DE69434651T2

DE69434651T2 - Bmp-12, bmp-13 und diese enthaltende sehne-induzierende zusammensetzungen

Info

Publication number: DE69434651T2
Application number: DE69434651T
Authority: DE
Inventors: J. Anthony Hudson CELESTE; M. John Hudson WOZNEY; A. Vicki Brookline ROSEN; M. Neil Dover WOLFMAN; H. Gerald Port Jefferson THOMSEN; A. Douglas Lexington MELTON
Original assignee: Harvard College; Genetics Institute LLC
Current assignee: Harvard College; Genetics Institute LLC
Priority date: 1993-12-07
Filing date: 1994-12-06
Publication date: 2007-03-08
Anticipated expiration: 2014-12-07
Also published as: JP2007016037A; US6984623B2; ATE319823T1; US7365052B2; ES2255059T3; NO962304L; US6284872B1; NO962304D0; FI962350A0; CA2176942C; US5658882A; CA2176942A1; PT733109E; JP2005312457A; EP0733109A1; US20070004005A1; JP3939729B2; US20020160494A1; AU1301395A; KR100353182B1

Description

IN BEZIEHUNG STEHENDE ANMELDUNGEN
Die vorliegende Erfindung ist eine Teil-Fortsetzung der Anmeldung mit der Seriennummer 08/217,780, eingereicht am 25. März, 1994, 08/164,103, eingereicht am 7. Dezember, 1993, und 08/333,576, eingereicht am 2. November, 1994.
GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft eine neue Familie von aufgereinigten Proteinen und Zusammensetzungen, die solche Proteine enthalten, wobei die Zusammensetzungen nützlich sind für die Induktion der Bildung von Sehnen/Band-ähnlichem Gewebe, Wundheilung und Reparatur von Band- und anderem Gewebe. Diese Proteine können auch in Zusammensetzungen zum Steigern der Aktivität von Knochen-morphogenetischen Proteinen verwendet werden.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Die Suche nach dem Molekül oder den Molekülen, das/die für die Bildung von Knochen, Knorpel, Sehne und anderen Geweben, die in Knochen und anderen Gewebeextrakten vorhanden sind, verantwortlich ist/sind, hat zu der Entdeckung eines neuen Satzes von Molekülen, genannt die Knochen-Morphogenen Proteine (BMPs), geführt. Die Strukturen von einigen Proteinen, die als BMP-1 bis BMP-11 bezeichnet werden, sind vor kurzem aufgeklärt worden. Die einzigartigen induktiven Aktivitäten dieser Proteine gemeinsam mit ihrer Anwesenheit im Knochen legen nahe, dass sie wichtige Regulatoren von Knochenreparatur-Prozessen sind und in die normale Aufrechterhaltung von Knochengewebe involviert sein können. Es gibt einen Bedarf, zusätzliche Proteine, die eine Rolle in der Bildung von anderen lebenswichtigen Geweben spielen, zu identifizieren. Die vorliegende Erfindung betrifft die Identifizierung einer Familie von Proteinen, die Sehne/Band-ähnliches Gewebe-induzierende Aktivität aufweisen und die in Zusammensetzungen für die Induktion der Bildung und Reparatur von Sehne/Band-ähnlichem Gewebe nützlich sind.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
In einer Ausführungsform umfasst die vorliegende Erfindung DNA-Moleküle, die ein Sehne/Band-ähnliches induzierendes Protein codieren, das die Erfinder als V1-1 bezeichnet haben. Dieses neue Protein wird jetzt BMP-12 genannt. Die vorliegende Erfindung schließt auch DNA-Moleküle ein, die BMP-12-verwandte Proteine codieren.
BMP-12-verwandte Proteine sind eine Untergruppe der BMP/TGF-βVg-1-Familie von Proteinen, einschließlich BMP-12 und VL-1, die als Sehne/Band-ähnliches Gewebe-induzierende Proteine definiert sind und die durch DNA-Sequenzen codiert werden, die z.B. unter Verwendung von PCR, unter Verwendung von BMP-12-spezifischen Primern wie den unten beschriebenen Primern #6 und #7 mit reduzierten Stringenzbedingungen cloniert und identifiziert werden. Es wird bevorzugt, dass die DNA-Sequenzen, die BMP-12-verwandte Proteine codieren, mindestens etwa 80% Homologie auf dem Aminosäurebereich von Aminosäuren mit den Aminosäuren #3 bis #103 von SEQ ID NO:1 teilen.
Die DNA-Moleküle haben vorzugsweise eine DNA-Sequenz, die das BMP-12-Protein, dessen Sequenz in SEQ ID NO:1 geliefert wird, oder ein BMP-12-verwandtes Protein, wie hierin weiter beschrieben, codiert. Sowohl das BMP-12-Protein als auch die BMP-12-verwandten Proteine werden durch die Fähigkeit, die Bildung von Sehne/Band-ähnlichem Gewebe in dem in den Beispielen beschriebenen Test zu induzieren, charakterisiert.
Die DNA-Moleküle der Erfindung umfassen vorzugsweise eine DNA-Sequenz, wie in SEQUENZ ID NO:1 beschrieben; mehr bevorzugt die Nucleotide #496 bis #882, #571 bis #882 oder #577 bis #882 von SEQ ID NO:1; oder DNA-Sequenzen, die unter stringenten Hybridisierungsbedingungen an die obigen hybridisieren und ein Protein codieren, das die Fähigkeit zeigt, Sehne/Band-ähnliches Gewebe zu bilden. Die DNA-Moleküle der Erfindung können auch eine DNA-Sequenz, wie in SEQ ID NO:25 beschrieben, umfassen; mehr bevorzugt die Nucleotide #604 oder #658 bis #964 von SEQ ID NO:25.
Die DNA-Moleküle der Erfindung schließen auch DNA-Moleküle ein, die eine DNA-Sequenz umfassen, die ein BMP-12-verwandtes Protein mit der Aminosäuresequenz, wie in SEQ ID NO:2 oder SEQ ID NO:26 gezeigt, codiert so wie natürlich vorkommende allelische Sequenzen und äquivalente degenerative Codonsequenzen von SEQ ID NO:2 oder SEQ ID NO:26. Vorzugsweise codiert die DNA-Sequenz der vorliegenden Erfindung die Aminosäuren #-25 bis # 104, #1 bis # 104 oder #3 bis #103 von SEQ ID NO:2; oder die Aminosäuren #1 bis #120 oder #19 bis #120 von SEQ ID NO:26. Die DNA-Sequenz kann in einer 5' zu 3'-Richtung Nucleotide, die ein Pro-Peptid codieren, und Nucleotide, die die Aminosäuren #-25 bis #104, #1 bis #104 oder #3 bis #103 von SEQ ID NO:2; oder die Aminosäuren #1 bis #120 oder #19 bis #120 von SEQ ID NO:26 codieren, umfassen. Das Pro-Peptid, das in der obigen Ausführungsform nützlich ist, wird vorzugsweise aus der Gruppe ausgewählt, die aus dem natürlichen BMP-12-Pro-Peptid und einem Protein-Pro-Peptid eines unterschiedlichen Mitglieds der TGF-B-Überfamilie oder der BMP-Familie besteht. Die Erfindung umfasst darüber hinaus DNA-Sequenzen, die an die obigen DNA-Sequenzen unter stringenten Hybridisierungsbedingungen hybridisieren und ein BMP-12-verwandtes Protein codieren, das die Fähigkeit zeigt, die Bildung eines Sehne/Band-ähnlichen Gewebes zu induzieren.
In anderen Ausführungsformen umfasst die vorliegende Erfindung Wirtszellen und Vektoren, die ein DNA-Molekül umfassen, das das BMP-12-Protein oder ein BMP-12-verwandtes Protein codiert. Die Wirtszellen und Vektoren können darüber hinaus die codierende Sequenz in funktioneller Verknüpfung mit einer Expressionskontrollsequenz dafür umfassen.
In einer anderen Ausführungsform umfasst die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Produzieren eines aufgereinigten BMP-12-verwandten Proteins, wobei das Verfahren die Schritte des Kultivierens einer Wirtszelle, die mit dem obigen DNA-Molekül oder Vektor transformiert wurde, das/der eine Nucleotidsequenz umfasst, die ein BMP-12-verwandtes Protein codiert; und (b) die Gewinnung und Aufreinigung des BMP-12-verwandten Proteins vom Kulturmedium umfasst. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das Verfahren (a) das Kultivieren einer Zelle, die mit einem DNA-Molekül transformiert wurde, das die Nucleotidsequenz von Nucleotid #496, #571 oder #577 bis #879 oder #882, wie in SEQ ID NO:1 gezeigt, oder die Nucleotidsequenz von #604 oder #658 bis #963 von SEQ ID NO:25 umfasst; und

(b) das Gewinnen und Aufreinigen eines Proteins, das die Aminosäuresequenz von Aminosäure #-25, #1 oder #3 bis Aminosäure #103 oder #104, wie in SEQ ID NO:2 gezeigt, oder von Aminosäure #1 oder #19 bis Aminosäure #120, wie in SEQ ID NO:26 gezeigt, umfasst, aus dem Kulturmedium. Die vorliegende Erfindung schließt auch ein aufgereinigtes Protein ein, das durch die obigen Verfahren produziert wird.

Die vorliegende Erfindung umfasst darüber hinaus ein aufgereinigtes BMP-12-verwandtes Protein, das durch die Fähigkeit, die Bildung von Sehne/Band-ähnlichem Gewebe zu induzieren, charakterisiert ist. Die BMP-12-verwandten Polypeptide umfassen vorzugsweise eine Aminosäuresequenz, wie in SEQ ID NO:2 gezeigt. Das Polypeptid umfasst mehr bevorzugt die Aminosäuren #-25, #1 oder #3 bis #103 oder #104, wie in SEQ ID NO:2 dargelegt; oder die Aminosäuren #1 oder #19 bis #120, wie in SEQ ID NO:26 dargelegt. In einer bevorzugten Ausführungsform kann das aufgereinigte Polypeptid in der Form eines Dimers vorliegen, das aus zwei Untereinheiten besteht, jede mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO:2.
In einer anderen Ausführungsform umfasst die vorliegende Erfindung Zusammensetzungen, die eine wirksame Menge der oben beschriebenen BMP-12-verwandten Proteine umfassen. In den Zusammensetzungen kann das Protein mit einem pharmazeutisch verträglichen Vehikel vermengt sein.
Die Erfindung schließt auch Verfahren für die Heilung von Sehne/Band-ähnlichem Gewebe und Reparatur von Sehne/Band-ähnlichem Gewebe, zum Behandeln von Tendinitis oder anderen Sehne- oder Band-Defekten und für das Induzieren der Bildung von Sehne/Band-ähnlichem Gewebe in einem Patienten, der dasselbe benötigt, ein, umfassend die Verabreichung einer wirksamen Menge der obigen Zusammensetzung an den Patienten.
Andere Ausführungsformen schließen chimere DNA-Moleküle ein, die eine DNA-Sequenz umfassen, die ein Pro-Peptid von einem Mitglied der TGF-β-Überfamilie von Proteinen, das im richtigen Leseraster mit einer DNA-Sequenz verknüpft ist, die ein BMP-12-verwandtes Polypeptid codiert. Ein geeignetes Pro-Peptid ist das Pro-Peptid von BMP-2. Die Erfindung schließt auch heterodimere Proteinmoleküle ein, die ein Monomer, das die Aminosäuresequenz, die in SEQ ID NO:2 gezeigt wird, und ein Monomer, das die Aminosäuresequenz eines anderen Proteins der TGF-β-Überfamilie umfasst.
Schließlich umfasst die vorliegende Erfindung Verfahren zum Induzieren der Bildung von Sehne/Band-ähnlichem Gewebe in einem Patienten, der dasselbe benötigt, umfassend die Verabreichung einer wirksamen Menge einer Zusammensetzung, die ein Protein umfasst, das die Fähigkeit zeigt, die Bildung von Sehne/Band-ähnlichem Gewebe zu induzieren, an den Patienten, wobei das Protein eine Aminosäuresequenz aufweist, die in SEQ ID NO:2 oder SEQ ID NO:26 gezeigt wird. Die Aminosäursesequenzen sind bevorzugter eine der folgenden: (a) Aminosäuren #-25, #1 oder #3 bis #103 oder #104 von SEQ ID NO:2; (b) Aminosäuren #1 oder #19 bis #119 oder #120 von SEQ ID NO:26; (c) Mutanten und/oder Varianten von (a) oder (b), die die Fähigkeit zeigen, eine Sehne und/oder ein Band zu bilden. In anderen Ausführungsformen des obigen Verfahrens wird das Protein durch eine DNA-Sequenz von SEQ ID NO:1 oder SEQ ID NO:25 codiert, mehr bevorzugt eine der folgenden: (a) Nucleotide #496, #571 oder #577 bis #879 oder #882 von SEQ ID NO:1; (b) Nucleotide #605 oder #659 bis #961 oder #964 von SEQ ID NO:25; und (c) Sequenzen, die an (a) unter stringenten Hybridisierungsbedingungen hybridisieren und ein Protein codieren, das die Fähigkeit zeigt, ein Sehne/Band-ähnliches Gewebe zu bilden.
Beschreibung der Sequenzen
SEQ ID NO:1 ist die Nucleotidsequenz, die das menschliche BMP-12 codiert.
SEQ ID NO:2 ist die Aminosäuresequenz, die das reife menschliche BMP-12-Polypeptid umfasst.
SEQ ID NO:3, die nicht Teil der Erfindung ist, ist die Nucleotidsequenz, die das Protein MP52 codiert.
SEQ ID NO:4, die nicht Teil der Erfindung ist, ist die Aminosäuresequenz, die das reife MP52-Polypeptid umfasst.
SEQ ID NO:5 ist die Nucleotidsequenz eines speziell amplifizierten Teils der menschlichen BMP-12-codierenden Sequenz.
SEQ ID NO:6 ist die Aminosäuresequenz, die durch die Nucleotidsequenz von SEQ ID NO:5 codiert wird.
SEQ ID NO:7 ist die Nucleotidsequenz eines spezifisch amplifizierten Teils der menschlichen VL-1-codierenden Sequenz.
SEQ ID NO:8 ist die Aminosäuresequenz, die durch die Nucleotidsequenz von SEQ ID NO:7 codiert wird.
SEQ ID NO:9 ist die Nucleotidsequenz des Plasmids pALV1-781, das für die Expression von BMP-12 in E. coli verwendet wird.
SEQ ID NO:10 ist die Nucleotidsequenz eines Fragments des murinen Clons mV1.
SEQ ID NO:11 ist die Aminosäuresequenz eines Fragments des murinen Proteins, das durch mV1 codiert wird.
SEQ ID NO:12 ist die Nucleotidsequenz eines Fragments des murinen Clons mV2.
SEQ ID NO:13 ist die Aminosäuresequenz eines Fragments des murinen Proteins, das durch mV2 codiert wird.
SEQ ID NO:14 ist die Nucleotidsequenz eines Fragments des murinen Clons mV9.
SEQ ID NO:15 ist die Aminosäuresequenz eines Fragments des murinen Proteins, das durch mV9 codiert wird.
SEQ ID NO:16 ist die Aminosäuresequenz einer BMP/TGF-β/Vg-1-Protein-Konsensussequenz. Das erste Xaa repräsentiert entweder Gln oder Asn; das zweite Xaa repräsentiert entweder Val oder Ile.
SEQ ID NO:17 ist die Nucleotidsequenz von Oligonucleotid #1.
SEQ ID NO:18 ist die Aminosäuresequenz einer BMP/TGF-β/Vg-1-Protein-Konsensussequenz. Das Xaa repräsentiert entweder Val oder Leu.
SEQ ID NO:19 ist die Nucleotidsequenz von Oligonucleotid #2.
SEQ ID NO:20 ist die Nucleotidsequenz von Oligonucleotid #3.
SEQ ID NO:21 ist die Nucleotidsequenz von Oligonucleotid #4.
SEQ ID NO:22 ist die Nucleotidsequenz von Oligonucleotid #5.
SEQ ID NO:23 ist die Nucleotidsequenz von Oligonucleotid #6.
SEQ ID NO:24 ist die Nucleotidsequenz von Oligonucleotid #7.
SEQ ID NO:25 ist die Nucleotidsequenz der menschlichen VL-1 (BMP-13)-codierenden Sequenz.
SEQ ID NO:26 ist die Aminosäuresequenz, die durch die Nucleotidsequenz von SEQ ID NO:25 codiert wird.
SEQ ID NO:27 ist die Nucleotidsequenz, die eine Fusion des BMP-2-Pro-Peptids und der reifen codierenden Sequenz von BMP-12 codiert.
SEQ ID NO:28 ist die Aminosäuresequenz, die durch die Nucleotidsequenz von SEQ ID NO:27 codiert wird.
SEQ ID NO:29 ist die Nucleotidsequenz, die das murine mV1-Protein codiert. X01 ist Val, Ala, Glu oder Gly; X02 ist Ser, Pro, Thr oder Ala; X03 ist Ser oder Arg; X04 ist Leu, Pro, Gln oder Arg; X05 ist Cys oder Trp; X06 ist Val, Ala, Asp oder Gly; X07 ist Val, Ala, Glu oder Gly; X08 ist Gln, Lys oder Glu.
SEQ ID NO:30 ist die Aminosäuresequenz, die durch die Nucleotidsequenz von SEQ ID NO:29 codiert wird. X01 bis X08 sind die selben wie in SEQ ID NO:29.
SEQ ID NO:31 ist die Nucleotidsequenz, die das murine mV2-Protein codiert. X01 ist Pro oder Thr; X02 ist Val.
SEQ ID NO:32 ist die Aminosäuresequenz, die durch die Nucleotidsequenz von SEQ ID NO:31 codiert wird. X01 und X02 sind die selben wie in SEQ ID NO:31.
SEQ ID NO:33 ist die Nucleotidsequenz, die das menschliche BMP-12-Protein codiert.
SEQ ID NO:34 ist die Aminosäuresequenz, die durch die Nucleotidsequenz von SEQ ID NO:33 codiert wird.
SEQ ID NO:35 ist die Nucleotidsequenz von Oligonucleotid #8.
Kurze Beschreibung der Figuren
1 ist ein Vergleich der menschlichen BMP-12- und der menschlichen MP52-Sequenzen.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Die DNA-Sequenzen der vorliegenden Erfindung sind nützlich für das Produzieren von Proteinen, die die Bildung von Sehne/Band-ähnlichem Gewebe induzieren, wie es weiter unten beschrieben wird. Die DNA-Sequenzen der vorliegenden Erfindung sind darüber hinaus nützlich für das Isolieren und Clonieren von weiteren DNA-Sequenzen, die BMP-12-verwandte Proteine mit ähnlicher Aktivität codieren. Diese BMP-12-verwandten Proteine können Homologe von anderen Spezies sein oder können verwandte Proteine innerhalb der selben Spezies sein.
Ein noch weiterer Aspekt der Erfindung sind DNA-Sequenzen, die die Expression eines Sehne/Band-ähnliches Gewebe-induzierenden Proteins codieren. Solche Sequenzen schließen die Sequenz von Nucleotiden in einer 5' zu 3'-Richtung, die in SEQ ID NO:1 oder SEQ ID NO:25 dargestellt ist, DNA-Sequenzen, die, trotz der Degeneriertheit des genetischen Codes, identisch zu der DNA-Sequenz SEQ ID NO:1 oder 25 sind und das Protein der SEQ ID NO:2 oder 26 codieren, ein.
Darüber hinaus sind in der vorliegenden Erfindung DNA-Sequenzen eingeschlossen, die unter stringenten Bedingungen mit der DNA-Sequenz von SEQ ID NO:1 oder 25 hybridisieren und ein Protein codieren, das die Fähigkeit aufweist, die Bildung einer Sehne oder eines Bands zu induzieren. Bevorzugte DNA-Sequenzen schließen jene ein, die unter stringenten Bedingungen hybridisieren, wie in Maniatis et al, Molecular Cloning (A Laboratory Manual), Cold Spring Harbor Laboratory (1982), Seiten 387 bis 389, beschrieben. Schließlich sind allelische oder andere Variationen der Sequenzen von SEQ ID NO:1 oder 25, egal ob solche Nucleotidänderungen in Änderungen in der Peptidsequenz resultieren oder nicht, aber wo die Peptidsequenz noch die Sehne/Band-ähnliches Gewebe-induzierende Aktivität aufweist, auch in der vorliegenden Erfindung eingeschlossen.
Die menschliche BMP-12-DNA-Sequenz (SEQ ID NO:1) und die Aminosäuresequenz (SEQ ID NO:2) sind im Sequenzprotokoll dargelegt. Ein anderes Protein, das für die Zusammensetzungen und Verfahren der vorliegenden Erfindung nützlich ist, ist VL-1. VL-1 ist ein BMP-12-verwandtes Protein, das unter Verwendung der Sequenzen von BMP-12 cloniert wurde. Die Erfinder haben VL-1 jetzt als BMP-13 bezeichnet. Eine teilweise DNA-Sequenz von VL-1 (SEQ ID NO:7) und die codierte Aminosäuresequenz (SEQ ID NO:8); so wie eine DNA-Sequenz, die das reife VL-1 (SEQ ID NO:25) codiert, und die codierte Aminosäuresequenz (SEQ ID NO:26) sind im Sequenzprotokoll dargelegt. Obwohl weitere Beschreibungen mit Bezugnahme auf die BMP-12-Sequenz von SEQ ID NO:1 und 2 gemacht werden, wird erkannt werden, dass die Erfindung ähnliche Modifikationen und Verbesserungen einschließt, die an anderen BMP-12-verwandten Sequenzen wie der VL-1-Sequenz, die in SEQ ID NO:25 und 26 gezeigt ist, gemacht werden können.
Die Sequenz von BMP-12, die in SEQ ID NO:1 gezeigt ist, schließt die gesamte reife Sequenz und ungefähr 190 Aminosäuren des Pro-Peptids ein. Die codierende Sequenz des reifen menschlichen BMP-12-Proteins scheint bei Nucleotid #496 oder #571 zu beginnen und sich durch Nucleotid #882 von SEQ ID NO:1 fortzusetzen. Das erste Cystein in der sieben-Cystein-Struktur, die charakteristisch für TGF-β-Proteine ist, beginnt bei Nucleotid #577. Das letzte Cystein endet bei #879. Daher wird erwartet, dass DNA-Sequenzen, die aktive BMP-12-Arten codieren, die Nucleotide #577 bis #879 von SEQ ID NO:1 umfassen werden.
Es wird erwartet, dass BMP-12, wie es durch Säuger-Zellen wie CHO-Zellen exprimiert wird, als eine heterogene Population von aktiven Arten des BMP-12-Proteins mit variierenden N-Termini vorliegt. Es wird erwartet, dass alle aktiven Arten die Aminosäuresequenz enthalten werden, die mit dem Cysteinrest bei Aminosäure #3 von SEQ ID NO:2 beginnt und sich durch mindestens den Cysteinrest bei Aminosäure 103 oder bis zum Stoppcodon nach der Aminosäure 104 fortsetzt. Andere aktive Arten enthalten eine zusätzliche Aminosäuresequenz in der N-terminalen Richtung. Wie hierin weiter beschrieben wird, wird erwartet, dass die N-Termini der aktiven Arten, die durch Säuger-Zellen produziert werden, nach dem Auftreten einer Konsensus-Spaltungsstelle, die eine Peptidsequenz Arg-X-X-Arg codiert, beginnen. Daher wird erwartet, dass DNA-Sequenzen, die aktive BMP-12-Proteine codieren, eine Nucleotidsequenz aufweisen werden, die die Nucleotidsequenz umfasst, die bei irgendeinem der Nucleotide #196, 199, 208, 217, 361, 388, 493, 496 oder 571 bis Nucleotid #879 oder 882 von SEQ ID NO:1 beginnt.
Der N-Terminus von einer aktiven Art des menschlichen BMP-12 ist experimentell durch die Expression in E. coli bestimmt worden und ist wie folgt: [M]SRXSRKPLHVDF, wobei X einen Aminosäurerest ohne klares Signal bezeichnet, der konsistent mit einem Cysteinrest an jener Stelle ist. Daher scheint es, dass der N-Terminus dieser Art von BMP-12 bei Aminosäure #1 von SEQ ID NO:1 ist, und eine DNA-Sequenz, die diese Art von BMP-12 codiert, würde bei Nucleotid #571 von SEQ ID NO:1 beginnen. Das offensichtliche Molekulargewicht dieser Art von menschlichem BMP-12-Dimer wurde durch SDS-PAGE bestimmt, ungefähr 20-22 kd auf einem 16%igen Novex-Tricingel zu sein. Das menschliche BMP-12-Protein existiert als eine klare, farblose Lösung in 0,1% Trifluoressigsäure.
Wie früher beschrieben, sind BMP-12-verwandte Proteine eine Untergruppe der BMP/TGF-β/Vg-1-Familie von Proteinen, einschließlich BMP-12 und VL-1, die als Sehne/Band-ähnliches Gewebe-induzierende Proteine definiert werden können, die durch DNA-Sequenzen codiert werden, die z.B. unter Verwendung von PCR unter Verwendung von BMP-12-spezifischen Primern wie den Primern #6 und #7, die unten beschrieben sind, unter reduzierten Stringenzbedingungen cloniert und identifiziert werden können. Es wird bevorzugt, dass DNA-Sequenzen der vorliegenden Erfindung mindestens etwa 80% Homologie auf der Aminosäureebene von Aminosäuren mit der DNA, die die Aminosäuren #3 bis #103 von SEQ ID NO:1 codiert, teilen. Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung schließt der Ausdruck BMP-12-verwandte Proteine nicht das menschliche MP52-Protein ein. Unter Verwendung der Sequenzinformation von SEQ ID NO:1 und dem in 1 gelieferten Vergleich liegt es im Fachbereich, Primer für die BMP-12-Sequenz zu gestalten, die das Clonieren von Genen, die die BMP-12-verwandten Proteine codieren, ermöglichen werden.
Ein Beispiel der BMP-12-verwandten Proteine der vorliegenden Erfindung ist VL-1, das derzeit als BMP-13 bezeichnet wird. Die Sequenz der völlig reifen BMP-13-Sequenz und zumindest ein Teil des Pro-Peptids von BMP-13 ist in SEQ ID NO:25 angegeben. Es wird erwartet, dass BMP-13, wie es durch Säuger-Zellen wie CHO-Zellen exprimiert wird, wie BMP-12 als eine heterogene Population von aktiven Arten des BMP-13-Proteins mit variierenden N-Termini existiert. Es wird erwartet, dass alle aktiven Arten die Aminosäuresequenz enthalten werden, die mit dem Cysteinrest bei Aminosäure #19 von SEQ ID NO:26 beginnt und sich durch mindestens den Cysteinrest bei Aminosäure 119 oder bis zum Stoppcodon nach der Aminosäure 120 fortsetzt. Andere aktive Arten enthalten eine zusätzliche Aminosäuresequenz in der N-terminalen Richtung. Wie hierin weiter beschrieben, wird erwartet, dass die N-Termini der aktiven Arten, die durch Säuger-Zellen produziert werden, nach dem Auftreten einer Konsensus-Spaltungsstelle, die eine Peptidsequenz Arg-X-X-Arg codiert, beginnen. Daher wird erwartet, dass DNA-Sequenzen, die aktive BMP-13-Proteine codieren, eine Nucleotidsequenz haben werden, die die Nucleotidsequenz umfasst, die bei irgendeinem der Nucleotide #410, 458, 602, 605 oder 659 bis Nucleotid #961 oder 964 von SEQ ID NO:25 beginnt.
Um die aufgereinigten Sehne/Band-ähnliches Gewebe-induzierenden Proteine, die für die vorliegende Erfindung nützlich sind, zu produzieren, wird ein Verfahren angewendet, das das Kultivieren einer Wirtszelle, die mit einer DNA-Sequenz transformiert wurde, die eine geeignete codierende Sequenz, besonders die DNA, die die Sequenz von Nucleotid #496, #571 oder #577 bis #879 oder #882 von SEQ ID NO:1 codiert, umfasst; und das Gewinnen und Aufreinigen eines Proteins, das die Aminosäuresequenz oder eine im Wesentlichen homologe Sequenz enthält, wie durch die Aminosäuren #-25, #1 oder #3 bis #103 oder #104 von SEQ ID NO:2 repräsentiert, aus dem Kulturmedium umfasst. In einer anderen Ausführungsform umfasst das angewendete Verfahren das Kultivieren einer Wirtszelle, die mit einer DNA-Sequenz transformiert wurde, die eine geeignete codierende Sequenz umfasst, besonders die DNA, die die Sequenz von Nucleotid #605 oder #659 bis #961 oder #964 von SEQ ID NO:25 codiert; und das Gewinnen und Aufreinigen eines Proteins, das die Aminosäuresequenz oder eine im Wesentlichen homologe Sequenz enthält, wie durch die Aminosäuren #1 oder #19 bis #119 oder #120 von SEQ ID NO:26 repräsentiert, aus dem Kulturmedium.
Die menschliche MP52-DNA ist in WO93/16099 beschrieben.
Menschliches MP52 wurde ursprünglich unter Verwendung von RNA aus menschlichem Embryogewebe isoliert. Die menschliche MP52-Nucleotidsequenz (SEQ ID NO:3) und die codierten Aminosäuresequenzen (SEQ ID NO:4) sind hierin im Sequenzprotokoll dargelegt, bilden jedoch keinen Teil der Erfindung. Das MP52-Protein scheint bei Nucleotid #845 von SEQ ID NO:3 zu beginnen und sich durch Nucleotid #1204 von SEQ ID NO:3 fortzusetzen. Das erste Cystein der sieben-Cystein-Struktur, die für die TGF-β-Proteine charakteristisch ist, beginnt bei Nucleotid #899. Das letzte Cystein endet bei #1201. Andere aktive Arten des MP52-Proteins können zusätzliche Nucleotide in der N-terminalen Richtung von Nucleotid #845 von SEQ ID NO:3 aufweisen.
Für die Expression des Proteins in einer Säuger-Wirtszelle wird die Wirtszelle mit einer codierenden Sequenz transformiert, die ein Pro-Peptid codiert, das für die Sekretion von Proteinen durch die Wirtszelle geeignet ist, wobei diese codierende Sequenz im richtigen Leseraster mit der codierenden Sequenz für das reife Protein verknüpft ist. Siehe zum Beispiel Patent 5,168,505 der Vereinigten Staaten, in dem eine DNA, die einen Vorläufer-Teil eines anderen Säuger-Proteins als BMP-2 codiert, an die DNA fusioniert ist, die ein reifes BMP-2-Protein codiert. Daher schließt die vorliegende Erfindung chimere DNA-Moleküle ein, die eine DNA-Sequenz umfassen, die ein Pro-Peptid eines Mitglieds der TGF-β-Überfamilie von Proteinen codiert und im richtigen Leseraster mit einer DNA-Sequenz verknüpft ist, die ein Sehne/Band-ähnliches Gewebe-induzierendes Polypeptid codiert. Der Ausdruck „chimer" wird verwendet, um anzudeuten, dass das Pro-Peptid von einem anderen Polypeptid stammt als das codierte reife Polypeptid. Natürlich kann die Wirtszelle mit einer DNA-Sequenz-codierenden Sequenz transformiert werden, die das natürliche Pro-Peptid codiert, das im richtigen Leseraster mit einer codierenden Sequenz verknüpft ist, die das reife Protein, das in SEQ ID NO:2 oder SEQ ID NO:26 gezeigt ist, codiert. Die vollständige Sequenz des natürlichen Pro-Peptids kann durch Verfahren, die auf dem Fachgebiet bekannt sind, unter Verwendung der Sequenzen, die in SEQ ID NO:1 oder SEQ ID NO:25 offenbart sind, bestimmt werden, um eine geeignete Sonde für die Identifizierung und Isolierung des gesamten Clons zu gestalten.
Die vorliegende Erfindung umspannt auch die neuen DNA-Sequenzen, die frei sind von einer Assoziation mit den DNA-Sequenzen, die andere proteinartige Materialen codieren, und die Expression von Sehne/Band-ähnliches Gewebe-induzierenden Proteinen codieren. Diese DNA-Sequenzen schließen jene ein, die in SEQ ID NO:1 in einer 5' zu 3'-Richtung dargestellt sind, und jene Sequenzen, die daran unter stringenten Hybridisierungsbedingungen [zum Beispiel 0,1 × SSC, 0,1 % SDS bei 65°C; siehe T. Maniatis et al, Molecular Cloning (A Labaratory Manual), Cold Spring Harbor Labaratory (1982), Seiten 387 bis 389] hybridisieren und ein Protein codieren, das eine Sehne/Band-ähnliches Gewebe-induzierende Aktivität aufweist.
Auf ähnliche Weise codieren DNA-Sequenzen, die Proteine, die durch die Sequenzen von SEQ ID NO:1 oder SEQ ID NO:25 codiert werden, oder Proteine, die die Aminosäursesequenz von SEQ ID NO:2 oder SEQ ID NO:26 umfassen, codieren, sich aber in der Codonsequenz auf Grund der Degeneriertheit des genetischen Codes oder von allelischen Variationen (natürlich vorkommenden Basenänderungen in der Speziespopulation, die in einer Aminosäureänderung resultieren können oder nicht) unterscheiden, auch die hierin beschriebenen Sehe/Band-ähnliches Gewebe-induzierenden Proteine. Variationen in den DNA-Sequenzen von SEQ ID NO:1 oder SEQ ID NO:25, die durch Punktmutationen oder durch induzierte Modifikationen (einschließlich Insertion, Deletion und Substitution) verursacht werden, um die Aktivität, Halbwertszeit oder Produktion der codierten Polypeptide zu verstärken, sind auch in der Erfindung eingeschlossen.
Ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung liefert ein neues Verfahren zum Produzieren von Sehne/Band-ähnliches Gewebe-induzierenden Proteinen. Das Verfahren der vorliegenden Erfindung involviert das Kultivieren einer geeigneten Zelllinie, die mit einer DNA-Sequenz transformiert worden ist, die ein Protein der Erfindung unter der Kontrolle von bekannten regulatorischen Sequenzen codiert. Die transformierten Wirtszellen werden kultiviert und die Proteine vom Kulturmedium gewonnen und aufgereinigt. Die aufgereinigten Proteine sind im Wesentlichen frei von anderen Proteinen, mit denen sie zusammen produziert werden, so wie von anderen Kontaminationen.
Geeignete Zellen oder Zelllinien können Säugerzellen wie Chinesische Hamsterovar-Zellen (CHO) sein. Wie oben beschrieben, erfordert die Expression eines Proteins in Säugerzellen ein passendes Pro-Peptid, um die Sekretion des Proteins sicher zu stellen. Die Selektion von geeigneten Säuger-Wirtszellen und Verfahren für die Transformation, die Kultur, die Amplifizierung, das Screenen, die Produktproduktion und die Aufreinigung sind auf dem Fachgebiet bekannt. Siehe z.B. Gething und Sambrook, Nature, 293:620-625 (1981) oder alternativ Kaufman et al, Mol. Cell. Biol., 5(7):1750-1759 (1985) oder Howley et al, US-Patent 4,419,446. Eine andere geeignete Säuger-Zelllinie, die in den begleitenden Beispielen beschrieben wird, ist die Affen-COS-1-Zelllinie. Die Säugerzelle CV-1 kann auch geeignet sein.
Bakterielle Zellen können auch geeignete Wirte sein. Zum Beispiel sind die verschiedenen Stämme von E. coli (z.B. HB101, MC1061) als Wirtszellen auf dem Gebiet der Biotechnologie wohlbekannt. Verschiedene Stämme von B. subtilis, Pseudomonas, anderen Bacillen und dergleichen können auch in diesem Verfahren angewendet werden. Für die Expression des Proteins in bakteriellen Zellen ist eine DNA, die ein Pro-Peptid codiert, nicht notwendig.
Von der bakteriellen Expression von Säuger-Proteinen, einschließlich der Mitglieder der TGF-β-Familie, ist bekannt, dass sie die Proteine in einer nicht-glycosylierten Form und in der Form von unlöslichen Pellets, bekannt als Einschlusskörper, produziert. Techniken sind auf dem Gebiet für das Solubilisieren dieser Einschlusskörper, das Denaturieren des Proteins unter Verwendung eines chaotropen Mittels und die ausreichend korrekte Neufaltung des Proteins, um seine Produktion in einer löslichen Form zu ermöglichen, beschrieben worden. Zum Beispiel siehe EP 0433225 .
Alternativ sind Verfahren erfunden worden, die die Einschlusskörper-Bildung umgehen, wie die Expression von Gen-Fusionsproteinen, in denen das erwünschte Protein als ein Fusionsprotein mit einem Fusionspartner exprimiert wird. Das Fusionsprotein wird später einer Spaltung unterzogen, um das erwünschte Protein zu produzieren. Ein Beispiel eines solchen Genfusions-Expressionssystems für E. coli basiert auf der Verwendung des E. coli-Thioredoxingens als ein Fusionspartner, LaVallie et al., Bio/Technology, 11:187-193 (1993).
Viele Stämme von Hefezellen, die Fachleuten bekannt sind, können auch als Wirtszellen für die Expression der Polypeptide der vorliegenden Erfindung verfügbar sein. Zusätzlich können, wo es erwünscht ist, Insektenzellen als Wirtszellen im Verfahren der vorliegenden Erfindung angewendet werden. Siehe z.B. Miller et al, Genetic Engineering, 8:277-298 (Plenum Press 1986).
Ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung liefert Vektoren für die Verwendung im Verfahren der Expression von diesen Sehne/Band-ähnliches Gewebe-induzierenden Proteinen. Vorzugsweise enthalten die Vektoren die vollständigen neuen DNA-Sequenzen, die oben beschrieben sind, die die neuen Faktoren der Erfindung codieren. Zusätzlich enthalten die Vektoren geeignete Expressionskontrollsequenzen, die die Expression der Proteinsequenzen erlauben. Alternativ sind Vektoren, die modifizierte Sequenzen, wie oben beschrieben, inkorporieren, auch Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung. Zusätzlich könnte die Sequenz von SEQ ID NO:1 oder SEQ ID NO:25, um ein reifes Protein zu exprimieren, durch das Deletieren von Pro-Peptidsequenzen und das Ersetzen davon mit Sequenzen, die die vollständigen Pro-Peptide von BMP-Proteinen oder Mitgliedern der TGF-β-Überfamilie codieren, manipuliert werden. Daher schließt die vorliegende Erfindung chimere DNA-Moleküle ein, die ein Pro-Peptid eines Mitglieds der TGF-β-Überfamilie codieren, das im richtigen Leseraster mit einer DNA-Sequenz verknüpft ist, die ein Protein codiert, das die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO:2 oder SEQ ID NO:4 oder SEQ ID NO:26 aufweist. Die Vektoren können im Verfahren des Transformierens von Zelllinien angewendet werden und ausgewählte regulatorische Sequenzen in funktioneller Assoziation mit den DNA-codierenden Sequenzen der Erfindung enthalten, die in der Lage sind, die Replikation und Expression davon in ausgewählten Wirtszellen zu lenken. Regulatorische Sequenzen für solche Vektoren sind Fachleuten bekannt und können abhängig von den Wirtszellen ausgewählt werden. Eine solche Auswahl ist Routine und bildet keinen Teil der vorliegenden Erfindung.
Ein Protein der vorliegenden Erfindung, das die Bildung von Sehne/Band-ähnlichem Gewebe oder die Bildung eines anderen Gewebes unter Umständen induziert, unter denen solch ein Gewebe normalerweise nicht gebildet wird, hat eine Anwendung im Heilen von Sehne- oder Bandrissen, -deformationen und anderen Sehne- und Banddefekten in Menschen und anderen Tieren. Solch ein Präparat, das ein Sehne/Band-ähnliches Gewebe-induzierendes Protein anwendet, kann eine prophylaktische Verwendung für die Verhinderung eines Schadens am Sehne- oder Bandgewebe so wie eine Verwendung in der verbesserten Fixierung von Sehne oder Band an Knochen oder andere Gewebe und für das Reparieren von Defekten an Sehne- oder Bandgewebe haben. De novo-Bildung von Sehne/Band-ähnlichem Gewebe, die durch eine Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung induziert wird, trägt zu der Reparatur von angeborenen, Trauma-induzierten oder anderen Sehne- oder Banddefekten von anderem Ursprung bei und ist auch nützlich in der kosmetischen, plastischen Chirurgie zum Anheften oder Reparieren von Sehnen oder Bändern. Die Zusammensetzungen der Erfindung können auch in der Behandlung von Tendinitis, des Karpal-Tunnel-Syndroms und von anderen Sehne- oder Banddefekten nützlich sein. Die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung können auch für andere Indikationen verwendet werden, bei denen es wünschenswert ist, ein Sehne- und/oder Bandgewebe zu heilen oder zu regenerieren. Solche Indikationen schließen ohne Einschränkungen die Regeneration oder Reparatur von Verletzungen der Wurzelhaut, wie sie bei Tendinitis erfolgen, und die Regeneration oder Reparatur der Sehne-an-Knochen-Anheftung ein. Die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung können ein Umfeld liefern, um Sehne- oder Band-bildende Zellen anzuziehen, das Wachstum von Sehne- oder Band-bildenden Zellen zu stimulieren oder die Differenzierung von Vorläufern von Sehne- oder Band-bildenden Zellen zu induzieren.
Die BMP-12-verwandten Proteine können aus dem Kulturmedium gewonnen werden und durch das Isolieren von ihnen von anderen proteinartigen Materialen, mit denen sie gemeinsam produziert werden, und von anderen vorliegenden Kontaminationen aufgereinigt werden. Die Proteine der vorliegenden Erfindung sind fähig zur Induktion der Bildung von Sehne/Band-ähnlichem Gewebe. Diese Proteine können weiter durch die Fähigkeit, Bildungsaktivität von Sehne/Band-ähnlichem Gewebe im unten beschriebenen ektopischen Ratten-Implantat-Test zu zeigen, charakterisiert werden. Es wird in Betracht gezogen, dass diese Proteine die Fähigkeit haben können, auch die Bildung von anderen Typen von Gewebe wie von Bändern zu induzieren.
Die Sehne/Band-ähnliches Gewebe-induzierenden Proteine, die hierin geliefert werden, schließen auch Faktoren ein, die durch die Sequenzen codiert werden, die ähnlich zu jenen von SEQ ID NO:1 oder SEQ ID NO:25 sind, aber in denen Modifikationen natürlicherweise geliefert (z.B. allelische Variationen in der Nucleotidsequenz, die in Aminosäure-Änderungen im Polypeptid resultieren können) oder willentlich manipuliert werden. Zum Beispiel können synthetische Polypeptide ganz oder teilweise fortlaufende Sequenzen der Aminosäurereste von SEQ ID NO:2 duplizieren. Diese Sequenzen können auf Grund des Teilens von primären, sekundären oder tertiären strukturellen und konformativen Charakteristika mit den Sehne/Band-ähnlichen Gewebe-Wachstumsfaktor-Polypeptiden von SEQ ID NO:2 Sehne/Band-ähnliche oder andere biologische Gewebe-Wachstumsfaktor-Eigenschaften gemeinsam mit ihnen besitzen. Daher können sie als biologisch aktive Substitute für natürlich vorkommende Sehne/Band-ähnliches Gewebe-induzierende Polypeptide in therapeutischen Zusammensetzungen und Vorgehensweisen angewendet werden.
Andere spezifische Mutationen der Sequenzen der Sehne/Band-ähnliches Gewebe-induzierenen Proteine, die hierin beschrieben werden, involvieren Modifikationen von Glycosylierungsstellen. Diese Modifikationen können O-verknüpfte oder N-verknüpfte Glycosylierungsstellen involvieren. Zum Beispiel resultiert die Abwesenheit einer Glycosylierung oder eine nur teilweise Glycosylierung aus einer Aminosäure-Substitution oder -Deletion an den Aspargin-verknüpften Glycosylierungs-Erkennungsstellen. Die Aspargin-verknüpften Glycosylierungs-Erkennungsstellen umfassen Tripeptid-Sequenzen, die spezifisch durch geeignete zelluläre Glycosylierungsenzyme erkannt werden. Diese Tripeptid-Sequenzen können Aspargin-X-Threonin, Aspargin-X-Serin oder Aspargin-X-Cystein sein, wobei das X gewöhnlich irgendeine Aminosäure außer Prolin ist. Eine Vielzahl von Aminosäure-Substitutionen oder -Deletionen an einer oder beiden der ersten oder dritten Aminosäure-Positionen einer Glycosylierungs-Erkennungsstelle (und/oder eine Aminosäure-Deletion an der zweiten Position) resultiert in einer nicht-Glycosylierung an der modifizierten Tripeptid-Sequenz. Zusätzlich wird die bakterielle Expression des Proteins auch in der Produktion eines nicht-glycosylierten Proteins resultieren, sogar wenn die Glycosylierungsstellen unmodifiziert bleiben.
Die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung umfassen ein aufgereinigtes BMP-12-verwandtes Protein, das durch Kultivieren einer Zelle, die mit der DNA-Sequenz von SEQ ID NO:1 oder SEQ ID NO:25 transformiert wurde, und Gewinnen und Aufreinigen des Proteins, das die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO:2 oder SEQ ID NO:26 aufweist, aus dem Kulturmedium produziert werden kann. Das aufgereinigte, exprimierte Protein ist im Wesentlichen frei von anderen proteinartigen Materialien, mit denen es gemeinsam produziert wird, so wie von anderen Kontaminationen. Es wird in Betracht gezogen, dass das gewonnene, aufgereinigte Protein eine Bildungsaktivität von Sehne/Band-ähnlichem Gewebe und andere Gewebe-Wachstumsaktivität wie Band-Regenerierung zeigt. Die Proteine der Erfindung können weiter durch die Fähigkeit, Bildungsaktivität von Sehne/Band-ähnlichem Gewebe im unten beschriebenen Ratten-Test zu zeigen, charakterisiert werden.
Die Zusammensetzungen zum Induzieren der Bildung von Sehne/Band-ähnlichem Gewebe der vorliegenden Erfindung können eine wirksame Menge eines Sehne/Band-ähnliches Gewebe-induzierenden Proteins umfassen, wobei das Protein die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO:2, vorzugsweise die Aminosäuren #-25, #1 oder #3 bis #103 oder #104 von SEQ ID NO:2; oder die Aminosäuren #1 oder #19 bis #120 von SEQ ID NO:26 sowie Mutanten und/oder Varianten von SEQ ID NO:2 oder SEQ ID NO:26, die die Fähigkeit zeigen, Sehne- und/oder Band-ähnliches Gewebe zu bilden, umfasst.
Die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung können darüber hinaus zusätzliche Proteine wie zusätzliche Mitglieder der TGF-β-Überfamilie von Proteinen wie Aktivine umfassen. Ein anderer Aspekt der Erfindung liefert Arzneimittel, die eine therapeutisch wirksame Menge eines Sehne/Band-induzierenden Proteins wie BMP-12 oder VL-1 in einem pharmazeutisch verträglichen Vehikel oder Träger enthalten. Diese Zusammensetzungen können verwendet werden, um die Bildung von Sehne/Band-ähnlichem Gewebe oder von anderem Gewebe zu induzieren. Es wird in Betracht gezogen, dass solche Zusammensetzungen auch für die Sehne- und Band-Reparatur, die Wundheilung und die Reparatur von anderem Gewebe wie die Reparatur von Haut verwendet werden können. Es wird darüber hinaus in Betracht gezogen, dass die Proteine der Erfindung das neuronale Überleben erhöhen können und daher für die Transplantation und Behandlung von Zuständen, die eine Abnahme des neuronalen Überlebens zeigen, nützlich sein können. Die Zusammensetzungen der Erfindung können darüber hinaus mindestens ein anderes therapeutisch nützliches Agens wie die BMP-Proteine BMP-1, BMP-2, BMP-3, BMP-4, BMP-5, BMP-6 und BMP-7, die zum Beispiel in den Patenten 5,108,922; 5,013,649; 5,116,738; 5,106,748; 5,187,076; und 5,141,905 der Vereinigten Staaten offenbart sind; BMP-8, das in der PCT-Veröffentlichung WO91/18098 offenbart ist; BMP-9, das in der PCT-Veröffentlichung WO93/00432 offenbart ist; und BMP-10 oder BMP-11, die in den zusammen anhängigen Patent-Anmeldungen, Seriennummer 08/061,695 und 08/061,464, eingereicht am 12. Mai 1993, offenbart sind, einschließen.
Die Zusammensetzungen der Erfindung können zusätzlich zu einem Sehne/Band-induzierenden Protein wie BMP-12 oder VL-1 (BMP-13) andere therapeutisch nützliche Agenzien, einschließlich des epidermalen Wachstumsfaktors (EGF), des Fibroblasten-Wachstumsfaktors (FGF), des von Blutplättchen-abgeleiteten Wachstumsfaktors (PDGF), der transformierenden Wachstumsfaktoren (TGF-α und TGF-β) und des Fibroblasten-Wachstumsfaktors-4 (FGF-4), des Nebenschilddrüsen-Hormons (PTH), des Leukämie-inhibierenden Faktors (LIF/HILDA/DIA), der Insulin-ähnlichen Wachstumsfaktoren (IGF-I und IGF-II), umfassen. Teile dieser Agenzien können auch in Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Zum Beispiel bringt eine Zusammensetzung, die sowohl BMP-2 als auch BMP-12, die zusammen implantiert werden, umfasst, sowohl Knochen- als auch Sehne/Band-ähnliches Gewebe hervor. Solch eine Zusammensetzung kann für die Behandlung von Defekten des embryonalen Gelenks, wo sich Sehne, Bänder und Knochen gleichzeitig an sich fortsetzenden anatomischen Stellen bilden, nützlich sein und kann für die Regenerierung von Gewebe an der Stelle der Anheftung der Sehne an den Knochen nützlich sein. Es wird in Betracht gezogen, dass die Zusammensetzungen der Erfindung auch in der Wundheilung wie der Haut-Heilung und der Reparatur von verwandtem Gewebe verwendet werden können. Die Typen der Wunden schließen Verbrennungen, Schnitte und Geschwüre ein, sind aber nicht darauf beschränkt. (Siehe z.B. PCT-Veröffentlichung WO84/01106 für die Diskussion der Wundheilung und Reparatur verwandter Gewebe).
Es wird erwartet, dass die Proteine der Erfindung zusammen mit oder vielleicht synergistisch mit anderen verwandten Proteinen und Wachstumsfaktoren wirken können. Darüber hinaus umfassen die therapeutischen Verfahren und Zusammensetzungen der Erfidung daher eine therapeutische Menge von mindestens einem Protein der Erfindung mit einer therapeutischen Menge von mindestens einem der oben beschriebenen BMP-Proteine. Solche Zusammensetzungen können separate Moleküle der BMP-Proteine oder Heteromoleküle umfassen, die unterschiedliche BMP-Einheiten umfassen. Zum Beispiel können ein Verfahren und eine Zusammensetzung der Erfindung ein Disulfid-verknüpftes Dimer umfassen, das eine BMP-12-verwandte Protein-Untereinheit und eine Untereinheit von einem der oben beschriebenen „BMP"-Proteine umfasst. Daher schließt die vorliegende Erfindung Zusammensetzungen ein, die ein aufgereinigtes BMP-12-verwandtes Polypeptid umfassen, das ein Heterodimer ist, in dem eine Untereinheit die Aminosäuresequenz von Aminosäure #1 bis Aminosäure #104 von SEQ ID NO:2 umfasst und eine Untereinheit eine Aminosäuresequenz für ein Knochen-morphogenes Protein umfasst, das aus der Gruppe ausgewählt wurde, die aus BMP-1, BMP-2, BMP-3, BMP-4, BMP-5, BMP-6, BMP-7, BMP-8, BMP-9, BMP-10 und BMP-11 besteht. Eine weitere Ausführungsform kann ein Heterodimer von Disulfid-gebundenen Sehne/Band-ähnliches Gewebe-induzierenden Einheiten wie BMP-12, VL-1 (BMP-13) umfassen. Zum Beispiel kann das Heterodimer eine Untereinheit umfassen, die eine Aminosäuresequenz von #1 bis #104 von SEQ ID NO:2 umfasst, und die andere Untereinheit kann eine Aminosäuresequenz von #1 bis #120 von SEQ ID NO:26 umfassen. Darüber hinaus können Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung mit anderen Agenzien kombiniert werden, die günstig für die Behandlung des Defekts, der Wunde oder des besagten Gewebes sind.
Die Präparation und Formulierung von solchen physiologisch verträglichen Protein-Zusammensetzungen, unter gebührlicher Berücksichtigung von pH-Wert, Isotonizität, Stabilität und dergleichen, liegt innerhalb des Fachkönnens. Die therapeutischen Zusammensetzungen sind derzeit auf Grund des Fehlens der Speziesspezifität der TGF-β-Proteine auch wertvoll für veterinärmedizinische Anwendungen. Insbesondere Haustiere und Vollblutpferde sind zusätzlich zu Menschen erwünschte Patienten für eine solche Behandlung mit den Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung.
Das therapeutische Verfahren schließt die Verabreichung der Zusammensetzung örtlich, systemisch oder lokal als ein Implantat oder eine Vorrichtung ein. Wenn sie verabreicht wird, liegt die therapeutische Zusammensetzung für die Verwendung in dieser Erfindung natürlich in einer Pyrogen-freien, physiologisch verträglichen Form vor. Darüber hinaus kann die Zusammensetzung erwünscht verkapselt oder in einer viskösen Form zur Abgabe an die Stelle des Gewebeschadens injiziert werden. Die örtliche Verabreichung kann für die Wundheilung und die Gewebereparatur geeignet sein. Andere therapeutisch nützliche Agenzien als die Proteine, die auch wahlweise in die Zusammensetzung, wie oben beschrieben, eingeschlossen werden können, können alternativ oder zusätzlich simultan oder sequenziell mit der Zusammensetzung in den Verfahren der Erfindung verabreicht werden.
Die Zusammensetzungen können auch eine geeignete Matrix und/oder ein sequestrierendes Agens als einen Träger einschließen. Zum Beispiel kann die Matrix die Zusammensetzung unterstützen oder eine Oberfläche für die Bildung von Sehne/Band-ähnlichem Gewebe und/oder die Bildung von anderem Gewebe liefern. Die Matrix kann langsame Freigabe des Proteins und/oder die geeignete Umgebung für die Präsentation davon bereit stellen. Das sequestrierende Agens kann eine Substanz sein, die für die Leichtigkeit der Verabreichung durch Injektion oder andere Mittel behilflich ist, oder kann die Wanderung des Proteins von der Stelle der Verabreichung verlangsamen.
Die Wahl eines Trägermaterials basiert auf der Biokompatibilität, der Biodegradierbarkeit, den mechanischen Eigenschaften, der kosmetischen Erscheinung und den Grenzflächen-Eigenschaften. Die bestimmte Anwendung der Zusammensetzungen wird die geeignete Formulierung definieren. Potenzielle Matrices für die Zusammensetzungen können biodegradierbar und chemisch definiert sein. Weitere Matrices umfassen reine Proteine oder extrazelluläre Matrixkomponenten. Andere potenzielle Matrices sind nicht biodegradierbar und chemisch definiert. Bevorzugte Matrices schließen auf Kollagen basierende Materialien wie den Helistat⁺-Schwamm (Integra LifeSciences, Plainsboro, N.J.) oder Kollagen in einer injizierbaren Form so wie sequestrierende Agenzien ein, die auch biodegradierbar sein können und die Alkylcellulose-Materialien einschließen können.
Eine andere bevorzugte Klasse der Trägers sind poröse, partikuläre, polymere Matrices, einschließlich Polymere von Poly(milchsäure), Poly(glycolsäure) und Co-Polymere von Milchsäure und Glycolsäure. Diese Matrices können auch ein sequestrierendes Agens einschießen. Geeignete polymere Matrices sind zum Beispiel in WO 93/00050 beschrieben.
Eine bevorzugte Familie von sequestrierenden Agenzien sind Cellulose-Materialien wie Alkylcellulosen (einschließlich Hydroxyalkylcellulosen), einschließlich Methylcellulose, Ethylcellulose, Hydroxyethylcellulose, Hydroxypropylcellulose, Hydroxypropylmethylcellulose und Carboxymethylcellulose, wobei kationische Salze der Carboxymethylcellulose (CMC) die bevorzugtesten sind. Andere bevorzugte sequestrierende Agenzien schließen Hyaluronsäure, Natriumalginat, Poly(ethylenglycol), Polyoxyethylenoxid, Carboxyvinylpolymer und Poly(vinylalkohol) ein. Die hierin nützliche Menge des sequestrierenden Agens ist 0,5-20 Gewichts-%, vorzugsweise 1-10 Gewichts-%, basierend auf dem Gesamtgewicht der Formulierung, das die nötige Menge darstellt, um die Desorption des Proteins von der Polymer-Matrix zu verhindern und um geeignete Handhabung der Zusammensetzung zu liefern, jedoch nicht so viel, dass verhindert wird, dass die Vorläuferzellen die Matrix infiltrieren, wodurch dem Protein die Möglichkeit geboten wird, die Aktivität der Vorläuferzellen zu unterstützen.
Zusätzliche wahlweise Komponenten, die in der Praxis der vorliegenden Anmeldung nützlich sind, schließen z.B. Gefrierschutzmittel wie Mannit, Saccharose, Lactose, Glucose oder Glycin (um das Protein vor der Degradierung während der Lyophilisierung zu schützen), antimikrobielle Konservierungsmittel wie Methyl- und Propyl-Parabene und Benzylalkohol; Antioxidanzien wie EDTA, Citrat und BHT (butyliertes Hydroxytoluol); und oberflächenaktive Stoffe wie Poly(sorbate) und Poly(oxyethylene); usw. ein.
Die Erfindung beschreibt darüber hinaus Verfahren zum Behandeln einer Anzahl von Sehnendefekten wie die Regenerierung von Sehne/Band-ähnlichem Gewebe in Bereichen eines Sehne- oder Band-Schadens, um die Reparatur von Rissen von Sehnengewebe, Ligamenten und verschiedenen anderen Typen von Gewebedefekten oder Wunden zu unterstützen. Diese Verfahren gemäß der Erfindung bringen die Verabreichung einer Zusammensetzung, die eine wirksame Menge eines Sehne/Band-ähnliches Gewebe-induzierenden Proteins, wie in SEQ ID NO:2 und/oder SEQ ID NO:26 beschrieben, umfasst, an einen Patienten, der die Reparatur eines solchen Sehne/Band-ähnlichen Gewebes oder eines anderen Gewebes benötigt mit sich. Diese Verfahren können auch die Verabreichung eines Sehne/Band-ähnliches Gewebe-induzierenden Proteins in Verbindung mit mindestens einem der oben beschriebenen BMP-Proteine mit sich bringen.
Die beschriebenen Verfahren können die Verabreichung eines heterodimeren Proteins mit sich bringen, in dem eines der Monomere ein Sehne/Band-ähnliches Gewebe-induzierendes Polypeptid wie BMP-12 oder VL-1 (BMP-13) ist und das zweite Monomer ein Mitglied der TGF-β-Überfamilie von Wachstumsfaktoren ist. Zusätzlich können diese Verfahren auch die Verabreichung eines Sehne/Band-ähnliches Gewebe-induzierenden Proteins mit anderen Wachstumsfaktoren, einschließlich EGF, FGF, TGF-α, TGF-β und IGF, einschließen.
Die Erfindung beschreibt auch ein therapeutisches Verfahren und eine Zusammensetzung für das Reparieren von Sehne/Band-ähnlichem Gewebe, für das Reparieren einer Sehne oder eines Bands so wie die Behandlung von Tendinitis und anderen Zuständen, die mit Sehne- oder Band-Defekten in Beziehung stehen. Solche Zusammensetzungen umfassen eine therapeutisch wirksame Menge von einem oder mehreren Sehne/Band-ähnliches Gewebe-induzierenden Proteinen wie BMP-12, einem BMP-12-verwandten Protein in einer Zumischung mit einem pharmazeutisch verträglichen Vehikel, Träger oder einer pharmazeutisch verträglichen Matrix.
Das Dosierungsschema wird durch den behandelnden Arzt mit Rücksicht auf verschiedene Faktoren, die die Wirkung der Zusammensetzung modifizieren, z.B. der Menge des Sehne- oder Band-Gewebes, von dem gewünscht wird, dass es gebildet wird, der Stelle der Sehne- oder Band-Schädigung, des Zustands der geschädigten Sehne oder des geschädigten Bands, der Größe einer Wunde, des Typs des geschädigten Gewebes, des Alters, Geschlechts und der Ernährung des Patienten, der Schwere von jeglicher Infektion, der Zeit der Verabreichung und anderen klinischen Faktoren, bestimmt. Die Dosis kann mit dem Typ der in der Rekonstitution verwendeten Matrix und den Typen von zusätzlichen Proteinen in der Zusammensetzung variieren. Die Zugabe von anderen bekannten Wachstumsfaktoren wie IGF-I (Insulin-ähnlicher Wachstumsfaktor I) zu der endgültigen Zusammensetzung kann auch die Dosierung beeinflussen.
Der Fortschritt kann durch periodische Bewertung der Bildung von Sehne/Band-ähnlichem Gewebe oder des Wachstums und/oder der Reparatur einer Sehne oder eines Bands überwacht werden. Der Fortschritt kann durch Verfahren, die auf dem Fachgebiet bekannt sind, zum Beispiel Röntgen, Arthroskopie, histomorphometrische Determinationen und Tetracyclin-Markierung, überwacht werden.
Die folgenden Beispiele illustrieren die Handhabung der vorliegenden Erfindung bei der Gewinnung und Charakterisierung eines menschlichen Sehne/Band-ähnliches Gewebe-induzierenden Proteins und dessen Anwendung, um die anderen Sehne/Band-ähnliches Gewebe-induzierenden Proteine zu gewinnen, beim Erhalt von menschlichen Proteinen, bei der Expression der Proteine durch rekombinante Techniken, und der Demonstration der Fähigkeit der Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung, Sehne/Band-ähnliches Gewebe in einem in vivo-Modell zu bilden. Obwohl die Beispiele die Erfindung in Bezug auf BMP-12 darstellen, wird angenommen, dass mit kleinen Modifikationen, die innerhalb des Fachkönnens liegen, die selben Ergebnisse mit VL-1 erreichbar sind.
BEISPIEL 1
Isolierung von DNA
DNA-Sequenzen, die BMP-12 und BMP-12-verwandte Proteine codieren, können durch verschiedene Techniken, die Fachleuten bekannt sind, isoliert werden. Wie unten beschrieben, können Oligonucleotidprimer auf der Basis der Aminosäuresequenzen, die in anderen BMP-Proteinen, Vg-1-verwandten Proteinen und anderen Proteinen der TGF-β-Überfamilie vorhanden sind, gestaltet werden. Regionen, die Aminsäuresequenzen enthalten, die innerhalb der BMP-Familie von Proteinen und innerhalb von anderen Mitgliedern der TGF-β-Überfamilie von Proteinen hochgradig konserviert sind, können identifiziert werden, und Konsens-Aminosäuresequenzen von diesen hochgradig konservierten Regionen können basierend auf der Ähnlichkeit der korrespondierenden Regionen von individuellen BMP/TGF-β/Vg-1-Proteinen konstruiert werden. Ein Beispiel einer solchen Konsensus-Aminosäuresequenz ist unten angezeigt.
Konsensus-Aminosäuresequenz (1):

Trp-Gln/Asn-Asp-Trp-Ile-Val/Ile-Ala (SEQ ID NO:16), wobei X/Y anzeigt, dass jeder Aminosäurerest an jener Position erscheinen kann.

Das folgende Oligonucleotid wird auf der Basis der oben identifizierten Konsensus-Aminosäuresequenz (1) gestaltet:
#1: CGGATCCTGGVANGAYTGGATHRTNGC (SEQ ID NO:17)
Diese Oligonucleotidsequenz wird auf einem automatisierten DNA-Synthesegerät synthetisiert. Die Standard-Nucleotidsymbole in den oben identifizierten Oligonucleotidprimern sind wie folgt: A, Adenosin; C, Cytosin; G, Guanin; T, Thymin; N, Adenosin oder Cytosin oder Guanin oder Thymin; R, Adenosin oder Cytosin; Y, Cytosin oder Thymin; H, Adenosin oder Cytosin oder Thymin; V, Adenosin oder Cytosin oder Guanin; D, Adenosin oder Guanin oder Thymin.
Die ersten sieben Nucleotide von Oligonucleotid #1 (unterstrichen) enthalten die Erkennungssequenz für die Restriktionsendonuclease BamHI, um die Manipulation einer spezifisch amplifizierten DNA-Sequenz, die das BMP-12-Protein codiert, zu erleichtern und stammen daher nicht von der oben dargelegten Konsensus-Aminosäuresequenz (1) ab.
Eine zweite Konsensus-Aminosäuresequenz wird von einer anderen hochgradig konservierten Region der BMP/TGF-β/Vg-1-Proteine, wie unten beschrieben, abgeleitet:
His-Ala-Ile-Val/Leu-Gln-Thr (SEQ ID NO:18)
Das folgende Oligonucleotid wird auf der Basis der oben identifizierten Konsensus-Aminosäuresequenz (2) gestaltet:
#2: TTTCTAGAARNGTYTGNACDATNGCRTG (SEQ ID NO:19)
Diese Oligonucleotidsequenz wird auf einem automatisierten DNA-Synthesegerät synthetisiert. Es werden die selben Nucleotidsymbole, wie oben beschrieben, verwendet.
Die ersten sieben Nucleotide von Oligonucleotid #1 (unterstrichen) enthalten die Erkennungssequenz für die Restriktionsendonuclease XbaI, um die Manipulation einer spezifisch amplifizierten DNA-Sequenz, die das BMP-12-Protein codiert, zu erleichtern und stammen daher nicht von der oben dargelegten Konsensus-Aminosäuresequenz (2) ab.
Es wird in Betracht gezogen, dass das BMP-12-Protein der Erfindung und andere BMP/TGF-β/Vg-1-verwandte Proteine Aminosäuresequenzen enthalten können, die ähnlich zu den oben beschriebenen Konsensus-Aminosäuresequenzen sind, und dass die Lokalisation von jenen Sequenzen innerhalb eines BMP-12-Proteins oder von anderen neuen, verwandten Proteinen den relativen Lokalisationen in den Proteinen, von denen sie abgeleitet wurden, entsprechen würden. Es wird darüber hinaus in Betracht gezogen, dass diese positionelle Information, die von der Struktur von anderen BMP/TGF-β/Vg-1-Proteinen und den Oligonucleotidsequenzen #1 und #2 abgeleitet wurde, die von den Konsensus-Aminosäuresequenzen (1) beziehungsweise (2) abgleitet worden sind, ausgenutzt werden könnte, um spezifisch DNA-Sequenzen zu amplifizieren, die die entsprechenden Aminosäuren eines BMP-12-Proteins oder von anderen BMP/TGF-β/Vg-1-verwandten Proteinen codieren.
Basierend auf der Kenntnis der Genstrukturen von BMP/TGF-β/Vg-1-Proteinen wird weiter in Betracht gezogen, dass menschliche, genomische DNA als eine Matrize verwendet werden kann, um spezifische Amplifikationsreaktionen durchzuführen, die in der Identifizierung von BMP-12 BMP/TGF-β/Vg-1 (BMP-12-verwandtes Protein)-codierenden Sequenzen resultieren würden. Solche spezifischen Amplifizierungsreaktionen einer menschlichen, genomischen DNA-Matrize könnten mit der Verwendung der früher beschriebenen Oligonucleotidprimer #1 und #2 initiiert werden. Die oben identifizierten Oligonucleotide #1 und #2 werden als Primer verwendet, um die spezifische Amplifizierung einer spezifischen Nucleotidsequenz von menschlicher genomischer DNA zu ermöglichen. Die Amplifikationsreaktion wird wie folgt durchgeführt:
Menschliche, genomische DNA (Quelle: periphere Blutlymphocyten), die von Ken Jacobs vom Genetics Institute zur Verfügung gestellt wurde, wird durch wiederholte Passage durch eine 25-Gauge-Nadel geschert, bei 100°C für 5 Minuten denaturiert und dann auf Eis abgekühlt, bevor sie zu einem Reaktionsgemisch zugefügt wird, das je 200 μM Desoxynucleotid-Triphosphate (dATP, dGTP, dCTP und dTTP), 10 mM Tris-HCl pH 8,3, 50 mM KCl, 1,5 mM MgCl₂, 0,001% Gelatine, 1,25 Einheiten Taq-DNA-Polymerase, 100 pM Oligonucleotid #1 und 100 pM Oligonucleotid #2 enthält. Dieses Reaktionsgemisch wird bei 94°C für zwei Minuten inkubiert und dann den Thermozyklen in der folgenden Weise ausgesetzt: 1 Minute bei 94°C, 1 Minute bei 40°C, 1 Minute bei 72°C für drei Zyklen; dann 1 Minute bei 94°C, 1 Minute bei 55°C, 1 Minute bei 72°C für 37 Zyklen, gefolgt von einer 10 Minuten-Inkubation bei 72°C.
Die DNA, die durch diese Reaktion spezifisch amplifiziert wird, wird Ethanol-präzipitiert, mit den Restriktionsendonucleasen BamHI und XbaI verdaut und einer Agarose-Gelelektrophorese unterzogen. Eine Region auf dem Gel, die der vorhergesagten Größe des BMP-12 oder eines anderen BMP/TGF-β/Vg-1-codierenden DNA-Fragments entspricht, wird ausgeschnitten, und die darin enthaltenen spezifisch amplifizierten DNA-Fragmente werden elektro-eluiert und in den Plasmidvektor pGEM-3 zwischen die XbaI- und BamHI-Stellen des Polylinkers sub-cloniert. Die DNA-Sequenzanalyse von einem der resultierenden BMP-12-verwandten Subclone weist darauf hin, dass das darin enthaltene, spezifisch amplifizierte DNA-Sequenz-Produkt einen Teil des BMP-12-Proteins der Erfindung codiert.
Die DNA-Sequenz (SEQ ID NO:5) und die abgeleitete Aminosäuresequenz (SEQ ID NO:6) dieses spezifisch amplifizierten DNA-Fragments von BMP-12 sind in dem SEQUENZ-Protokoll gezeigt.
Die Nucleotide #1-#26 von SEQ ID NO:5 umfassen einen Teil von Oligonucleotid #1, und die Nucleotide #103 – #128 umfassen einen Teil des umgekehrten Komplements von Oligonucleotid #2, das angewendet wird, um die spezifische Amplifikationsreaktion durchzuführen. Auf Grund der Funktion der Oligonucleotide #1 und #2 im Initiieren der Amplifikationsreaktion müssen sie nicht exakt der tatsächlichen Sequenz entsprechen, die ein BMP-12-Protein codiert, und werden daher nicht in die entsprechende Aminosäure-Ableitung (SEQ ID NO:6) translatiert.
Die DNA-Sequenzanalyse eines anderen Subclons weist darauf hin, dass das spezifisch amplifizierte DNA-Produkt, das darin enthalten ist, einen Teil eines anderen BMP/TGF-β/Vg-1- (BMP-12-verwandten) Proteins der Erfindung, genannt VL-1, codiert.
Die DNA-Sequenz (SEQ ID NO:7) und die abgeleitete Aminosäuresequenz (SEQ ID NO:8) dieses spezifisch amplifizierten DNA-Fragments sind in dem Sequenzprotokoll gezeigt.
Die Nucleotide #1 – #26 von SEQ ID NO:7 umfassen einen Teil von Oligonucleotid #1, und die Nucleotide #103 – #128 umfassen einen Teil des umgekehrten Komplements von Oligonucleotid #2, das verwendet wird, um die spezifische Amplifikationsreaktion durchzuführen. Auf Grund der Funktion der Oligonucleotide #1 und #2 im Initiieren der Amplifikationsreaktion müssen sie nicht exakt der tatsächlichen Sequenz entsprechen, die ein VL-1-Protein der Erfindung codiert, und werden daher nicht in die entsprechende Aminosäure-Ableitung (SEQ ID NO:8) translatiert.
Die folgende Oligonucleotidsonde wird auf der Basis der spezifisch amplifizierten menschlichen BMP-12-DNA-Sequenz, die oben dargelegt ist (SEQ IDNO:5), gestaltet und auf einem automatisierten DNA-Synthesegerät synthetisiert:
#3: CCACTGCGAGGGCCTTFGCGACTTCCCTTTGCGTTCGCAC (SEQ ID NQ:20)
Diese Oligonucleotidsonde wird radioaktiv mit ³²P markiert und wird angewendet, um eine menschliche genomische Genbank zu screenen, die in den Vektor λFIX (Stratagene, Katalog #944201) eingebaut wurde. 500 000 Rekombinante der menschlichen genomischen Genbank werden in einer Dichte von ungefähr 10 000 Rekombinante pro Platte auf 50 Platten plattiert. Doppelte Nitrocellulose-Kopien der rekombinanten Bakteriophagen-Plaques und an die Oligonucleotidsonde #3 in einem Standard-HybridisierungspufFer (SNB = 5 × SSC, 0,1% SDS, 5 × Denhardt, 100 μg/ml Lachssperma-DNA) bei 65°C über Nacht hybridisiert. Am folgenden Tag wird das radioaktiv-markierte Oligonucleotid, das die Hybridisierungslösung enthält, entfernt, und die Filter werden mit 0,2 × SSC, 0,1% SDS bei 65°C gewaschen. Eine einzige positiv hybridisierende Rekombinante wird identifiziert und plaquegereinigt. Dieser plaquegereinigte, rekombinante Bakteriophagenclon, der an die BMP-12-Oligonucleotidsonde #3 hybridisiert, wird als λHuG-48 bezeichnet. Eine Bakteriophagenplattenstammlösung wird hergestellt, und die Bakteriophagen-DNA wird von dem menschlichen, genomischen λHuG-48-Clon isoliert. Die Bakteriophage λHuG-48 ist bei der American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD „ATCC" unter der Zugangsnummer 75625 am 7. Dezember, 1993 hinterlegt worden. Diese Hinterlegung entspricht den Anforderungen des Budapester Vertrags der Internationalen Anerkennung der Hinterlegung von Mikroorganismen für den Zweck von Patentverfahren und den darunter fallenden Bestimmungen. Die Oligonucleotid-Hybridisierungsregion dieser Rekombinante λHuG-48 ist in einem 3,2 kb-BamHI-Fragment lokalisiert. Dieses Fragment wird in einen Plasmidvektor (pGEM-3) subcloniert, und eine DNA-Sequenzanalyse wird durchgeführt. Dieser Plasmidclon wird als PCR1-1#2 bezeichnet und ist bei der American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD „ATCC" unter der Zugangsnummer 69517 am 7. Dezember, 1993 hinterlegt worden. Diese Hinterlegung entspricht den Anforderungen des Budapester Vertrags der Internationalen Anerkennung der Hinterlegung von Mikroorganismen für den Zweck von Patentverfahren und den darunter fallenden Bestimmungen. Die teilweise DNA-Sequenz (SEQ ID NO:1) und die abgeleitete Aminosäuresequenz (SEQ ID NO:2) der 3,2 kb-DNA-Insertion des Plasmid-Subclons PCR1-1#2, abgeleitet vom Clon λHuG-48, sind in dem Sequenzprotokoll gezeigt.
Es sollte erwähnt werden, dass die Nucleotide #639 -# 714 von SEQ ID NO:1 den Nucleotiden #27 – #102 des spezifisch amplifizierten, BMP-12-codierenden DNA-Fragments, das in SEQ ID NO:5 dargelegt ist, entsprechen, was daher bestätigt, dass der menschliche, genomische Bakeriophagen-Clon λHuG-48 und der abgeleitete Subclon PCR1-1#2 mindestens einen Teil des BMP-12-Proteins der Erfindung codieren. Die Nucleotidsequenz eines Teils der 3,2 kb-BamHI-Insertion des Plasmids PCR1-1#2 enthält einen offenen Leseraster von mindestens 882 Basenpaaren, wie durch die Nucleotide #1-#882 von SEQ ID NO:1 definiert. Dieser offene Leserrahmen codiert mindestens 294 Aminosäuren des menschlichen BMP-12-Proteins der Erfindung. Das codierte menschliche 294 Aminosäuren-BMP-12-Protein schließt das vollständige, reife menschliche BMP-12-Protein (Aminosäuren #1-#104 von SEQ ID NO:2) so wie den C-terminalen Teil der Pro-Peptidregion des primären Translationsprodukts (Aminosäure #-190 bis #-1 von SEQ ID NO:2) ein.
Eine zusätzliche DNA-Sequenz der 3,2 kb-BamHI-Insertion des Plasmids PCR1-1#2, das in SEQ ID NO:33 dargelegt ist, zeigt die Anwesenheit eines 1164 kb langen, offenen Leserasters, das durch die Nucleotide #138 bis #1301 von SEQ ID NO:33 definiert ist. [MAN BEACHTE, dass die ganze Sequenz, die in SEQ ID NO:1 offenbart ist, in SEQ ID NO:33 enthalten ist]. Da diese Sequenz von einem genomischen Clon abgeleitet ist, ist es schwer, die Grenze zwischen der 5'-Ausdehnung der codierenden Sequenz und der 3'-Grenze der intervenierenden Sequenz (Intron/nicht-codierende Sequenz) festzustellen.
Basierend auf der Kenntnis der anderen BMP-Proteine und von anderen Proteinen innerhalb der TGF-β-Familie wird vorhergesagt, dass das Vorläufer-Polypeptid an der multibasischen Sequenz Arg-Arg-Gly-Arg in Übereinstimmung mit einer vorgeschlagenen proteolytischen Konsensus-Prozessierungssequenz von Arg-X-X-Arg gespalten werden würde. Von der Spaltung des BMP-12-Vorläufer-Polypeptids wird erwartet, dass sie ein reifes 104 Aminosäure-Peptid hervorbringt, das mit der Aminosäure Ser bei der Position #1 von SEQ ID NO:2 beginnt. Von der Prozessierung von BMP-12 in die reife Form wird erwartet, dass sie Dimerisierung und Entfernen der N-terminalen Region in einer Weise involviert, die analog ist zu der Prozessierung des verwandten Proteins TGF-β [Gentry et al., Molec & Cell. Biol., 8:4162 (1988); Derynck et al. Nature, 316:701 (1985)].
Es wird daher in Betracht gezogen, dass die reife, aktive Art von BMP-12 ein Homodimer von zwei Polypeptid-Untereinheiten umfasst, wobei jede Untereinheit die Aminosäuren #1 bis #104 von SEQ ID NO:2 mit einem vorhergesagten Molekulargewicht von ungefähr 12 000 Dalton umfasst. Darüber hinaus werden aktive Arten in Betracht gezogen, die mindestens die Aminosäuren #3 bis #103 von SEQ ID NO:2 umfassen, wodurch sie den ersten und den letzten konservierten Cystein-Rest einschließen. Wie bei anderen Mitgliedern der TGF-β/BMP-Familie von Proteinen zeigt der Carboxy-terminale Teil des BMP-12-Proteins eine größere Sequenz-Konservierung als der mehr aminoterminale Teil. Die Aminosäure-Identität in Prozent des menschlichen BMP-12-Proteins in der Cystein-reichen C-terminalen Domäne (Aminosäuren #3 – #104) mit der entsprechenden Region der menschlichen BMP-Proteine und anderen Proteinen in der TGF-β-Familie ist wie folgt: BMP-2, 55%; BMP-3, 43%; BMP-4, 53%; BMP-5, 49%; BMP-6, 49%, BMP-7, 50%; BMP-8, 57%; BMP-9, 48%, BMP-10, 57%; Activin WC (BMP-11), 38%, Vg1, 46%; GDF-1, 47%; TGF-β1, 36%; TGF-β2, 36%; TGF-β3, 39%; Inhibin β(B), 36%; Inhibin β(A), 41 %.
Die menschliche BMP-12-DNA-Sequenz (SEQ ID NO:1) oder ein Teil davon kann als eine Sonde verwendet werden, um eine menschliche Zelllinie oder ein menschliches Gewebe zu identifizieren, die/das BMP-12-mRNA synthetisiert. Kurz beschrieben wird RNA von einer ausgewählten Zell- oder Gewebe-Quelle extrahiert und entweder auf einem Formaldehyd-Agarosegel einer Elektrophorese unterzogen und auf Nitrocellulose übertragen oder mit Formaldehyd reagieren gelassen und direkt auf Nitrocellulose getüpfelt. Die Nitrocellulose wird dann an eine Sonde hybridisiert, die von der codierenden Sequenz des menschlichen BMP-12 abgeleitet ist.
Alternativ wird die menschliche BMP-12-Sequenz verwendet, um Oligonucleotidprimer zu gestalten, die spezifisch einen Teil der BMP-12-codierenden Sequenz amplifizieren werden, der in der Region zwischen den angewendeten Primern gelegen ist, um die spezifische Amplifizierungsreaktion durchzuführen. Es wird in Betracht gezogen, dass diese von menschlichem BMP-12 abgeleiteten Primer es einem ermöglichen würden, entsprechende BMP-12-codierende Sequenzen von mRNA-, cDNA- oder genomischen DNA-Matrizen spezifisch zu amplifizieren. Sobald eine positive Quelle durch eines der oben beschrieben Verfahren identifiziert worden ist, wird mRNA durch oligo(dT)-Cellulose-Chromatographie ausgewählt, und cDNA wird synthetisiert und in λgt10 oder andere λ-Bakteriophagen-Vektoren, die Fachleuten bekannt sind, zum Beispiel λZAP durch etablierte Techniken (Toole et al., obenstehend) cloniert. Es ist auch möglich, die oben beschriebene Oligonucleotid-Primer-gelenkte Amplifizierungsreaktion direkt an einer vor-etablierten menschlichen cDNA- oder genomischen Genbank durchzuführen, die in einen λ-Bakteriophagen-Vektor cloniert worden ist. In solch einem Fall könnte eine Genbank, die ein spezifisch amplifiziertes DNA-Produkt ergibt, das einen Teil des menschlichen BMP-12-Proteins codiert, direkt unter Anwendung des Fragments der amplifizierten, BMP-12-codierenden DNA als eine Sonde durchmustert werden.
Von den Oligonucleotidprimern, die auf der Basis der DNA-Sequenz des menschlichen, genomischen BMP-12-Clons λHuG-48 gestaltet wurden, wird vorhergesagt, dass sie die spezifische Amplifikation von menschliches BMP-12-codierenden DNA-Sequenzen von vor-etablierten menschlichen cDNA-Genbanken, die kommerziell erhältlich sind (d.h. Stratagene, La Jolla, CA oder Clontech Laboratories, Inc., Palo Alto, CA), ermöglichen. Der folgende Oligonucleotidprimer wird auf der Basis der Nucleotide #571 bis #590 der in SEQ ID NO:1 dargelegten DNA-Sequenz gestaltet und auf einem automatisierten DNA-Synthesegerät synthetisiert:
#4: TGCGGATCCAGCCGCTGCAGCCGCAAGCC (SEQ ID NO:21)
Die ersten neun Nucleotide von Primer #4 (unterstrichen) umfassen die Erkennungssequenz für die Restriktionsendonuclease BamHI, die verwendet werden kann, um die Manipulation einer spezifisch amplifizierten DNA-Sequenz, die das menschliche BMP-12-Protein der Erfindung codiert, zu ermöglichen, und sind daher nicht von der in SEQ ID NO:1 dargelegten DNA-Sequenz abgeleitet.
Der folgende Oligonucleotidprimer wird auf der Basis der Nucleotide #866 – #885 der in SEQ ID NO:1 dargelegten DNA-Sequenz gestaltet und auf einem automatisierten DNA-Synthesegerät synthetisiert:
#5 GACTCTAGACTACCTGCAGCCGCAGGCCT (SEQ ID NO:22)
Die ersten neun Nucleotide von Primer #5 (unterstrichen) umfassen die Erkennungssequenz für die Restriktionsendonuclease XbaI, die verwendet werden kann, um die Manipulation einer spezifisch amplifizierten DNA-Sequenz, die das menschliche BMP-12-Protein der Erfindung codiert, zu ermöglichen, und sind daher nicht von der in SEQ ID NO:1 dargelegten DNA-Sequenz abgeleitet.
Die Nucleotid-Standardsymbole in den oben identifizierten Primern sind wie folgt: A, Adenin; C, Cytosin; G, Guanin; T, Thymin.
Die oben identifizierten Primer #4 und #5 werden als Primer verwendet, um die Amplifikation einer spezifischen BMP-12-codierenden Nucleotidsequenz von vor-etablierten cDNA-Genbanken zu ermöglichen, die das Folgende einschließen können: menschliches fötales Gehirn-cDNA/λZAPII (Stratagene Katalog #936206), menschliche Leber/λUNI-ZAP XR (Stratagene Katalog #937200), menschliche Lunge/λUNI-ZAP XR (Stratagene Katalog #937206) und menschliche fötale Milz/UNI-ZAP XR (Stratagene Katalog #937205).
Ungefähr 1 × 10⁸ PBE (Plaque-bildende Einheiten) von λ-Bakteriophagen-Genbanken, enthaltend menschliche cDNA-Insertionen wie jene, die oben detailliert angeführt sind, werden bei 95°C für fünf Minuten denaturiert, vor der Zugabe zu einem Reaktionsgemisch, enthaltend je 200 μM Desoxynucleotid-Triphosphate (dATP, dGTP, dCTP und dTTP), 10 mM Tris-HCl pH8,3, 50 mM KCl, 1,5 mM MgCl₂, 0,001 % Gelatine, 1,25 Einheiten Taq-DNA-Polymerase, 100 pM Oligonucleotidprimer #4 und 100 pM Oligonucleotidprimer #5. Das Reaktionsgemisch wird dann in der folgenden Weise Thermozyklen unterzogen: 1 Minute bei 94°C, 1 Minute bei 50°C, 1 Minute bei 72°C für 39 Zyklen, gefolgt von 10 Minuten bei 72°C.
Von der DNA, die durch diese Reaktion spezifisch amplifiziert wird, würde erwartet werden, dass sie ein BMP-12-codierendes Produkt von ungefähr 333 Basenpaaren herstellt, dessen interne 315 Basenpaare den Nucleotiden #571 bis #885 von SEQ ID NO:1 entsprechen und das auch 9 bp an jedem Ende des BMP-12-spezifischen Fragments einschließt, die den Restriktionsstellen entsprechen, die durch die Nucleotide #1 – #9 der Primer #4 und #5 definiert sind. Das resultierende 333 bp-DNA-Produkt wird mit den Restriktionsendonucleasen BamHI und XbaI verdaut, Phenol-extrahiert, Chloroform-extrahiert und Ethanol-präzipitiert.
Alternativ zu der Ethanol-Präzipitation wird ein Puffer-Austausch und Entfernen von kleinen Fragmenten der DNA, die aus dem BamHI/XbaI-Restriktionsverdau resultieren, durch Verdünnen des verdauten DNA-Produkts in 10 mM Tris-HCl pH 8,0, 1 mM EDTA, gefolgt von einer Zentrifugation durch einen Centricon^TM 30 Micro-Konzentriergerät (W.R. Grace & Co., Beverly, MA; Produkt #4209) erreicht. Das resultierende BamHI/XbaI-verdaute, amplifizierte DNA-Produkt wird in einen Plasmid-Vektor (d.h. pBluescript, pGEM-3, usw.) zwischen die BamHI- und die XbaI-Stellen der Polylinker-Region subcloniert. DNA-Sequenzanalyse der resultierenden Subclone würde erforderlich sein, um die Integrität der BMP-12-codierenden Insertion zu bestätigen. Sobald eine positive cDNA-Quelle auf diese Weise identifiziert worden ist, könnte die entsprechende cDNA-Genbank, von der eine 333 bp lange, BMP-12-spezifische Sequenz amplifiziert wurde, direkt mit der 333 bp-Insertion oder anderen BMP-12-spezifischen Sonden durchmustert werden, um cDNA-Clone, die das Volllängen-BMP-12-Protein der Erfindung codieren, zu identifizieren und zu isolieren.
Zusätzliche Verfahren, die Fachleuten bekannt sind, können verwendet werden, um andere Volllängen-cDNAs, die menschliches BMP-12-verwandte Proteine oder Volllängen-cDNA-Clone, die BMP-12-verwandte Proteine der Erfindung von anderen Spezies als dem Menschen, insbesondere von anderen Säuger-Spezies codieren, zu isolieren.
Die folgenden Beispiele demonstrieren die Verwendung der menschlichen BMP-12-Sequenz, um Homologe von BMP-12-verwandten Proteinen in einer murinen genomischen DNA-Genbank zu isolieren.
Von der DNA-Sequenz, die das menschliche BMP-12-Protein der Erfindung codiert, wird vorausgesagt, dass sie signifikant homolog zu BMP-12 und BMP-12-verwandten Sequenzen von anderen Spezies als dem Menschen ist und verwendet werden könnte, um DNA-Sequenzen von jenen anderen Spezies spezifisch zu amplifizieren, die die entsprechenden BMP-12-verwandten Proteine codieren würden. Insbesondere werden die folgenden Oligonucleotide auf der Basis der menschlichen BMP-12-Sequenz (SEQ ID NO:1) gestaltet und werden auf einem automatisierten DNA-Synthesegerät synthetisiert.
#6: GCGGATCCAAGGAGCTCGGCTGGGACGA (SEQ ID NO:23)
#7: GGAATTCCCCACCACCATGTCCTCGTAT (SEQ ID NO:24)
Die ersten acht Nucleotide der Oligonucleotidprimer #6 und #7 (unterstrichen) umfassen die Erkennungssequenz für die Restriktionsendonucleasen BamHI beziehungsweise EcoRI. Diese Sequenzen werden verwendet, um die Manipulation einer spezifisch amplifizierten DNA-Sequenz, die ein BMP-12- oder ein BMP-12-verwandtes Protein von einer anderen Spezies als dem Menschen codiert, zu ermöglichen, und sind daher nicht von der in SEQ ID NO:1 dargelegten DNA-Sequenz abgeleitet. Der Oligonucleotidprimer #6 wird auf der Basis der Nucleotide #607-#626 von SEQ ID NO:1 gestaltet. Der Oligonucleotidprimer #7 wird auf der Basis des umgekehrten Komplements der Nucleotide #846-#865 der in SEQ ID NO:1 dargelegten DNA-Sequenz gestaltet.
Die oben identifizierten Oligonucleotidprimer #6 und #7 werden als Primer verwendet, um die Amplifikation von spezifischen BMP-12-verwandten Sequenzen von genomischer DNA, die von anderen Spezies als dem Menschen abgeleitet wurden, zu ermöglichen. Die Amplifikationsreaktion wird wie folgt durchgeführt:
Murine genomische DNA (Quelle: Stamm Balb c) wird durch wiederholte Passage durch eine 25 Gauge-Nadel geschert, bei 100°C für fünf Minuten denaturiert und dann auf Eis abgekühlt, bevor sie zu einem Reaktionsgemisch, enthaltend je 200 μM Desoxynucleotid-Triphosphate (dATP, dGTP, dCTP und dTTP), 10 mM Tris-HCl pH 8,3, 50 mM KCl, 1,5 mM MgCl₂, 0,001% Gelatine, 1,25 Einheiten Taq-DNA-Polymerase, 100 pM Oligonucleotidprimer #6 und 100 pM Oligonucleotidprimer #7, zugefügt wird. Das Reaktionsgemisch wird dann in der folgenden Weise den Thermozyklen unterzogen: 1 Minute bei 95°C, 1 Minute bei 55°C, 1 Minute bei 72°C für 40 Zyklen, gefolgt von 10 Minuten bei 72°C.
Die DNA, die spezifisch durch diese Reaktion amplifiziert wird, wird Ethanol-präzipitiert, mit den Restriktionsendonucleasen BamHI und EcoRI verdaut und einer Agarose-Gelelektrophorese unterzogen. Eine Region des Gels, die der vorausgesagten Größe des murinen BMP-12- oder eines BMP-12-verwandten codierenden DNA-Fragments entspricht, wird ausgeschnitten und die darin enthaltenen spezifisch amplifizierten DNA-Fragmente werden extrahiert (durch Elektro-Elution oder durch andere Verfahren, die Fachleuten bekannt sind) und in einen Plasmid-Vektor wie pGEM-3 oder pBluescript zwischen die BamHI- und EcoRI-Stellen des Polylinkers subcloniert. Die DNA-Sequenzanalyse von einem der resultierenden Subclone, genannt mV1, weist darauf hin, dass die darin enthaltene, spezifisch amplifizierte DNA-Sequenz einen Teil eines Proteins codiert, das das murine Homolog zu entweder der BMP-12- oder der VL-1-Sequenz der Erfindung zu sein scheint. Die DNA-Sequenz (SEQ ID NO:10) und die abgeleitete Aminosäuresequenz (SEQ ID NO:11) dieses spezifisch amplifizierten murinen DNA-Fragments sind in dem Sequenzprotokoll gezeigt.
Die Nucleotide #1-#26 von SEQ ID NO:10 umfassen einen Teil von Oligonucleotid #6, und die Nucleotide #246-#272 umfassen einen Teil des umgekehrten Komplements von Oligonucleotid #7, das verwendet wird, um die spezifische Amplifikationsreaktion durchzuführen. Nucleotid #27 von SEQ ID NO:10 scheint das letzte Nucleotid eines Codon-Tripletts zu sein, und die Nucleotide #244-#245 von SEQ ID NO:10 scheinen die ersten zwei Nucleotide eines Codon-Tripletts zu sein. Daher entsprechen die Nucleotide #28 bis #243 von SEQ ID NO:10 einer teilweisen codierenden Sequenz von mV1. Auf Grund der Funktion der Oligonucleotide #6 und #7 im Iniziieren der Amplifikationsreaktion müssen sie nicht genau der tatsächlichen Sequenz entsprechen, die das murine Homolog zum menschlichen BMP-12- oder VL-1-Protein der Erfindung codiert, und werden daher nicht in die entsprechende Aminosäuresequenz-Ableitung (SEQ ID NO:11) translatiert.
Oligonucleotidsonden, die auf der Basis der spezifisch amplifizierten murinen BMP-12- oder VL-1-DNA-Sequenz, die in SEQ ID NO:10 dargelegt ist, gestaltet wurden, können von Fachleuten verwendet werden, um die murinen Volllängen-BMP-12- oder -VL-1-codierenden Clone (entweder cDNA oder genomisch) zu identifizieren.
Die DNA-Sequenzanalyse eines anderen der resultierenden Subclone, genannt mV2, weist darauf hin, dass die spezifisch amplifizierte DNA-Sequenz, die darin enthalten ist, einen Teil einer murinen BMP-12-verwandten Sequenz der Erfindung codiert. Die DNA-Sequenz (SEQ ID NO:12) und die abgeleitete Aminosäuresequenz (SEQ ID NO:13) dieses spezifisch amplifizierten murinen DNA-Fragments sind in dem Sequenzprotokoll gezeigt.
Die Nucleotide #1-#26 von SEQ ID NO:12 umfassen einen Teil von Oligonucleotid #6, und die Nucleotide #246-#272 umfassen einen Teil des umgekehrten Komplements von Oligonucleotid #7, die verwendet werden, um die spezifische Amplifikationsreaktion durchzuführen. Nucleotid #27 von SEQ ID NO:12 scheint das letzte Nucleotid eines Codon-Tripletts zu sein, und die Nucleotide #244-#245 von SEQ ID NO:12 scheinen die ersten zwei Nucleotide eines Codon-Tripletts zu sein. Daher entsprechen die Nucleotide #28 bis #243 von SEQ ID NO:12 einer teilweisen codierenden Sequenz von mV2. Auf Grund der Funktion der Oligonucleotide #6 und #7 im Initiieren der Amplifikationsreaktion müssen sie nicht genau der tatsächlichen Sequenz entsprechen, die das murine BMP-12-verwandte Protein der Erfindung codiert, und werden daher nicht in die entsprechende Aminosäuresequenz-Ableitung (SEQ ID NO:13) translatiert.
Oligonucleotidsonden, die auf der Basis der spezifisch amplifizierten murinen BMP-12-verwandten DNA-Sequenz, die in SEQ ID NO:12 dargelegt ist, gestaltet wurden, können von Fachleuten verwendet werden, um die murinen Volllängen-BMP-12-verwandten codierenden Clone (entweder cDNA oder genomisch) zu identifizieren.
Die DNA-Sequenzanalyse eines anderen der resultierenden Subclone, genannt mV9, weist darauf hin, dass die spezifisch amplifizierte DNA-Sequenz, die darin enthalten ist, einen Teil einer murinen BMP-12-verwandten Sequenz der Erfindung codiert. Diese Sequenz scheint das murine Homolog zu der menschlichen MP52-DNA-Sequenz zu sein, die in SEQ ID NO:3 beschrieben ist. Die DNA-Sequenz (SEQ ID NO:14) und die abgeleitete Aminosäuresequenz (SEQ ID NO:15) dieses spezifisch amplifizierten murinen DNA-Fragments sind in dem Sequenzprotokoll gezeigt.
Die Nucleotide #1-#26 von SEQ ID NO:14 umfassen einen Teil von Oligonucleotid #6, und die Nucleotide #246-#272 umfassen einen Teil des umgekehrten Komplements von Oligonucleotid #7, die verwendet werden, um die spezifische Amplifikationsreaktion durchzuführen. Nucleotid #27 von SEQ ID NO:14 scheint das letzte Nucleotid eines Codon-Tripletts zu sein, und die Nucleotide #244-#245 von SEQ ID NO:14 scheinen die ersten zwei Nucleotide eines Codon-Tripletts zu sein. Daher entsprechen die Nucleotide #28 bis #243 von SEQ ID NO:14 einer teilweisen codierenden Sequenz von mV9. Auf Grund der Funktion der Oligonucleotide #6 und #7 im Initiieren der Amplifikationsreaktion müssen sie nicht genau der tatsächlichen Sequenz entsprechen, die das murine BMP-12-verwandte Protein der Erfindung codiert, und werden daher nicht in die entsprechende Aminosäuresequenz-Ableitung (SEQ ID NO:15) translatiert.
Oligonucleotidsonden, die auf der Basis der spezifisch amplifizierten murinen BMP-12-verwandten DNA-Sequenz, die in SEQ ID NO:14 dargelegt ist, gestaltet wurden, können von Fachleuten verwendet werden, um die murinen Volllängen-BMP-12-verwandten codierenden Clone (entweder cDNA oder genomisch) zu identifizieren.
Alternativ können die oben identifizierten Oligonucleotidprimer #6 und #7 als Primer verwendet werden, um die spezifische Amplifikation einer 275 Basenpaar-DNA-Sonde zu ermöglichen, deren interne 259 bp den Nucleotiden #607 bis #865 von SEQ ID NO:1 des BMP-12-codierenden Plasmid-Subclons PCR1-1#2 entsprechen. Diese 275 bp-DNA-Sonde wurde mit ³²P radioaktiv markiert und angewendet, um eine murine genomische Genbank, die in den Vektor λ FIX II (Stratagene, Katalog #946306) konstruiert wurde, zu durchmustern. 1 Million Rekombinanten der murinen genomischen Genbank werden in einer Dichte von ungefähr 20 000 Rekombinanten pro Platte auf 50 Platten plattiert. Doppelte Nitrocellulose-Replika der rekombinanten Bakteriophagen-Plaques werden unter reduzierten Stringenzbedingungen an die spezifisch amplifizierte 333 bp-Sonde in einem Standard-Hybridisierungspuffer (SHB = 5 × SSC, 0,1 % SDS, 5 × Denhard, 100 μg/ml Lachssperma-DNA) bei 60°C über Nacht hybridisiert. Am nächsten Tag wird die radioaktiv markiertes Oligonucleotid-enthaltende Hybridisierungslösung entfernt, und die Filter werden unter reduzierten Stringenzbedingungen mit 2 × SSC, 0,1% SDS bei 60°C gewaschen. Mehrere positiv hybridisierende Rekombinanten werden identifiziert und plaquegereinigt. Fragmente der positiv hybridisierenden, murinen, genomischen, rekombinanten Clone werden in Standard-Plasmid-Vektoren (d.h. pGEM-3) subcloniert und einer DNA-Sequenzanalyse unterzogen.
Die DNA-Sequenzanalyse von einem dieser Subclone, genannt MVR3, weist darauf hin, dass er einen Teil des Maus-Gens codiert, das dem oben beschriebenen PCR-Produkt mV1 entspricht (das murine Homolog zu der menschlichen BMP-12- Sequenz, die in SEQ ID NO:1 dargelegt ist). Die teilweise DNA-Sequenz dieses Subclons und die entsprechende Aminosäuretranslation sind in SEQ ID NO:29 beziehungsweise in SEQ ID NO:30 dargelegt.
Die DNA-Sequenzanalyse eines anderen von diesen Subclonen, genannt MVR32, weist darauf hin, dass er einen Teil des Maus-Gens codiert, das dem oben beschriebenen PCR-Produkt mV2 (das murine Homolog zu der menschlichen VL-1-Sequenz, die in SEQ ID NO:7 dargelegt ist) entspricht. Die teilweise DNA-Sequenz dieses Subclons und die entsprechende Aminosäuretranslation sind in SEQ ID NO:31 beziehungsweise in SEQ ID NO:32 dargelegt.
Die DNA-Sequenzanalyse eines anderen dieser Subclone, genannt MVR23, weist darauf hin, dass er einen Teil des Maus-Gens codiert, das dem oben beschriebenen PCR-Produkt mV9 (das murine Homolog der MP-52-Sequenz, die in SEQ ID NO:3 dargelegt ist) entspricht.
In einer ähnlichen Weise wie jener, die oben für die Identifizierung und Isolierung von menschlichen genomischen Clonen, die das BMP-12-Protein der Erfindung codieren, beschrieben ist, kann eine/können Oligonucleotidsonde/n, die der in SEQ ID NO:7 dargelegten, VL-1-codierenden Sequenz entspricht/entsprechen, gestaltet und verwendet werden, um menschliche genomische oder cDNA-Sequenzen zu identifizieren, die das VL-1 (BMP-13)-Protein codieren. Diese Oligonucleotide würden als Regionen gestaltet werden, die spezifisch für VL-1-codierende Sequenzen sind, und würden daher wahrscheinlich von Regionen mit dem niedrigsten Grad an Nucleotidsequenz-Identität zwischen der spezifisch amplifizierten, VL-1-codierenden Sequenz (SEQ ID NO:7) und der spezifisch amplifizierten, BMP-12-codierenden Sequenz (SEQ ID NO:5) abgeleitet werden.
Alternativ können die oben identifizierten Oligonucleotidprimer #4 und #5 als Primer verwendet werden, um die spezifische Amplifikation einer 333 Basenpaar-DNA-Sonde zu ermöglichen, deren interne 315 bp den Nucleotiden #571 bis #885 von SEQ ID NO:1 des BMP-12-codierenden Plasmid-Subclons PCR1-1#2 entsprechen. Diese 333 bp-DNA-Sonde wurde mit ³²P radioaktiv markiert und angewendet, um eine menschliche genomische Genbank, die in den Vektor λDASH II (Stratagene, Katalog #945203) konstruiert wurde, zu durchmustern. 1 Million Rekombinanten der menschlichen genomischen Genbank werden in einer Dichte von ungefähr 20 000 Rekombinanten pro Platte auf 50 Platten plattiert. Doppelte Nitrocellulose-Replika der rekombinanten Bakteriophagen-Plaques werden unter reduzierten Stringenzbedingungen an die spezifisch amplifizierte 333 bp-Sonde in einem Standard-Hybridisierungspuffer (SHB = 5 × SSC, 0,1 % SDS, 5 × Denhardt, 100 μg/ml Lachssperma-DNA) bei 60°C über Nacht hybridisiert. Am nächsten Tag wird die radioaktiv markierte Oligonucleotid-enthaltende Hybridisierungslösung entfernt, und die Filter werden unter reduzierten Stringenzbedingungen mit 2 × SSC, 0,1 % SDS bei 60°C gewaschen. Mehrere (ungefähr 15) positiv hybridisierende Rekombinanten werden identifiziert und plaquegereinigt.
Um positiv hybridisierende Rekombinanten, die das VL-1-Protein der Erfindung codieren, von BMP-12- und anderen BMP-12-verwandten codierenden Rekombinanten, von denen vorhergesagt würde, dass sie positiv an die 333 bp-DNA-Sonde hybridisieren, die vom BMP-12-codierenden Plasmid PCR-1-1#2 erzeugt wird, das in diesem Screening-Verfahren angewendet wird, zu unterscheiden, wird die folgende Oligonucleotidsonde basierend auf der in SEQ ID NO:7 dargelegten VL-1-Sequenz gestaltet und auf einem automatisierten DNA-Synthesegerät synthetisiert:
#8: TGTATGCGACTTCCCGC [SEQUENCE ID NO: 35]
Ein Oligonucleotid, das den Nucleotiden #60 bis #76 von SEQ ID NO:7 entspricht und das 5 Nucleotid-Unterschiede zu der entsprechenden Region der in SEQ ID NO:1 (Nucleotide #672 bis #689) dargelegten BMP-12-codierenden Sequenz enthält. Einer der rekombinanten Bakteriophagenclone, der an die VL-1-Oligonucleotidsonde #8 hybridisiert, wird als λJLDc31 bezeichnet. Dieser rekombinante Bakteriophagenclon wird plaquegereinigt, eine Bakteriophagenplatten-Stammlösung wird hergestellt, und Bakteriophagen-DNA wird aus dem menschlichen genomischen λJLDc31-Clon isoliert. Der Bakteriophage λJLDc31 ist bei der American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD „ATCC" unter der Zugangsnummer 75922 am 20. Oktober, 1994 hinterlegt worden. Diese Hinterlegung erfüllt die Anforderungen des Budapester Vertrags der Internationalen Anerkennung der Hinterlegung von Mikroorganismen für den Zweck von Patentverfahren und die darunter fallenden Bestimmungen. Die Oligonucleotid-hybridisierende Region dieser Rekombinante λJLDc31 ist auf einem 2,5 kb-EcoRI-Fragment lokalisiert. Dieses Fragment wird in einen Plasmid-Vektor (pGEM-3) subcloniert, und eine Sequenzanalyse wird durchgeführt. Dieser Plasmid-Subclon wird als pGEMJLDc31/2.5 bezeichnet und ist bei der American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD „ATCC" unter der Zugangsnummer 69710 am 20. Oktober, 1994 hinterlegt worden. Diese Hinterlegung erfüllt die Anforderungen des Budapester Vertrags der Internationalen Anerkennung der Hinterlegung von Mikroorganismen für den Zweck von Patentverfahren und die darunter fallenden Bestimmungen.
Die teilweise DNA-Sequenz (SEQ ID NO:25) und die abgeleitete Aminosäuresequenz (SEQ ID NO:26) eines Teils der 2,5 kb-DNA-Insertion des Plasmid-Subclons pGEMJLDc31/2.5, der vom Clon λJLDc31 abgeleitet wurde, sind in dem Sequenzprotokoll gezeigt.
Die DNA-Sequenz eines Teils der 2,5 kb-EcoRI-Insertion des Plasmids pGEMJLDc31/2.5 ist in SEQ ID NO:25 dargelegt. enthält einen 912 bp langen, offenen Leseraster, definiert durch die Nucleotide #52 bis #963 von SEQ ID NO:25. Da diese Sequenz von einem genomischen Clon abgeleitet ist, ist es schwer, die Grenze zwischen der 5'-Ausdehnung der codierenden Sequenz und der 3'-Grenze der intervenierenden Sequenz (Intron/nicht-codierende Sequenz) festzustellen. Das gesamte offene Leseraster (Nucleotide #52 bis #963 von SEQ ID NO:25) codiert einen Teil des VL-1-Proteins der Erfindung von bis zu 304 Aminosäuren.
Basierend auf der Kenntnis von anderen BMP-Proteinen und anderen Proteinen innerhalb der TGF-β-Familie wird vorhergesagt, dass das Vorläufer-Polypeptid in Übereinstimmung mit einer vorgeschlagenen proteolytischen Konsensus-Prozessierungssequenz von Arg-X-X-Arg an der multibasischen Sequenz Arg-Arg-Arg-Arg gespalten werden würde. Von der Spaltung des VL-1-Vorläufer-Polypeptids wird erwartet, dass sie ein reifes 120 Aminosäure-Peptid hervorbringt, das mit der Aminosäure Thr bei Position #1 von SEQ ID NO:26 beginnt. Von der Prozessierung von VL-1 in die reife Form wird erwartet, dass sie Dimerisierung und Entfernen der N-terminalen Region in einer Weise involviert, die analog zu der Prozessierung des verwandten Proteins TGF-β ist [Gentry et al., Molec & Cell. Biol., 8:4162 (1988); Derynck et al. Nature, 316:701 (1985)].
Es wird daher in Betracht gezogen, dass die reife aktive Art von VL-1 ein Homodimer von zwei Polypeptid-Untereinheiten umfasst, wobei jede Untereinheit die Aminosäuren #1 bis #120 von SEQ ID NO:26 mit einem vorhergesagten Molekulargewicht von ungefähr 12 000 Dalton umfasst. Weitere aktive Arten werden in Betracht gezogen, die zumindest die Aminosäuren #19 bis #119 oder #120 von SEQ ID NO:26 umfassen und dadurch den ersten und den letzten konservierten Cysteinrest einschließen.
Unter Verwendung eines solchen Verfahrens wurde ein Clon, der das reife menschliche VL-1 (BMP-13) codiert, erhalten. Die Nucleotidsequenz und die entsprechende Aminosäuresequenz, die durch diesen Clon codiert wird, sind in dem Sequenzprotokoll bei SEQ ID NO:25 beziehungsweise 26 aufgelistet.
BEISPIEL 2
Expression von BMP-12
Um menschliche BMP-12-Proteine zu produzieren, wird die DNA, die sie codiert, in einen geeigneten Expressionsvektor transferiert und in Säuger-Zellen oder andere bevorzugte eukaryontische oder prokaryontische Wirte durch konventionelle Gentechnik-Verfahren eingebracht.
Um das menschliche BMP-12-Protein in bakteriellen Zellen zu produzieren, wird die folgende Vorgehensweise angewendet.
Expression von BMP-12 in E. coli
Ein Expressionsplasmid pALV1-781 für die Produktion von BMP-12 in E. coli wurde konstruiert, das die folgenden hauptsächlichen Eigenschaften enthält. Die Nucleotide 1-2060 enthalten DNA-Sequenzen, die vom Plasmid pUC-18 [Norrander et al., Gene 26:101-106 (1983)] stammen, einschließlich Sequenzen, die das Gen für β-Lactamase, welches Resistenz gegen das Antibiotikum Ampicillin in E. coli-Wirtsstämmen verleiht, und einen colE1-abgeleiteten Replikationsursprung enthalten. Die Nucleotide 2061-2221 enthalten DNA-Sequenzen für den linksseitigen Hauptpromotor (pL) des Bakteriophagen λ [Sanger et al., J. Mol. Biol. 162:729-773 (1982)], einschließlich die drei Operatorsequenzen O_L1, O_L2 und O_L3. Die Operatoren sind die Bindungsstellen für λcI-Repressorprotein, dessen intrazelluläre Spiegel die Menge des Transkriptions-Beginns von pL kontrollieren. Die Nucleotide 2222-2723 enthalten eine starke Ribosomen-Bindungssequenz, die auf einer Sequenz eingeschlossen ist, die von den Nucleotiden 35566 bis 35472 und 38137 bis 38361 des Bakteriophagen Lambda abgeleitet wurde, wie in Sanger et al., J. Mol. Biol. 162:729-773 (1982) beschrieben. Die Nucleotide 2724-3041 enthalten eine DNA-Sequenz, die das reife BMP-12-Protein, von dem alle untranslatierten 3'-Sequenzen entfernt wurden, codiert. Die BMP-12-DNA-Sequenzen, die in den pALV1-781-Expressionsvektor eingebracht wurden, wurden am 5'-Ende modifiziert, um den A + T-Gehalt zu erhöhen, ohne die codierende Kapazität zu verändern. Diese Änderungen wurden gemacht, um die Wirksamkeit der Translation, die auf der BMP-12-mRNA begonnen wurde, in E. coli zu erhöhen. Die Nucleotide 3042-3058 liefern eine „Linker"-DNA-Sequenz, die Restriktionsendonuclease-Stellen enthält. Die Nucleotide 3059-3127 liefern eine Transkriptions-Terminierungssequenz, die auf jener des E. coli-asp A-Gens basiert [Takagi et al., Nucl. Acids Res. 13:2063-2074 (1985)]. Die Nucleotide 3128-3532 sind DNA-Sequenzen, die von pUC18 abgeleitet wurden.
Das Plasmid pALV1-781 wurde in den E. coli-Wirtsstamm G1724 (F, lacl^q, lacp^L8, ampC::λcl⁺) durch das Verfahren von Dagert und Ehrlich, Gene 6:23 (1979) transformiert. G1724 (ATCC-Zugangsnummer 55151) enthält eine Kopie des Wildtyp-λcl-Repressorgens, das stabil in das Chromosom am ampC-Locus integriert ist, wo es unter die transkriptionelle Kontrolle von Salmonella typhimurium-trp-Promotor/Operator-Sequenzen gesetzt worden ist. In G1724 wird das λCl-Protein nur während des Wachstums in Tryptophan-freiem Medium wie minimalem Medium oder einem minimalen Medium, das mit Casaminosäuren ergänzt ist, wie IMC, das oben beschreiben wird, hergestellt. Die Zugabe von Tryptophan zu einer Kultur von G1724 wird den trp-Promotor unterdrücken und die Synthese von λcl abschalten, was schrittweise die Induktion der Transkription von pL-Promotoren verursacht, wenn sie in der Zelle vorhanden sind.
Transformanten werden auf 1,5% (Gew./Vol.) Agarplatten, die IMC-Medium enthalten, das aus M9-Medium [Miller, „Experiments in Molecular Genetics", Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1972)] zusammengesetzt ist, das 1 mM MgSO₄ enthält und mit 0,5% (Gew./Vol.) Glucose, 0,2% (Gew./Vol.) Casaminosäuren und 100 μg/ml Ampicillin ergänzt wurde, ausgewählt. G1724, der mit pALV1-781 transformiert wurde, wurde bei 37° zu einer A₅₅₀ von 0,5 in IMC-Medium, enthaltend 100 μg/ml Ampicillin, gezüchtet. Tryptophan wurde dann zu einer endgültigen Konzentration von 100 μg/ml zugefügt und die Kultur für weitere 4 Stunden inkubiert. Während dieser Zeit akkumulierte das BMP-12-Protein in der „Einschlusskörper"-Fraktion.
Herstellung eines Protein-Monomers
18 g gefrorene Zellen wurden gewogen und in 60 ml 100 mM Tris, 10 mM EDTA, 1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid [PMSF], pH 8,3, resuspendiert. Die Zellen wurden durch 3 Durchläufe durch einen Microfluidizer^TM [Modell #MCF 100 T] lysiert. Das Einschlusskörper-Pellet wurde durch Zentrifugation bei 15 000g bei 4°C für 20 Minuten erhalten. Der Überstand wurde dekantiert, und das Pellet wurde mit 100 ml 100 mM Tris, 1,0 M NaCl, 10 mM EDTA, 1 mM PMSF, pH 8,3, gewaschen. Die Suspension wurde wieder bei 15 000g bei 4°C für 10 Minuten zentrifugiert und der Überstand dekantiert. Das Pellet wurde dann mit 100 ml 100 mM Tris, 10 mM EDTA, 1 % Triton X-100, 1 mM PMSF, pH 8,3, gewaschen. Die Suspension wurde wieder bei 15 000g bei 4°C für 10 Minuten zentrifugiert und der Überstand dekantiert. Das Pellet wurde mit 50 ml 20 mM Tris, 1 mM EDTA, 1 mM PMSF, pH 8,3, enthaltend 1 % DTT, in einem Glas-Gewebehomogenisator resuspendiert. Das monomere BMP-12 wurde dann durch Ansäuern auf einen pH-Wert von 2,5 mit Eisessig solubilisiert. Die lösliche Fraktion wurde durch Zentrifugieren bei 15 000g für 20 Minuten bei 4°C isoliert.
Der Überstand von dieser Zentrifugation wurde gesammelt und über eine Sephacryl S-100^TM-Größenausschluss-Säule (83 cm × 2,6 cm; ≈440 ml Bett) in 20 ml-Einzelproben chromatographiert. Der Lauf wurde bei der Sephacryl S-100^TM-Säule mit einer mobilen Phase von 1% Essigsäure bei einer Flussrate von 1,4 ml/min durchgeführt. Fraktionen, die dem BMP-12-Monomer entsprachen, wurden durch das Absorptionsvermögen bei 280 nm nachgewiesen und unter Verwendung eines Computers wurden der Extinktionskoeffizient von 18200M^–1cm^–1 und das Molekulargewicht (11667 Dalton) berechnet. Dieses gepoolte Größenausschluss-Säulen-Material wurde als das Ausgangsmaterial für die Neufaltungs-Reaktionen verwendet.
Als eine Alternative für das obige wurden 1,0 g Zellen, die bei –80°C gelagert wurden, gemessen. Eine Lösung (3,4 ml 100 mM TRIS, 10 mM EDTA, pH 8,5) wird zugefügt. Die Lösung wird verwirbelt, bis die Zellen gut resuspendiert sind. 40 μl 100 mM PMSF in Isopropanol werden zugefügt. Die Zellen werden bei 1000 psi in einer French-Presse lysiert. Die Einschlusskörper werden bei 4°C für 20 Minuten in einer Eppendorf-Microfuge zentrifugiert, um Pellets zu bilden. Die Überstände werden dekantiert. Zu einem Pellet (von insgesamt 4) wird 1,0 ml entgastes 8,0 M Guanidinhydrochlorid, 0,5 M TRIS, 5 mM EDTA, pH 8,5, enthaltend 250 mM DTT, zugefügt. Das Pellet wird gelöst, und Argon wird für 30 Sekunden über die Flüssigkeit geblasen. Als nächstes wird die Lösung bei 37°C für eine Stunde inkubiert. Unlösliches Material wird für 2-3 Minuten in einer Eppendorf-Microfuge bei 23°C pelletiert. 0,5-1,0 ml des Überstands werden auf eine 2 cm-Supelco-Schutzpatrone (LC-304) injiziert und mit einem Acetonitril-Gradienten in 0,1% TFA von 1-70% über 35 Minuten eluiert. BMP-12 eluiert zwischen 29 und 31 Minuten. Fraktionen werden gepoolt, und die Proteinkonzentration wird durch Adsorption bei 280 Nanometern gegen 0,1 % TFA unter Verwendung des theoretischen Extinktionskoeffizienten, basierend auf dem Aminosäuregehalt, bestimmt.
Als ein zweites alternatives Verfahren zum obigen werden gefrorene Zellpellets, die von den E. coli-Transformanten, wie oben beschrieben, erhalten wurden, in 30 ml TE8.3(100:10)-Puffer (100 mM Tris-HCl pH 8,3, 10 mM Na₂EDTA, 1 mM PMSF) aufgetaut. Die Zellen werden durch drei Durchläufe durch einen Microfluidizer^TM [Modell #MCF 100 T] lysiert. Das anfängliche Einschlusskörpermaterial-Pellet wird in 8 M Guanidin-HCl, TE8.5(100:10)-Puffer (100 mM Tris-HCl pH 8,5, 10 mM Na₂EDTA, das 100 mM DTT enthielt, gelöst und für 1 Stunde bei 37°C inkubiert. Dieses Material wird bei 12 000 × g für 15 Minuten bei Zimmertemperatur zentrifugiert.
Neufalten des BMP-12-Proteins unter Verwendung des CHAPS-Systems
Ein ausreichendes Volumen des BMP-12-Pools wird lyophilisiert, um 10 μg des Proteins zu ergeben. 5 μl Glas-destilliertes Wasser wird zugefügt, um den Rest wieder zu lösen, dann 100 μl des Neufaltungs-Gemischs (50 mM Tris, 1,0 M NaCl, 2% 3-(3-Chlolamidopropyl)dimethylammonium-1-propansulfat (CHAPS), 5 mM EDTA, 2 mM Glutathion (reduziert), 1 mM Glutathion (oxidiert); bei einem pH von ungefähr 8,5). Die Lösung wird sanft gemischt und bei 23°C für 1-4 Tage gelagert. Die Dimer-Bildung wird durch Laufenlassen eines Aliquots auf einem 16% Novex-Tricingel bei 125 Volt für 2,5 Stunden, gefolgt von Coomassie-Blau-Färbung und Entfärbung bewertet.
Das BMP-12-Dimer wurde unter Verwendung einer analytischen C4-RP-HPLC (Umkehrphasen-Hochleistungs-Flüssigchromatographie)-Säule (Vydac 214TP54), die auf 1 % B-Puffer (verdünnt in A-Puffer) äquilibriert worden war, aufgereinigt und über 35 Minuten laufen gelassen, währenddessen das Protein unter Verwendung des folgenden Gradienten (A-Puffer = 0,1% Trifluoressigsäure, B-Puffer = 95% Acetonitril, 0,1 % Trifluoressigsäure [TFA]) mit einer Flussrate von 1 ml/min eluiert:

1-5 Minuten 20% B-Puffer

5-10 Minuten 20-30% B-Puffer

10-30 Minuten 30-50% B-Puffer

30-35 Minuten 50-100% B-Puffer
Das Protein wurde durch die Absorptionsfähigkeit bei 280 nm überwacht. Peak-BMP-12-Fraktionen (die zwischen 29 und 31 Minuten eluierten) wurden gepoolt. Die Reinheit wurde durch SDS-PAGE bewertet. Die Konzentration wurde durch Absorption bei 280 nm und unter Verwendung des Computer-berechneten Extinktionskoeffizienten und Molekulargewichts, wie oben angezeigt, bestimmt.
Expression von BMP-12 in Säuger-Zellen
Ein anderes in Betracht gezogenes, bevorzugtes Expressionssystem für das biologisch aktive, rekombinante menschliche BMP-12 sind stabil transformierte Säuger-Zellen.
Ein Fachmann kann Säuger-Expressionsvektoren durch Anwenden der Sequenz von SEQ ID NO:1 oder von anderen DNA-Sequenzen, die BMP-12-Proteine codieren, oder anderen modifizierten Sequenzen und bekannten Vektoren wie pCD [Okayama et al., Mol. Cell Biol., 2:161-170 (1982)], pJL3, pJL4 [Gough et al., EMBO J., 4:645-653 (1985)] und pMT2 CXM konstruieren.
Der Säuger-Expressionsvektor pMT2 CXM ist eine Ableitung von p91023(b) (Wong et al., Science 228:810-815, 1985), die sich von letzterem dadurch unterscheidet, dass sie das Ampicillin-Resistenzgen an Stelle des Tetracyclin-Resistenzgens enthält und darüber hinaus eine XhoI-Stelle für die Insertion von cDNA-Clonen enthält. Die funktionellen Elemente von pMT2 CXM sind beschrieben worden (Kaufman, R.J., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:689-693) und schließen die Adenovirus-VA-Gene, den SV40-Replikationsursprung einschließlich des 72 bp-Enhancers, den späten Adenovirus-Hauptpromotor, einschließlich einer 5'-Spleißstelle und den Hauptteil der dreigeteilten Adenovirus-Führungssequenz, die auf den späten Adenovirus-mRNAs vorhanden ist, eine 3'-Spleiß-Akzeptorstelle, eine DHFR-Insertion, die frühe SN40-Polyadenylierungsstelle (SV40) und pBR322-Sequenzen, die für die Vermehrung in E. coli nötig sind, ein.
Das Plasmid pMT2 CXM wird durch EcoRI-Verdau von pMT2-VWF erhalten, das bei der American Type Culture Collection (ATCC), Rockville, MD (USA) unter der Zugangsnummer ATCC 67122 hinterlegt worden ist. Der EcoRI-Verdau schneidet die cDNA-Insertion, die in pMT2-VWF vorhanden ist, aus, was pMT2 in einer linearen Form ergibt, die ligiert und verwendet werden kann, um E. coli HB 101 oder DH-5 auf Ampicillinresistenz zu transformieren. Die Plasmid pMT2-DNA kann durch konventionelle Verfahren hergestellt werden. pMT2 CXM wird dann unter Verwendung der Loopout/in-Mutagenese [Morinaga, et al., Biotechnology 84: 636 (1984)] konstruiert. Dies entfernt die Basen 1075 bis 1145 im Hinblick auf die Hind III-Stelle nahe dem SV40-Replikationsursprung und den Enhancer-Sequenzen von pMT2. Zusätzlich wird eine Sequenz inseriert, die die Erkennungsstelle für die Restriktionsendonuclease Xho I enthält. Eine Ableitung von pMT2CXM, genannt pMT23, enthält die Erkennungsstellen für die Restriktionsendonucleasen PstI, Eco RI, SalI und XhoI. Plasmid pMT2 CXM- und pMT23-DNA können durch konventionelle Verfahren hergestellt werden.
pEMC2β1, das von pMT21 abgeleitet ist, kann auch in der Praxis der Erfindung geeignet sein. pMT21 ist von pMT2 abgeleitet, das von pMT2-VWF abgeleitet ist. Wie oben beschrieben, schneidet der EcoRI-Verdau die cDNA-Insertion aus, die in pMT-VWF vorhanden ist, was pMT2 in linearer Form ergibt, das ligiert und verwendet werden kann, um E. coli HB 101 oder DH-5 auf Ampicillinresistenz zu transformieren. Plasmid pMT2-DNA kann durch konventionelle Verfahren hergestellt werden.
pMT21 wird von pMT2 durch die folgenden zwei Modifikationen abgeleitet. Zuerst werden 76 bp der untranslatierten 5'-Region der DHFR-cDNA, einschließlich einer Ausdehnung von 19 G-Resten des G/C-Schwanzes, für die cDNA-Clonierung deletiert. In diesem Vorgang wird eine XhoI-Stelle inseriert, um die folgende Sequenz unmittelbar stromaufwärts von DHFR zu erhalten. Als Zweites wird eine einmalige ClaI-Stelle durch den Verdau mit EcoRV und XbaI, die Behandlung mit dem Klenow-Fragment der DNA-Polymerase I und die Ligierung an einen ClaI-Linker (CATCGATG) eingebracht. Dies deletiert ein 250 bp-Segment der Adenovirusassoziierten RNA (VAI)-Region, aber stört nicht die VAI-RNA-Genexpression oder -Funktion. pMT21 wird mit EcoRI und XhoI verdaut und verwendet, um den Vektor pEMC2B1 abzuleiten.
Ein Teil des EMCV-Leaders wird von pMT2-ECAT1 [S.K. Jung, et al., J. Virol 63:1651-1660 (1989)] durch Verdau mit Eco RI und PstI erhalten, was in einem 2752 bp-Fragment resultiert. Diese Fragment wird mit TaqI verdaut, was ein Eco RI-TagI-Fragment von 508 bp ergibt, das durch Elektrophorese auf einem Agarosegel mit niedrigem Schmelzpunkt aufgereinigt wird. Ein 68 bp-Adapter und sein komplementärer Strang werden mit einem vorstehenden 5'-TagI-Ende und einem vorstehenden 3'-XhoI-Ende synthetisiert, der eine Sequenz aufweist, die der EMC-Virusleadersequenz von Nucleotid 763 bis 827 entspricht. Er ändert auch das ATG bei Position 10 innerhalb des EMC-Virusleaders zu einem ATT und auf ihn folgt eine XhoI-Stelle. Eine Dreiwege-Ligierung des pMT21-Eco RI-XhoI-Fragments, des EMC-Virus-Eco RI-TagI-Fragments und des 68 bp-Oligonucleotid-Adapter-TagI-XhoI-Adapters resultiert im Vektor pEMC2β1.
Dieser Vektor enthält den SV40-Replikationsursprung und -Enhancer, den späten Adenovirus-Hauptpromotor, eine cDNA-Kopie des Hauptteils der dreigeteilten Adenovirus-Leadersequenz, eine kleine intervenierende Hybridsequenz, ein SV40-Polyadenylierungssignal und das Adenovirus VA-I-Gen, DHFR und die β-Lactamase-Markierungen und eine EMC-Sequenz in geeigneter Relation, um die Expression mit hohem Spiegel der erwünschten cDNA in Säuger-Zellen zu lenken.
Die Konstruktion der Vektoren kann eine Modifikation der BMP-12-DNA-Sequenzen involvieren. Zum Beispiel kann BMP-12-cDNA durch Entfernen der nicht-codierenden Nucleotide von den 5'- und 3'-Enden der codierenden Region modifiziert werden. Die deletierten, nicht-codierenden Nucleotide können durch andere Sequenzen, von denen bekannt ist, dass sie für die Expression günstig sind, ersetzt werden oder nicht. Diese Vektoren werden in geeignete Wirtszellen für die Expression der BMP-12-Proteine transformiert. Zusätzlich können die Sequenz von SEQ ID NO:1 oder andere Sequenzen, die BMP-12-Proteine codieren, manipuliert werden, um ein BMP-12-Protein durch die Isolierung der reifen codierenden Sequenz der Nucleotide 571 bis 882 von SEQ ID NO:1 und Anfügen von Sequenzen, die die vollständigen Pro-Peptide von anderen BMP-Proteinen codieren, an das 5'-Ende zu exprimieren.
Zum Beispiel kann ein Fachmann ein Fusionsprotein herstellen, in dem das Pro-Peptid von BMP-2 durch das Herstellen eines DNA-Vektors, in dem die DNA-Sequenz, die das BMP-2-Pro-Peptid codiert, im richtigen Leseraster mit der DNA- Sequenz, die das reife BMP-12-Peptid codiert, verknüpft ist, in einer funktionellen Weise mit dem reifen BMP-12-Peptid verknüpft ist. Die DNA-Sequenz eines solchen Fusionsproteins ist in SEQUENZ ID NO:27 gezeigt.
Ein Fachmann kann die Sequenz von SEQ ID NO:1 durch Eliminieren oder Ersetzen der regulatorischen Säuger-Sequenzen, die die codierende Sequenz flankieren, durch bakterielle Sequenzen manipulieren, um bakterielle Vektoren für die intrazelluläre oder extrazelluläre Expression durch bakterielle Zellen, wie oben beschrieben, zu bilden. Als ein anderes Beispiel könnten die codierenden Sequenzen weiter manipuliert werden (z.B. an andere bekannte Linker ligiert oder durch Deletieren von nicht-codierenden Sequenzen davon oder Verändern der Nucleotide darin durch andere bekannte Techniken modifiziert werden). Die modifizierte BMP-12-codierende Sequenz könnte dann in einen bekannten bakteriellen Vektor unter Verwendung von Vorgehensweisen, wie sie in T. Taniguchi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:5230-5233 (1980) beschrieben werden, inseriert werden. Dieser beispielhafte bakterielle Vektor könnte dann in bakterielle Wirtszellen transformiert und ein BMP-12-Protein dadurch exprimiert werden. Für eine Strategie zum Hervorrufen von extrazellulärer Expression von BMP-12-Proteinen in bakteriellen Zellen siehe z.B. die Europäische Patentanmeldung EPA 177,343.
Ähnliche Manipulationen können für die Konstruktion eines Insektenvektors [siehe z.B. die Vorgehensweisen, die in der veröffentlichten Europäischen Patentanmeldung 155,476 beschrieben sind] für die Expression in Insektenzellen durchgeführt werden. Ein Hefevektor könnte auch konstruiert werden, der die regulatorischen Hefesequenzen für die intrazelluläre oder extrazelluläre Expression der Faktoren der vorliegenden Erfindung durch Hefezellen anwendet. [Siehe z.B. die Vorgehensweisen die in der veröffentlichten PCT-Anmeldung WO86/00639 und der Europäischen Patentanmeldung EPA 123,289 beschrieben sind].
Ein Verfahren zum Produzieren von hohen Spiegeln eines BMP-12-Proteins der Erfindung in Säuger-Zellen kann die Konstruktion von Zellen involvieren, die mehrfache Kopien des heterologen BMP-12-Gens enthalten. Das heterologe Gen ist mit einem amplifizierbaren Marker, z.B. dem Dihydrofolatreduktase (DHFR)-Gen, verknüpft, auf das Zellen, die erhöhte Gen-Kopien enthalten, für die Vermehrung in steigenden Konzentrationen von Methotrexat (MTX) entsprechend den Vorgehensweisen von Kaufman und Sharp, J. Mol. Biol., 159:601-629 (1982) selektiert werden können. Dieser Ansatz kann mit einer Reihe von unterschiedlichen Zelltypen angewendet werden.
Zum Beispiel können ein Plasmid, das eine DNA-Sequenz für ein BMP-12 der Erfindung in funktioneller Assoziation mit anderen Plasmidsequenzen enthält, die die Expression davon ermöglichen, und das DHFR-Expressionsplasmid pAdA26SV(A)3 [Kaufman und Sharp, Mol. Cell. Biol., 2:1304 (1982)] durch verschiedene Verfahren einschließlich der Calciumphosphat-Copräzipitierung und -Transfektion, Elektroporation oder Protoplasten-Fusion zusammen in die DHFR-defizienten CHO-Zellen DUKX-BII eingebracht werden. DHFR-exprimierende Transformanten werden auf das Wachstum in alpha-Medien mit dialysiertem fötalen Kälberserum selektiert und danach auf die Amplifikation durch das Wachstum in steigenden Konzentrationen von MTX (z.B. sequenzielle Schritte in 0,02, 0,2, 1,0 und 5 uM MTX), wie in Kaufman et al., Mol. Cell Biol., 5:1750 (1983) beschrieben, selektiert. Die Transformanten werden cloniert, und die Expression von biologisch aktivem BMP-12 wird durch den Rosen-modifizierten Sampath-Reddi-Rattentest, der unten in Beispiel 5 beschrieben wird, überwacht. Die BMP-12-Expression sollte mit steigenden Spiegeln der MTX-Resistenz steigen. BMP-12-Polypeptide werden unter Verwendung von Standardtechniken, die auf dem Fachgebiet bekannt sind, wie Puls-Markierung mit [35S]-Methionin oder -Cystein und Polyacrylamidgel-Elektrophorese charakterisiert. Ähnliche Vorgehensweisen können befolgt werden, um andere verwandte BMP-12-Proteine zu produzieren.
BEISPIEL 3
Herstellung einer BMP-2-Pro-Peptid/reifes BMP-12-Peptid-Fusion
Um einen Vektor zu konstruieren, der die BMP-2-Pro-Peptid/reifes BMP-12-Peptid-Fusion codiert, wurde die folgende Clonierungs-Vorgehensweise verwendet, um die zwei Sequenzen aneinander zu fusionieren.
Zuerst wird ein DNA-Restriktionsenzym-Fragment, das das Pro-Peptid des menschlichen BMP-2-Proteins umfasst, das die Nucleotide 1 bis 843 von SEQ ID NO:27 umfasst, von pBMP2ΔEMC ausgeschnitten. pBMP2ΔEMC ist ein Plasmid, das von Lambda U20S-39 (ATCC #40345) abgeleitet ist, das die gesamte codierende Sequenz für das menschliche BMP-2-Protein, bei dem die nicht-translatierten 5'- und 3'-Sequenzen des BMP-2 vom Vektor deletiert wurden, umfasst. Das verwendete 5'-Restriktionsenzym war Bgl II, und es schneidet pBMP2ΔEMC im Vektor bei Nucleotid 979. Das verwendete 3'-Restriktionsenzym war Mae II, und es schneidet pBMP2ΔEMC im BMP-2-Pro-Peptid bei Nucleotid 1925, nur knapp am Carboxy-Terminus. Das resultierende 954 Basenpaar-Produkt wurde dann gelisoliert und gengereinigt. Als Zweites wird ein DNA-Restriktionsenzymfragment, das den 5'-Teil der reifen menschlichen BMP-12-Peptid-DNA-Sequenz umfasst, von pPCR1-1#2-V1-1 (ATCC #69517) ausgeschnitten. Das verwendete 5'-Restriktionsenzym war Eae I, und es schneidet pPCR1-1#2-V1-1 genau 3' des N-Terminus der reifen menschlichen BMP-12-Peptidsequenz. Das resultierende 259 Basenpaar-Produkt wurde gelisoliert und gengereinigt. Als Drittes wurden zwei DNA-Oligos gestaltet und synthetisiert, so dass sich, wenn sie aneliert würden, ein winziges DNA-Fragment bilden würde, das die Fusionssequenz des äußersten 3'-Endes des menschlichen BMP-2-Pro-Peptids und des 5'-Endes des reifen BMP-12-Peptids umfasst. Das DNA-Fragment hat ein 5'-komplementäres klebendes Mae II-Ende, das an das 3'-Restriktionsenzym-Fragment aneliert, umfassend das menschliche BMP-2-Pro-Peptid. Das anelierte Oligo-DNA-Fragment hat ein komplementäres klebendes 3'-Eae I-Ende, das an den 5'-Bereich des Restriktionsenzym-Fragments aneliert, das das reife Peptid des menschlichen BMP-12 umfasst. Das Oligo des codierenden Strangs wird B2/12 genannt und ist 13 Basenpaare lang. Als nächstes wurde ein DNA-Fragment, das die 123 Basenpaare am 3'-Ende des reifen BMP-12-Peptidfragments codiert, wie folgt erhalten. Zuerst wird ein DNA-Fragment, das das Pro-Peptid des menschlichen BMP-2-Proteins umfasst, das die Nucleotide 1 bis 846 umfasst, von pBMP2ΔEMC PCR-amplifiziert. Der 5'-Primer (Oligo 655a) aneliert gerade 5' des Polylinkers. Der 3'-Primer (BMPpro3) aneliert an das 3'-Ende des BMP-2-Pro-Peptids und bringt eine Bgl II-Restriktionsenzym-Stelle durch stille Sequenzmutationen ein. Das resultierende PCR-Produkt wurde mit Sal I, das im Polylinker spaltet, und Bgl II geschnitten. Das 850 Basenpaar-Restriktionsenzym-Fragment (das in der Aminosäuresequenz REKR endet) wurde gelisoliert und gengereinigt. Das reife BMP-12-Peptid wurde unter Verwendung eines 5'-Primers (Oligo 5-1) PCR-amplifiziert, der die Bgl II-Restriktionsenzym-Stelle durch stille Sequenzmutationen codiert und an das 5'-Ende eines möglichen reifen Spaltungsprodukts, beginnend mit der Aminosäuresequenz SRCS, aneliert. Der 3'-Primer (V1-1 3) aneliert an das 3'-Ende des reifen BMP-12- Peptids und bringt eine Xba I-Restriktionsenzym-Stelle nach dem Stopp-Codon ein. Das resultierende PCR-Produkt wurde mit Bgl II und Xba I geschnitten. Das 321 Basenpaar-Restriktionsenzym-Fragment wurde gelisoliert und gengereinigt.
Die zwei Restriktionsfragmente wurden in einen vorher SalI- und XbaI-geschnittenen Vektor durch eine Dreiwegeligierung ligiert. Das resultierende Konstrukt wurde sequenziert, um auf PCR-induzierte Fehler zu testen, und eine stille C zu T-Mutation wurde bei Basenpaar 185 im Pro-Peptid beobachtet. Dieses Plasmid wurde als pREKRSRC bezeichnet. Dann wurde pREKRSRC mit BglII und NgoMI geschnitten, und das Vektorfragment, das die letzten 123 Basenpaare der reifen BMP-12-Sequenz umspannt, wurde dadurch isoliert. Die drei Restriktionsfragmente und der anelierte Oligolinker wurden durch eine Vierwegeligierung ligiert, um pREKR-TAL mit dem BMP-2-Pro-Peptid mit der reifen Spaltungsstelle am 3'-Ende, fusioniert an das 5'-(TAL)-Ende des reifen BMP-12-Peptids, zu ergeben. Die codierende Sequenz des resultierenden ligierten Vektors ist in SEQ ID NO:27 gezeigt.
BEISPIEL 4
Die biologische Aktivität von exprimiertem BMP-12
Um die biologische Aktivität der exprimierten BMP-12-Proteine, die oben in Beispiel 2 erhalten wurden, zu messen, werden die Proteine von der Zellkultur gewonnen und durch Isolieren der BMP-12-Proteine von anderen proteinartigen Materialien, mit denen sie zusammen produziert werden, so wie von anderen Kontaminationen aufgereinigt. Das aufgereinigte Protein kann in Übereinstimmung mit dem unten in Beispiel 5 beschriebenen Ratten-Test gestestet werden.
Die Aufreinigung wird unter Verwendung von Standard-Techniken, die Fachleuten bekannt sind, durchgeführt.
Die Proteinanalyse wird unter Verwendung von Standard-Techniken wie SDS-PAGE-Acrylamid [Laemmli, Nature 227:680 (1970)], gefärbt mit Coomassie-Blau oder Silber [Oakley, et al. Anal. Biochem. 105:361 (1980)], und durch Immunblot [Towbin, et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76:4350 (1979)] ausgeführt.
Beispiel 5
ROSEN-MODIFIZIERTER SAMPATH-REDDI-TEST
Eine modifizierte Version des ektopisches Implantat-Ratten-Tests, der in Sampath und Reddi, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80:6591-6595 (1983) beschrieben wurde, wird verwendet, um die Aktivität der BMP-12-Proteine zu bewerten. Dieser modifizierte Test wird hierin der Rosen-modifizierte Sampath-Reddi-Test genannt. Der Test ist weithin verwendet worden, um die Knochen- und Knorpel-induzierende Aktivität von BMPs zu bewerten. Der Ethanol-Präzipitationsschritt des Sampath-Reddi-Vorgangs wird durch Dialysieren (wenn die Zusammensetzung eine Lösung ist) oder Diafiltrieren (wenn die Zusammensetzung eine Suspension ist) der zu testenden Fraktion gegen Wasser ersetzt. Die Lösung oder Suspension wird dann auf 0,1 % TFA äquilibriert. Die resultierende Lösung wird zu 20 mg der Ratten-Matrix zugefügt. Eine Pseudo-Ratten-Matrixprobe, die nicht mit dem Protein behandelt wurde, dient als eine Kontrolle. Dieses Material wird gefroren und lyophilisiert und das resultierende Pulver in #5-Gelatinekapseln verkapselt. Die Kapseln werden subcutan in den abdominalen-thorakalen Bereich von 21-49 Tage alten, männlichen Long Evans-Ratten implantiert. Die Implantate werden nach 10 Tagen entfernt. Ein Schnitt von jedem Implantat wird fixiert und für die histologische Analyse verarbeitet. 1 μm Glycolmethacrylat-Schnitte werden mit Von Kossa und saurem Fuschin gefärbt, um die Menge der induzierten Bildung von Sehne/Band-ähnlichem Gewebe, das in jedem Implantat vorhanden ist, zu bewerten.
BMP-12 wurde in die Ratten in Dosen von 1, 5, 25 und 50 μg pro Implantat für 10 Tage implantiert. BMP-2 wurde in einer Dosis von 5 μg als eine Positivkontrolle eingeschlossen. Für keine der getesteten Dosen von BMP-12 wurde nach 10 Tagen Knochen- oder Knorpelbildung in den Implantaten beobachtet. Anstatt dessen wurden die Implantate mit Gewebe gefüllt, das einer embryonalen Sehne glich, was leicht durch die Anwesenheit von dichten Bündeln von Fibroblasten, die in der selben Ebene orientiert und eng aneinander gepackt sind, erkannt wird. [Sehne/Band-ähnliches Gewebe wird zum Beispiel in Ham und Cormack, Histology (JB Lippincott Co. (1979), S. 367-369 beschrieben].
Diese Ergebnisse wurden in einem zweiten Satz von Tests reproduziert, in dem Sehne/Band-ähnliches Gewebe in allen BMP-12-enthaltenden Implantaten vorhanden war. Im Gegensatz dazu zeigten die BMP-2-Implantate wie erwartet Knorpel- und Knochenbildung, aber enthielten kein Sehne/Band-ähnliches Gewebe.
Die BMP-12-Proteine und verwandten Proteine dieser Erfindung können auf Aktivität auf diesen Test getestet werden.
Beispiel 6
Unter Verwendung von Verfahren in Übereinstimmung mit den obigen Beispielen mit geringen Modifikationen innerhalb des Fachkönnens wurden menschliches MP52-Protein und das murine Homolog des BMP-13-Proteins exprimiert und auf Sehne/Band-ähnliches Gewebe-induzierende Aktivität getestet. Alle Proteine zeigten vergleichbare Ergebnisse, ähnlich zu jenen, die oben für menschliches BMP-12 beschrieben sind.
Die vorangehenden Beschreibungen beschreiben detailliert derzeit bevorzugte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung. Es wird erwartet, dass Fachleute bei In-betrachtziehen dieser Beschreibungen zahlreiche Modifikationen und Variationen in der Anwendung durchführen. Es wird angenommen, dass solche Modifikationen und Variationen von den hierzu angefügten Ansprüchen umfasst werden.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

DNA-Molekül, umfassend eine Nucleotidsequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: (a) Nucleotid #196, #199, #208, #217, #361, #388, #493, #496, #571 oder #577 bis #879 oder #882 von SEQ ID NO: 1; (b) Nucleotiden, welche die Aminosäuren #-25, #1, oder #3 bis #103 oder #104 von SEQ ID NO: 2 codieren; (c) Nucleotid #410, #458, #602, #605 oder #659 bis #961 oder #964 von SEQ ID NO: 25; (d) Nucleotiden, welche die Aminosäuren #1 oder #19 bis #119 oder #120 von SEQ ID NO: 26 codieren; oder (e) natürlich vorkommenden menschlichen allelen Sequenzen oder äquivalenten degenerierten Codonsequenzen gemäß einem von (a) bis (d); wobei die Nucleotidsequenz ein Polypeptid codiert, das die Fähigkeit besitzt, die Bildung von Sehnen-ähnlichem oder Band-ähnlichem Gewebe zu induzieren.
Chimeres DNA-Molekül, umfassend eine DNA-Sequenz, welche ein Pro-Peptid von einem Mitglied der BMP-Familie von Proteinen codiert, welches im richtigen Leseraster mit einer DNA-Sequenz gemäß Anspruch 1 verknüpft ist.
Chimeres DNA-Molekül, umfassend eine DNA-Sequenz, welche ein Pro-Peptid von einem Mitglied der TGF-β-Superfamilie von Proteinen codiert, welches im richtigen Leseraster mit einer DNA-Sequenz gemäß Anspruch 1 verknüpft ist.
Chimeres DNA-Molekül gemäß Anspruch 3, wobei das Pro-Peptid von BMP-2 ist.
Vektor, umfassend das DNA-Molekül gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, welches funktionell mit einer Expressionskontrollsequenz dafür verknüpft ist.
Wirtszelle, welche mit dem DNA-Molekül gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4 oder dem Vektor gemäß Anspruch 5 transformiert wurde.
Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids, welches die Fähigkeit besitzt, die Bildung von Sehne/Band-ähnichem Gewebe von BMP-12- oder BMP-12-verwandtem Protein zu induzieren, umfassend: (a) das Züchten der Wirtszelle gemäß Anspruch 6, und (b) das Gewinnen und, gegebenenfalls, Aufreinigen des BMP-12- oder BMP-12-verwandten Proteins aus dem Kulturmedium.
Polypeptid, welches die Fähigkeit besitzt, die Bildung von Sehne/Band-ähnlichem Gewebe von BMP-12- oder BMP-12-verwandtem Protein zu induzieren, das durch das DNA-Molekül gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4 codiert oder durch das Verfahren gemäß Anspruch 7 hergestellt wird.
Polypeptid in Form eines Dimers, zusammengesetzt aus zwei Untereinheiten, jede mit der Aminosäuresequenz, die durch das DNA-Molekül gemäß eines der Ansprüche 1 bis 4 codiert wird.
Heterodimeres Proteinmolekül, umfassend ein Monomer mit der Aminosäuresequenz des Polypeptids gemäß Anspruch 8 und ein Monomer mit der Aminosäuresequenz eines Proteins der TGF-β-Superfamilie.
Arzneimittel, umfassend das Polypeptid oder Protein gemäß einem der Ansprüche 8 bis 10, gegebenenfalls im Gemisch mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger.