h lang bei 20ºC gerührt. Das Polymer wird durch Zugabe von 10 Volumenteilen Isopropanol ausgefällt; der Niederschlag wird nach Zentrifugieren (1.800 g, 15 Minuten) wiedergewonnen.
  • Nach Waschen mit Isopropanol wird das Polymer in einen 0,1 M Natriumphosphatpuffer mit pH = 7,2 (1 ml) gelöst.
    • Das Glykopeptid: Oligosylpyroglutamylamidoethyldithiopyridin:
  • Galβ4Glcβ-pyroglutamyl-NH-(CH&sub2;)&sub2;-S-S-pyridin (1 umol) wird mit 1 umol TCEP (Triscarboxyethylphosphin: P-(CH&sub2;-CH&sub2;-CO&sub2;&supmin;)&sub3;) in einem 0,1 M Natriumphosphatpuffer (1 ml) 1 h lang bei 20ºC behandelt. Diese Lösung wird einer Lösung von gluconoyliertem Polylysin zugegeben, das durch Pyridyldithiopropionat substituiert ist. Nach 1 h bei 20ºC wird das Polymer durch Zugabe von 10 Volumenteilen Isopropanol ausgefällt. Der Niederschlag wird nach Zentrifugieren (1.800 g, 15 min.) wiedergewonnen und in Isopropanol gewaschen, dann in Wasser gelöst und lyophilisiert.
  • Die Ausbeute der Kupplungsreaktion bei den eingesetzten Bedingungen ist gleich oder größer 90%.
  • Die verwendeten Reaktionen in dieser Zubereitung sind von denen abgeleitet, die in Midoux, P., Mendes, C., Legrand, A., Rammond, J., Mayer, R., Monsigny, M. & Roche, A. C., 1993: "Specific gene transfer mediated by lactosylated poly-l-lysine into hepatoma cells". Nucleic Acid Research, 21: 871-878, und in Arar, K., Monsigny, M., und Mayer, R., 1993: "Synthetis of oligonucleotide peptide conjugates containing a KDEL signal sequence". Tetrahedron Letters, 34: 8087-8090 beschrieben sind.
    • b) Bindung eines Glykopeptids an das gluconoylierte Polylysin über eine Thioharnstoffbindung.
  • Das gluconoylierte Polylysin (Polymerisationsgrad 190; Gehalt 60 gluconoylierte Reste) wird durch ein in Form von Phenylisothiocyanat aktiviertes Glykopeptid substituiert.
  • Das Glykopeptid Oligosylpyroglutamyl-p-nitroanilin wird zu einem p-Aminoanilin-Derivat reduziert, das anschließend zu einem p-Cyanatoanilin-Derivat aktiviert wird:
  • Galβ4Glcβ-Pyroglutamyl-NH-p-C&sub6;H&sub4;-NCS gemäß einer Vorschrift, die gegenüber der in Roche, A. C., Barzilay, M., Midoux, P., Junqua, S., Sharon, N. & Monsigny, M. (1983): "Sugar specific endocytosis of glycoproteins by Lewis lung carcinoma cells., J. Cell. Biochem., 22: 131-140 beschriebenen, angepasst wurde.
  • Das Cyanatoanilin-Derivat (1 umol) wird in Dimethylsulfoxid (1 ml), das 1 umol gluconoyliertes Polylysin und 4 umol Diisopropylethylamin enthält, gelöst. Die Lösung wird 24 h lang bei 20ºC gerührt. Das glykosylierte Polymer wird durch Zugabe von 10 Volumenteilen Isopropanol ausgefällt; der Niederschlag wird nach Zentrifugieren wiedergewonnen, mit Isopropanol gewaschen und schließlich in Wasser gelöst und lyophilisiert.
  • Bei den beschriebenen Bedingungen ist die Ausbeute der Kupplung des Glykopeptids mit dem gluconoylierten Polylysin größer als 95%.
    • Beispiel 10 Herstellung eines Glykopeptids (Oligosylpyroglutamyl-p- nitroanilin) in Dimethylformamid als Lösungsmittel.
  • α-Glutamyl-p-nitroanilin (0,2 mmol) und Lactose (0,1 mmol) werden in 1 ml Dimethylformamid in Gegenwart von 0,2 mmol Imidazol gelöst. Die Lösung wird 8 h lang bei 50ºC gehalten.
  • Man kühlt auf 25ºC ab und gibt 0,2 mmol BOP und 0,2 mmol Imidazol zu und wartet 30 Minuten. Bei diesen Bedingungen werden mehr als 95% des Ausganasosids in das Glykopeptid- Derivat übergeführt. Die Reinigung ist identisch zu der für andere Lösungsmittel beschriebenen.
    • Beschreibung der Figuren:
  • Die Fig. 1 stellt das Elutionsprofil von β-Lactosyl-pyroGlupNA dar, erhalten durch hochauflösende Anionenaustauschchromatografie.
  • Die Fig. 2 stellt das Elutionsprofil von LewisA/LewisX- pyroGlu-pNA dar, erhalten durch hochauflösende Anionenaustauschchromatografie.
    • Beispiel 11
  • Die Reinheit des in Beispiel 2 hergestellten Produkts (N- Lactosylβ-pyroGlu-pNA, das man nachstehend gleichfalls mit β- Lactosyl-pyroGlu-pNA bezeichnet) wurde durch hochauflösende Anionenaustauschchromatografie und mit amperometrischem Nachweis (HPAE-PAD) mit einem Gerät der Marke DIONEX überprüft.
  • Bei dieser Technik wird wie folgt vorgegangen:
  • Die Oside werden in alkalischem Medium (0,1 M Natriumcarbonat) in Form von Multialkoholaten ionisiert. Ihre Abtrennung auf einem kationischen Harz (immobilisierte Ammoniumionen) ist sehr wirksam. Die Detektion der Oside wird vorteilhafterweise durch ein amperometrisches Verfahren bei gepulstem Strom durchgeführt. Die verwendete Vorrichtung (DIONEX) wurde speziell zur Durchführung der Chromatografie in alkalischem Medium und für die amperometrische Detektion in Reihe konzipiert.
  • Die Retentionszeiten (tr) der verschiedener Produkte wurden charakterisiert (siehe Fig. 1):
    • Zu Fig. 1:
  • Die erste Kurve (in der Aufzeichnung beginnend von oben) entspricht der Injektion lediglich von Lactose,
  • die zweite Kurve entspricht der Injektion der Reaktionsmischung nach 12 h,
  • die dritte Kurve entspricht der Injektion der Reaktionsmischung nach 12 h + 30 Minuten Zyklisierung.
    • Beispiel 12 Herstellung eines intramolekular acylierten Glykosylamin- Derivats: LewisA/LewisX-pyroGlu-pNA
  • LewisA/LewisX (0,06 mmol) wird in 1 ml Dimethylformamid gelöst. 0,12 mmol Glu-pNA, dann 0,24 mmol Imidazol werden zugegeben. Die Lösung wird 15 h lang bei 50ºC gehalten. Die Stabilisierung des Glykopeptids erreicht man, indem das Reaktionsmedium bei 20ºC gehalten wird und 0,13 mmol BOP und 0,24 mmol Imidazol zugegeben werden. Nach 30 Minuten ist das Glykopeptid zu LewisA/LewisX-pyroGlu-pNA zyklisiert. Der Reaktion folgt das HPAE-PAD.
    • Synthese von LewisA/LewisX-pyroGlu-pNA. Elutionsprofile mit DIONEX.
  • Die Retentionszeiten (tr) der verschiedenen Produkte wurden charakterisiert (siehe Fig. 2):
    • Zu Fig. 2:
  • Die erste Kurve (in der Aufzeichnung beginnend von oben) entspricht der Injektion der Reaktionsmischung nach 15 Minuten,
  • die zweite Kurve entspricht der Injektion der Reaktionsmischung nach 15 h, und
  • die dritte Kurve entspricht der Injektion der Reaktionsmischung nach 15 h + 30 Minuten Zyklisierung.
    • Reinigung des Glykopeptids
  • Nach der vorstehend beschriebenen Synthese wird die Reinigung in zwei Schritten durchgeführt:
  • Durch Molekularsiebohromatografie auf einer Trisacryl-GF05- Säule (100 cm · 2,3 cm) mit einem Durchsatz von 10 ml/h, eluiert mit einer wässrigen Lösung enthaltend 0,1 M Essigsäure und 3% n-Butanol; dieser erste Schritt ermöglicht die Eliminierung der Oligosaccharide, die nicht reagiert haben ebenso wie des Überschusses an BOP = Benzotriazolyl-oxy- tris(dimethylamino)phosphoniumhexafluorophosphat und von GlupNA.
  • Durch Ausfällung mit Ethanol (90%), wobei die Probe 24 h lang bei 4ºC gehalten wird; dieser zweite Schritt ermöglicht die Eliminierung des Überschusses an Imidazol.
  • Der Reinigung folgt die HPAE-PAD.
  • In Bezug auf Fig. 2 entspricht die vierte Kurve der Injektion des Produkts LewisA/LewisX-pyroGlu-pNA, gereinigt durch Molekularsiebohromatografie, gefolgt von einer ethanolischen Ausfällung (tr: 17,4/17,6).
    • Charakterisierung des Glykopeptids (LewisA/LewisX-pyroGlu-pNA)
  • Eine ¹H-NMR-Analyse bei 300 MHz wurde durchgeführt.
  • Das LewisA/LewisX-pyroGlu-pNA wird in D&sub2;O (6 · 10&supmin;³ Mol/l) gelöst. LewisA besitzt eine terminale Galactose, die an Position 3 und eine terminale Fucose, die an Position 4 an das N-Acetylglucosamin gebunden ist. LewisX besitzt eine terminale Galactose, die in Position 4 und eine terminale Fucose, die in Position 3 an das N-Acetylglucosamin gebunden ist. Die Auswertung des Spektrums ermöglichte die Identifizierung einer bestimmten Anzahl von charakteristischen Protonen.
  • - Zwei Glykopeptiden gemeinsam: 8,33 und 7,79 (4H, 2d, aromatisches H); 4, 90 (2H, m, H5 α Fuc); 4, 67 (1H, d, J1/2, 7,32 Hz, H1 βGlcNAc); 4,37 (1H, d, J1/2 7,42 Hz, H1 βGalint); 4,16 (1H, s, H4 βGalint); 2,83 (2H, m, γCH&sub2; pyroGlu); 2,33 (2H, m, β und β'CH&sub2; pyroGlu); 2,05 und 2,04 (6H, 25, CH&sub3; Ac GlcNAc); 1,22 und 1,21 (6H, 25, CH&sub3; Fuc);
  • - spezifisch für LewisA: 5,05 (1H, d, H1 αFuc); 4,53 (1H, d, H1 βGal)
  • - spezifisch für LewisX: 5,24 (1H, d, J1/2, 7,2 Hz, H1 αFuc); 4,50 (1H, d, H1 βGal).
    • Beispiel 13
  • Wie in Beispiel 12 angegeben, wurde LewisB-pyroGlu-pNA und OligOH-pyroGlu-pNA hergestellt.
  • Nachstehend wird die Analyse der erhaltenen Glykopeptide wiedergegeben, worin diejenige für β-Lactosyl-pyroGlu-pNA (N- Lactosylβ-pyroGlu-pNA) und für LewisA/LewisX-pyroGlu-pNA enthalten ist.
    • Analyse der Glykopeptide (Gerät: DIONEX)
  • Trennung durch Anionenaustauschchromatografie. CarboPac-Säule PA1 (4 · 250 mm). Durchsatz: 1 ml/min. Detektion durch gepulste Amperometrie. Durchführung bei Umgebungstemperatur.
  • Zur guten Trennung greift man zurück auf einen Natriumacetatgradienten:
    • Retentionszeit in Minuten:
  • Imidazol: 4,4 ± 0,1
  • Lactose: 10,0 ± 0,1
  • β-Lactosyl-Glu-pNA: 27,5 ± 0,1
  • β-Lactosyl-pyroGlu-pNA: 22,9 ± 0,1
  • Imidazol: 4,5 ± 0,1
  • LewisA/LewisX: 8,9 - 9,4 ± 0,1
  • LewisA/LewisX-Glu-pNA: 22,5/22,7 ± 0,1
  • LewisA/LewisX-pyroGlu-pNA: 17,4/17,6 ± 0,1
  • Imidazol: 4,4 ± 0,1
  • LewisB: 7,3 ± 0,1
  • LewisB-Glu-pNA: 19,7 ± 0,1
  • LewisB-pyroGlu-pNA: 16,6 ± 0,1
  • Imidazol: 4,5 ± 0,1
  • OligoH: 8,2/8,7 ± 0,1
  • OligoH-Glu-pNA: 23,8 ± 0,1
  • OligOH-pyroGlu-pNA: 18,9 ± 0,1

Claims (20)

1. Verbindungen, umfassend ein oder mehrere Oligoside, wobei jedes der Oligoside über ein Zwischenmolekül, das aufweist ein an ein Kohlenstoffatom in α-Stellung einer C=O- Gruppe gebundenes Stickstoffatom, wobei das Stickstoffatom N-acyliert ist, und eine oder mehrere funktionelle Gruppen, insbesondere eine, zwei oder drei, kovalent an ein oder mehrere Moleküle, Matrizen oder Partikel gebunden ist, vorzugsweise an eines, zwei oder drei, wobei jene eine Matrix als Träger für die Affinitätschromatographie; eine Gold-, Latexkugel für die Histologie und Zytologie; ein Protein, ein Lipid, Oligonukleotide oder auch Polymere für die Zielerkennung von Medikamenten, Oligonukleotiden oder Genen, darstellen, wobei sich die kovalente Bindung zwischen dem Zwischenmolekül und dem Oligosid durch die Verbindung über das Stickstoffatom ergibt und sich die kovalente Bindung zwischen dem Zwischenmolekül und dem Molekül, der Matrix, dem Partikel oder den Molekülen, den Matrizen, den Partikeln durch die Verbindung über die funktionelle(n) Gruppe(n) des Zwischenmoleküls mit geeigneten funktionellen Gruppen auf dem (den) Molekül(en), der (den) Matrix (Matrizen) oder dem (den) Partikel(n) ergibt.
2. Verbindungen der allgemeinen Formel (I)
in der:
a = 0 oder 1,
j = 0 oder 1,
b = 0 oder 1,
p = 2 bis 4, insbesondere 2, ist,
mit der Maßgabe, daß a = b = 0 ist, falls j = 1 ist, was das Vorliegen eines cyclischen Moleküls bedeutet, bzw. daß a = b = 1 ist, falls j = 0 ist, was die Abwesenheit der (CH&sub2;)p-Gruppe impliziert,
D einen Rest einer organischen Säure der Formel D(CO&sub2;)H, insbesondere H oder eine Alkylkette mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen, insbesondere CH&sub3;, darstellt,
Z B, wobei B H, eine Alkylgruppe mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen oder eine Seitenkette einer natürlichen oder synthetischen α-Aminosäure, wie CH(CH&sub3;)&sub2;, CH&sub2;OH, CH&sub3;, und vorzugsweise H ist, oder
B'-P' darstellt, wobei B' eine Alkylidenkette mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen oder eine Seitenkette einer natürlichen oder synthetischen α-Aminosäure ist, wobei die Ketten eine freie oder geschützte, vorzugsweise geschützte Gruppe enthalten, die von einer funktionellen Gruppe abgeleitet ist, die aktiviert sein kann, wie Carboxyl, SH, OH oder Amin, und P' die nachstehend gezeigten Bedeutungen besitzt, X die Gruppe
oder die Gruppe
oder die Gruppe
darstellt,
m eine Zahl von 0 bis 10, vorzugsweise von 0 bis 5 und vorteilhaft 1 oder 2 ist, k = 0 oder 1 ist, Q OH, OCH&sub3;, OCH&sub2;-C&sub6;H&sub5;, O-C&sub6;H&sub5;, O-C&sub6;F&sub5;, O-pC&sub6;H&sub4;-NO&sub2;,
darstellt,
R eine Gruppe, umfassend eine Alkohol-, Phenol-, Thiol- oder Amin-Funktion, darstellt,
P wie nachstehend definiert ist,
Ai ein organischer Rest, wie eine Alkylidenkette mit 1 bis Kohlenstoffatomen, insbesondere (CH&sub2;)n-W-(CH&sub2;)n- darstellt, wobei n + n' eine ganze Zahl von 0 bis 10 darstellt, W CHY darstellt, Y H, eine lineare oder verzweigte Alkylgruppe mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, ein Rest einer natürlichen oder synthetischen α-Aminosäure ist oder W eine aromatische Verbindung, insbesondere Phenol, darstellt,
wobei P, P' und P" identisch oder verschieden sind und darstellen:
- eine Matrix als Träger für die Affinitätschromatographie;
- eine Gold-, Latexkugel für die Histologie und Zytologie;
- ein Protein für die Sichtbarmachung, die Reinigung, insbesondere 1) von spezifischen Osidrezeptoren, die Lectine, Adhesine, Agglutinine usw. genannt werden, oder auch 2) von Proteinen mit oder ohne enzymatischer Aktivität, die Affinität für die Oside aufweisen, insbesondere Glycosyltransferasen wie die Sialyltransferase, Sulfotransferasen, Phosphotransferasen, Exoglycosidasen oder Endoglycosidasen;
- ein Lipid für die Charakterisierung der vorstehenden Rezeptoren;
- Oligonukleotide für die selektive Erhöhung ihrer Bindung durch die Zielzellen;
- ein Protein oder Polymere für die Zielerkennung von Medikamenten, Oligonukleotiden oder Genen, wobei P, P' und P" mindestens eine Funktion besitzen, die eine Kondensationsreaktion durch Umsetzung mit einem Oligopeptid erlaubt, beispielsweise
- eine Aminfunktion (-NH&sub2;), die die Bildung eines Amids mit einem aktiven Ester, eines Amidins mit einem Imidat, eines Thioharnstoffs mit einem Isothiocyanat erlaubt,
- eine Thiolfunktion (-SH), die die Bildung einer Disulfidbrücke mit einem ein Thiol enthaltenden Oligopeptid, eines Thioethers mit einem eine Maleinimid- oder eine Halogenalkyl- oder eine Halogenalkanoylgruppe enthaltenden Oligopeptid erlaubt, oder
- ein Phenol (-C&sub6;H&sub4;OH), das die Bildung einer Azoverbindung mit einem eine Diazogruppe enthaltenden Oligopeptid erlaubt, mit der Maßgabe, daß Z B'-P' darstellt und/oder X P und/oder P" in seiner Formel enthält.
3. Verbindungen nach einem der Ansprüche 1 oder 2 mit der allgemeinen Formel (II)
in der
a = 0 oder 1,
j = 0 oder 1,
b = 0 oder 1,
p = 2 bis 4, insbesondere 2, ist,
mit der Maßgabe, daß a = b = 0 ist, falls j = 1 ist, was das Vorliegen eines cyclischen Moleküls bedeutet, bzw. daß a = b = 1 ist, falls j = 0 ist, was die Abwesenheit der (CH&sub2;)p-Gruppe impliziert,
D einen Rest einer organischen Säure der Formel D(CO&sub2;)H, insbesondere H oder eine Alkylkette mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen, insbesondere CH&sub3;, darstellt,
B H, eine Alkylgruppe mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen oder eine Seitenkette einer α-Aminosäure wie CH(CH&sub3;)&sub2;, CH&sub2;OH, CH&sub3;, und vorzugsweise H, darstellt,
X entweder die Gruppe [-NH-(Ai)-CO]m-P
oder die Gruppe [-NH-(Ai)-CO]m-R-P darstellt,
m eine Zahl von 0 bis 10, vorzugsweise von 0 bis 5 und vorteilhaft 1 oder 2 ist, R und P wie nachstehend definiert sind,
Ai einen organischen Rest, wie eine Alkylidenkette mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen, insbesondere (CH&sub2;)n-W-(CH&sub2;)n- darstellt,
wobei n + n' eine ganze Zahl von 0 bis 10 darstellt, W CHY darstellt, Y H, eine lineare oder verzweigte Alkylgruppe mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, ein Rest einer natürlichen oder synthetischen α-Aminosäure ist oder W eine aromatische Verbindung, insbesondere Phenyl, darstellt,
wobei R eine Gruppe, umfassend eine Alkohol-, Phenol-, Thiol- oder Amin-Funktion, darstellt, P darstellt:
- eine Matrix als Träger für die Affinitätschromatographie;
- eine Gold-, Latexkugel für die Histologie und Zytologie;
- ein Protein für die Sichtbarmachung, die Reinigung, besonders 1) von spezifischer Osidrezeptoren, die Lectine, Adhesine, Agglutinine usw. genannt werden oder auch 2) von Proteinen mit oder ohne enzymatischer Aktivität, die Affinität für die Oside aufweisen, insbesondere Glycosyltransferasen wie die Sialyltransferase, Sulfotransferasen, Phosphotransferasen, Exoglycosidasen oder Endoglycosidasen;
- ein Lipid für die Charakterisierung der vorstehenden Rezeptoren;
- Oligonukleotide für die selektive Erhöhung ihrer Bindung durch die Zielzellen;
- ein Protein oder Polymere für die Zielerkennung von Medikamenten, Nukleotiden oder Genen.
4. Verbindungen nach einem der Ansprüche 1 oder 2 mit der allgemeinen Formel (III)
in der X[NH-(Ai)-CO]m-P oder [NH-(Ai)-CO]m-R-P darstellt, wobei Ai, m, P und R die in Anspruch 2 gezeigten Bedeutungen besitzen.
5. Verbindungen nach einem der Ansprüche 1 oder 2 mit der allgemeinen Formel (IV)
in der D und B die in Anspruch 2 gezeigten Bedeutungen besitzen, und X[NH-(Ai)-CO]m-P oder [NH-(Ai)-CO]m-R-P darstellt, wobei Ai, m, R und P die in Anspruch 2 gezeigten Bedeutungen besitzen.
6. Verbindungen nach einem der Ansprüche 1 oder 2 mit der allgemeinen Formel (V)
in der X[NH-(Ai)-CO]m-P oder [NH-(Ai)-CO]m-R-P darstellt, wobei P, Ai, m und R die in Anspruch 2 gezeigten Bedeutungen besitzen.
7. Produkte, die insbesondere als Zwischenprodukte für die Herstellung einer der Verbindungen nach einem der Ansprüche bis 6 dienen können, wobei die Produkte ein Oligosid enthalten, das an ein Molekül gebunden ist, welches ein Stickstoffatom, gebunden an ein Kohlenstoffatom in α- Stellung einer C=O-Gruppe, und mindestens eine funktionelle Gruppe, insbesondere eine, zwei oder drei funktionelle Gruppen, umfaßt, wobei sich die kovalente Bindung zwischen dem Oligosid und dem Molekül durch die Verbindung über das Stickstoffatom ergibt.
8. Produkte der allgemeinen Formel (Ia)
in der
a = 0 oder 1,
j = 0 oder 1,
b = 0 oder 1,
p = 2 bis 4, insbesondere 2, ist,
mit der Maßgabe, daß a = b = 0 ist, falls j = 1 ist, was das Vorliegen eines cyclischen Moleküls bedeutet, bzw. daß a = b = 1 ist, falls j = 0 ist, was die Abwesenheit der (CH&sub2;)p-Gruppe impliziert,
D einen Rest einer organischen Säure der Formel D(CO&sub2;)H, insbesondere H oder eine Alkylkette mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen, insbesondere CH&sub3;, darstellt,
Z&sub1; B, wobei B aus H, einer Alkylkette mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen oder einer Seitenkette einer α-Aminosäure wie CH(CH&sub3;)&sub2;, CH&sub2;OH, CH&sub3;, und vorzugsweise H ausgewählt ist, oder B' darstellt, wobei B' aus einer Alkylidenkette mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen oder einer Seitenkette einer α-Aminosäure ausgewählt ist, wobei die Ketten eine freie oder geschützte funktionelle Gruppe, wie Carboxyl, SH, OH oder Amin, enthalten,
X die Gruppe [NH-(Ai)-CO]m-R,
die Gruppe [NH-(Ai)-CO]m-Q darstellt,
R eine Gruppe, umfassend eine Alkohol-, Phenol-, Thiol- oder Amin-Funktion, darstellt,
darstellt,
m eine ganze Zahl von 0 bis 10, vorzugsweise von 0 bis 5 und vorteilhaft 1 oder 2 ist,
Ai einen organischen Rest wie eine Alkylidenkette mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen, insbesondere (CH&sub2;)n-W-(CH&sub2;)n,- darstellt,
wobei n + n' eine ganze Zahl von 0 bis 10 darstellt, W CHY darstellt, Y H, eine lineare oder verzweigte Alkylgruppe mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, ein Rest einer natürlichen oder synthetischen α-Aminosäure ist oder W eine aromatische Verbindung, insbesondere Phenyl, darstellt.
9. Produkte nach einem der Ansprüche 7 oder 8 der allgemeinen Formel (IIa)
in der
a = 0 oder 1,
j = 0 oder 1,
b = 0 oder 1,
p = 2 bis 4, insbesondere 2, ist,
mit der Maßgabe, daß a = b = 0 ist, falls j = 1 ist, was das Vorliegen eines cyclischen Moleküls bedeutet, bzw. daß a = b = 1 ist, falls j = 0 ist, was die Abwesenheit der (CH&sub2;)p-Gruppe impliziert,
D einen Rest einer organischen Säure der Formel D(CO&sub2;)H, insbesondere H oder eine Alkylkette mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen, insbesondere CH&sub3;, darstellt,
B H, eine Alkylkette mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen oder eine Seitenkette einer α-Aminosäure wie CH (CH&sub3;)&sub2;, CH&sub2;OH, CH&sub3;, und vorzugsweise H darstellt,
m eine ganze Zahl von 0 bis 10, vorzugsweise von 0 bis 5 und vorteilhaft 1 oder 2 ist,
Ai einen organischen Rest wie eine Alkylidenkette von 1 bis Kohlenstoffatomen, insbesondere (CH&sub2;)n-W-(CH&sub2;)n- darstellt, wobei n + n' eine ganze Zahl von 0 bis 10 darstellt, wobei W CHY darstellt, Y H, eine lineare oder verzweigte Alkylgruppe mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, ein Rest einer natürlichen oder synthetischen α-Aminosäure ist oder W eine aromatische Verbindung, insbesondere Phenyl, darstellt,
R eine Gruppe, umfassend eine Alkohol-, Phenol-, Thiol- oder Amin-Funktion, darstellt.
10. Produkte nach einem der Ansprüche 7 oder 8 mit der allgemeinen Formel (IIIa)
in der Ai, m und R die in Anspruch 8 gezeigten Bedeutungen besitzen.
11. Produkte nach einem der Ansprüche 7 oder 8 mit der allgemeinen Formel (IVa)
in der D, B, m, Ai und R die in Anspruch 8 gezeigten Bedeutungen besitzen.
12. Produkte nach einem der Ansprüche 7 oder 8 mit der allgemeinen Formel (Va)
in der Ai, m und R die in Anspruch 8 gezeigten Bedeutungen besitzen.
13. Produkte der Formel (VI)
in der B, Ai, m und R die in Anspruch 2 gezeigten Bedeutungen besitzen.
14. Produkte der Formel (VII)
in der p, Ai, R, m die in Anspruch 2 gezeigten Bedeutungen besitzen.
15. Verbindungen oder Produkte nach einem der Ansprüche 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß Q die folgenden Reste darstellt:
und dadurch gekennzeichnet, daß R einen der folgenden Reste darstellt:
-NH-pC&sub6;H&sub4;-N=C=S und seine Vorläufer:
-NH-pC&sub6;H&sub4;-NO&sub2;
-NH-pC&sub6;H&sub4;-NH&sub2;
-NH-CH&sub2;-(CH&sub2;)m-C(=NH&sub2;&spplus;)OCH&sub3;
-NH-CH&sub2;-(CH&sub2;)m-CN
-NH-CH&sub2;-(CH&sub2;)m-CH&sub2;-NH-CO-CH&sub2;-(CH&sub2;)m-C(=NH&sub2;+)OCH&sub3;
-NH-CH&sub2;-(CH&sub2;)m-CH&sub2;-NH-CO-CH&sub2;(CH&sub2;)m-CN
-NH-CH&sub2;-(CH&sub2;)m-CH&sub2;-NH-CO-CH&sub2;-T T = Br, I, Cl
-NH-CH&sub2;-CH&sub2;-NH-CO-CH&sub2;-(CH&sub2;)m-S-S-Pyr
-NH-CH&sub2;-(CH&sub2;)m-CH&sub2;-S-S-Pyr
-NH-(CH&sub2;)m-pC&sub6;H&sub4;OH
-NH-CH&sub2;-(CH&sub2;)m-CH&sub2;-NH-CO-(CH&sub2;)m-pC&sub6;H&sub4;OH
wobei m eine ganze Zahl von 0 bis 10, vorzugsweise 0 bis 5 und vorteilhaft 1 oder 2 darstellt,
Pyr eine 2-Pyridin-Gruppe darstellt.
16. Verbindung nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß P ein Oligopeptid oder ein Polypeptid,
insbesondere gluconoyliertes Polylysin, darstellt und P' oder P" ein Oligonukleotid darstellen, oder R Fluorescein oder eines seiner Derivate oder ein anderes fluoreszierendes Derivat darstellt, und P' oder P" ein Oligonukleotid darstellen oder P ein therapeutisches Mittel oder irgendein Molekül von Interesse darstellt.
17. Verbindungen nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß der oligosidische Rest ein 2 bis 50 Saccharide enthaltendes Oligosaccharid ist und insbesondere ausgewählt ist aus:
Lacto-N-tétraose Galβ 3 GlcNAcβ 3 Gal β 4 Glc
Neolacto-N-tétraose Galβ 4 GlcNAcβ 3 Gal β 4 Glc
H-Gruppe Fuc α 2 Galβ 3 Galβ 4 Glc
Lewisa Galβ 3 GlcNAcβ 3 Gal β 4 Glc Fuc α 4- - -↑
LewisX Galβ 4 GlcNAcβ 3 Galβ 4 Glc Fuc α 3- - -↑
Lewisb Fucα 2 Galβ 3 GlcNAc β 3 Galβ 4 Glc Fuc α4- - -↑
LewisY Fuc α 2 Gslβ 4 GlcNAcβ 3 Galβ 4 Glc Fuc α 3- - -↑
Disialolacto-N-tétraose Neu 5 Acα 3 Gal β 3 GlcNAc β 3 Gal β 4 Glc Neu 5 Acα 6- - -↑
Komplexer Typ mit drei Antennen
Sialylactose 3 Neu 5 Ac α 3 Gal 4 Glc
Sialylactose 6 Neu 5 Ac α 6 Gal β 4 Glc
Disialylactose 3 Neu 5 Ac α 8 Neu 5 Ac α 3 Gal β 4 Glc
- einfachen oder komplexen Sacchariden, die von membranständigen Lectinen erkannt werden und beispielsweise ausgewählt sind aus:
a. Asialo-Oligosid des dreiantennigen Lactosamintyps: Asialoglycoproteinrezeptor
b. Asialo-Oligosid des vierantennigen Lactosamintyps: Asialoglycoproteinrezeptor
10c. Lewisx: LECAM 2/3
d. Sialyl-Lewisx: LECAM 3/2
e. Derivat des Lewisx-Sulfats (HNK1): LECAM 1
f. Oligomannosid: Mannoserezeptor
g. phosphoryliertes Oligomannosid: Mannose-6-phosphat- Rezeptor
h. Oligosaccharid des Lactosaminsulfattyps: GalNAc4-sulfat
18. Verfahren der Herstellung der Verbindungen nach einem der Ansprüche 7 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß:
- ein Oligosid mit einem freien reduzierenden Saccharid in einem geeigneten Lösungsmittel mit einem Stickstoffatom eines Zwischenmoleküls kondensiert wird, wobei dieses Stickstoffatom zu einer Amino-Gruppe gehört, die an ein Kohlenstoffatom in α-Stellung einer C=O-Gruppe gebunden ist, wobei das Zwischenmolekül gegebenenfalls eine Seitenkette besitzt, die eine freie oder ungeschützte funktionelle Gruppe wie OH, SH, NH&sub2; oder COOH enthält, wobei dieses Ausgangsmolekül aus den folgenden Zwischenmolekülen ausgewählt ist: natürliche oder synthetische α-Aminosäure, Derivat einer α-Aminosäure, Aminosäure in N-terminaler Position eines Peptids oder eines peptidischen Derivats, gegebenenfalls in Gegenwart eines Katalysators wie Imidazol in einem geeigneten Lösungsmittel, um ein Glycosylamin- Derivat zu erhalten, in dem das terminale Saccharid des Oligosids seine cyclische Struktur beibehält und in dem das semiacetalische Hydroxyl durch das α-Amin eines der Ausgangsmoleküle ersetzt ist,
- falls das Zwischenmolekül nicht eine Seitenkette besitzt, die eine wie vorstehend definierte funktionelle Gruppe enthält, oder eine Seitenkette besitzt, in der die funktionelle Gruppe gegebenenfalls geschützt ist, das am Ende des vorstehenden Schritts erhaltene Glycosylaminderivat durch Zugabe einer durch einen klassischen Aktivator, wie Carbonyldiimidazol, BOP (Benzotriazol-1- yloxytris(dimethylamino)-phosphoniumhexafluorphosphat) oder HBTU (O-Benzotriazol-1-yl-,N,N,N',N'- tetramethyluroniumhexafluorphosphat), aktivierten organischen Säure acyliert wird, um eine N-acyliertes Glycosylaminderivat zu erhalten, gegebenenfalls gefolgt von einer Entschützung der funktionellen Gruppe der Seitenkette im Hinblick auf eine optionale Substitution,
- falls das Zwischenmolekül eine eine Carboxylgruppe enthaltende Seitenkette besitzt, die Carboxylgruppe aktiviert wird, um sie intramolekular mit dem α-Amin umzusetzen, was eine Cyclisierung innerhalb des Ausgangsmolekül zur Folge hat, um ein Derivat des N-acylierten Glycosylaminderivats zu erhalten.
- falls das Zwischenmolekül eine eine Carboxylgruppe enthaltende Seitenkette besitzt, ein Acylierungsmittel in Form eines aktiven Esters zugegeben werden kann.
19. Verfahren der Herstellung einer Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß umgesetzt werden:
- ein oder mehrere Produkte (acylierte Derivate des Glycosylamins) nach einem der Ansprüche 8 bis 12, die eine aktivierte oder aktivierbare Gruppe Q tragen, mit einem Molekül, einer Matrix oder einem Partikel P, P' und P",
- ein oder mehrere Produkte (acylierte Derivate des Glycosylamins) nach einem der Ansprüche 8 bis 12, die entweder eine aktivierte oder aktivierbare Gruppe R oder eine Gruppe B', enthaltend eine aktivierte oder aktivierbare funktionelle Gruppe, oder eine Gruppe Ai, enthaltend eine funktionelle Gruppe, tragen, mit einem Molekül, einer Matrix oder einem Partikel P, P' bzw. P", enthaltend eine funktionelle Gruppe, um ein Produkt des Typs (Glycopeptidyl-R)n-P, (Glycopeptidyl-B')n-P' oder (Glycopetidyl-Ai)n-P", n ≥ 1, zu erhalten,
- ein oder mehrere erfindungsgemäße Produkte (acylierte Derivate des Glycosylamins), die einerseits eine aktivierte oder aktivierbare Gruppe R, andererseits eine Gruppe B', enthaltend eine aktivierte oder aktivierbare Gruppe, oder eine Gruppe Ai, enthaltend eine funktionelle Gruppe, tragen, mit Molekülen, Matrizen oder Partikeln P und P' oder Molekülen, Matrizen oder Partikeln P und P",
- ein oder mehrere erfindungsgemäße Produkte (acylierte Derivate des Glycosylamins), die einerseits eine aktivierte oder aktivierbare Gruppe R, andererseits eine Gruppe B', enthaltend eine aktivierte oder aktivierbare Gruppe, und eine Gruppe Ai, enthaltend eine funktionelle Gruppe, tragen, jeweils mit Molekülen, Matrizen oder Partikeln P, P' und P",
wobei R, B', Ai, P, P' und P" wie nach einem der Ansprüche 1 bis 6 definiert sind.
20. Verfahren nach Anspruch 19, wobei die aus dem Molekül, der Matrix oder dem Partikel P, P' oder P" bestehende zu substituierende Verbindung ein Protein, ein Lipid, eine Nukleinsäure, ein Oligonukleotid, ein Polylysin, ein unlösliches Polymer, eine Latexkugel oder eine Goldkugel ist.
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