DE69433997T2

DE69433997T2 - Verfahren zur Identifizierung eines PDE IV Hemmers

Info

Publication number: DE69433997T2
Application number: DE69433997T
Authority: DE
Inventors: Mary S. Barnette; Theodore J. Torphy; Iv Siegfried B. Christensen
Original assignee: GlaxoSmithKline LLC; SmithKline Beecham Corp
Current assignee: GlaxoSmithKline LLC; SmithKline Beecham Corp
Priority date: 1993-06-18
Filing date: 1994-06-17
Publication date: 2005-01-27
Anticipated expiration: 2014-06-18
Also published as: HK1012255A1; JPH08511805A; ATE275951T1; DK0710109T3; ES2229221T3; EP0710109A4; EP0710109B1; DE69433997D1; AU7174794A; PT710109E; SI0710109T1; EP1466598A3; WO1995000139A1; EP1466598A2; EP0710109A1; US6143782A

Description

Umfang der Erfindung
Diese Erfindung betrifft ein Verfahren zur Identifikation von Verbindungen, die vorzugsweise eine Form eines Phosphodieseterase-Isozyms inhibieren oder binden, das als IV (hier nachstehend PDE IV) bezeichnet wird, während gegenüber einer zweiten Form des Enzyms gleiche oder vorzugsweise weniger Bindung oder Inhibierung gezeigt wird. Diese Formen, und man nimmt an, daß sie verschiedene Formen von nicht umwandelbaren Konformationen desselben Enzyms sind, obwohl dies nicht bewiesen wurde, unterscheiden sich durch ihre Bindungsaffinität zu Rolipram, einem architypischen PDE N-Inhibitor. Rolipram bindet mit hoher Affinität an die katalytische Stelle einer Form, aber mit niedriger Affinität an die katalytische Stelle der anderen. Hier wird eine Form als die Rolipram-Bindungsstelle mit hoher Affinität bezeichnet und die andere Form wird als die Rolipram-Bindungsstelle mit niedriger Affinität identifiziert.
Gebiet der Erfindung
Cyclische Nucleotid-Phosphodieseterasen (PDEs) stellen eine Familie von Enzymen dar, die die verbreiteten intrazellulären sekundären Botenstoffe Adenosin-3',5'-Monophosphat (CAMP) und Guanosin-3',5'-Monophosphat (cGMP) in ihre entsprechenden inaktiven 5'-Monophosphat-Metabolite hydrolysieren. Man nimmt an, daß mindestens fünf verschiedene Klassen von PDE-Isozymen existieren, wobei jede einzigartige physikalische und kinetische Charakteristika besitzt und jede ein Produkt einer anderen Genfamilie darstellt. Sie wurden unter Verwendung der römischen Ziffern I bis V unterschieden.
Das Zielenzym dieser Erfindung ist das PDE IV-Isozym in all seinen verschiedenen Formen und im vollen Bereich seiner Verteilung in allen Zellen. Es ist ein für cAMP-selektives Enzym mit niedrigem K_m (cAMP K_m=1–5 μM), das wenig Aktivität gegenüber cGMP hat (Km>100 μM). Mitglieder dieser Isozymklasse haben die interessanten Charakteristika, daß sie in zwei oder mehr nicht umwandelbaren oder langsam umwandelbaren Formen existieren, die Rolipram oder andere PDE IV-Inhibitoren mit einer unterschiedlichen Rangordung der Wirksamkeiten binden. Somit kann dasselbe Genprodukt in mehr als einem katalytisch aktiven Konformationszustand existieren. Dabei ist wichtig, daß die relativen Anteile der verschiedenen Bindungsformen in Abhängigkeit vom der Zellgewebeart variieren können. Zum Beispiel können Entzündungszellen einen relativ hohen Anteil der Form enthalten, die Rolipram mit einer niedrigen Affinität bindet, während Gehirn- und Wandzellen (Parietal-Zellen) einen relativ hohen Anteil der Form enthalten können, die Rolipram mit einer hohen Affinität bindet.
Von besonderem Interesse bei dieser Erfindung ist die Rolle, die diese Klasse an Isozymen bei der Entzündung und der glatten Muskulatur der Luftwege spielen. Untersuchungen zeigen, daß sie eine wichtige Rolle bei der Regulation von cAMP bei einer Vielzahl verschiedener Entzündungszellen (z.B. Mastzellen, basophilen, eosinophilen und neutrophilen Zellen und Monozyten) und bei der glatten Muskulatur des Luftwegs spielen. Die Arbeit dieser Erfindung ist insbesondere bei Entzündungszellen und bei der glatten Muskulatur des Luftwegs anwendbar; die Isozymart, die in menschlichen Monozyten exprimiert wird, ist von besonderem Interesse. Dies trifft zu, weil cyclisches AMP bei der Inhibierung der Chemotaxis und der Aktivierung von Entzündungszellen als sekundärer Botenstoff dient. Außerdem vermittelt cAMP die Relaxation der glatten Muskulatur des Luftwegs. Dies ist, zusammen mit der wichtigen Rolle von PDE IV bei der Metabolisierung von cAMP, die Grundlage zur Untersuchung von PDE IV-Inhibitoren: wegen ihrer Fähigkeit zur Anhebung des Gehalts an cAMP in Leukozyten und der glatten Muskulatur des Luftwegs können PDE IV-Inhibitoren anti-Entzündungs- und bronchodilatorische Aktivitäten besitzen.
Die gegenwärtig bei der Behandlung einer Entzündung und als Bronchodilatoren verwendeten PDE-Inhibitoren, Medikamente wie Theophyllin und Pentoxyfyllin, inhibieren PDE-Isozyme ohne Unterschied in allen Geweben. Diese Verbindungen haben Nebenwirkungen, offensichtlich weil sie unselektiv alle 5 PDE-Isozymklassen in allen Geweben inhibieren. Dies ist eine Überlegung bei der Bewertung des therapeutischen Profils dieser Verbindungen. Der Krankheitszustand, der bekämpft werden soll, kann durch solche Verbindungen wirksam behandelt werden, es können jedoch unerwünschte Nebenwirkungen auftreten, die, wenn sie vermieden oder minimiert werden könnten, die therapeutische Gesamtwirkung dieses Ansatzes bei der Behandlung gewisser Krankheitszustände verbessern würden. Zusammengenommen legt diese Information nahe, daß die Nebenwirkungen, die bei der Verwendung von unselektiven Standard-PDE-Inhibitoren auftreten, durch die Verwendung neuer Isozym-selektiver PDE-Inhibitoren für das vorwiegende PDE in dem Gewebe oder der Zelle von Interesse reduziert werden könnten. Obwohl in der Theorie Isozym-selektive PDE-Inhibitoren eine Verbesserung gegenüber unselektiven Inhibitoren darstellen sollten, sind die bis heute getesteten selektiven Inhibitoren nicht ohne Nebenwirkungen, die als Folge der Inhibition des Isozyms von Interesse in einem nicht geeigneten oder nicht gezielt angegangenen Gewebe auftreten. Zum Beispiel zeigen klinische Studien mit dem selektiven PDE-IV-Inhibitor Rolipram, der als Antidepressivum entwickelt wurde, daß er psychotropische Aktivität hat und gastrointestinale Wirkungen auftreten, z.B. Sodbrennen, Übelkeit und Erbrechen. Es zeigt sich, daß die Nebenwirkungen von Denbufyllin, einem anderen PDE-IV-Inhibitor, der auf die Behandlung von Demens nach mehreren Infarkten gerichtet ist, ebenfalls Sodbrennen, Übelkeit und Erbrechen umfassen können. Man nimmt an, daß diese Nebenwirkungen als Ergebnis der Inhibition von PDE-IV in spezifischen Regionen des ZNS und des gastrointestinalen Systems auftreten.
1986 haben Schneider und Kollegen die Anwesenheit und Charakteristika von stereoselektiven [³H]-Rolipram-Bindungsstellen mit hoher Affinität in Homogenisaten von Rattenhirn beschrieben. Obwohl man annahm, daß diese Bindungsstellen die katalytische Stelle der "nicht Calmodulin-abhängigen cAMP-Phosphodieseterase" (d.h. PDE IV) des Rattenhirns darstellten, war in den Ergebnissen eine auffällige Anormalität offensichtlich. Unter ähnlichen, aber nicht identischen experimentellen Bedingungen, zeigten die Ergebnisse, daß Rolipram einen K_d = 1 nM hatte, während es die PDE IV-Aktivität von Rattenhirn mit einem Ki = 1 μM inhibierte. Somit gab es einen 1000-fachen Unterschied zwischen der Affinität von Rolipram zur Bindungsstelle gegenüber seiner Wirkung auf die katalytische Aktivität. Obwohl bisher keine verständlichen Struktur-Aktivitäts-Beziehungen (SARs) für die PDE-Inhibition und für die Konkurrenz um die [³H]-Rolipram-Bindung aufgestellt wurden, schien der beträchtliche Unterschied in der Wirksamkeit von Rolipram als PDE IV-Inhibitor im Vergleich zu seiner Wirksamkeit an der Bindungsstelle den Bestand er Annahme in Frage zu stellen, daß beide Aktivitäten an demselben molekularen Lokus enthalten sind.
Aufgrund dieses Rätsels wurden mehrer Untersuchungen begonnen. Eine versuchte zu bestimmen, ob die Rolipram-Bindungsstelle mit hoher Affinität auf demselben Protein existierte wie die katalytische Stelle für cAMP. Eine andere Untersuchung versuchte zu bestimmen, ob die SAR für die Inhibition von PDE IV dieselbe war wie die SAR für die Konkurrenz um Rolipram-Bindungsstelle mit hoher Affinität. Eine dritte Untersuchung versuchte zu ermitteln welche biologische Bedeutung, wenn überhaupt, in diesen Ergebnissen liegen könnte, insbesondere, da es die Entwicklung neuer medikamentöser Behandlungen betreffen könnte.
1
Als die Daten von mehreren Tests zusammengebracht wurden, wurde deutlich, daß es auf rekombinantem PDE IV auf menschlichen Monocyten (hPDE IV) mindestens zwei Bindungsformen gibt, an die Inhibitoren binden. Eine Erklärung für diese Beobachtungen ist, daß hPDE IV in zwei unterschiedlichen Formen existiert. Eine bindet Rolipram und Denbufyllin und dergleichen mit einer hohen Affinität, während die andere diese Verbindungen mit niedriger Affinität bindet. Hier unterscheiden wir diese Formen, indem wir sie als die Rolipram-Bindungsform mit hoher Affinität (HPDE IV) und als die Rolipram-Bindungsform mit niedriger Affinität (LPDE IV) bezeichnen.
Die Bedeutung dieser Befunde liegt in der Entdeckung, daß Verbindungen, die wirkungsvoll um die Rolipram-Bindungsform mit hoher Affinität (HPDE IV) konkurrieren, mehr Nebenwirkungen oder intensivere Nebenwirkungen haben als diejenigen, die wirkungsvoller um LPDE IV (die Rolipram-Bindungsform mit niedriger Affinität) konkurrieren. Weitere Ergebnisse zeigen, daß Verbindungen zu der PDE IV-Bindungsform mit niedriger Affinität gerichtete werden können und daß diese Form unterschiedlich ist zu der Bindungsform, an die Rolipram mit hoher Affinität bindet. Es wurde gefunden, daß verschiedene SARs für Inhibitoren existieren, die an der Rolipram-Bindungsform mit hoher Affinität agieren gegenüber der Rolipram-Bindungsform mit niedriger Affinität. Außerdem scheinen diese beiden Formen verschiedene funktionelle Rollen zu haben. Somit scheinen Verbindungen, die mit der Rolipram-Bindungsform mit niedriger Affinität wechselwirkten, entzündungshemmende Aktivität zu haben, wohingegen diejenigen, die mit der Rolipram-Bindungsform mit hoher Affinität wechselwirkten, Nebenwirkungen zeigen oder diese Nebenwirkungen intensiver zeigen.
Es gibt keine eindeutige Erklärung für diese Befunde. Es wird jedoch vorgeschlagen, daß PDE IV in zwei unterschiedlichen tertiären oder quaternären Zuständen existieren kann. Es wird angenommen, daß beide Formen katalytisch aktiv sind. Rolipram bindet an eine katalytische Stelle einer Form mit einer hohen Affinität, die hier mit einem K_i von weniger als 10 nanomolar definiert ist, und an die andere Form mit einer niedrigen Affinität, die hier mit einem K_i von mehr als 100 nanomolar definiert ist.
Eine nützliche Konsequenz dieser Befunde ist, daß es nun möglich ist, Verbindungen zu identifizieren, die vorzugsweise die katalytische Aktivität gegenüber cAMP dann inhibieren, wenn das Enzym in der Form ist, die Rolipram mit einer niedrigen Affinität bindet, wobei die Nebenwirkungen reduziert werden, die offensichtlich mit der Inhibition der Form verknüpft sind, die Rolipram mit einer hohen Affinität bindet. Dies stellt einen überlegenen therapeutischen Index der entzündungshemmenden und/oder bronchodilatorischen Aktivitäten gegenüber den Nebenwirkungen bereit.
Zusammenfassung der Erfindung
Das Ziel der Erfindung wird in den Ansprüchen definiert.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Für die Zwecke dieser Erfindung wird die katalytische Stelle für cAMP, die Rolipram mit einer niedrigen Affinität bindet, als die Bindungsstelle mit "niedriger Affinität" (LPDE IV) bezeichnet, und die andere Form der katalytischen Stelle, die Rolipram mit einer hohen Affinität bindet, als die Bindungsstelle mit "hoher Affinität" (HPDE IV) bezeichnet.
Es wurden anfängliche Experimente durchgeführt, um einen [³H]-Rolipram-Bindungstest zu etablieren und validieren. Details dieser Arbeit sind nachstehend in Beispiel 1 dargestellt.
Um zu bestimmen, ob die Bindungsaktivität mit hoher Affinität und die Bindungsaktivität mit niedriger Affinität beide in demselben Genprodukt liegen, wurde Hefe mittels bekannter Verfahren transformiert und die Expression von rekombinantem PDE IV über einen Zeitraum von 6 Stunden Züchtung verfolgt. Unter Verwendung eines gegen PDE IV gerichteten Antikörpers zeigte die Western-Plot-Analyse, daß die Menge an exprimiertem PDE IV mit der Zeit zunahm und nach 3 Stunden Wachstum ein Maximum erreichte. Außerdem war mehr als 90 % an immunreaktivem Produkt im Überstand einer Zentrifugation bei hoher Geschwindigkeit (100.000 × g) von Hefelysat. [³H]R-(-)-Rolipram-Bindung und die PDE-Aktivität wurden parallel zur Proteinexpression bestimmt. Die PDE IV-Aktivität wurde mit der Rolipram-Bindungsaktivität co-exprimiert, was anzeigt, daß beide Funktionen in demselben Genprodukt existieren. Ähnlich den Ergebnissen mit der Western-Plot-Analyse wurde gefunden, daß mehr als 85 % der durch Rolipram inhibierbaren PDE-Aktivität und [³H]-Rolipram-Bindungsaktivität in der Hefe-Überstandsfraktion vorhanden waren.
Insgesamt existiert das meiste PDE IV, das in diesem System exprimiert wird, als LPDE IV und nur ein kleiner Anteil als HPDE IV. Folglich reflektiert die Inhibition der katalytischen Aktivität von rekombinantem PDE IV primär die Wirkungen von Verbindungen an LPDE IV. Die Inhibition der katalytischen Aktivität von PDE IV kann somit als ein Index der Wirksamkeit von Verbindungen an LPDE IV verwendet werden. Die Wirksamkeit von Verbindungen an HPDE IV kann durch Bestimmung ihrer Fähigkeit der Konkurrenz mit [³H]-Rolipram bewertet werden. Um SARs für die Rolipram-Bindungsstellen mit niedriger Affinität und mit hoher Affinität zu entwickeln, wurden die Wirksamkeiten ausgewählter Verbindungen in zwei Testsystemen bestimmt. Die Ergebnisse von Experimenten unter Verwendung von Standardverbindungen wurden in einer Tabelle zusammengestellt. Wie erwartet waren gewisse Verbindungen bei der Konkurrenz mit [³H]-Rolipram eindeutig an der Stelle wirkungsvoller, an der Rolipram mit hoher Affinität bindet, im Vergleich mit der anderen Stelle, derjenigen, an der Rolipram mit niedriger Affinität bindet. Die SAR-Korrelation zwischen der Bindung mit hoher Affinität und mit niedriger Affinität war schlecht und es wurde geschlossen, daß die SAR für die Inhibition der Bindung von [³H]-Rolipram mit hoher Affinität unterschiedlich war von der SAR für die Bindung für die Rolipram-Bindungsstellen mit niedriger Affinität. Tabelle I zeigt die Ergebnisse von diesen SAR-Arbeiten.
Tabelle I
Denbufyllin ist 7-Acetonyl,1,3-dibutylxanthin, hergestellt bei SmithKline Beecham. Papaverin ist 1-[(3,4-Dimethoxyphenyl)methyl]-6,7-dimethoxyisochinolin. Trequinsin ist 2,3,6,7-Tetrahydro-2-(mesitylimino)-9,10-dimethoxy-3-methyl-4H-primido[6,1-α]isochinolin-4-on. Dipyrimadol ist der generische Name für 2,2',2",2"'-[(4,8-Dipiperidinopyrimido[5,4-d]pyrimidin-2-6-diyl)dinitrilo]tetraethanol.
Diese Ergebnisse zeigen, daß einige Verbindungen selektiv die sogenannte Niedrig-Affinitäts-Form inhibieren können, im Vergleich mit der Hoch-Affinitäts-Form, und vice versa. Die Bedeutung dieser Befunde ist, daß es möglich ist, die Nebenwirkungen durch Planung oder Auswahl von Verbindungen zu minimieren, die selektiv (bevorzugt) eine Stelle inhibieren und damit die gewünschte Antwort hervorrufen bei Ausschluß einer anderen unerwünschten Antwort, oder zumindest die nicht gewünschte Antwort in dem Maß zu minimieren, daß sie nicht mit der geplanten Therapie in nicht akzeptablem Maß interferiert.
Ungeachtet dieser Arbeit haben wir nicht die Basis für die verschiedenen SARs für die Rolipram-Bindung mit hoher Affinität und die Rolipram-Bindung mit niedriger Affinität in dem PDE IV-Isozym definiert. Es wurde jedoch gefunden, daß wenn eine Verbindung ein IC₅₀-Verhältnis von etwa 0,1 oder höher zeigt, berechnet als das Verhältnis von IC₅₀ für die Rolipram-Bindungsform mit hoher Affinität geteilt durch das IC₅₀ für die Form, die Rolipram mit niedriger Affinität bindet, sie einen akzeptablen therapeutischen Index hat. Das heißt, daß man nun eine Reihe von Immun- und Entzündungskrankheiten mit Erfolg behandeln kann, wobei man andere physiologischen Phänomene in keinster Weise oder in einem nicht akzeptablem Maß beeinflußt. Die am meisten bevorzugte Ausführungsform hier ist die Inhibition der Rolipram-Bindungsstelle mit niedriger Affinität als Mittel zur Behandlung von Entzündungskrankheiten und allergischen Erkrankungen.
Verbindungen
Diese Erfindung betrifft diejenigen Verbindungen, die ein IC₅₀-Verhältnis (hohe/niedrige Bindung) von etwa 0,1 oder höher haben. Dies umfaßt jede und alle Verbindungen, die PDE IV-Inhibitoren gemäß der Testanordnung hier sind und die in diesen oder ähnlichen Tests ein Verhältnis innerhalb des definierten Bereichs zeigen; von besonderem Interesse sind diejenigen Verbindungen, die vor dem Anmeldedatum dieser Anmeldung nicht im Stand der Technik sind und/oder nicht getestet sind als oder bekannt als PDE IV-Inhibitoren.
Beispiele solcher Verbindungen, die den IC₅₀-Verhältnisstandard erfüllen, sind in Tabelle 1 dargestellt, ebenso wie in den anhängigen U.S.-Patentanmeldungen USSN 862,083, angemeldet am 30. Oktober 1992; USSN 862,111, angemeldet am 30. Oktober 1992; USSN 862,030, angemeldet am 30. Oktober 1992; und USSN 862,114, angemeldet am 30. Oktober 1992.
Bevorzugte Verbindungen sind diejenigen, die ein IC₅₀-Verhältnis von mehr als 0,5 haben, und insbesondere diejenigen Verbindungen die ein Verhältnis von mehr als 1,0 haben. Bevorzugte Verbindungen sind Trequinsin, Dipyridamol und Papaverin. Verbindungen wie cis-[Cyano-4-(3-cyclopentyloxy-4-methoxyphenyl)cyclohexan-1-carboxylat], 2-Carbomethoxy-4-cyano-4-(3-cyclopropylmethoxy-4-difluormethoxyphenyl)cyclohexan-1-on und cis[4-Cyano-4-(3-cyclopropylmethoxy-4-difluormethoxyphenyl)cyclohexan-1-ol] sind Beispiele von Strukturen, die bevorzugt an die Bindungsstelle mit niedriger Affinität binden und die ein IC₅₀-Verhältnis von 0,1 oder darüber haben.
Die folgenden Beispiele werden dargestellt, um zu illustrieren, wie man die Erfindung durchführen und anwenden kann. Sie sind in keinster Weise so gedacht, den Umfang der Erfindung in irgendeiner Weise oder irgendeinem Maße zu beschränken. Bitte auf die Ansprüche beziehen für das, was für die Erfinder hier reserviert ist.
Beispiele
Acht verschiedene Tests, die auf fünf Arten verteilt sind, wurden verwendet, um die Daten zu erhalten, die die Auswahl eines IC₅₀-Verhältnisses von mehr als 0,1 oder darüber stützten. Die Tests waren: Stimulierung der Säureproduktion bei der Scheiteldrüse, isoliert vom Kaninchen; Inhibition der durch FMLP induzierten Degranulation (Freisetzung von Myeloperoxidase) in menschlichen Neutrophilen; Inhibition der durch FMLP induzierten O₂-Bildung in Eosinophilen des Meerschweinchens; Inhibition der durch LPS induzierten TNF_α-Produktion in menschlichen Monocyten; Erzeugung von Erbrechen beim Hund; Inhibition der durch Antikörper induzierten Bronchokonstriktion bei Meerschweinchen; Umkehrung der durch Reserpin induzierten Hypothermie in Mäusen; und Inhibition der durch LPS induzierten TNF_α-Produktion in adoptiv übertragenen menschlichen Monocyten in Mäusen. Diese Test und die Ergebnisse sind nachstehend dargestellt.
Statistische Analyse
Um die Hypothese zu überprüfen, daß die Inhibition der Stelle mit niedriger Affinität bei PDE IV einhergeht mit der entzündungshemmenden Wirkung dieser Klasse von Verbindungen, wohingegen die Inhibition der Stelle mit hoher Affinität einhergeht mit der Erzeugung von gewissen Nebenwirkungen, bestimmten wir die Fähigkeit verschiedener PDE IV-Inhibitoren die Funktion von Entzündungszellen in vitro und in vivo zu blockieren und die Fähigkeit dieser Verbindungen, in in vitro- und in vivo-Modellen Nebenwirkungen zu erzeugen. Um die Fähigkeit von PDE IV-Inhibitoren zu vergleichen, mit ihrer Fähigkeit der Inhibition der Bindungsstelle mit niedriger Affinität gegenüber ihrer Fähigkeit der Inhibition der Bindungsstelle mit hoher Affinität, eine gegebene therapeutischen Wirkung oder eine Nebenwirkung zu hervorzurufen, verglichen wir die Wirksamkeit dieser Verbindungen in den in vitro- und in vivo-Tests mit ihrer Wirksamkeit gegenüber der katalytischen Aktivität des isolierten Enzyms oder der Stelle mit hoher Affinität mittels einer linearen Korrelation von (r²) oder einer Rangordnungskorrelation (Spearman's Rho). Die lineare Korrelation fragt, ob die Fähigkeit einer Verbindung zur Inhibition der Stelle mit niedriger Affinität oder der Stelle mit hoher Affinität verwendet werden kann, um die Fähigkeit vorauszusagen, eine gegebene entzündungshemmende Wirkung oder Nebenwirkung hervorzurufen. Die Rangordnungskorrelation testet, ob die Rangordnung der Wirksamkeit bei der Produktion einer gegebenen entzündungshemmenden Wirkung oder Nebenwirkung ähnlich ist der Rangordnung der Wirksamkeit bei der Inhibition der Stelle mit niedriger Affinität oder der Stelle mit hoher Affinität. r² und Spearman's Rho wurden unter Verwendung des STAT View II-Computerprogramms für Macintosh berechnet.
PDE IV gegen Rolipram-Bindung mit hoher Affinität
Beispiel 1 – Phosphodiesterase und Rolipram-Bindungstests Es wurde bestimmt, daß isoliertes PDE IV und HPDE IV von menschlichen Monocyten primär in der Form mit niedriger Affinität existiert. Somit kann die Aktivität von Testverbindungen gegen die Form mit niedriger Affinität von PDE IV unter Verwendung von Standardtests für die katalytische Aktivität von PDE IV unter Verwendung von 1 μM [³H]cAMP als Substrat bewertet werden (Torphy et al., 1992).
Überstände einer Zentrifugation bei hoher Geschwindigkeit von Rattenhirn wurden als Quelle für Protein verwendet und beide Enantiomeren von [³H]-Rolipram wurden mit einer spezifischen Aktivität von 25,6 Ci/mMol gewonnen. Die Standardtestbedingungen wurden gegenüber dem publizierten Verfahren dahingehend modifiziert, daß sie mit den PDE-Testbedingungen identisch sind, außer dem letzten cAMP: 50 mM Tris HCl (pH 7,5), 5 mM MgCl₂, 50 μM 5'-AMP und 1 nM [³H]-Rolipram (Torphy et al., 1992). Der Test lief eine Stunde bei 30°C. Die Reaktion wurde beendet und gebundener Ligand wurde von freiem Ligand unter Verwendung eines Brandel-Zellerntegeräts getrennt. Die Konkurrenz um die Bindungsstelle mit hoher Affinität wurde unter Bedingungen bewertet, die identisch waren mit denen, die bei der Messung der PDE-Aktivität bei niedriger Affinität verwendet wurden, außer daß [³H]-cAMP nicht anwesend war.
Beispiel 2 – Akkumulation von Aminopyrin
Gewisse Methylxanthine und andere unselektive PDE-Inhibitoren erhöhen die Säuresekretion in einer Reihe von Arten. Gewisse selektive PDE IV-Inhibitoren, z.B. Rolipram und Ro 20–1724, erhöhen die Säuresekretion in Ratten, insbesondere wenn sie in Kombination mit einem Aktivator der Adenylatcyclase, wie Histamin, gegeben werden. Diese erhöhte Säuresekretion wird begleitet von einer Erhöhung der durch Histamin induzierten Akkumulation von cAMP. Diese berichtete Information wurde getestet, um zu bestimmen, ob das Phänomen existierte. Die Fähigkeit von Verbindungen zur Induktion der Säuresekretion wurde mit ihrer Fähigkeit gegen die Stelle mit niedriger Affinität oder die Stelle mit hoher Affinität korreliert. Der bei dieser Arbeit verwendete Test war die Akkumulation einer schwachen Base, radiomarkiertem Aminopyrin, von dem berichtet wurde, daß es als biochemischer Marker für erhöhte Säuresekretion dient. Der Test folgt:
Gewinnung der Magendrüse
Kaninchen beiderlei Geschlechts wurden durch Genickbruch getötet und der Magen entfernt. Das Fell wurde vom Körper abgezogen; die oberen und inneren Teile des Magens wurden verworfen. Die Magendrüsen wurden mittels einer Modifikation der Verfahren isoliert, die von Berglindh und Obrink (1976) und Sack und Spenney (1982) beschrieben wurden. Die Mucosa wurde dann zerkleinert und mit Kollagenase verdaut, um die Magendrüsen zu isolieren. Die verdauten Drüsen wurden filtriert, gewaschen und 1:15 (Vol./Vol.) in Inkubationsmedium der folgenden Zusammensetzung resuspendiert: NaCl, 132,4 mM; KCl, 5,4 mM; Na₂HPO₄, 5,0 mM; NaH₂PO₄, 1,0 mM; MgSO₄, 1,2 mM; CaCl₂, 1,0 mM; NaHCO₃, 12,0 mM; Kaninchenserumalbumin, 2 mg/ml; Dextrose, 2 mg/ml; bei pH 7,4.
Akkumulation von Aminopyrin
Um die Säuresekretion zu bestimmen, wurden die Magendrüsen in Kombination mit [¹⁴C]-Aminopyrin, verschiedenen Konzentrationen an selektiven PDE IV-Inhibitoren und einer Schwellenkonzentration an Histamin (0,3–1,0 μM) bei 37°C auf einem horizontalen Schüttelgerät (110 Bewegungen/Min.) 20 Minuten gemäß den Verfahren von Sack und Spenney (1982) inkubiert. Die Proben wurden dann zentrifugiert und die Radioaktivität in Teilmengen der Überstandsfraktion und des Pellet bestimmt. Die Aminopyrin-Verhältnisse wurden wie von Sack und Spenney (1982) beschrieben berechnet. Die Ergebnisse wurden ausgedrückt als Prozent einer Antwort, die von einer maximalen Konzentration an Histamin (100 μM) produziert wurden. Die EC₅₀-Werte wurden durch lineare Interpolation unter Verwendung der maximalen Antwort bestimmt, die für jede Verbindung erhalten wurde.
Beispiel 3 – Bewertung der Brechwirkung von selektiven PDE-Inhibitoren in Hunden Mischlingshunde (n=5 für jede Untersuchung) beiderlei Geschlechts wurden von der Tierstation erhalten. Nach einmal übernacht Fasten wurden die Hunde mit 1/2 Dose Hundefutter (Big Bet) mindestens 30 Minuten vor der Untersuchung gefüttert. Eine Kanüle wurde in die Kopfvene einer Vorderpfote platziert, um Wirkstoffe zu verabreichen. Die Kanüle wurde vor der Verabreichung der Versuchsverbindung mit 1 ml isotonischer Salzlösung (0,9 %) gespült. Die Verbindungen wurden entweder in einem Gemisch aus Polyethylenglycol und Salzlösung oder 100 % Polyethylenglycol gelöst und mit einem Volumen von 1,0–2,0 ml/10kg verabreicht. Um sicherzustellen, daß die gesamte Dosis in den Kreislauf gelangte wurde die Kanüle zusätzlich mit 0,5–1 ml Salzlösung gespült. Das Tier wurde für eine Beobachtungszeitraum von 1 Stunde in einen Käfig zurückgebracht. Jedes Tier wurde auf Zeichen von Würgen oder Erbrechen beobachtet und es wurde die Zeit nach der Verabreichung der Verbindung bis zum Auftreten des Verhaltens notiert. Am Ende des Beobachtungszeitraum wurde das Tier in seinen Heimatkäfig zurückgebracht. Die Untersuchungstage wurden durch 7 Tage unterbrochen. Jede Verbindung wurde jedem Hund an den folgenden Untersuchungstagen in steigenden Dosen verabreicht, bis eine Brechwirkung beobachtet wurde. Zu diesem Zeitpunkt wurde der einzelne Hund aus der Untersuchung genommen und höhere Dosen wurden nur bei den Hunden getestet, die noch nicht reagiert hatten.
Die Ergebnisse wurden als kumulativer Prozentsatz an Hunden, die bei jeder Dosis reagiert hatten, wie in der Literatur für quantale Dosis-Wirkungs-Kurven beschrieben. Ein ED₅₀-Wert wurde unter Verwendung der Probit-Analyse berechnet.
Beispiel 4 – Eosinophil-Test beim Meerschweinchen
Isolierung und Reinigung von Eosinophilen
Männlichen (Hartley, Hazelton Labs) Meerschweinchen wurde 4–6 Wochen vor der Verwendung wöchentlich 1 ml Pferdeserum injiziert. Die Tiere wurden mit einem Gemisch von Ketamin/Xylazin (88 mg; 12 mg/ml; 0,4 ml/kg) mindestens 24 Std. nach der Injektion von Pferdeserum anästhesiert. Nach der Induktion der Anästhesie wurde die Bauchhöhle mit 50 ml warmer steriler Salzlösung (0,9 %) gewaschen. Die Waschlösung wurde unter Verwendung eines 14 G-Katheters in konischen Plastikzentrifugenröhrchen von 50 ml gesammelt. Die Meerschweinchen durften sich von der Anästhesie erholen und konnten nach einem Ruhezeitraum von zwei Wochen wieder verwendet werden.
Von der Waschlösung wurden durch Zentrifugation (400 × g, 10 Min.) Zellen isoliert und wurden in 35 ml phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) resuspendiert und mit 10 ml isotonischem Percoll (1,075 g/ml) unterschichtet. Diese Suspension wurde 30 Min. bei 300 × g zentrifugiert. Das Pellet, das vor allem Eosinophile und Erythrocyten enthielt, wurde mit PBS gewaschen und die Erythrocyten wurden lysiert. Diese Zellen wurden in RPMI 1640-Medium mit 20 % FBS resuspendiert und bei 37°C übernacht in einem befeuchteten Inkubator mit 5 % CO₂ inkubiert. Am nächsten Tag wurden die Zellen gewaschen und zur Bestimmung der Lebensfähigkeit (Trypanblau-Ausschluß) und der Reinheit in PBS resuspendiert.
Produktion von Superoxid-Anion (O₂ ^–) Gereinigte Eosinophile (Lebensfähigkeit >95 % und Reinheit >90 %) wurden in PBS mit 20 mM HEPES-Puffer (pH 7,4) und 0,1 % Gelatine mit einer Konzentration von 1–2 × 10⁶ Zellen/ml resuspendiert. Eosinophile (1 × 10⁵) wurden zu einer Platte mit 96 Mulden zugegeben und wurden etwa 1 Std. bei 37°C inkubiert. PDE IV-Inhibitoren wurden für 10 Min. vor dem Beginn der Reaktion zugegeben. Die Reaktion wurde durch Zugabe von Cytochrom C (160 μM) und Formyl-Met-Leu-Phe (fMLP) (30 nM) in der Abwesenheit oder Anwesenheit von 60 Einheiten Superoxid-Dismutase (SOD) initiiert. Die Cytochrom C-Reduktion wurde zu verschiedenen Zeitpunkten mit einem Dynatech MR 7000-Plattenlesegerät bei 550 nm mit der Referenz bei 630 nm gemessen. Die Rate der O₂ ^–-Produktion wurde mittels der linearen Regressionsanalyse unter Verwendung der Nettoabsorption der Mulden in der Abwesenheit oder Anwesenheit von SOD zu verschiedenen Zeitpunkten bestimmt. Die Ergebnisse wurden als Prozentsatz der Kontrollproduktion von O₂ ^– ausgedrückt, korrigiert mit der Basisfreisetzung. Da die maximale beobachtete Inhibition 60 % war, wurde unter Verwendung der linearen Intrapolation der Konzentration und Einklammern von 30 % der log IC₃₀ berechnet.
Beispiel 5 – Bronchokonstriktion in Meerschweinchen
Männliche Hartley Meerschweinchen (200–250g/4 Wochen, Hazelton Research, Denver, PA) wurden durch I.M.-Injektionen von 0,35 ml einer 5%-igen (Gew./Vol.) Ovalbumin-/Kochsalzlösung in jeden Schenkel (0,7 ml insgesamt) am Tag 1 und 4 sensibilisiert. Nach dem Tag 25 standen die Meerschweinchen zur Verwendung zur Verfügung.
Experimentelles Verfahren
Männliche Hartley Meerschweinchen (600–800 g Hazelton), aktiv sensibilisiert gegen Ovalbumin, wurden 10–15 Minuten vor der Operation mit Natriumpentobarbital anästhesiert (40 mg/kg I.P.). In die Jugularvene, die Halsschlagader und die Trachea wurden Katheter (Deseret Intracath^® Vialon^® Polymerharz Radiopaque Katheter (Deseret Medical, Inc., Sandy, UT) 22GA und 19 GA, und PE Schläuche 260) für die Wirkstoffverabreichung, Blutdruckmessung und Beatmung eingebracht. Es wurde eine bilaterale Vagotomie durchgeführt, um die cholinergische Störung zu minimieren. Die Tiere wurden betäubt (Pancuroniumbromid, 0,1 mg/kg i.v.) und mit einem Harvard Rodent Respirator (Modell 683, Harvard Apparatus, South Natick, MA) beatmet (45 Atemzüge/Min.). Druckänderungen im Atmungsweg wurden mittels eines Seitenarms des Trachea-Katheters mit einem Elcomatic-Transducer (Buxco Electronics, Sharon, CT) gemessen. Das Atmungsvolumen wurde so eingestellt, daß. im Seitenarm ein Druck von 8 cm H₂O erzeugt wurde (ca 5 cc Raumluft). Der Blutdruck wurde mit einem Statham P23XL Physical Pressure Transducer (Viggo-Spectramed, Oxnard, CA) gemessen. Der Druck wurde mit einem Grass Modell 7D Polygraph (Grass Instrument Co., Qincy, MA) aufgezeichnet. Die Tiere wurden während des Experiments auf einem Wärmetisch warmgehalten, um die Körpertemperatur aufrechtzuerhalten.
Testverbindungen oder Vehikel wurden 10 Minuten vor der Herausforderung mit dem Antigen i.v. verabreicht. Zum Zeitpunkt 0 wurden 0,1 mg/kg Ovalbumin i.v. verabreicht. Bei der maximalen Antigenantwort wurde eine zusätzliche Dosis Antigen, 0,2 mg/kg Ovalbumin, i.v. verabreicht. Nachdem die maximale Antigenantwort auf die zusammengenommen 0,3 mg/kg Ovalbumin erreicht war, wurde eine gesättigte KCl-Lösung, 1 cc/kg i.v., verabreicht, die eine maximale Bronchokonstriktion erzeugte.
BEISPIEL 6 – INHIBITION VON DURCH LPS INDUZIERTEM TNF_α in menschlichen Monocyten
In vitro-Untersuchungen
Um zu bestimmen, ob die TNF_α-Inhibition mit der Inhibition von LPDE IV oder HPDE IV in Beziehung steht, wurde eine Reihe von PDE IV-Inhibitoren, die einen Bereich von Wirksamkeiten für LPDE IV und HPDE IV hatten, auf ihre Fähigkeit untersucht, die TNF_α-Erzeugung in menschlichen Monocyten zu inhibieren, die mit Lipopolysacchariden (LPS) in vitro stimuliert worden waren. Die Verwendung von primären menschlichen Zellen für diese Durchmusterung wurde unter der Voraussetzung als extrem wichtig eingeschätzt, daß verschiedene Arten sich beim relativen Beitrag von LPDE IV und HPDE IV bei der Hydrolyse von cAMP in Entzündungszellen dramatisch zu unterscheiden scheinen.
Verfahren
Die TNF_α-Inhibition wurde in peripheren menschlichen Blutmonocyten getestet, die aus frisch erhaltenen Buffy coats oder Plasmaphorese-Resten von Blut von normalen menschlichen Spendern gereinigt wurden (Collata). Die Monocyten wurden mit einer Dichte von 1 × 10⁶ Zellen/ml Medium/Mulde in Vielfachgefäßen mit 24 Mulden ausplattiert. Die Zellen konnten 1 Std. adhärieren, wonach der Überstand abgesaugt wurde und 1 ml frisches Medium (RPMI-1640, das 1 % fötales Kälberserum und Penicillin/Streptomycin mit 10U/ml enthielt) wurde zugegeben. Die Zellen wurden vor der Zugabe von LPS (E. coli 055:B5, Sigma Chemicals) mit einer Endkonzentration von 100 ng/ml 45 Min. in der Anwesenheit oder Abwesenheit von Testverbindungen mit Konzentration inkubiert, die von 1 nM bis zu 1 mM reichten. Die Testverbindungen wurden in einer 50:50 Konzentration von Dimethylsulfoxid/Ethanol gelöst und verdünnt, so daß die endgültige Lösungsmittelkonzentration in dem Monocyten-Kulturmedium 0,5 % Dimethylsulfoxid und 0,5 % Ethanol war. Die Kulturüberstände wurden nach 14–16 Std. Inkubation bei 37°C/5 % CO₂ von den Monocyten entfernt und bei 100 × G zentrifugiert, um Zelltrümmer zu entfernen. Es wurden entweder sofort Cytokin-Tests durchgeführt oder die Kulturüberstände wurden bei –70°C bis zum Test aufbewahrt.
Die Niveaus an TNF_α wurden unter Verwendung eines ELISA (Winston) unter Verwendung eines murinen monoclonalen anti-Mensch-TNF_α-Antikörpers (vgl. nachstehend) als Capture-Antikörper und eines polyclonalen Kaninchen-anti-Mensch-TNF_α als zweitem Antikörpers gemessen. Zum Nachweis wurde ein Peroxidase-gekoppelter Ziege-anti-Kaninchen (Boehringer Mannheim, Kat. #605222) zugegeben, gefolgt von einem Substrat für die Peroxidase (1 mg/ml Orthophenylendiamin mit 0,1 % Harnstoffperoxid). Die Levels an TNF_α in den Proben wurden aus einer Standardkurve berechnet, die mit in E. coli produziertem rekombinantem menschlichem TNF_α erzeugt wurde. Die monoclonalen Antikörper gegen menschliches TNF_α wurden aus der Milz von BALB/c-Mäusen gewonnen, die mit rekombinantem menschlichem TNF_α immunisiert worden waren, mittels einer Modifikation des Verfahrens von Kohler und Millstein (Nature, Bd. 256, S. 495–497, 1975). Polyclonale Kaninchen-anti-Mensch-TNF_α-Antikörper wurden durch wiederholte Immunisierung von weißen Neu Seeland-Kaninchen mit rekombinantem menschlichem TNF_α erzeugt, das in vollständigem Freund's Adjuvans emulgiert war.
In vivo-Unterdrückung der Produktion von menschlichem TNF_α in einem adoptiven Peritonitis-Modell
Verfahren
Eine halbe Einheit von mit Heparin versetztem venösem Gesamtblut wurde gesunden Angestellten entnommen, die keinerlei Medikamente nahmen. Polymorphonukleäre Leukozyten wurden Überlagerung des Bluts auf Histopaque-1077 mit 30 Min. Zentrifugation bei 25°C und 800 × g abgetrennt. Der Lymphocyten/Monocyten-Anteil wurde entnommen und zweimal mit DPBS (Dulbecco's phosphatgepufferter Salzlösung) ohne Ca²⁺ und Mg²⁺ bei 1000 rpm 10 Min. bei 25°C gewaschen. Das Pellet wurde in 5 ml DPBS ohne Ca²⁺ und Mg²⁺ resuspendiert, 5 ml Percoll-Lösung überlagert, die in RPMI 1640-Medium hergestellt wurde, das bei 25°C ohne Serum war, und 30 Min. bei 550 × g und 25°C zentrifugiert. Die schwimmende Schicht an Monocyten wurde entnommen und zweimal mit DPBS ohne Ca²⁺ und Mg²⁺ und 10 Min. bei 1000 rpm und 25°C gewaschen. Das zuletzt gewaschene Monocyten-Isolat wurde mit 6–10 × 10⁶ Zellen/ml in DPBS ohne Ca²⁺ und Mg²⁺ bei 25°C suspendiert. Monocyten wurden auch mit demselben Verfahren aus Source Leukozyten Packen isoliert. Die Monocyten-Herstellungen bewegten sich zwischen 65 und 90 % Monocyten, und die Lebensfähigkeit der Zellen war >97 % (Trypanblau-Ausschluß).
BALB/c-Männchen (Charles River Laboratories, Wilmington, MA) wurden in Gruppen von 4–5 Vorrichtung mit Barrieren gehalten. Mäusen mit einem Gewicht von 18–25 g und demselben Alter wurde 0,5 ml von 6–10 × 10⁶ Monocyten/ml unter Verwendung von leichtem Druck auf eine Spritze mit einer Nadel von 23 ga in die Bauchhöhle injiziert, so daß die Monocyten minimalen Scherkräften und Streß ausgesetzt waren. Innerhalb von 2 Min. nach Erhalt der Monocyten wurden die Mäuse durch 15 Min. orale Zuführung mit Vehikel oder Verbindung behandelt. Den Tieren wurde dann intraperitoneal (i.p.) 0,2 ml an 125 mg/ml Endotoxin (E. coli, Typ W, Difco) injiziert, das in DPBS ohne Ca²⁺ und Mg²⁺ gelöst war. Zwei Std. später wurden die Tiere durch Ersticken in Kohlenstoffdioxid getötet und 1,5 ml DPBS ohne Ca²⁺ und Mg²⁺ (4°C) wurden i.p. injiziert. Die Bauchhöhle wurde vorsichtig massiert und die Waschlösung entfernt und in Polypropylen-Röhrchen in einem Eisbad platziert. Die Proben wurden durch Zentrifugation (5 Min. bei 12.500 × g und 4°C) geklärt. Die Überstände wurden in neue Röhrchen dekantiert (können bei –20°C aufbewahrt werden) und mittels ELISAs auf menschlichen und Mäuse-TNF_α getestet werden. Die ED₅₀-Werte wurden mit Standardverfahren berechnet.
Beispiel 7 –Verfahren mit menschlichen Neutrophilen
Isolierung und Reinigung
Neutrophile (PMNs) wurden durch Gradientenzentrifugation aus mit Heparin versetztem Blut unter Verwendung von Ficoll (Histopaque 1077) isoliert, gefolgt von Dextransedimentation, um Erythrocyten zu entfernen. Verbliebene Erythrocyten wurden 30 Sek. mit Wasser lysiert und die Isotonie unter Verwendung von 10X DB-PBS (w/o Ca²⁺ oder Mg²⁺) wiederhergestellt. PMNs wurden durch Zentrifugation isoliert und vor der Bestimmung der Zellzahl und der Lebensfähigkeit (Trypanblau-Ausschluß) ein zusätzliches mal mit 10X DB-PBS gewaschen. Die Zellzahl wurde in Abhängigkeit von dem einzelnen Spender auf 0,75–1,5 × 10⁶ Zellen/ml eingestellt.
Degranulation (Freisetzung von Myeloperoxidase)
Eine Teilvolumen (0,1 ml) der vorstehenden Zellsuspension wurde in Earles Balanced Salzlösung, die 20 mM HEPES-Puffer (pH = 7,4) und 0,1 % Gelatine in der Gegenwart von 5 μg/ml Cytochalasin B enthielt, 5 Min. bei 37°C in einem Schüttelbad inkubiert. Die Zellen wurden vor der Zugabe von fMLP (30 nM) zusätzlich 5 Min. mit verschiedenen Konzentrationen von selektiven PDE IV-Inhibitoren und PGE₂ (3–10 nM) vorbehandelt. FMLP wurde zugegeben und die Inkubation zusätzliche 30 Min. fortgeführt. Die Reaktion wurde durch Stellen der Proben auf Eis beendet, gefolgt von Zentrifugation. Die Überstandsfraktion wurde entfernt und bis zum Test auf Myeloperoxidase-Aktivität gefroren (–30°C) aufbewahrt.
Bestimmung der Myeloperoxidase-Aktivität
Die Myeloperoxidase-Aktivität wurde unter Verwendung von o-Dianisidin als Substrat und Meerrettich-Peroxidase als Standard bestimmt. Ein Teilvolumen (50 μl) an Überstand wurde mit 100 μl Substrat (o-Dianisidin, 0,53 mM; H₂O₂, 0,147 mM; Endkonzentration) in 50 mM Na-Phosphatpuffer (pH 6,0) inkubiert. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 50 μl 4 M H₂SO₄ beendet. Die Produktbildung wurde durch Messung der Absorption bei 410 nm bestimmt und die Aktivität wurde durch Vergleich mit der Standardkurve unter Verwendung von Meerrettich-Peroxidase bestimmt. Die Ergebnisse wurden als Prozent von der Kontrolle (Menge der in der Gegenwart von PGE₂ allein freigesetzten Myeloperoxidase) ausgedrückt. Da die maximale Inhibition, die für die Mehrzahl der Verbindungen beobachtet wurde, 30 % war, wurde unter Verwendung der linearen Intrapolation der Konzentration und Einklammern von 15 % log (IC₁₅)-Werte berechnet.
Beispiel 8 – Umkehr der durch Reserpin induzierten Hypothermie bei Mäusen
Männliche CF-1- oder BALB/c-Mäuse wurden einzeln in Drahtkäfigen isoliert. Die rektale Temperatur wurde vor der Vorbehandlung mit Reserpin (10 mg/kg, i.p.) aufgezeichnet. Vier Stunden nach Reserpin wurde die rektale Temperatur aufgezeichnet und einzelnen Tieren wurden verschiedene Dosen (oral) an Testverbindung, Vehikel oder Rolipram (10 mg/kg) verabreicht. Dann wurden 2 Std. alle 30 Min. die rektalen Temperaturen aufgezeichnet. Die Ergebnisse wurden als Änderung der Temperatur von derjenigen ausgedrückt, die 4 Std. nach Reserpin beobachtet wurde (die Temperaturen fielen etwa 10–15°C unter das Grundniveau). Die Dosis-Antwort-Kurven wurden unter Verwendung der Änderungen der Temperatur konstruiert, die 90 oder 120 Min. nach der Behandlung aufgezeichnet wurden. Die ED₅₀-Werte wurden durch Probit-Analyse oder lineare Regression der Mittelwerte von 6–9 Tieren bestimmt. Um die Fähigkeit von Verbindungen zur Umkehr der durch Reserpin induzierten Hypothermie mit ihrer Fähigkeit zur Inhibition der Bindung mit niedriger Affinität oder der Bindung mit hoher Affinität zu vergleichen, wurden die ED₅₀- und die IC₅₀-Werte als – log(Wert) ausgedrückt.
Beispiel 9 – Beziehung zwischen der biologischen Funktion und der Inhibition von PDE IV
Um zu bestimmen, ob gewisse biologische Wirkungen der PDE IV-Inhibition assoziiert waren mit der Inhibition von LPDE IV oder HPDE IV, wurde unter Verwendung einer linearen und Rangordnungskorrelation ein Vergleich zwischen der Fähigkeit von Verbindungen zur Erzeugung einer Wirkung und die Fähigkeit von Verbindungen zur Inhibition von LPDE IV oder HPDE IV angestellt. Diese Korrelationen können von mehreren Faktoren beeinflußt werden: 1) der Stabilität von Verbindungen; 2) der Fähigkeit von Verbindungen zum Eindringen in Zellen; 3) in vivo-Untersuchungen, der Bioverfügbarkeit von Verbindungen; 4) den Korrelationswerten, insbesondere die lineare Korrelation ist empfindlich gegenüber der Differenz bei den Wirkungen, je größer der Bereich der Wirkungswerte ist, um so einfacher ist es, eine signifikante lineare Korrelation zu messen.
Diese Erkenntnisse wurden bei der Analyse und Zusammenstellung der Korrelation zwischen der Inhibition von LPDE IV oder HPDE IV und der biologischen Funktion in den verschiedenen Testsystemen berücksichtigt.
Unter Verwendung von isolierten Entzündungszellen war die Unterdrückung der Produktion von Monocyten-TNF_α und die Inhibition der Produktion von Superoxid in Eosinophilen vom Meerschweinchen besser korreliert mit der Inhibition von LPDE IV, und nicht von HPDE IV. Außerdem war die Verhinderung der durch Antigen erzeugten Bronchokonstriktion in vivo besser korreliert mit der Inhibition von LPDE IV als mit HPDE IV. In diesem in vivo-Modell scheinen die PDE IV-Inhibitoren dadurch zu wirken, daß sie die Mastzellen-Degranulation verhindern (Underwood et al., im Druck). Die Inhibition von Entzündungszellen war jedoch nicht immer assoziiert mit der Inhibition von LPDE IV, weil gefunden wurde, daß die Inhibition der Degranulation von Neutrophilen besser korrelierte mit der Inhibition von HPDE IV als von LPDE IV. Somit scheint es, daß einige, aber nicht die gesamte Unterdrückung der Aktivität von Entzündungszellen mit der Inhibition von LPDE IV einhergeht. Im Gegensatz dazu waren die Erhöhung der Säureproduktion, die Erzeugung von Erbrechen und die Umkehr der durch Reserpin induzierten Hypothermie (eine Messung des psychotropischen Potentials von PDE IV-Inhibitoren) besser korreliert mit der Inhibition von HPDE IV, und nicht von LPDE IV. Somit gehen die meisten der potentiellen Nebenwirkungen dieser Klasse von Verbindungen einher mit der Inhibition von HPDE IV.
Somit legen diese Befund nahe, daß Verbindungen, die bevorzugt LPDE IV inhibieren, nützliche entzündungshemmende Wirkungen erzeugen bei reduziertem Potential des Hervorrufens von unerwünschten Nebenwirkungen. Somit sollte die Auswahl von Verbindungen mit einem IC₅₀-Verhältnis von etwa 0,1 oder darüber bezüglich des IC₅₀ für die katalytische Form von PDE IV, die Rolipram mit hoher Affinität bindet, geteilt durch das IC₅₀ für die katalytische Form von PDE IV, die Rolipram mit niedriger Affinität bindet (HPDE IV/LPDE IV) in einem Anwachsen ihres therapeutischen Index resultieren, d.h. die gewünschte Wirkung wird maximiert und die schädliche Wirkung wird minimiert.
Um zu bestimmen, ob diese Auswahlregel in der Tat Verbindungen mit einem verbesserten therapeutischen Index identifizieren würde, wurden drei Modelle überprüft, die die therapeutische Wirkung mit der Nebenwirkung verglichen. Diese umfaßten einen in vitro- Vergleich zwischen der Fähigkeit von Verbindungen zur Unterdrückung der TNF_α-Produktion von isolierten menschlichen Monocyten mit ihrer Fähigkeit zur Stimulierung der Säuresekretion in isolierten Wanddrüsen des Kaninchens und zwei in vivo-Vergleiche der Untersuchung der Fähigkeit von Verbindungen zur Verhinderung der durch Antigen induzierten Bronchokonstriktion im Meerschweinchen und der Fähigkeit der Erzeugung von Erbrechen bei Hunden und der Fähigkeit von Verbindungen zur Unterdrückung der TNF_α-Produktion in einem adoptiven Übertragungsmodell in Mäusen und ihrer Fähigkeit zur Umkehr der durch Reserpin induzierten Hypothermie in Mäusen.
PDE IV-Inhibitoren mit einem Selektivitätsverhältnis (HPDE IV /LPDE IV) von gleich oder größer als 0,1 zeigten eine ausgeprägte Verbesserung in ihrem therapeutischen Index. Zum Beispiel zeigten cis-[4-Cyano-4-(3-cyclopentyloxy-4-methoxyphenyl)cyclohexan-1-carboxylat], 2-Carbomethoxy-4-cyano-4-(3-cyclopropylmethoxy-4-difluormethoxyphenyl)cyclohexan-1-on und cis-[4-Cyano-4-(3-cyclopropylmethoxy-4-difluormethoxyphenyl)cyclohexan-1-ol], alle mit einem Selektivitätsverhältnis von ≥0,1, eine 100-fache Verbesserung in ihrem therapeutischen Index im Vergleich mit dem archetypischen PDE IV-Inhibitor R-Rolipram. Dies zeigt somit, daß die Verwendung der Selektionsanweisung von HPDE IV IC₅₀/LPDE IV IC₅₀ ≥0,1 Verbindungen mit einem verbesserten therapeutischen Index beim in vitro-Vergleich identifiziert.

Claims

Verfahren zum Identifizieren eines PDE IV-Inhibitors, wobei das Verfahren umfasst: Bestimmen des IC₅₀-Wertes des Inhibitors für sein Binden an die PDE IV-Form, die Rolipram mit hoher Affinität bindet, und seines IC₅₀-Wertes für sein Binden an die PDE IV-Form, die Rolipram mit niedriger Affinität bindet; und Bestimmen, ob das Verhältnis des IC₅₀-Wertes für Binden mit hoher Affinität zum IC₅₀-Wert für Binden mit niedriger Affinität etwa 0,1 oder größer ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Verfahren einen Inhibitor identifiziert, der ein IC₅₀-Verhältnis von etwa 0,1 oder größer hat; bestimmt unter Verwendung von Rattenhirn-PDE IV als die Form, die Rolipram mit hoher Affinität bindet, und von menschlichem PDE IV als die Form, die Rolipram mit niedriger Affinität bindet.
Verfahren nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, wobei das IC₅₀-Verhältnis etwa 0,5 oder größer ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das IC₅₀-Verhältnis etwa 1,0 oder größer ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die mit niedriger Affinität bindende Form von PDE IV von menschlichen Monocyten abgeleitet ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei das PDE IV, das als mit hoher Affinität bindende Form von PDE IV verwendet wird, der Hochgeschwindigkeitsüberstand eines Rattenhirnzellenhomogenates ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5 oder Anspruch 8, wobei das Verfahren umfasst: Bestimmen des IC₅₀-Wertes des Inhibitors für das Konkurrieren mit dem Binden von 1 nM von [³H]R-Rolipram an eine Form von PDE IV, die Rolipram mit hoher Affinität bindet; Bestimmen des IC₅₀-Wertes für das Hemmen der katalytischen Aktivität einer PDE IV-Form, die Rolipram mit einer niedrigen Affinität bindet, unter Verwendung von 1 μM [³H]-cAMP als das Substrat; und Bestimmen, ob das Verhältnis des IC₅₀-Wertes für das Binden mit hoher Affinität zu dem IC₅₀-Wert für das Binden mit niedriger Affinität etwa 0,1 oder größer ist.