DE69430312T2

DE69430312T2 - Peralkylierte oligopeptidmischungen

Info

Publication number: DE69430312T2
Application number: DE69430312T
Authority: DE
Inventors: Sylvie Blondelle; Richard A. Houghten; John M. Ostresh
Original assignee: Torrey Pines Institute for Molecular Studies
Current assignee: Torrey Pines Institute for Molecular Studies
Priority date: 1993-06-17
Filing date: 1994-06-10
Publication date: 2002-10-02
Anticipated expiration: 2014-06-11
Also published as: EP0722458B1; DE69430312D1; US5480971A; CA2165561A1; AU694438B2; EP0722458A4; WO1995000539A1; CA2165561C; EP0722458A1; US5763193A; ATE215559T1; AU7171994A

Description

Gebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft die Synthese und Verwendung Peptid-ähnlicher Gemische. Die vorliegende Erfindung betrifft insbesondere die Synthese und Verwendung eines Gemisches von peralkylierten Peptiden, deren Peptid-Bindungs- Amidostickstoffatome alkyliert sind, wie auch reaktive Wasserstoffatome an Seitenketten und, falls vorliegend, eine N-terminale Aminogruppe und eine C-terminale Carboxylgruppe, dies sein können.

Hintergrund der Erfindung

Innerhalb der letzten Jahre führten die Entwicklungen in der Peptidsynthese- Technologie zur automatisierten Synthese von Peptiden, die durch die Anwendung der Festphasen-Syntheseverfahren erfolgte. Die Festphasen-Synthesechemie, die diese Technologie ermöglichte, wurde erstmalig von Merrifield et al. in J. Amer. Chem. Soc., 85: 2149-2154 (1963) beschrieben. Das "Merrifield-Verfahren" blieb zum größten Teil unverändert und es wird in nahezu allen heute verfügbaren aromatischen Peptidsynthesizern angewendet.
Kurz dargestellt, beinhaltet das Merrifield-Verfahren die Synthese einer Peptidkette auf festen Harzträgerteilchen. Diese Teilchen bestehen im Allgemeinen aus Polystyrol, das mit Divinylbenzol unter Bildung poröser Kügelchen, welche sowohl in Wasser als auch in verschiedenen in der Synthesevorschrift verwendeten organischen Lösungsmitteln unlöslich sind, vernetzt ist. Die Harzteilchen enthalten eine festgelegte Menge an Amino- oder aromatischen Hydroxymethyleinheiten, die als Verknüpfungspunkt für die erste Aminosäure im Peptid dienen.
Die Anbindung der ersten Aminosäure erfordert die chemische Reaktion seines Carboxy-terminalen (C-terminalen) Endes mit dem derivatisierten Harz unter Bildung des Carboxy-terminalen Endes des Oligopeptids. Das α-Amino-Ende der Aminosäure ist im Allgemeinen mit einer t-Butoxy-Carbonylgruppe (t-BOC) oder mit einer 9-Fluorenylmethyloxycarbonylgruppe (Fmoc) blockiert, um die Aminosäure, die auch in einer anderen Weise als der Teilnahme an der Kupplungsreaktion reagieren könnte, zu schützen. Die Seitenkettengruppen der Aminosäuren werden, wenn sie reaktiv sind, auch durch verschiedene Benzyl-abgeleitete Schutzgruppen in Form von Ethern, Thioethern, Estern und Carbamaten und durch t-Butyl-abgeleitete Blockierungsmittel für die Fmoc-Synthesen blockiert (oder geschützt).
Der nächste Schritt und die nachfolgenden Wiederholungscyclen beinhalten die Deblockierung der Amino-terminalen (N-terminalen) Harz-gebundenen Aminosäure (oder des terminalen Rests der Peptidkette) zur Entfernung der α-Amino- Blockierungsgruppe, gefolgt von der chemischen Addition (Kupplung) der nächsten blockierten Aminosäure. Das Verfahren wird für so viele Zyklen wiederholt, wie es für die Synthese der gesamten erwünschten Peptidkette notwendig ist. Nach jedem der Kupplungs- und Deblockierungsschritte wird das Harz-gebundene Peptid sorgfältig gewaschen, um vor der Durchführung des nächsten Schritts jegliche restlichen Reaktanten zu entfernen. Die festen Trägerteilchen erleichtern die Entfernung der Reagenzien bei jedem Schritt, da das Harz und das Harz-gebundene Peptid leicht filtriert und gewaschen werden können, während sie in einer Säule oder einer Ausstattung mit porösen Öffnungen, wie einem Filter, zurückgehalten werden.
Die synthetisierten Peptide werden von dem Harz durch saure Katalyse (im Allgemeinen mit Fluorwasserstoffsäure oder Trifluoressigsäure) freigesetzt, welche das Peptid vom Harz spaltet, wobei eine Amid- oder Carboxylgruppe an seiner C- terminalen Aminosäure verbleibt. Die saure Spaltung dient auch der Entfernung der Schutzgruppen von den Seitenketten der Aminosäuren in dem synthetisierten Peptid. Die fertigen Peptide können anschließend durch ein beliebiges der vielen chromatografischen Verfahren gereinigt werden.
Obwohl die meisten Peptide mit dem vorstehend beschriebenen Verfahren mittels automatisierter Instrumente synthetisiert werden, ermöglicht ein neuerer Fortschritt in dem Festphasen-Verfahren von R. A. Houghten die Synthese einer Vielzahl unabhängiger Peptide gleichzeitig durch manuelle Mittel. Das "Simultaneous Multiple Peptide Synthesis" ("SMPS")-Verfahren ist in US-Patent 4 631 211 (1986); Houghten, Proc Natl. Acad. Sci., 82: 5131-5135 (1985); Houghten et al., Int. J. Peptide Protein Res., 27: 673-678 (1986); Houghten et al., Biotechniques, 4, 6, 522-528 (1986) und Houghten, US-Patent 4 631 211, beschrieben.
Zur Veranschaulichung, das SMPS-Verfahren nutzt poröse Behälter, wie Beutel aus Plastiknetzen, um das feste Trägersyntheseharz zurückzuhalten. Ein Festphasen- Verfahren des Merrifield-Typs wird mit den Harz-enthaltenden Beuteln durchgeführt, die bei jedem beliebigen Schritt zur Anfügung des gleichen erwünschten Aminosäurerests gemeinsam gruppiert werden. Die Beutel werden anschließend gewaschen, getrennt und zur Anfügung der nachfolgenden gleichen oder verschiedenen Aminosäurereste umgruppiert, bis die Peptide der vorgesehenen Länge und Sequenz auf den gesonderten Harzen innerhalb jedes entsprechenden Beutels synthetisiert worden sind.
Das Verfahren ermöglicht die Synthese einer Vielzahl, aber verschiedener Peptide zur gleichen Zeit, da die Peptid-gebundenen Harze während des Verfahrens in ihren gesonderten Beuteln verbleiben. Das SMPS-Verfahren wurde verwendet, um bis zu 200 verschiedene Peptide durch einen einzigen Techniker in weniger als zwei Wochen zu synthetisieren, eine Geschwindigkeit, die eine Produktion der meisten automatischen Peptidsynthesizer enorm übersteigt.
Seit kurzem ist eine Roboter-Ausstattung für die automatisierte mehrfache Peptidsynthese kommerziell verfügbar. Die Ausstattung führt die nachfolgenden Schritte der mehrfachen, gesonderten Festphasen-Peptidsynthese durch iterative mechanisch-intensive Mittel durch. Dieses Instrument kann bis zu 96 verschiedene Peptide gleichzeitig synthetisieren, aber es ist derzeit hinsichtlich der Menge seiner Peptidausbeute begrenzt.
Das Interesse an der Gewinnung biologisch aktiver Peptide für pharmazeutische, diagnostische und andere Zwecke würde ein Verfahren, ausgelegt zum Auffinden eines Peptidgemisches oder eines einzigen Peptids innerhalb eines Gemisches, mit optimaler Wirkung für eine Zielanwendung wünschenswert erscheinen lassen. Peptidgemische zum Screening ermöglichen es dem Forscher, die Suche nach geeigneten therapeutischen und diagnostischen Peptidverbindungen stark zu vereinfachen. Das Screening bzw. Absuchen von Gemischen, die Hunderttausende oder mehr Peptide enthalten, ist leicht durchzuführen, da viele biochemische, biologische und einige wenige Tier-Assays ausreichend empfindlich sind, um die Wirksamkeit der Verbindungen nachzuweisen, die bis in den Nanogramm- oder sogar Pikogramm-Bereich pro Milliliter verdünnt worden sind, dem Konzentrationsbereich, in dem natürlich vorkommende biologische Signale, wie Peptide und Proteine, wirken.
Fast alle der breiten Vielfalt an biologisch relevanten Ligand-Rezeptor-(oder Affektor- Akzeptor)-Wechselwirkungen erfolgen in Anwesenheit eines komplexen Milieus anderer Substanzen (d. h. Proteine machen bis zu annähernd 5-10 Prozent des Plasmas aus, z. B. Albumin 1-3 Prozent, Antikörper 2-5 Prozent - Salze, Lipide/Fette usw.) Dies trifft eigentlich auf alle biologisch wirksamen Substanzen zu, da die meisten allgemein vorhanden sind und im nanomolaren Bereich oder bei niedrigeren Konzentration wirksam sind. Diese Verbindungen werden auch in den meisten Fällen entfernt von ihren Wirkungsorten produziert.
Dass ein kleines Peptid (oder ein anderes Moleküle) leicht ein Akzeptorsystem "finden" kann, daran binden kann und eine notwendige biologische Funktion beeinflussen kann, bevor es aus dem Kreislauf entfernt oder abgebaut wird, lässt vermuten, dass eine einzige spezifische Peptidsequenz in einer sehr großen Mannigfaltigkeit und Konzentration in anderen individuellen Peptiden vorhanden sein kann und durch sein besonderes Akzeptorsystem (Antikörper, Zellrezeptor, usw.) noch erkannt werden kann. Wenn jemand ein Mittel erfinden könnte, um eine synthetische, kombinatorische Bibliothek von Peptiden herzustellen und zu screenen bzw. abzusuchen, dann könnte die normale vorzügliche Empfindlichkeit biologischer Affektor/Akzeptor-Systeme zum Screening einer riesigen Anzahl synthetischer Oligopeptide verwendet werden.
Von Interesse beim Screening einer sehr großen Zahl von Peptiden ist die Arbeit von Geysen et al., der sich mit Verfahren zur Synthese von Peptiden mit spezifischen Aminosäuresequenzen befasste und anschließend diese Peptide nutzte, um Reaktionen mit verschiedenen Rezeptoren zu identifizieren. Siehe US-Patente 4 708 871, 4 833 092 und 5 194 392; P.C.T. Veröffentlichungsnr. WO 84/03506 und WO 84/03564; Geysen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 81: 3998-4002 (1984); Geysen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 82: 178-182 (1985); Geysen et al., in Synthetic Peptides as Antigens, 130-149 (1986); Geysen et al., J. Immunol. Meth., 102: 259-274 (1987); und Schoofs et al., J. Immunol., 140: 611-616 (1988).
In US-Patent 5 194 392 beschreibt Geysen ein Verfahren zur Bestimmung sogenannter "Mimotope". Ein Mimotop wird als ein Katamer (ein Polymer einer genau definierten Sequenz, das durch die Kondensation einer genauen Anzahl kleiner Moleküle gebildet wird) definiert, das in mindestens einer seiner Konformationen einen Oberflächenabschnitt aufweist, in dem die Molekültopologie dem Epitop entspricht, von dem es eine Nachahmung ist. Ein Epitop wird als die Oberfläche eines antigenen Moleküls definiert, das durch das Gebiet der Wechselwirkung mit einem Antikörpermolekül gekennzeichnet ist.
Die Mimotope werden auf einer Reihe von festen Polymerstäben (z. B. Polyethylen mit einer Beschichtung aus einer gepfropften Polyacrylsäure) synthetisiert, die einen Durchmesser von etwa 4 mm und eine Länge von etwa 50 mm besitzen. An die aufpolymerisierten Polyacrylsäureharze wird ein Spacer angefügt, der durch die Reaktion der s-Aminogruppe des t-BOC-Lysinmethylesters und anschließend t-BOC- Alanin gebildet wurde, gefolgt von Entfernung der t-BOC-Gruppe, wodurch eine Aminogruppe bereitgestellt wird, die zu Beginn der Synthesen zu verwenden ist.
Ein Gemisch der blockierten (N-geschützten) Aminosäuren, welches verschiedene Mengen an jeder der blockierten (N-geschützten) zwanzig zu verwendenden Aminosäuren enthält, wurde in Dimethylformamid gelöst und anschließend an die Stäbe gekuppelt. Die erste Kupplung wurde dreimal unter Anwendung herkömmlicher Festphasen-Syntheseverfahren wiederholt. Als nächstes wurden zwanzig Aminosäurereste einzeln an zwanzig verschiedene Stäbe angefügt, sodass zwanzig Stabgebundene 5-mer-Peptidsequenzen hergestellt wurden. Jede Sequenz besaß einen einzelnen bekannten Aminosäurerest am Amino-terminalen Ende und ein angeblich äquimolares Gemisch von Aminosäureresten an jeder der vier anderen Positionen der Kette. Jedes dieser zwanzig Stab-gebundenen Peptide wurde dann einzeln mit jedem der zwanzig Aminosäurereste umgesetzt, unter Bildung von 400 (20 · 20) Stab-gebundenen 6-mer-Peptiden, in denen die zwei Amino-terminalen Positionen definiert sind und die vier verbleibenden Positionen als Gemische vorliegen. Anschließend wurden zwei weitere Positionen des angeblich äquimolaren Gemisches von Aminosäuren hinzugefügt und das endständige Amin wurde acetyliert, sodass an die Stäbe gebundene N-Acetyl-8-mers entstanden, deren erste beiden Aminosäurepositionen undefiniert waren (Gemische), gefolgt von zwei definierten Positionen, gefolgt von vier undefinierten Positionen (Gemische), gefolgt von dem Spacer und dann den tragenden Stäben.
Die 400 Stab-gebundenen 8-mer N-Acetyl-Peptidgemischpräparationen wurden dann in einem ELISA-Assay mittels eines monoklonalen Antikörpers hinsichtlich des erwünschten antigenen Proteins abgesucht. Die 8-mers mit der bevorzugten Bindung an den Antikörper wurden identifiziert. Es wurden zwei Sätze weiterer 8-mers hergestellt, welche die identifizierten, am besten bindende 2-mer-Sequenzen innerhalb dieser 8-mers enthielten.
Ein erster Satz enthielt die gemischten Aminosäuren an den drei C-terminalen Positionen, gefolgt in N-terminaler Richtung von einer durch zwanzig gesonderte Kupplungen hergestellten Position, die jede der zwanzig, Aminosäuren enthält, den identifizierten 2-mer-Sequenzen, zwei weiteren Gemischen an den nächsten beiden Positionen und einer N-terminalen Acetylgruppe. Die zweite Gruppe enthielt Aminosäuregemische an den vier C-terminalen Positionen, die identifizierten 2-mer- Sequenzen, eine Position, die durch gesonderte Kupplungen jeder der zwanzig Aminosäuren hergestellt wurde, Aminosäuregemische als endständige Reste und eine N-terminale Acetylgruppe.
Jede dieser Stab-gebundenen N-Acetyl-8-mers wurde erneut in einem ELISA mit dem monoklonalen Antikörper abgesucht. Die bevorzugten Bindungssequenzen für jede Gruppe wurden identifiziert und es wurden so bevorzugt bindende 4-mer- Sequenzen identifiziert.
Das vorstehend genannte Verfahren der gesonderten Anfügung jeder der Aminosäuren an jede Seite der identifizierten bevorzugt bindenden Sequenzen wurde wiederholt bis eine optimale Bindungssequenz identifiziert wurde.
Obwohl das vorstehend genannte Verfahren elegant ist, bringt es für die Peptide mehrere Nachteile mit sich. Erstens werden infolge der geringen Größe der verwendeten Stäbe verhältnismäßig geringe Mengen von jedem Peptid hergestellt. Zweitens wird jedes Assay unter Verwendung der Stab-gebundenen Peptide durchgeführt, anstatt unter Verwendung der freien Peptide in Lösung. Drittens gibt es sogar dann, wenn spezifische Mengen jeder blockierten Aminosäure zur Herstellung der Aminosäurerestgemische an den erwünschten Positionen verwendet werden, keine Möglichkeit nachzuweisen, dass an diesen Positionen tatsächlich eine äquimolare Menge von jedem Rest vorhanden ist.
US-Patent 5 194 392 enthält tatsächlich eine Tabelle der zur Bereitstellung einer vermutlichen Äquimolarität zu verwendenden spezifischen Mengen jeder N- geschützten Aminosäure. Die vorausgehende Geschichte dieses Patents liefert eine revidierte Tabelle mit verschiedenen Mengen der zu verwendenden N-geschützten Aminosäuren.
Rutter et al., US-Patent 5 010 175, offenbaren die Herstellung von Peptidgemischen, von den behauptet wird, dass sie äquimolare Mengen jeder umgesetzten Aminosäure an den vorbestimmten Positionen der Peptidkette enthalten. Von diesen Gemischen wird auch behauptet, dass sie jedes Peptid in wieder auffindbaren und analysierbaren Mengen enthalten und sie werden aus Reaktionsgemischen von aktivierten Aminosäuren in Konzentrationen zusammengesetzt, die auf den relativen Kupplungskonstanten dieser aktivierten Aminosäuren basieren.
Das zur Synthese der Peptide verwendete Gemisch von Aminosäuren mit äquimolaren Mengen an jedem Rest wird durch Einstellen der Konzentration jeder Aminosäure in der Reaktionslösung, basierend auf ihrer relativen Kupplungskonstante, hergestellt. Diese relativen Kupplungskonstanten wurden durch die vollständige Umsetzung der zwanzig natürlich vorkommenden Harz-gebundenen Aminosäuren mit jeder der gleichen zwanzig Aminosäuren bestimmt. Die entstehenden verschiedenen 400 Dipeptide wurden von ihren Harz abgetrennt und die Menge jeder gekuppelten Aminosäure wurde bestimmt.
Nach der Bestimmung jener 400 Mengen wurden die 400 entsprechenden relativen Geschwindigkeitskonstanten bestimmt. Um eine Äquimolarität der Kupplung zu erreichen wurden anschließend die Konzentrationen der Reaktanten eingestellt, unter Verwendung eines Algorithmus, der nicht einfach zu berechnen sein soll, sodass die Beeinflussungen des vorher gebundenen Rests (Akzeptor) auf die neu eintretende Aminosäure berücksichtigt werden können.
Um die erwünschten Ergebnisse zu erreichen, werden in der Praxis Akzeptoren mit ähnlichen Reaktivitäten mit geeigneten Gemischen aus Aminosäuren umgesetzt. Die Konzentrationen der reagierenden Aminosäure werden anschließend, basierend auf den erhaltenen Kondensationsergebnissen eingestellt. Akzeptoren mit unterschiedlichen Kupplungsgeschwindigkeiten sollten in gesonderten Reaktionsgemischen verwendet werden.
US-Patent 5 010 175 beschreibt die Herstellung mehrerer Pentapeptide, die einen einzelnen Rest an einer oder mehreren Position(en) und Gemische aus vier Resten an anderen Positionen besitzen. Es wurde beschrieben, dass die Gemischpositionen ihre Restgemische in einer Äquimolarität von Plus-oder-Minus (±) etwa 20 bis etwa 24 Prozent enthalten.
Es wurde auch eine Studie beschrieben, die ein Gemisch der N-geschützten natürlich vorkommenden Aminosäuren verwendet. Die Mengen an den verwendeten N- geschützten Aminosäuren basierten auf der Bestimmung ihrer relativen Geschwindigkeiten und sie wurden auf die Kinetik der annähernd ersten Ordnung eingestellt, indem jede Aminosäure im mindestens 10-fachen Überschuss über ihrem Endprodukt vorhanden ist. Die relativen Geschwindigkeiten wurden durch die Mittelung der Werte aus 400 gesonderten Reaktionen bestimmt und zusätzliche Daten werden nicht geliefert. In diesem Patent wird auch eine Tabelle mit den Mengen jeder der zwanzig N-geschützten natürlich vorkommenden Aminosäuren bereitgestellt, die, wenn sie als ein Gemisch verwendet werden, Äquimolarität liefern sollen.
Zudem beschreiben Furka et al., (1988, 14th International Congress of Biochemistry, Band 5, Abstract FR : 013) und (1988, Xth International Symposium on Medicinal Chemistry, Budapest, Abstract 288, S. 168) die Synthese von neun Tetrapeptiden, von denen jedes einen einzigen Rest an jedem der Amino- und Carboxy-terminalen Enden und Gemische von drei Resten in jeder dazwischen liegenden Position enthält. Diese Gemischpositionen wurden durch die Umsetzung von physikalisch gemischten Harzen mit einzelnen Aminosäuren erhalten. In dem Abstract wird des weiteren behauptet, dass die Experimente dieser Autoren darauf hinweisen, dass ein Gemisch, welches bis zu 180 Pentapeptide enthält, leicht in einem einzigen Versuch synthetisiert werden kann. Es wurden keine biologischen Assays beschrieben. Kürzlich beschrieben Furka et al., Int. J. Peptide Protein Res., 37: 487-493 (1991) die Synthese von Gemischen von 27 Tetrapeptiden und 180 Pentapeptiden, die durch physikalisches Mischen der umgesetzten Harz-gebundenen Peptide hergestellt wurden. Diese Peptide wurden mit einer oder mit Gemischen von drei oder vier Resten an jeder Position entlang der Kette synthetisiert. Es wurden keine biologischen Ergebnisse beschrieben, die diese verhältnismäßig einfachen Gemische verwenden.
Kürzlich beschrieben Huebner et al., US-Patent 5 182 366, das im Wesentlichen gleiche Verfahren. Huebner et al. lieferten Daten für ein Gemisch aus Tetrameren mit einem Glycin an 2-Position, bezüglich des Amino-(N)-terminalen Endes und jeder der fünf verschiedenen Aminosäurereste an den Positionen 1, 3 und 4, bezüglich des N-terminalen Endes, zeigte an, dass jeder der Reste in den Positionen 1, 3 und 4 im Wesentlichen in äquimolaren Mengen und das Glycin in seiner vorhergesehenen Menge vorhanden war. Ähnliche Daten wurden auch für fünfundzwanzig Gruppen von Pentameren geliefert, von denen jede zwei bekannte Reste an den N- terminalen Enden und Gemische von fünf Resten in den jeweils verbliebenen Positionen besaß. Bezüglich der biologischen Wirksamkeit oder der tatsächlichen Gewinnung eines aus den hergestellten Gemischen beliebig ausgewählten Peptids wurden keine Daten dargestellt.
Ein ähnlicher Ansatz wurde auch von Lam et al., Letters to Nature, 354: 82-84 (1991) beschrieben. Diese Autoren beschreiben die Herstellung von Millionen von Kügelchen-gebundenen Peptiden, wobei jedes Kügelchen ein einzelnes Peptid enthalten soll. Die Peptid-gebundenen Kügelchen wurden mit einem Fluoreszenz- oder Enzym-markierten Akzeptor umgesetzt. Die durch den Akzeptor gebundenen Kügelchen waren durch die Markierung nachweisbar und sie wurden physikalisch entfernt. Die Sequenz des gebundenen Peptids wurde analysiert.
Neuere Berichte (Devlin et al. Science, 249: 404-405 [1990] und Scott et al., Science, 249: 386-390 [1990]) haben die Anwendung rekombinanter DNA und der bakteriellen Expression zur Schaffung hoch komplexer Peptidgemische beschrieben. Kürzlich beschrieben Fodor et al., Science, 251: 767-773 (1991) die Festphasen- Synthese von Tausenden von Peptiden oder Nukleotiden auf Objektträgern aus Glas, die zur Bereitstellung Amin-funktioneller Gruppen mit Aminopropyltriethoxysilan behandelt wurden. Die vorbestimmten Aminosäuren wurden anschließend unter Verwendung einer Photomaskierung an vordefinierte Gebiete der Objektträger gekuppelt. Als Amino-terminale Schutzgruppe wurde die photolabile Schutzgruppe NVOC (Nitroveratryloxycarbonyl) verwendet.
Fodor et al. beschrieben die Herstellung eines Arrays von 1024 verschiedenen, an die Objektträger gekuppelten Peptiden durch die Anwendung von Bestrahlung, einer Schutzgruppe und der Maskierung in zehn Schritten. Die Immunreaktion mit einem fluoreszenzmarkierten monoklonalen Antikörper wurde mittels eines Epifluoreszenzmikroskops nachgewiesen.
Dieses elegante Verfahren ist auch begrenzt, da nur eine geringe Menge an Peptid oder Oligonukleotid produziert wird, durch das auf dem Objektträger fixierte synthetisierte Peptid oder Nukleotid und auch infolge der Auflösung der Photomaskierung. Dieses Verfahren ist auch in dem Fall weniger geeignet, in dem das durch den Antikörper gebundene Epitop unbekannt ist, da nicht alle der möglichen Sequenzen hergestellt werden.
Die vorrangige Einschränkung der vorstehend genannten neuen Ansätze zum Umgehen des individuellen Screenings von Millionen einzelner Peptide mittels einer kombinatorischen Bibliothek ist sowohl die Unfähigkeit der in diesen Systemen erzeugten Peptide, in einer "normalen" Weise mit den Orten das Akzeptors, analog zu den natürlichen ablaufenden Wechselwirkungen, in Wechselwirkung zu treten (d. h. frei in einer Lösung bei einer Konzentration, die relevant für die Rezeptoren, Antikörper-Bindungsstellen, Enzymbindungstaschen oder ähnliches ist, die ohne den Ausschluss eines großen prozentualen Anteils der möglichen kombinatorischen Bibliothek untersucht werden), als auch die Schwierigkeiten bei der Lokalisierung eines oder mehrerer wirksamer Peptide. Zweitens gestatten die Expressionsvektorsysteme nicht einfach den Einbau der D-Formen der natürlichen Aminosäuren oder der breiten Vielfalt nicht-natürlicher Aminosäuren, die für die Studie oder die Entwicklung derartiger Wechselwirkungen von Interesse sein könnten.
Houghten et al., Letters to Nature, 354: 84-86 (1991) beschrieben die Anwendung physikalischer Gemische in einem anderen Ansatz, der sich etwas von denen von Furka et al., Huebner et al. und Lam et al. unterscheidet, da Lösungen freier anstatt Träger-gekuppelter Peptid-Bibliotheken oder -Sätze verwendet werden, wodurch mehrere der vorstehend genannten Probleme überwunden werden. Hier wurden erstmalig 324 beispielhafte Hexamergemische hergestellt, welche mehr als 34 Millionen Peptide enthielten, deren beide N-terminale Positionen vorbestimmte Reste waren, wohingegen die C-terminalen Positionen der Sätze äquimolare Mengen von achtzehn der zwanzig natürlichen (Gen-kodierten) L-Aminosäurereste waren. Unter Verwendung dieser 324 Gemische wurden Bindungsstudien durchgeführt, um zu bestimmen, welche wenigen davon eine optimale Bindung an einen ausgewählten Rezeptor, wie an einen monoklonalen Antikörper oder an lebende Bakterienzellen, gewährleisten. Diese Studie bestimmte die zwei N-terminalen, optimal bindenden Reste.
Anschließend wurden achtzehn andere Sätze hergestellt, in denen die ersten beiden optimal bindenden Reste erhalten blieben, die dritte Position innerhalb der achtzehn verwendeten L-Aminosäuren variierte und die drei C-terminalen Positionen als äquimolare Gemische erhalten blieben. Es wurden erneut Bindungsstudien durchgeführt und ein optimaler Rest für die dritte Position wurde bestimmt. Dieses allgemeine Verfahren wurde zur Bestimmung der gesamten Hexamersequenz angewendet.
Ähnliche Studien wurden auch von Pinilla et al., Vaccines 92, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Habor, Seiten 25-27 (1992); Appel et al., Immunomethods, 1: 17-23 (1992); Houghten et al., BioTechniques, 13: 412-421 (1992); Houghten et al., in Innovation and Perspectives in Solid Phase Syntheses: Peptides, Polypeptides and Oligonucleotides, R. Epton (Hrsg.), Intercept, Ltd., Andover, Seiten 237-239 (1992); Houghten et al., in Peptides, J. A. Smith und J. E. Rivier (Hrsg.), Proceedings of the Twelfth American Peptide Symposium, ESCOM, Leiden, Seite 560- 561 (1992); und WO 92/09300, veröffentlicht 11. Juni 1992, beschrieben.
Ein noch anderes Verfahren wurde in Pinilla et al., BioTechniques, 13: 901-905 (1992) beschrieben. In diesem Bericht wurden insgesamt 108 freie Hexamerpeptidgemisch-Sätze hergestellt. Diese Sätze enthielten einen der achtzehn Aminosäurereste an jeder der sechs Positionen der Hexamerketten, wobei die anderen fünf Positionen durch äquimolare Mengen dieser gleichen achtzehn Reste besetzt sind. Durch diese 108 Sätze (6 Positionen · 18 Reste/Position) wurden wiederum über 34 Millionen verschiedene Peptide wiedergegeben.
Jeder der Sätze wurde bezüglich der Bindung an einen monoklonalen Antikörper als Rezeptor geprüft. Der Rest an jeder Position, der die besten Bindungsergebnisse für diese Position liefert, stellte eine Peptidsequenz bereit, die mit dem für diesen monoklonalen Antikörper bekannten Epitop identisch ist. Dieses Verfahren liefert auch Sequenzen für andere Peptide, die gleichfalls gut durch den monoklonalen Antikörper gebunden wurden.
Trotz der vorstehend genannten Untersuchungen mit den Oligopeptiden und den Schlussfolgerungen daraus ist die Halbwertszeit eines Oligopeptids bei in vivo- Systemen, in die das Peptid durch Injektion oder Inhalation eingeführt wird, infolge der Hydrolyse oder durch andere, von der Peptidbindung abhängigen Abbaumechanismen sehr kurz. Die Hydrolyse durch sowohl Enzyme als auch Magensäuren kann die perorale Verabreichung anderweitig wirksamer Oligopeptide gleichfalls einschränken.
Die Verfügbarkeit einer breiten Vielfalt klar identifizierter, hydrolytisch stabiler Peptide oder Peptid-ähnlicher Moleküle in verhältnismäßig begrenzten Gemischen würde die Suche nach optimalen Molekülen für jede beliebige besondere therapeutische Endanwendung sehr erleichtern.
Es ist daher von beträchtlichem Interesse, ein Verfahren zur Synthese von Gemischen Peptid-ähnlicher Moleküle zu besitzen, welche gegenüber der enzymatischen Hydrolyse stabil sind und in denen einzelne Aminosäurerestpositionen besonders definiert sein können, sodass dem Forscher ein vergleichendes Array von Molekülen zur Identifizierung eines oder mehrerer der optimalen Moleküle für die Reaktion mit den interessierenden Rezeptoren (Akzeptoren) zur Verfügung steht, aus dem man die optimalen therapeutischen Materialien zur Behandlung verschiedener Störungen des Organismus ableiten kann. Die nachfolgende Offenbarung diskutiert eine derartige Gruppe Peptid-ähnlicher Moleküle, die gegenüber der enzymatischen Hydrolyse stabiler sind als die Peptide selbst.

Kurzdarstellung der Erfindung

Hinsichtlich eines Aspekts betrifft die vorliegende Erfindung einen Satz linearer peralkylierter Oligopeptide, umfassend ein Gemisch äquimolarer Mengen linearer C&sub1;-C&sub7;- Alkyl-peralkylierter Oligopeptidkettenmitglieder, welche die gleiche Anzahl von etwa zwei bis etwa zehn peralkylierten Aminosäureresten in jeder Oligopeptidkette enthalten. Das Peptidylamidstickstoffatom von jedem der peralkylierten Aminosäurereste, ausgenommen Prolin, ist mit einer C&sub1;-C&sub7;-Alkylgruppe alkyliert. Die Aminosäureseitenketten und die, falls vorhanden, N-terminale Aminogruppe können bzw. kann auch alkyliert sein, sodass jedes alkylierte Peptid in dem Gemisch als ein peralkyliertes Oligopeptid angesehen werden kann. Die Entfernung der Alkylestergruppen von den alkylierten Carbonsäureseitenketten unter Bildung von Carboxylgruppen kommt gleichfalls in Betracht. Die Mitglieder des Satzes besitzen einen oder mehrere vorbestimmte, bekannte peralkylierte Aminosäurereste an der gleichen einen oder den gleichen mehreren vorbestimmten Position(en) der Oligopeptidkette und die Bibliothek besitzt äquimolare Mengen von wenigstens sechs verschiedenen peralkylierten Aminosäureresten an einer oder mehreren der gleichen anderen Position(en) der peralkylierten Oligopeptidkette. Das Amino-terminale Ende jedes Oligopeptids ist eine quaternäre C&sub1;-C&sub7;-Alkylammoniumgruppe, eine Aminogruppe, eine N-C&sub1;-C&sub7;-Alkylaminogruppe oder eine N-C&sub1;-C&sub7;-Alkyl-N-C&sub1;-C&sub1;&sub8;-kohlenwasserstoffoyl- oder eine Pyroglutamoylgruppe. Das Carboxy-terminale Ende ist ein C&sub1;-C&sub7;- Alkylcarbonsäureester, Mono- oder Di-N-C&sub1;-C&sub7;-alkylcarboxamid oder eine Carboxylgruppe. Eine C&sub1;-C&sub7;-Alkylgruppe am N- oder C-terminalen Ende ist eine C&sub1;-C&sub7;- Alkylgruppe, die die gleiche wie die in jedem Molekül vorhandene C&sub1;-C&sub7;-Alkylgruppe sein kann oder sie kann von diesen verschieden sein.
Der eine oder die mehreren peralkylierten Aminosäurerest(e) an der gleichen einen oder den gleichen mehreren vorbestimmten Position(en) der peralkylierten Oligopeptidkette befinden sich bevorzugt an einer vorbestimmten Position, die zu einem Ende benachbart ist und das eine Ende ist besonders bevorzugt das Amino-terminale Ende. Die ersten beiden peralkylierten Aminosäurereste an der gleichen einen oder den gleichen mehreren vorbestimmten Position(en) befinden sich in einer anderen bevorzugten Ausführungsform benachbart zu dem Amino-terminalen Ende. Die äquimolaren Mengen der peralkylierten Aminosäurereste befinden sich in einer anderen bevorzugten Ausführungsform an einer oder mehreren Position(en), die zu dem einem Ende benachbart ist und das eine Ende ist bevorzugter das Carboxyterminale Ende.
Ein Satz peralkylierter Oligopeptidketten enthält vorzugsweise fünf bis etwa acht peralkylierte Aminosäurereste in jeder Kette. Eine Vielzahl von Sätzen von Sätzen (eine Bibliothek) von peralkylierten Oligopeptiden sind ebenfalls denkbar. Eine derartige Bibliothek enthält Sätze, in denen nur eine Position durch einen vorbestimmten peralkylierten Aminosäurerest besetzt ist, wohingegen die anderen Positionen jedes Satzes durch äquimolare Gemische von Aminosäureresten besetzt sind. Die Anzahl derartiger Sätze einer Bibliothek ist gleich der Anzahl der Positionen in der Oligopeptidkette (die Länge des peralkylierten Peptids) multipliziert mit der Anzahl der peralkylierten Aminosäurereste an jeder Position der Kette. Diese Bibliotheken werden manchmal als positionale Bibliotheken bezeichnet.
Hinsichtlich eines anderen Aspekts betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Bestimmung der Sequenz eines peralkylierten Oligopeptids, das bevorzugt an einen Akzeptor bindet. Ein derartiges Verfahren umfasst die Schritte:
(a) Bereitstellung einer Bibliothek von Sätzen linearer C&sub1;-C&sub7;-Alkyl-peralkylierter Oligopeptide, in denen jeder Satz ein Gemisch von äquimolaren Mengen der peralkylierten Oligopeptidkettenmitglieder umfasst, das die gleiche Anzahl von zwei bis etwa zehn peralkylierten Aminosäurereste in jeder peralkylierten Oligopeptidkette enthält. Die Kettenmitglieder jedes Satzes weisen einen oder mehrere von mindestens sechs verschiedenen vorbestimmten peralkylierten Aminosäureresten an einer oder mehreren vorbestimmten Position(en) der peralkylierten Oligopeptidkette auf und jeder Satz weist eine äquimolare Menge von mindestens sechs verschiedenen peralkylierten Aminosäureresten an der gleichen einen oder den gleichen mehreren anderen Position(en) der peralkylierten Oligopeptidkette auf. Das Amino-terminale Ende jedes der peralkylierten Oligopeptide in dem Satz ist eine quaternäre Alkylammonium-, Amino-, N-Alkylamino-, C&sub1;-C&sub1;&sub8;-Kohlenwasserstoffoylalkylamid- oder Pyroglutamoylgruppe und das Carboxy-terminale Ende ist eine Alkylamid-, Akylcarboxylat- oder Carboxylgruppe. Eine C&sub1;-C&sub7;-Alkylgruppe am N- oder C-terminalen Ende ist eine C&sub1;-C&sub7;-Alkylgruppe, die die gleiche wie die in jedem Molekül vorhandenen C&sub1;-C&sub7;- Alkylgruppen sein kann oder von diesen verschieden sein kann. Die Sätze der Bibliothek unterscheiden sich darin, dass der eine oder die mehreren vorbestimmte(n) peralkylierte(n) Aminosäurerest(e), der bzw. die an der einen oder den mehreren vorbestimmten Ketten-Position(en) innerhalb jedes Satzes vorhanden ist bzw. sind, sich zwischen den Sätzen unterscheiden.
(b) Jeder Satz dieser Bibliothek von Sätzen wird mit dem Akzeptor gesondert in einem wässrigen Medium mit einer festgelegten Konzentration von etwa 0,1 Milligramm pro Liter bis etwa 100 Gramm pro Liter angemischt. Die Bindung jedes Satzes an den Akzeptor wird gesondert untersucht. Es wird ein Satz bestimmt, der eine im Vergleich zu den anderen Sätzen bevorzugte spezifische Bindung aufweist, wodurch ein peralkylierter Aminosäurerest identifiziert wird, der eine bevorzugte Bindung an die eine oder die mehreren vorbestimmten Positionen liefert.
(c) Eine zweite Bibliothek von Sätzen linearer peralkylierter Oligopeptide wird bereitgestellt, in der jeder Satz ein Gemisch von äquimolaren Mengen von C&sub1;-C&sub7;-Alkylperalkylierten Oligopeptidkettenmitgliedern umfasst, das die gleiche Anzahl von zwei bis etwa zehn peralkylierten Aminosäureresten in jeder Kette, wie die Ketten der erst genannten Vielzahl von Sätzen enthält. Die Kettenmitglieder von jeder zweiten Bibliothek von Sätzen enthalten den einen oder die mehreren peralkylierten Aminosäurerest(e) des erst genannten Satzes, der bzw. die als eine bevorzugte, spezifische Bindung in derselben einen oder denselben mehreren vorbestimmten Kettenposition(en) wie die erst genannten Sätze aufweisend identifiziert wurde(n). Die Kettenmitglieder der zweiten Sätze weisen einen vorbestimmten der mindestens sechs verschiedenen peralkylierten Aminosäurereste an einer anderen vorbestimmten Position der peralkylierten Oligopeptidkette auf, die sich von der einen oder den mehreren Position(en) der bzw. des identifizierten peralkylierten Aminosäurereste(s) der erst genannten Vielzahl von Sätzen unterscheidet. Jede der zweiten Bibliothek von Sätzen (a) weist äquimolare Mengen der mindestens sechs verschiedenen peralkylierten Aminosäurereste der erst genannten Sätze an der gleichen einen oder den gleichen mehreren Position(en) der peralkylierten Oligopeptidkette auf, die nicht durch den einen oder die mehreren identifizierten peralkylierten Aminosäurerest(e) oder die vorbestimmten peralkylierten Aminosäurereste besetzt sind, (b) weist eine durch äquimolare Mengen der mindestens sechs verschiedenen peralkylierten Aminosäurereste besetzte peralkylierte Aminosäurerestposition weniger auf und (c) weist die gleichen ersten und zweiten Enden wie die peralkylierten Oligopeptide des erst genannten Satzes auf.
(d) Jeder Satz der zweiten Bibliothek von Sätzen wird gesondert mit dem Akzeptor in einem wässrigen Medium mit einer festgelegten Konzentration von etwa 0,1 Milligramm pro Liter zu etwa 100 Gramm pro Liter angemischt. Die Bindung jedes Satzes an den Akzeptor wird gesondert untersucht. Es wird ein zweiter Satz bestimmt, der eine bevorzugte spezifische Bindung aufweist, wodurch ein peralkylierter Aminosäurerest identifiziert wird, der eine bevorzugte Bindung an die andere vorbestimmte Position in der Oligopeptidkette liefert.
(e) Die Schritte (c) und (d) werden unter Verwendung von null bis sieben weiteren Bibliotheken von Sätzen von peralkylierten Oligopeptiden anstelle der zweiten Bibliothek von Sätzen wiederholt. Jede weitere Bibliothek von Sätzen von peralkylierten Oligopeptiden umfasst ein Gemisch von äquimolaren Mengen der linearen peralkylierten Oligopeptidkettenmitglieder, die die gleiche Anzahl von zwei bis etwa zehn peralkylierten Aminosäureresten in jeder peralkylierten Oligopeptidkette wie die Ketten der erst genannten Bibliothek von Sätzen enthält. Die Kettenmitglieder jeder weiteren Bibliothek von Sätzen enthalten die peralkylierten Aminosäurereste in den Oligopeptidkettenpositionen, die eine bevorzugte spezifische Bindung in einer unmittelbar vorher verwendeten Bibliothek von Sätzen aufweisen und eine vorbestimmte der mindestens sechs verschiedenen peralkylierten Aminosäurereste an einer anderen vorbestimmten Position der alkylierten Kette, die sich von den Positionen der identifizierten peralkylierten Aminosäurereste der unmittelbar vorher verwendeten Bibliothek von Sätzen unterscheidet. Jede der weiteren Bibliotheken von Sätzen weist äquimolare Mengen der mindestens sechs verschiedenen peralkylierten Aminosäurereste der erst genannten Sätze an der gleichen einen oder den gleichen mehreren Position(en) der peralkylierten Oligopeptidkette auf, die nicht durch die identifizierten peralkylierten Aminosäurereste oder die vorbestimmten peralkylierten Aminosäurereste besetzt sind und sie weist die ersten und zweiten Enden wie das peralkylierte Oligopeptid des erst genannten Bibliothek-Satzes auf.
(f) Mindestens sechs verschiedene peralkylierte Oligopeptidketten werden bereitgestellt, in denen jede Kette die gleiche Anzahl von zwei bis etwa zehn peralkylierten Aminosäureresten in jeder peralkylierten Oligopeptidkette wie die Ketten der erst genannten Bibliothek von Sätzen enthält. Jede peralkylierte Oligopeptidkette enthält die identifizierten peralkylierten Aminosäurereste in den peralkylierten Oligopeptidkettenpositionen, die in Schritt (e) eine bevorzugte spezifische Bindung aufwiesen, eine vorbestimmte der mindestens sechs verschiedenen peralkylierten Aminosäurereste an einer anderen vorbestimmten Position in der peralkylierten Kette, die sich von den Positionen des in Sehritte (e) verwendeten Aminoseitenketten-reduzierten identifizierten Substituenten unterscheidet und sie weist die gleichen N- und C- terminalen Enden wie die Sätze der erst genannten Bibliothek von Sätzen auf.
(g) Jedes der mindestens sechs peralkylierten Oligopeptide von (f) wird mit dem Akzeptor gesondert in einem wässrigen Medium mit einer Konzentration an substituiertem peralkyliertem Oligopeptid von etwa 0,1 Milligramm bis etwa 100 Gramm pro Liter angemischt. Die Bindung jedes peralkylierten Oligopeptids wird gesondert untersucht. Das peralkylierte Oligopeptid, das eine bevorzugte spezifische Bindung aufweist wird bestimmt, wodurch die Sequenz eines linearen peralkylierten Oligopeptids bestimmt wird, das bevorzugt an den Akzeptor bindet.
Die vorstehend diskutierten Vorzüge bezüglich der Sätze trafen dort zu, wo die Sätze in dem vorstehend genannten Assay verwendet wurden. Es ist zudem bevorzugt, dass die identifizierten und vorbestimmten peralkylierten Aminosäurerestsubstituenten sich benachbart zueinander befinden. Besonders bevorzugt schließen der eine oder die mehreren vorbestimmten der mindestens sechs verschiedenen peralkylierten Aminosäurereste an der einen oder den mehreren vorbestimmten Position(en) von (a) eine endständige Position des Rests der peralkylierten Oligopeptidkette ein.
Es ist auch bevorzugt, dass die erst genannten peralkylierten Oligopeptidketten etwa 5 bis etwa 8 peralkylierte Reste enthalten. Es ist des weiteren bevorzugt, dass anstelle von mindestens sechs mindestens zehn verschiedene peralkylierte Säurereste verwendet werden.
In einem bevorzugten Verfahren ist der Akzeptor ein Zellrezeptor. Der Zellrezeptor ist besonders bevorzugt in einem in Wachstumsmedium gezüchteten Bakterium oder in einer Hefezelle vorhanden.
Eine andere Ausführungsform ist weiterhin ein anderes Verfahren zur Bestimmung der Sequenz eines peralkylierten Oligopeptids, das bevorzugt an den Akzeptor bindet. Dieses Verfahren umfasst die Schritte:
(a) der Bereitstellung gesonderter Bibliotheken oder einer gesonderten Vielzahl von Sätzen linearer peralkylierter Oligopeptide. Jeder Satz dieser Bibliotheken umfasst ein Gemisch von äquimolaren Mengen von C&sub1;-C&sub7;-Alkyl-peralkylierten Oligopeptidketten, die die gleiche Anzahl von zwei bis etwa zehn peralkylierten Aminosäureresten in jeder Kette enthalten. Jede peralkylierte Oligopeptidkette weist einen einzelnen der mindestens sechs verschiedenen vorbestimmten peralkylierten Aminosäurereste an einer einzelnen vorbestimmten Position der peralkylierten Oligopeptidkette auf und jeder Satz weist äquimolare Mengen von jeder der mindestens sechs verschiedenen peralkylierten Aminosäurereste an den anderen Positionen der peralkylierten Oligopeptidkette auf. Jeder Satz unterscheidet sich von den anderen Sätzen in der Identität und der Kettenposition des einzelnen vorbestimmten peralkylierten Aminosäurerests, der innerhalb des Satzes an der vorbestimmten Position vorhanden ist. Das Amino-terminaie Ende jedes der peralkylierten Oligopeptide in dem Satz ist eine quaternäre Alkylammoniumgruppe, eine Aminogruppe, eine N- Alkylaminogruppe, eine N-Alkyl-N-C&sub1;-C&sub1;&sub8;-kohlenwasserstoffoylgruppe oder eine Pyroglutamoylgruppe und das Carboxy-terminale Ende ist eine Mono- oder Dialkylcarboxamid-, Alkylcarboxylat- oder Carboxylgruppe. Eine C&sub1;-C&sub7;-Alkylgruppe am N- oder C-terminalen Ende kann die gleiche C&sub1;-C&sub7;-Alkylgruppe wie die in jedem Molekül vorhandenen C&sub1;-C&sub7;-Alkyl-Gruppen sein oder sie kann von diesen verschieden sein.
(b) Jeder Satz wird mit dem Akzeptor gesondert in einem wässrigen Medium bei einer festgelegten Konzentration mit etwa 0,1 Milligramm pro Liter zu etwa 100 Gramm pro Liter angemischt und die Bindung jedes Satzes an den Akzeptor wird gesondert untersucht. Der peralkylierte Aminosäurerest, der eine bevorzugte spezifische Bindung an jeder Position der peralkylierten Oligopeptidkette aufweist, liefert die Sequenz eines peralkylierten Oligopeptids, das bevorzugt an den Akzeptor oder an einen oder mehrere peralkylierte Reste, die für diese Bindung wichtig sind, bindet.
Die vorstehend diskutierten Vorzüge für die Sätze treffen auch hier zu. Zudem ist es auch bevorzugt, dass die einzelnen vorbestimmten Positionen der Bibliothek der Sätze, als eine Gruppe betrachtet, in der peralkylierten Oligopeptidkette zueinander benachbart sind. Jede peralkylierte Kette enthält ebenfalls vorzugsweise etwa 5 bis etwa 8 peralkylierte Aminosäurereste.
Es ist auch bevorzugt, dass der einzelne vorbestimmte peralkylierte Aminosäurerest jeder peralkylierten Aminosäurekette mindestens einer von zehn verschiedenen peralkylierten Aminosäureresten ist und die gleichen der mindestens zehn verschiedenen peralkylierten Aminosäurereste in äquimolaren Mengen an den anderen peralkylierten Oligopeptidpositionen jedes Satzes vorhanden sind.
Denkbar ist auch ein Satz linearer C&sub1;-C&sub7;-Alkyl peralkylierter Oligopeptide, der wie vorstehend beschrieben an einen festen Träger, wie ein Festphasen-Syntheseharz, gebunden ist. Die peralkylierten Oligopeptide werden einzeln durch eine selektive spaltbare Bindung, wie eine Amid- oder Esterbindung, an den festen Träger gebunden.
Spezifische permethylierte Oligopeptide kommen ebenfalls in Betracht. Eine Gruppe der permethylierten Oligopeptide besitzt die Formel
Xaa&sub1;PheXaa&sub3;PheXaa&sub5;Xaa&sub6; (SEQ ID-Nr.: 35),
worin Xaa&sub1; an der ersten Position ein α-Trimethylammonium-Leu- oder Phe-Rest ist;
Xaa&sub3; an der dritten Position His oder Phe ist;
Xaa&sub5; an der fünften Position Ile oder Phe ist; und
Xaa&sub6; an der sechsten Position ein C-terminales N-Methylcarboxamido-His oder -Phe ist, mit der Maßgabe, dass mindestens eines von Xaa&sub5; oder Xaa&sub6; Phe ist.
Ein anderes, denkbares permethyliertes Oligopeptid ist ein permethyliertes α-N- terminales Trimethylammonium-C-terminales N-Methylamidoligophenylalanin mit 5 bis 8 Phe-Resten.
Die vorliegende Erfindung hat verschiedene Vorzüge und Vorteile.
Ein herausragender Vorzug ist die Möglichkeit, eine neue Klasse antimikrobieller Mittel zu finden, die jeder früher untersuchten Klasse unähnlich ist und gegen die Mikroben keine Widerstandskraft besitzen.
Ein anderer Vorzug ist, dass die durch Peralkylierung eines an einen festen Träger gebundenen Peptids hergestellten permethylierten Oligopeptide während des Permethylierungsschritts im Wesentlichen keiner Racemisierung unterliegen.
Ein Vorteil der vorliegenden Erfindung ist, dass die peralkylierten Oligopeptide gegenüber der Spaltung durch proteolytische Enzym, wie Trypsin oder Chymotrypsin, resistent sind.
Ein anderer Vorteil der vorliegenden Erfindung ist, dass peralkylierte Oligopeptide, die gegenüber bestimmten Gram-positiven Bakterien ziemlich toxisch sind, im Wesentlichen keine Hämolyse von Humanblut bei antimikrobiellen Konzentrationen bewirken.
Noch weitere Vorzüge und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden dem Fachmann aus der nachfolgenden Diskussion ersichtlich.

Beschreibung der Erfindung im Einzelnen

Einführung

Peptide sind eine wesentliche Klasse von grundlegenden biologisch relevanten Effektormolekülen. Akzeptorsysteme für Peptide schließen ein: Antikörper, Enzyme, Membran-gebundene und intra-Zellrezeptoren. Biologisch wichtige Peptide schließen Bradykinin, Oxytocin, α-Endorphine, Insulin und ähnliche ein. Arzneimittelforschung, die die Invariabilität der Peptide beinhaltet, erfordert die Synthese und Testung Hunderttausender Analoger der ursprünglichen biologisch wirksamen Sequenzen. Um die Wirkungsbeziehungen einer vorgegebenen Peptidstruktur zu verstehen, wird eine große Anzahl von Peptidanalogen auf allen diesen Gebieten benötigt.
Diese Mannigfaltigkeit der Kombinationsmöglichkeiten selbst der 20 natürlichen Aminosäuren schränkt die Anwendung üblicherweise verwendeter Syntheseverfahren zum Screening auf optimale Peptidantigene, Peptidliganden für biologisch relevante Akzeptorsysteme, Enzyminhibitoren, antimikrobielle Mittel und ähnliches empfindlich ein [d. h., es gibt 64 000 000 mögliche Peptide bei sechs Resten (20&sup6;), 1 280 000 000 mögliche Peptide bei sieben Resten (20&sup7;) und ähnlich]. Obwohl die üblicherweise verwendeten Verfahren für einzelne Peptidsynthesen Untersuchungen mit synthetischen Peptiden sehr erleichtert haben und sie kommerziell entweder auf einer Gebrauchsgrundlage oder zur Anwendung in Kit-Form verfügbar sind, gestatten sie nur die Herstellung eines sehr geringen Teils der herstellbaren Oligopeptide (entweder aus natürlichen oder aus nicht-natürlichen Aminosäuren zusammengesetzt).
Es wird erwartet, dass äquimolare Mengen an jedem Bestandteil der zu untersuchenden Bibliothek (oder Satzmitglied) die notwendige Selektivität der Wechselwirkungen des erwünschten peralkylierten Oligopeptids in dem verwendeten Gemisch sichern könnte (d. h., die Suche "nach der Nadel im Heuhaufen", um das richtige peralkylierte Hexapeptid innerhalb der 64 000 000 Kombinationsmöglichkeiten der 20 natürlichen Aminosäureseitenketten zu finden, entspricht der Suche nach einer einzelnen Stahlnadel zwischen 63 999 999 Kupfernadeln). Um einen Einblick in die außerordentlichen Auswahlkriterien in einem derartigen System zu gewinnen, ist es hilfreich, zu bedenken, dass ein einziges sechsbuchstabiges Wort in Anwesenheit von 63 999 999 anderen sechsbuchstabigen Wörtern leicht gefunden werden müsste (63 999 999 sechsbuchstabige Wörter würden annähernd 50 000 Textseiten einer üblichen wissenschaftlichen Zeitschrift füllen).
Die vorliegende Erfindung betrifft oligomere Peptid-ähnliche Moleküle, die peralkylierte Aminosäurereste besitzen. Die Peptid-ähnlichen Moleküle der vorliegenden Erfindung sind C&sub1;-C&sub7;-Alkyl-peralkylierte Oligopeptide. Die vorliegende Erfindung betrifft im Allgemeinen lineare peralkylierte Oligopeptide, die 2 bis etwa 10 peralkylierte Aminosäurereste besitzen.
Gemische linearer C&sub1;-C&sub7;-Alkyl-peralkylierter Oligopeptide werden hier besonders in Erwägung gezogen, sowie ein Gemisch, das einen oder mehrere vorbestimmte peralkylierte Aminosäurerest(e) an einer oder mehreren vorbestimmten Position(en) der peralkylierten Oligopeptidkette enthält, wobei die verbleibende eine oder mehreren Position(en) durch die beschriebenen äquimolaren Gemische von peralkylierten Aminosäureresten besetzt sind, wird hier als peralkylierter Oligopeptidsatz bezeichnet. Ein derartiges Gemisch oder ein derartiger Satz wird vorzugsweise durch Peralkylierung eines entsprechenden Gemisches von Oligopeptiden hergestellt.
Eine Vielzahl verwandter peralkylierter Oligopeptidsätze bildet eine Bibliothek von Sätzen. Die Satzmitglieder einer Bibliothek von Sätzen, die auch einfach als Bibliothek bezeichnet werden, weisen die gleiche Länge und die gleichen Enden auf und sie besitzen die gleiche Anzahl von Kettenpositionen, die durch äquimolare Gemische der gleichen von mindestens sechs verschiedenen peralkylierten Aminosäurereste besetzt sind. Die Satzmitglieder unterscheiden sich voneinander in (a) der Position des einen oder der mehreren vorbestimmten peralkylierten Aminosäurereste, (b) der Identität der einen oder der mehreren vorbestimmten peralkylierten Aminosäurereste und (c) sowohl in der Position als auch in der Identität des einen oder der mehreren vorbestimmten peralkylierten Aminosäurereste.
In einer beispielhaften Bibliothek von 400 Sätzen von Hexameren sind die ersten beiden N-terminalen Positionen durch jede der 20 natürlich vorkommenden (Gen kodierten) Aminosäurereste besetzt und die vier C-terminalen Restpositionen sind durch äquimolare Gemische von mindestens sechs peralkylierten natürlich vorkommenden Aminosäureresten besetzt. Eine andere Bibliothek ist selbst eine Bibliothek von sechs Bibliotheken von Hexameren und sie enthält insgesamt 120 Mitglieder von Sätzen. Ein erstes Bibliothek-Mitglied enthält zwanzig Satzmitglieder, in denen die Position 1 am N-terminalen Ende durch jede der peralkylierten zwanzig natürlich vorkommenden Aminosäurereste besetzt ist, wobei die verbleibenden fünf Positionen durch Gemische besetzt sind. In einer anderen Bibliothek aus zwanzig Satzmitgliedern ist die Position 2 durch jeden dieser peralkylierten Reste besetzt und die verbleibenden Positionen sind durch Gemische besetzt. Es kommen ähnliche zwanzig Satzmitglieder enthaltende Bibliotheken in Betracht, in denen jede der verbleibenden fünf Positionen durch einen dieser 20 peralkylierten Reste besetzt ist und die verbleibenden Positionen sind äquimolare Gemische dieser peralkylierten Reste.
Ein in Betracht kommendes C&sub1;-C&sub7;-Alkyl-peralkyliertes Oligopeptid eines Satzes ist an jeder Position eines Vorläufer-Oligopeptids alkyliert, das ein aktives Wasserstoffatom trägt. In der Konsequenz ist auch jeder Satz ebenso wie eine Bibliothek von Sätzen peralkyliert.
Die Seitenketten vieler Aminosäuren werden durch die Peralkylierung nicht verändert, sodass z. B. die Methylseitenkette eines Alanin-Aminosäure-Rests in einem Oligopeptid eine Methylseitenkette eines peralkylierten Oligopeptids ist. Hydroxylgruppen-enthaltende Seitenketten sind üblicherweise gegenüber Alkylierung geschützt, sie können jedoch, falls erwünscht, alkyliert sein. Carboxyl-, Amid-, Guanidin-, Mercapto-, Amino- und Aza-Substituenten enthaltende Aminosäureseitenketten enthalten aktiven Wasserstoff und sie sind gegenüber dem in Betracht kommenden, bevorzugten Peralkylierungsverfahren nicht inert. Als solche kommen die Seitenketten von Asparagin- und Glutaminsäuren, Asparagin und Glutamin und die Guanidingruppen-enthaltende Seitenkette von Arginin nicht in Betracht.
Es werden ziemlich alle Atome mit einem aktiven Wasserstoffatom alkyliert. Somit wird die N-terminale α-Aminogruppe, wenn als solche vorhanden, in eine quaternäre C&sub1;-C&sub7;-Alkylammoniumgruppe umgebildet, wohingegen dann, wenn eine N-terminale C&sub1;-C&sub1;&sub8;-Acyl (Kohlenwasserstoffoyl)gruppe, wie Acetyl, vorhanden ist, eine N-Acyl-N- alkylamino-C&sub1;-C&sub1;&sub8;-Kohlenwasserstoffoylalkylamidgruppe gebildet wird. Eine N-Alkyl- N-pyroglutamoylgruppe wird gebildet, wenn eine N-Pyroglutamoylgruppe vorhanden war. Ähnlich wird jede der Amidgruppen, ausgenommen der von Prolin (Prolyl), das eine sekundäre Amidpeptidylbindung ausbildet, in dem größtmöglichen Ausmaß alkyliert, sodass die endständigen Amidgruppen von Gln und Asn dialkyliert werden. Die während der Synthese verwendeten Seitenketten-blockierenden Gruppen werden üblicherweise entfernt, sodass die Carboxylgruppen von Asp und Gln zu Alkyl- Carbonsäureestern werden und Cys bildet einen Alkylthioether. Die Aza- Stickstoffatome von His und Trp werden N-aikyliert und die Amino- und Guanidingruppen von Lys und Arg werden zu quaternären Alkylammoniumgruppen. Die Benzylschutzgruppen von Ser und Thr werden im Allgemeinen nicht entfernt und Met wird vorzugsweise als das Sulfoxid verwendet, das auch gegenüber der Alkylierung stabil ist und es kann in einem peralkyliertem Satz erhalten bleiben oder, falls erwünscht, reduziert werden.
In dem Fall, in dem ein Vorläufer-Otigopeptid synthetisiert wird, bei dem der C- terminale Rest an ein Benzhydrylamin (BHA)- oder Methylbenzhydrylamin (MBHA)- Harz als festen Träger gebunden ist, wird der C-terminale Rest zu einem monoalkylierten Carboxamid, wenn die Alkylierung vor der Abspaltung vom Harz erfolgt und zu einem dialkylierten Amid, wenn die Alkylierung nach der Abspaltung vom Harz durchgeführt wird. In dem Fall, in dem der C-terminale Rest über eine Esterbindung an den festen Syntheseträger über eine Esterbindung gebunden ist, wird ein C-terminaler Carbonsäureester gebildet. Durch die Reaktion eines peralkylierten Oligopeptidsatzes, der eine C-terminale Estergruppe mit einem Mono- oder Di-C&sub1;-C&sub7;- alkylamin enthält, entsteht das entsprechende C-terminale C&sub1;-C&sub7;-Alkylcarboxamid. Durch die Reaktion eines peralkylierten Oligopeptids oder eines peralkylierten Oligopeptidsatzes, das bzw. der eine oder mehrere Alkylcarbonsäureestergruppe(n) enthält, mit einer wässrigen Base, wie Natriumhydroxid, wird der Ester in eine Carboxylgruppe umgewandelt. Die Carboxylgruppe kann danach wieder mit der gleichen oder einer anderen C&sub1;-C&sub7;-Alkylgruppe mittels standardmäßigen Veresterungsverfahren verestert werden.
Es ist auch bemerkenswert, dass die Behandlung eines C&sub1;-C&sub7;-Alkyl-peralkylierten Oligopeptids oder eines Satzes von C&sub1;-C&sub7;-Alkyl-peralkylierten Oligopeptiden, das bzw. der eine N-terminale C&sub1;-C&sub1;&sub8;-Acylgruppe und besonders eine N-Benzoylgruppe mit einer Säure enthält, unter sauren Bedingungen die Entfernung des N-terminalen Rests bewirkt, wodurch ein N-Alkylamin als N-terminale Gruppe des peralkylierten Oligopeptids oder Satzes, der einen Rest kürzer als sein Vorläufer-Satz ist, verbleibt. Somit wird in dem Fall, in dem eine N-terminale C&sub1;-C&sub1;&sub8;-Acylgruppe in dem peralkylierten Oligopeptid erwünscht ist, diese Gruppe nach der Spaltung von dem festen Träger hinzugefügt.
Die in Betracht kommenden Sätze linearer peralkylierter Oligopeptide werden vorzugsweise aus den entsprechenden Sätzen oder Gemischen der Oligopeptide durch C&sub1;-C&sub7;-Alkyl-Peralkylierung des Gemisches hergestellt. Ein einziges lineares peralkyliertes Oligopeptid wird vorzugsweise ebenfalls aus einem entsprechenden einzelnen Oligopeptid hergestellt. In der Konsequenz wird die vorliegende Erfindung in der nachstehenden Beschreibung in einer bevorzugten Ausführungsform beschrieben, in der die linearen peralkylierten Oligopeptide aus Vorläufer-Oligopeptiden hergestellt werden, die die meisten oder alle der zwanzig natürlich vorkommenden Aminosäurereste enthalten oder enthalten können. Es ist jedoch verständlich, dass die vorliegende Erfindung mit mindestens sechs verschiedenen Aminosäureresten und mehr als zwanzig verschiedenen Resten angewendet werden kann.
Ein Oligopeptid kann beispielsweise die natürlich vorkommenden 20 Aminosäuren, ein oder beide Isomere von Ornithin, Norleucin, Hydroxyprolin, β-Alanin und die anderen C&sub4;-C&sub6;-Aminosäuren, wie γ-Aminobutter- und &epsi;-Aminocapronsäuren, und die D- Stereoisomere der natürlich vorkommenden zwanzig Aminosäuren enthalten, sodass die Verwendung von etwa fünfzig geschützten D- und L-Aminosäuren für die Synthese in Betracht kommt. Vorläufer-Oligopeptidsätze und gepoolte Oligopeptidgemische (hier nachstehend diskutiert), welche alle D-Aminosäurereste und Gemische aus sowohl D- als auch L-Formen enthalten, werden bezüglich der Verwendung zur Herstellung entsprechender linearer peralkyierter Oligopeptide und linearer peralkylierter Oligopeptidsätze in Betracht gezogen. In der Konsequenz schließt der hier verwendete Ausdruck "Aminosäure", wenn nicht anders angegeben, nicht nur die natürlich vorkommenden (genetisch kodierten) L-Aminosäuren, sondern auch ihre D-Stereoisomere und nicht-natürlich vorkommenden Aminosäuren ein. Die Begriffe "Aminosäurederivat", "geschütztes Aminosäurederivat" oder ähnliche werden hier für eine als Reaktant zugesetzte geschützte Aminosäure verwendet, wohingegen der Begriff "Aminosäurerest", "Rest" oder ähnliche hier für eine umgesetzte geschützte Aminosäure, die Teil einer Oligopeptidkette ist, verwendet wird.
Des weiteren werden die Bezeichnungen "Peptid" und "Oligopeptid" als Synonyme angesehen (wie es allgemein üblich ist) und jede Bezeichnung kann in Abhängigkeit vom Zusammenhang austauschbar verwendet werden. Das Wort "Polypeptid" wird für Ketten verwendet, die mehr als zehn Aminosäurereste enthalten. Alle hier dargestellten Oligopeptid- und Polypeptidformeln oder -sequenzen sind von links nach rechts und in Richtung vom Amino-terminalen zum Carboxy-terminalen Ende geschrieben.
Die hier für die Derivate und Reste der zwanzig natürlichen Aminosäuren verwendeten Abkürzungen sind in der nachfolgenden Tabelle dargestellt: Konkordanz-Tabelle
Das Wort "vorbestimmt" wird hier in zwei verschiedenen Zusammenhängen verwendet und besitzt in jedem Zusammenhang die gleiche Bedeutung.
Ein "vorbestimmter" Aminosäurerest ist im Vergleich zu einem Gemisch von Resten ein einzelner Rest, dessen Identität bekannt oder besonders definiert ist, z. B. Alanin, Glycin, Tyrosin usw.. Ein lineares peralkyliertes Oligopeptid oder ein Satz davon enthält in ähnlicher Weise eine vorher definierte peralkylierte Aminosäureseitenkette, deren Identität bekannt oder besonders definiert ist.
Eine "vorbestimmte Position" in einer Oligopeptidgemisch-Sequenz oder -Kette ist eine Position am und einschließlich des Amino-terminalen Rests als Position 1, die durch einen vorbestimmten Aminosäurerest oder ein Gemisch von Resten besetzt ist und deren Position bekannt und besonders definiert ist. In ähnlicher Weise enthält ein lineares peralkyliertes Oligopeptid einen peralkylierten Aminosäurerest an einer bestimmten Position in der Kette und ein Satz derartig peralkylierter Oligopeptide enthält ebenfalls ein Gemisch peralkylierter Aminosäurereste an (einer) anderen bekannten oder spezifizierten Position(en) in der Kette.
Der Buchstabe "O" wird hier verwendet, um einen vorbestimmten, aber unspezifischen einzelnen Aminosäurerest oder den peralkylierten Aminosäurerest eines peralkylierten Oligopeptids zu bezeichnen. Die mit Index versehenen Buchstaben "O", z. B. O&sub1;, O&sub2;, O&sub3; ... On usw. bezeichnen einen vorbestimmten Aminosäurerest oder einen peralkylierten Aminosäurerest, der vorbestimmt (spezifiziert) ist und sich an der gleichen Position (1, 2, 3 ... n) innerhalb eines Satzes von Oligopeptidgemischen, von an feste Träger gekuppelten Oligopeptidgemischen, in einem peralkylierten Oligopeptid oder Satz, das/der frei oder an einen festen Träger gekuppelt ist, befindet. Ein mit Index versehener Buchstabe "O", wie O&sub1;, wird somit in dem Fall verwendet, in dem ein bestimmter Aminosäurerest oder peralkylierter Aminosäurerest, wie Alanin oder Leucin, vorgesehen ist, wohingegen die Verwendung eines nicht mit Index versehenen Buchstabens "O" bedeutet, dass jede der Vielzahl von Resten oder peralkylierten Resten an einer vorgegeben Position vorhanden ist, dass dieser Rest jedoch nicht spezifiziert ist, er jedoch ein einzelner Rest ist. Die mit Index versehenen Zahlen müssen für jedes beliebige vorgegebene Gemisch nicht am Aminoterminalen Ende beginnen.
Der Buchstabe "X" wird verwendet, um zu kennzeichnen, dass eine Position in einer Formel eines Oligopeptidsatzes oder peralkylierten Oligopeptidsatzes, die durch diesen Buchstaben besetzt ist, ein äquimolares Gemisch von jedem der mindestens sechs verschiedenen gekuppelten Aminosäureresten oder peralkylierten Resten und besonders bevorzugt von etwa 15 bis etwa 20 enthält.
Der Buchstabe "B" wird verwendet, um einen in der hier beschriebenen Synthese verwendeten festen Träger, wie ein bestimmtes Harz, zu kennzeichnen.
Ein peralkyliertes Oligopeptid "entspricht" einem Vorläufer-Oligopeptid, wenn das erstere die peralkylierte Form des letzteren ist, oder umgekehrt. Zudem wird einer dargestellten Oligopeptidsequenz üblicherweise das Wort "PerA" vorausgehen, um ein peralkyliertes Oligopeptid des weiteren von seinem entsprechenden Oligopeptid zu unterscheiden. Das Prefix "PerM" wird für ein bevorzugtes permethyliertes Oligopeptid verwendet.
Ein an einen festen Träger gebundener Trimeroligopeptid-Pool, dessen erste Position definiert ist und dessen zweite und dritte Position ein Gemisch sind, kann beispielsweise als O&sub1;XX-B dargestellt werden. Ähnlich kann ein Satz bevorzugter linearer peralkylierter Oligopeptide mit sechs peralkylierten Resten, dessen zweite und dritte Positionen vorbestimmte peralkylierte Aminosäurereste enthalten, dessen verbleibende Positionen durch Gemische von peralkylierten Resten besetzt sind, dessen N-terminales Stickstoffatom an drei Alkylgruppen, wie Methyl, gebunden ist und dessen C-terminales Ende eine N-Alkylgruppe, wie N-Methyl, ist, als PerA- N(CH&sub3;)&sub3;-X&sub1;O&sub2;O&sub3;XXX-NH(CH&sub3;) beschrieben werden.
Ein in Betracht kommender linearer peralkylierter Oligopeptidsatz enthält mindestens einen (einen oder mehrere) vorbestimmte peralkylierte Aminosäurereste an mindestens einer (einer oder mehreren) vorbestimmten Oligopeptidkettenposition(en) und Gemische von mindestens sechs, für die Synthese verwendeten peralkylierten Aminosäureresten an mindestens einer (einer oder mehreren) anderen Position(en) der peralkylierten Oligopeptidkette. Mindestens sechs verschiedene peralkylierte Aminosäurereste sind an den Mischpositionen vorhanden und einer dieser gleichen sechs peralkylierten Reste ist vorzugsweise der mindestens eine vorbestimmte peralkylierte Rest eines vorgegebenen Satzes, mit einer Ausnahme, die nachstehend diskutiert wird. Bei der bevorzugten Ausführung werden mindestens zehn verschiedene peralkylierte Reste verwendet und besonders bevorzugt werden noch etwa 15 bis etwa 20 peralkylierte Aminosäurereste an den Mischpositionen verwendet und jeder kann den einzelnen vorbestimmten peralkylierten Rest an der mindestens einen vorbestimmten Position bilden.
Somit kann der peralkylierte Rest an dieser mindestens einen vorbestimmten Position einer von mindestens sechs, vorzugsweise von mindestens zehn oder besonders bevorzugt von etwa 15 bis etwa 20 peralkylierten Resten sein. Dieser mindestens eine peralkylierte Rest wird hier üblicherweise als "ein vorbestimmter peralkylierter Aminosäurerest" bezeichnet, wohingegen in anderen Fällen dieser peralkylierte Rest als "einer von mindestens sechs peralkylierten Aminosäureresten" oder ähnlich beschrieben wird.

Syntheseverfahren

Überblick

Die Herstellung eines Satzes von linearen peralkylierten Oligopeptiden mit einem vorbestimmten C&sub1;-C&sub7;-Alkyl-peralkylierten Rest an mindestens einer Position und äquimolaren Mengen von mindestens sechs anderen erwünschten peralkylierten Resten an mindestens einer anderen Position beginnt vorzugsweise mit der Herstellung eines entsprechenden Oligopeptidsatzes, der danach peralkyliert wird. Die Äquimolarität, die für die peralkylierten Reste der Gemischpositionen von Bedeutung ist, ist auch für die Synthese des entsprechenden Oligopeptidsatzes von Bedeutung.
Für derartige. Synthesen sind zwei allgemeine Ansätze bevorzugt. Einer wird als physikalisches Gemischverfahren bezeichnet und der andere wird als chemisches Gemischverfahren bezeichnet. Beide Verfahren nutzen einen festen Träger, wie das üblicherweise verwendete Benzhydrylamin-(BHA)- oder Methylbenzhydrylamin- (MBHA)-Harz für Festphasen-Peptidsynthesen, die nachstehend diskutiert werden.
Das verwendete physikalische Gemischverfahren ist das in Houghten et al., Letters to Nature, 354: 84-86 (1991); Pinilla et al., Vaccines 92, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Habor, Seiten 25-27 (1992); Appel et al., Immunomethods, 1: 17-23 (1992) und WO 92/09300, veröffentlicht am 11. Juni 1992, beschriebene. Die Synthesverfahren ähneln auch den von Furka et al. in, Int. J. Peptide Protein Res., 37: 487-493 (1991), Huebner et äl. US-Patent 5 182 366, das hier als Literaturangabe einbezogen ist, und Lam et al., Letters to Nature, 355: 82-84 (1991) beschriebenen Verfahren:
Die letzten beiden Verfahren und das hier zur Herstellung der Vorläufer- Oligopeptidsätze verwendete unterscheiden sich im Konzept. Sowohl bei Lam et al. als auch bei Huebner et al. wird das erwünschte Peptid anhand seiner Bindung oder Reaktion ausgewählt, gewonnen und anschließend wird seine Sequenz bestimmt. Furka et al. beschreiben keine Reaktionen mit ihren Gemischen. Die vorliegenden Vorläufer-Oligopeptidsätze werden mit einem oder mehreren bekannten vorbestimmten Rest(en) an einer oder mehreren bekannten vorbestimmten Position(en) entlang der Kette hergestellt, sodass nur zu bestimmen ist, welches Oligopeptid einer bekannten Sequenz an den verwendeten Akzeptor gebunden hat. Das gleiche Konzept wird für die letztlich hergestellten peralkylierten Oligopeptide angewendet.
Eine chemische Gemischsynthese eines Vorläufer-Oligopeptidsatzes kann eine der von Rutter et al., US-Patent 5 010 175, oder Geysen, US-Patent 5 194 392, beschriebenen sein oder eine der in dem früher veröffentlichten Artikel beschriebenen, in dem Geysen einer der Autoren ist.
Sowohl Rutter et al. als auch Geysen beschreiben die Anwendung von N-t-BOC- Schutzgruppen bei ihren chemischen Gemischsynthesen. Jedes dieser Patente liefert ein beispielhaftes Gemisch von N-t-BOC-blockierten Aminosäurederivaten zur Anwendung bei der Synthese äquimolarer Mengen von Aminosäureresten.
Es ist zu bemerken, dass die vorliegende Erfindung nicht auf die Anwendung von N- t-BOC-Schutzgruppen zur Synthese von Vorläufer-Oligopeptidsätzen beschränkt ist.
Dies ist unabhängig davon, ob physikalische oder chemische gemischte Ansätze angewendet werden. Es kann somit jede Blockierungsgruppe verwendet werden. Die nachstehende Tabelle 1 liefert die Molverhältnisse der blockierten Aminosäuren, die für ein chemisches Gemischverfahren unter Anwendung der Fmoc-Gruppen- Blockierungschemie verwendet werden können.

Tabelle 1

Aminosäure / Molverhältnis

Ala 0,22
Asp (tBu-Ester) 0,47
Glu (tBu-Ester) 0,62
Phe 0,35
Gly 0,20
His (Tr) 0,72
Ile 2,51
Lys (tBoc) 0,59
Leu 0,48
Met 0,34
Asn 1,65
Pro 0,20
Gln 2,03
Arg (Mtr) 1,98
Ser (tBu-Ether) 0,80
Thr (tBu-Ether) 2,18
Val 1,85
Tyr (tBu-Ether) 0,81
Trp 0,99
*Die eingeklammerten Bezeichnungen in der linken Spalte sind die Schutzgruppen. tBu = t-Butyl; Tr = Trityl, tBoc = t-Butyloxycarbonyl; Mtr = 4-Methoxy-2,3,6- trimethylbenzolsulfonyl.
Eine wesentliche Äquimolarität in den Gemischpositionen liegt typisch innerhalb der Grenzen der Wägegenauigkeit bei der Anwendung des physikalischen Gemisch- Syntheseverfahrens, da einzelne Aminosäuren im großem Überschuss umgesetzt werden und man die Reaktionen bis zur Vollständigkeit ablaufen lässt. Das chemische Gemischverfahren liefert keine genaue Äquimolarität, wie es beim vorstehend beschriebenen physikalischen Gemischverfahren der Fall ist. US-Patent 5 010 175 beschrieb beispielsweise Abweichungen von der Äquimolarität im Bereich von 0,20-0,32 Mol und im Durchschnitt von 0,25±0,04, wobei jede Aminosäure nicht mehr als 0,8 bis 1,28 mal vom erwünschten Ergebnis abweichen sollte. Es wurde beobachtet, dass Abweichungen von der Äquimolarität bis zu etwa 35 Prozent im Vergleich zu der mit dem physikalischen Gemischverfahren erhaltenen Äquimolarität keine nachteilige Wirkung hatten. Trotz der Abweichungen von der genauen Äquimolarität, die bei der Anwendung des chemischen Gemischverfahrens beobachtet wurden, sind die verschiedenen Oligopeptide, von denen eine erhöhte Bindung an ein in ausreichenden Mengen vorhandenes entsprechendes Oligopeptid erwartet wurde, für die nachstehend beschriebenen Assay-Verfahren nützlich.
Es wird somit ersichtlich, dass sowohl die physikalischen als auch die chemischen Gemischsyntheseverfahren zur Herstellung eines erwünschten Vorläufer-Oligopeptidsatzes in dem Fachgebiet gut bekannt sind. Zudem diskutieren und veranschaulichen die Beispiele 1, 2 und 3 hier beispielhafte Synthesen unter Anwendung beider Synthesetypen.
Es ist bemerkenswert, dass Cystein und Tryptophan in den Vorläufer-Oligopeptidsätzen und den entsprechenden linearen peralkylierten Oligopeptidsätzen, infolge der Nebenreaktionen, die sich aus ihrer Verwendung ergeben, häufig nicht enthalten sind. Es wurde jedoch festgestellt, dass die Anwendung einer N-Formyl- Blockierungsgruppe am Tryptophan viele der Schwierigkeiten in der Synthese, die sich bei dem Einbau eines Rests in eine Oligopeptidkette ergeben, vermieden werden können.
Es ist weiterhin bemerkenswert, dass man eine Vielzahl von festen Trägern für eine in Betracht kommende Synthese eines Oligopeptidsatzes verwenden kann. Bevorzugte feste Träger sind die üblicherweise verwendeten vernetzten Styrol-Kügelchen mit Benzhydrylamingruppen. Es können jedoch auch viele andere feste Träger, wie sie in US-Patent 4 631 211 offenbart werden, verwendet werden, ebenso wie ein Celluloseträger, wie Baumwolle, der in Lebl et al., US-Patent 5 202 418, beschrieben ist.

C. Enden und Kupplung

In der bevorzugten Praxis ist jedes Oligopeptid während der Synthese durch eine selektiv spaltbare Bindung, wie eine Ester- oder Amidbindung, an den festen Träger gekuppelt. Ein zuletzt hergestellter Oligopeptidgemischsatz kann von dem festen Träger abgespalten (getrennt oder abgespalten) werden, gewonnen werden und danach unter Bildung eines freien linearen peralkylierten Oligopeptidsatzes peralkyliert werden oder die Alkylierung kann, während das Oligopeptid an den festen Träger gekuppelt ist (Oligopeptidgemisch-Pool) unter Bildung eines an einen festen Träger gekuppelten linearen peralkylierten Oligopeptidsatzes erfolgen.
Wie bereits früher beschrieben, enthält jedes peralkylierte Oligopeptid eine Kette von zwei bis etwa zehn peralkylierten Resten, und besonders bevorzugt von etwa fünf bis etwa acht peralkylierten Resten, sodass ein Vorläufer-Oligopeptidsatzmitglied eine Kette mit zwei bis etwa zehn umgesetzten Aminosäurerest-Wiederholungseinheiten enthält. Jedes Vorläufer-Oligopeptid enthält besonders bevorzugt eine Kette von etwa fünf bis etwa acht umgesetzten Aminosäureresten.
Eine geradkettige oder verzweigte C&sub1;-C&sub1;&sub8;-Acyl (Kohlenwasserstoffoyl)- oder Pyroglutamoylgruppe ist häufig an das N-terminale α-Amin eines Oligopeptids gebunden, sodass nach der Deblockierung, Alkylierung und Abspaltung von dem festen Träger jedes Kettenmitglied eines peralkylierten Oligopeptidsatzes eine geradkettige oder verzweigte C&sub1;-C&sub1;&sub8;-Kohlenwasserstoffoyl- oder Pyroglutamoylgruppe enthält. Als eine Acetylgruppe ist eine C&sub2;-Acylgruppe bevorzugt und sie wird hier häufig als "Ac" bezeichnet. Andere beispielhafte C&sub1;-C&sub1;&sub8;-Acylgruppen schließen Formyl, Propionyl, Butyryl, 2-Methylpropionyl, Hexanoyl, Benzoyl, Octanoyl, Lauroyl, Palmitoyl, Oleoyl und Stearoyl ein. An dem Amino-terminalen α-Amin der Vorläufer-Ketten kann auch Wasserstoff vorhanden sein, sodass nach der Peralkylierung und der Abspaltung von dem festen Träger eine quaternäre C&sub1;-C&sub7;-Alkylammoniumgruppe am N- terminalen Ende entsteht.
In dem Fall, in dem das N-terminale α-Amin als eine Tri-C&sub1;-C&sub7;-alkylammoniumgruppe vorliegt, ist natürlich ein anionisches Gegenion anwesend. Das ausgewählte Gegenion ist im Allgemeinen einwertig, um Vernetzung und Ausfällung des peralkylierten Oligopeptids zu vermeiden. Wird ein Halogenid-Alkylierungsmittel, wie Methyljodid, Benzylbromid oder Allylbromid, verwendet, ist das Halogenid das initiale Gegenion für die gebildete Tri-C&sub1;-C&sub7;-alkylammoniumgruppe. Durch die Abspaltung des peralkylierten Peptids von dem festen Träger mit HF kann das initiale Gegenion durch ein Fluoridion ersetzt werden. Jedes beliebige pharmazeutisch verträgliche Gegenion, wie ein Halogenid; d. h. Fluorid, Chlorid, Bromid oder Jodid, Nitrat oder ein C&sub1;-C&sub6;-Carboxylat, wie Formiat, Acetat, Trifluoracetat, Propional, iso-Butyrat, Hexanoat oder ähnliches, kann verwendet werden. Eine einzelne erwünschte Gegenion- Spezies kann durch Durchlaufen des deblockierten, abgetrennten, peralkylierten Oligopeptidsatzes durch ein Anionenaustauscherharz mit dem erwünschten Gegenion als das austauschbare Anion bereitgestellt werden.
Eine C&sub1;-C&sub1;&sub8;-Acyl- oder Pyroglutamoylgruppe wird durch die Reaktion eines entsprechenden Anhydrids, wie Essigsäureanhydrid, eines Säurehalogenid, wie Octanoylchlorid, durch die Reaktion eines geeigneten aktivierten Esters, wie N- Hydroxysuccinimidylbenzoat, oder durch Verwendung der freien Carboxylgruppe und eines Carbodümids, wie DCC, zugefügt. Üblicherweise wird an ein an einen festen Träger-gekuppeltes Oligopeptid nach der Entfernung der selektiv entfernbaren Blockierungs- (Schutz)-gruppe, z. B. N-t-Boc oder N-Fmoc, von der N-terminalen α- Aminogruppe eine Acylgruppe hinzugefügt.
In diesen Ausführungsformen, in denen an jedem Mitglied des peralkylierten Oligopeptidgemischsatzes eine freie N-terminale α-Aminogruppe erwünscht ist, wird vorzugsweise eine Trityl-(Triphenylmethyl)-gruppe zur Blockierung des N-terminalen Amins vor dem Peralkylierungsschritt verwendet. Wenn die Peralkylierung abgeschlossen ist, wird die Tritylgruppe durch Standardverfahren, wie durch die Behandlung mit einer Säure, wie Trifluoressigsäure (TFA; 2 Prozent) in Dichlormethan (DCM; 98 Prozent), entfernt.
In dem Fall, in dem eine einzelne C&sub1;-C&sub7;-Alkylgruppe an dem N-terminalen Amin erwünscht ist, reagiert häufig zuerst ein an einen festen Träger gebundener, ein freies N-terminales Amin-enthaltender peralkylierter Oligopeptidgemisch-Pool, der unter Verwendung einer Tritylgruppe wie vorstehend hergestellt wurde, mit einem z. B. zweifachen Überschuss an 4,4-Dimethoxydiphenylmethylchlorid (DodCl) entsprechend dem Verfahren von Kaljuste et al., Int. J. Peptide Protein Res., 42: 118- 124 (1993) unter Bildung eines eine Dod-Schutzgruppe enthaltenden N-terminalen Amins. Anschließend kann ein C&sub1;-C&sub7;-Alkyl-Aldehyd oder -Keton zur reduktiven Alkylierung des eine Dod-Schutzgruppe enthaltenden N-terminalen Amins mittels eines Reduktionsmittels, wie Natriumcyanoborhydrid, verwendet werden. Die Dod- Schutzgruppe wird danach mit 55 Prozent TFA in Dichlormethan entfernt.
Ein eine Dod-Schutzgruppe enthaltendes N-terminales Amin wird in dem Fall verwendet, in dem eine Monoalkylierung erwünscht ist und der/das alkylierende Aldehyd oder Keton verhältnismäßig klein und nicht sterisch gehindert ist, wie es bei Verwendung von Formaldehyd oder Acetaldehyd der Fall ist. Die Monoalkylierung mittels eines sperrigeren Alkylierungsmittels, wie Benzaldehyd, erfordert keine Verwendung einer Dod-Schutzgruppe und sie wird durch die direkte reduktive Alkylierung des freien N-terminalen α-Amins ausgeführt. Die reduktive Alkylierung des freien N-terminalen, α-Amins mit kleinen, sterisch nicht gehinderten Alkylierungsmitteln liefert eine N,N-Dialkylierung. Alkylierungen, die zwischen diesen beiden Extremfällen liegen, können mit einer minimalen Anzahl von Experimenten bezüglich der Reaktionsbedingungen und der Reagenzien, die dem Fachmann gut bekannt sind, erreicht werden.
Beispielhafte C&sub1;-C&sub7;-Aldehyde und -Ketone, die für diese reduktive Alkylierung verwendet werden können, schließen Formaldehyd, Acetaldehyd, Aceton, Butanal, Methylethylketon, Methylbutylketon und Benzaldehyd ein. Das für diesen Schritt verwendete C&sub1;-C&sub7;-Aldehyd oder -Keton muss nicht die gleiche C&sub1;-C&sub7;-Alkylgruppe bilden, die im Peralkylierungsschritt entsteht. Vorzugsweise sind die jeweilige N-terminale Alkylgruppe und die nach der Peralkylierung vorhandene die gleiche.
In dem Fall, in dem ein Oligopeptidgemisch-Pool durch eine Estergruppe, die von einem C-terminalen Rest gebildet wurde, über eine direkte Bindung oder ein intermediäres Bindeglied, wie eine PAM-Gruppe, an einen festen Träger gebunden ist und ein C-terminales N-Alkylamid in dem peralkylierten Oligopeptidsatz erwünscht ist, kann der Oligopeptidsatz von dem festen Träger durch Aminolyse mittels Ammoniak abgetrennt werden und wenn das Peptid nach der Abspaltung alkyliert wird, entsteht ein dialkyliertes C-terminales Amid. Die normale Abspaltung eines Estergruppen-gebundenen Oligopeptids von dem festen Träger mittels HF führt zu einer C-terminalen Carboxylgruppe. Derartige Ester, die durch Natriumhydroxid- Behandlung gespalten werden, führen jedoch zur Carboxylgruppe, die während des Peralkylierungsschritts peralkyliert wird. Der entstehende Ester kann mit einer Base, wie Natriumhydroxid, gespalten werden, unter Bildung einer entsprechenden Carboxylatgruppe, die unter Bildung einer freien Carboxylgruppe neutralisiert werden kann. Diese Carboxylgruppe kann auch mittels Standardverfahren unter Bildung eines C&sub1;-C&sub7;-Alkylesters, dessen Alkylgruppen sich von denen der peralkylierten Oligopeptidkettenmitglieder unterscheiden, alkyliert werden. Die Abspaltung eines Amin-gebundenen Oligopeptids von einem festen Benzhydrylamin-Trägerharz mittels HF vor der Peralkylierung führt zur Ausbildung einer C-terminalen N,N- Dialkylamidgruppe nach der Alkylierung, wohingegen die Abspaltung nach der Peralkylierung zur Ausbildung einer C-terminalen N-Alkylamidgruppe führt.
Die Synthesen von Vorläufer-Oligopeptidsätzen werden vorzugsweise mittels porösen Behälters, wie sie in US-Patent 4 631 211 beschrieben sind, durchgeführt. Ein anderes gebräuchliches Syntheseverfahren, besonders zur Anwendung im chemischen Gemischverfahren, ist das in Lebl et al., US-Patent 5 202 418, beschriebene Verfahren.
Verschiedene gebräuchliche feste Träger, Verfahren zu ihrer Anwendung, Reagenzien zur Bindung der wachsenden Oligopeptide an den Träger, die Abspaltung eines Oligopeptids von dem Träger und ähnliches sind dem Fachmann gut bekannt, sodass sich weitere Erläuterungen erübrigen. Weitere derartige Erläuterungen können jedoch in US-Patent 4 631 211 und WO 92/09300, veröffentlicht 11. Juni 1992, nachgelesen werden.

D. Oligopeptid-Alkylierung

Ein in Betracht kommender peralkylierter Oligopeptidsatz wird an jedem Amidstickstoff des Peptidgerüsts und an der Seitenkettengruppe, an der ein aktives Wasserstoffatom vorhanden ist, alkyliert. Ein Oligopeptidsatz wird mit einem Reagenz, das eine C&sub1;-C&sub7;-Alkylgruppe liefert, peralkyliert. Ein Vorläufer-Oligopeptidsatz wird vorzugsweise nach der Herstellung peralkyliert. Ein peralkylierter Oligopeptidsatz kann auch durch Verwendung geeigneter peralkylierter Aminosäurederivate hergestellt werden, ein solches Verfahren ist jedoch nicht geeignet.
In Betracht kommende C&sub1;-C&sub7;-Alkylgruppen, mit denen ein Oligopeptidsatz alkyliert wird, schließen Kohlenwasserstoff- und substituierte Kohlenwasserstoffalkylgruppen ein. Beispielhafte Kohlenwasserstoffgruppen schließen Methyl, das bevorzugt ist, Ethyl, Propyl, iso-Propyl-, sec-Butyl, Cyclopentyl, Hexyl, Heptyl und Benzyl, das auch als eine Phenyl-substituierte Methylgruppe oder eine Aralkylgruppe angesehen werden kann, ein.
Substituierte C&sub1;-C&sub7;-Alkylgruppen schließen Alkylcarboxamid ein, dessen Amidstickstoffatome selbst mit null, einer oder zwei der gleichen C&sub1;-C&sub3;-Kohlenwasserstoffalkylgruppen Alkylhydroxyl- und Alkylcarboxylatgruppen substituiert sind, ein. Beispiele derartig substituierter Alkylgruppen sind Methylcarboxamid [-CH&sub2;C(O)NH&sub2;], 2-Hydroxyethyl [-CH&sub2;CH&sub2;OH], 2-Hydroxypropyl [-C&sub2;CH(OH)CH&sub3;] und 3-Carboxylpropyl [-CH&sub2;CH&sub2;CH&sub2;CO&sub2;]. Wie vorstehend erwähnt, kann eine Benzylgruppe auch als eine Phenylmethylgruppe betrachtet werden und sie kann somit als eine substituierte Alkylgruppe angesehen werden. Der Hydroxylsubstituent ist im Allgemeinen mit einer Trialkylsilylgruppe, wie Trimethylsilyl, die nach der Alkylierung mit Tetrabutylammoniumfluorid entfernt wird, blockiert. Eine Carboxyl-substituierte Alkylgruppe wird vorzugsweise als ihr Alkalimetallsalz, wie das Natrium- oder Kaliumsalz, umgesetzt.
Die Peralkylierungsreaktion kann in einer Vielzahl von Reaktionsbedingungen, die nicht-nukleophile starke Basen, Lösungsmittel, Temperatur und Konzentrationen der Base und Alkylierungsmittel betreffen, durchgeführt werden. Die Peralkylierungsreaktion ist eine nukleophile Reaktion, sodass vorzugsweise ein polares, aprotisches Lösungsmittel, wie Dimethylsulfoxid (DMSO), Dimethylformamid (DMF) oder Hexamethylphosphoramid (HMPA), verwendet wird, DMSO wird bevorzugt. Gleichfalls können geringe Mengen anderer aprotischer Lösungsmittel, wie Dioxan und Tetrahydrofuran (THF), vorhanden sein. Das Peralkylierungsmittel ist eine vorstehend beschriebene substituierte oder unsubstituierte C&sub1;-C&sub7;-Alkylgruppe, die auch eine geeignete Abgangsgruppe, die während der Reaktion ersetzt wird, wie Chlorid, Bromid, Jodid, Methylsulfonat oder Trifluormethylsulfonat, einschließt.
Vorzugsweise wird ein Verhältnis von etwa 50 zu etwa 500 ml DMSO oder einem anderen Lösungsmittel pro Gramm an Peptid-gebundenem Harz verwendet. Besonders bevorzugt beträgt dieser Bereich etwa 100 zu etwa 250 ml/g in dem bevorzugten Lösungsmittel DMSO.
Das Alkylierungsmittel wird im Allgemeinen in einem großen molaren Überschuss im Vergleich zu dem im Peptid vorhandenen aktiven Wasserstoff verwendet, um die Peralkylierung abzusichern. Das Alkylierungsmittel wird im Allgemeinen in einem etwa 10- bis etwa 100-fachen molaren Überschuss über dem aktiven Wasserstoff des Peptids (potentielle Alkylierungsorte) und wird vorzugsweise in einem etwa 20- bis etwa 80-fach und besonders bevorzugt in einem etwa 25- bis etwa 40-fach molaren Überschuss verwendet.
Die nicht-nukleophile starke Base ist vorzugsweise ein Alkalimetallhydrid, wie Natrium- oder Kaliumhydrid. Besonders bevorzugt wird die mildere, aber starke nicht-nukleophile Base Lithium-t-butoxid verwendet. Die Base muss eine zur Entfernung eines aktiven Wasserstoffs von einer Peptidylamidbindung ausreichende Basenstärke besitzen. Ein Alkalimetallhydrid- oder t-Butoxidion besitzt diese erforderliche Basenstärke und die Anwendung eines der beiden verringert im Vergleich zu anderen starken Basen die Bildung von Nebenprodukten.
Die nicht-nukleophile starke Base wird in einem großen molaren Überschuss im Vergleich zu den möglichen Peptidalkylierungsorten (aktive Wasserstoffatome) verwendet. Es wird im Allgemeinen ein etwa 5- bis etwa 100-facher Überschuss an Base verwendet, wobei ein etwa 10- bis etwa 30-facher Überschuss bevorzugt ist. Eine bevorzugte nicht-nukleophile starke Base ist Natriumhydrid, das vorzugsweise etwa 0,25 molar in DMSO ist. Das besonders bevorzugte Lithium-t-butoxid in THF wird etwa 0,5 molar verwendet.
Bei der üblichen Ausführung wird das an einen festen Träger-gekuppelte Vorläufer- Peptid in dem Lösungsmittel suspendiert und der nicht-nukleophilen Base über einen Zeitraum von etwa 4 bis etwa 24 Stunden vor der Zugabe des Alkylierungsmittels angemischt. Im Allgemeinen beträgt der Zeitraum etwa 16 bis etwa 18 Stunden bei Raumtemperatur. Dieser Zeitraum kann bei Verwendung von Lithium-t-butoxid als Base auf etwa 15-30 Minuten verkürzt werden.
Die Peralkylierungsreaktion kann bei Temperaturen unterhalb Null Grad Celcius, wie sie in einem Trockeneis/Aceton-Bad vorliegen, bis etwa zum Siedepunkt des Lösungsmittels ablaufen, wobei niedrigere Temperaturen mehr Zeit erfordern als höhere. Es wurde festgestellt, dass die Peralkylierung bei Raumtemperatur sehr wirksam und geeignet ist und sie ist somit bevorzugt. Die Reaktion wird unter nichtwässrigen Bedingungen und vorzugsweise in einer inerten Atmosphäre, wie unter Stickstoff oder Argon, d. h. in Abwesenheit von Sauerstoff, durchgeführt.
Es wurde nachgewiesen, dass die Methylierung der Stickstoffatome des Peptidgerüsts etwa innerhalb einer Minute erfolgt, wobei die N-terminalen Amine einen längeren Zeitraum für die Permethylierung erfordern. Die Methylierungsreaktionszeit ist somit ein anderer Weg, um permethylierte Oligopeptidgemischsätze herzustellen, die eine andere Gruppe als eine N-terminale quaternäre Ammoniumgruppe aufweisen. Es ist beobachtet worden, dass der Anteil an N-terminalen Mono- und Dialkylaminoresten im Allgemeinen unterhalb von 15 Prozent liegt.
Wie von anderen Autoren beschrieben, ist es bevorzugt, die Peralkylierung des Oligopeptidsatzes durchzuführen, während er an den festen Träger gebunden ist. Durch die Anwendung der in US-Patent 4 631 211 offenbarten Syntheseverfahren, die poröse Behälter für die Synthesen verwenden, können mehrere an einen festen Träger gebundene Oligopeptidsätze, die sich jeweils innerhalb eines eigenen porösen Behälters befinden, gleichzeitig peralkyliert werden. Es wird angenommen, dass die vorliegende Erfindung den ersten Bericht über die Permethylierung eines Peptids, das während der Peralkylierung an einen festen Träger gebunden ist, darstellt.
Für die mit Natriumhydrid durchgeführte Peralkylierung befinden sich die Base, das Alkylierungsmittel und das Peptid im Allgemeinen zusammen in dem Reaktionsgemisch. Bei Verwendung von Lithium-t-butoxid in THF werden die Base und das Peptid gemischt und umgesetzt und anschließend wird im Wesentlichen die gesamte, t-Butoxid-enthaltende flüssige Phase (soweit wie möglich, z. B. etwa 75-95 Prozent) entfernt. Danach wird das Alkylierungsmittel in DMSO angemischt und umgesetzt.
Ist die Peralkylierung vollständig, wird die überschüssige nicht-nukleophile starke Base durch Waschen entfernt und es erfolgt die Neutralisierung durch Waschen mit DMSO und nachfolgend mit DMF und Dichlormethan und der an den Träger gebundene peralkylierte Peptidsatz (Gemisch-Pool) wird anschließend getrocknet. Ein anderes Waschprotokoll wendet drei Waschschritte mit DMF, zwei mit Isopropylalkohol (IPA), drei mit DCM und einen mit Methanol (MeOH) vor der Trocknung an. Die peralkylierten Oligopeptidsätze können dann einzeln von den festen Trägern abgespalten werden, um, falls erwünscht, die freien peralkylierten Oligopeptidsätze bereitzustellen oder ein an einen festen Träger gebundener (gekuppelter) peralkylierter Oligopeptidsatz kann ohne Abspaltung von dem Träger verwendet werden.
Die Alkylierungsreaktionen beinhalten die Zugabe einer substituierten oder nichtsubstituierten Alkylgruppe an ein derartiges Atom, wie Kohlenstoff, Sauerstoff, Stickstoff oder Schwefel. Die Kohlenstoffalkylierung wird hier nicht betrachtet. Wie hier in Betracht gezogen, werden an aktive Wasserstoffatome gebundene Sauerstoff-, Stickstoff- oder Schwefelatome, d. h. zur Entfernung mit einer starken nichtnukleophilen Base ausreichend saure Wasserstoffatome, vollständig alkyliert.
Es wird somit jede Peptid-gebundene Amidgruppe alkyliert. Die N-terminale α- Aminogruppe wird, wenn sie frei ist, quaternisiert, wenn sie als ein Acylamid oder ein Dod-Derivat vorliegt, mono-alkyliert oder sie wird, wenn sie wie ein cyclisches Imid, wie Succinimid, Maleimid oder Phthalimid, das nachfolgend mit Hydrazin reagiert oder mit einer Tritylgruppe blockiert ist, nicht umgesetzt.
Die Alkylierung der Seitenkettenaminosäurereste ist eine Funktion der während der Synthese der Vorläufer-Oligopeptidketten verwendeten Blockierungsgruppen. Somit werden die nicht-reaktiven Seitenketten, die keine Blockierungsgruppen benötigen, wie die von Glycin, Alanin, Isoleucin, Leucin, Phenylalanin und Prolin, nicht alkyliert. Die Aminoseitenketten von Asparagin und Glutamin benötigen normalerweise keine Blockierungsgruppen, sie enthalten jedoch zwei aktive Wasserstoffatome an jedem Seitenkettenamid und sie werden jeweils dialkyliert.
Werden beispielsweise die in einer N-t-BOC-Synthese üblicherweise verwendeten Blockierungsgruppen verwendet, kann bezüglich der Ergebnisse einer betrachteten Peralkylierung an verschiedenen Aminosäureseitenketten nachfolgendes ausgeführt werden.
Die Benzylether-Schutzgruppen von Serin und Threonin sind gegenüber der Alkylierung ebenso stabil, wie Methioninsulfoxid, sodass diese Seitenketten nicht alkyliert werden, wenn die Alkylierung vor der Deblockierung erfolgt. Methioninsulfoxid kann dafür verwendet werden oder es kann für die Anwendung reduziert werden.
Die vorzugsweise zur Blockierung des Aza-Stickstoffs von Tryptophan verwendete Formylgruppe geht während der Alkylierung verloren, sodass ein N-Alkyl-Tryptophan (N-Alkyl-Indolring) gebildet wird. Die Dinitrophenyl-Blockierungsgruppe des einen blockierten Aza-Stickstoffs von Histidin geht verloren, sodass ein N-Alkyl-Histidin (N- Alkyl-Imidazolring) entsteht. Die üblicherweise verwendeten β- und γ-Benzylester- Blockierungsgruppen von Asparagin- und Glutaminsäure gehen während der Alkylierung verloren, sodass diese Aminosäurereste zu Alkyl-Carbonsäureestern werden.
Die üblicherweise verwendeten p-Toluolsulfonyl-, o-Chlorbenzyloxycarbonyl- und m- Brombenzyloxycarbonyl-Blockierungsgruppen von Arginin, Lysin und Tyrosin gehen während der Peralkylierung verloren. Die Arginin- und Lysin-Restseitenketten werden zu quaternären Alkylammoniumgruppen, wohingegen das Tyrosinhydroxyl O-alkyliert wird. Nach der anfänglichen Bildung einer quaternären Lysinammoniumgruppe kann ein geringfügiger Abbau erfolgen. Die Verwendung einer cyclischen Imid-Blockierungsgruppe an der &epsi;-Aminogruppe des Lysins, gefolgt von der Umsetzung mit Hydrazin kann ein freies, nicht-alkyliertes Amin liefern, da ein derartiges Imidstickstoffatom keine aktiven Wasserstoffatome enthält.
In dem Fall, in dem Cystein, das nicht bevorzugt ist, verwendet wird, wird die üblicherweise verwendete p-Methoxybenzyl-Blockierungsgruppe teilweise entfernt, was nach der Deblockierung zu einem Gemisch aus alkylierten und nicht-alkylierten Mercaptylgruppen führt.
Es wird auch festgestellt, dass ein denkbarer Satz Reste einschließen kann, die nicht peralkyliert sind. Derartige Reste können zugesetzt werden nachdem ein Feststoffgekuppelter Gemisch-Pool aus Peptiden, mit Ausnahme des N-terminalen Restes, mittels bekannter Peptidsynthesverfahren zur Anfügung einzelner Reste oder Gemische von Resten peralkyliert wird. Der nicht-alkylierte Rest befindet sich, in Abhängigkeit von der Richtung der Peptidsynthese an dem einen oder dem anderen Ende. Da die Synthese vorzugsweise meistens von der C-terminalen in die N- terminale Richtung erfolgt, besetzen die nicht-peralkylierten Reste vorzugsweise die N-terminalen Positionen.
Die Anwendung von bis zu sechs nicht-peralkylierten Resten kommt in Betracht. Eine Peptidgesamtlänge von zwei (keine nicht-peralkylierten Reste) bis zu sechzehn Resten kommt in Betracht. Vorzugsweise wird nur der N-terminale Rest nicht peralkyliert.

Peralkylierte Oligopeptidsätze und Bibliotheken von Sätzen

Hinsichtlich eines Aspekts betrifft die vorliegende Erfindung einen Satz linearer peralkylierter Oligopeptidketten, der ein Gemisch äquimolarer Mengen von linearen peralkylierten Oligopeptidketten-Mitgliedern umfasst, wobei jedes Mitglied ein Amino- und Carboxy-terminales Ende aufweist und die gleiche Anzahl von zwei bis etwa zehn peralkylierten Aminosäureresten in jeder Kette enthält. Die Mitglieder des Satzes weisen einen oder mehrere (mindestens einen) vorbestimmte peralkylierte Aminosäurereste an der gleichen einen oder den gleichen mehreren vorbestimmten Position(en) der peralkylierten Oligopeptidkette auf. Ein Satz weist auch äquimolare Mengen der peralkylierten Aminosäure auf, die mindestens sechs verschiedene peralkylierte Aminosäurereste, vorzugsweise den peralkylierten Rest an der mindestens einen vorbestimmten Position einschließend, an einer oder mehreren (mindestens einer) der gleichen anderen Position(en) der peralkylierten Oligopeptidkette enthalten. Das Amino-terminale Ende jedes der peralkylierten Oligopeptide in dem Satz ist eine quaternäre Alkylammonium-, Amino-, N-Alkylamino- oder eine C&sub1;-C&sub1;&sub8;- Kohlenwasserstoffoylalkylamidgruppe und das Carboxy-terminale Ende ist eine Mono- oder Dialkylamid-, Alkylcarboxylat- oder Carboxylgruppe. Eine C&sub1;-C&sub7;- Alkylgruppe am N- oder C-terminalen Ende ist eine C&sub1;-C&sub7;-Alkylgruppe, die die gleiche wie die anderen in jedem Molekül vorhandenen C&sub1;-C&sub7;-Alkylgruppen sein kann oder von diesen verschieden sein kann.
Ein freier peralkylierter Oligopeptidsatz wird vorzugsweise aus dem entsprechenden Satz von Oligopeptiden hergestellt. Ein in Betracht kommender peralkylierter Oligopeptidsatz kann auch ein an einen festen Träger gebundener sein und er kann aus einem komplexen Gemisch-Pool von an feste Träger-gebundenen Oligopeptiden hergestellt werden. Aus diesem Grund werden beispielhafte Predecessor- Oligopeptidsätze zuerst diskutiert, wobei dieser Diskussion eine Diskussion folgt, die die entsprechenden peralkylierten Oligopeptidsätze betrifft, unter Anwendung der Träger-gespaltenen (freien) Oligopeptidsätze und der peralkylierten Oligopeptidsätze als Veranschaulichung.
Ein komplexer Gemisch-Pool von an feste Träger gekuppelten Vorläufer-Oligopeptiden wird hier, wenn er einmal keine Schutzgruppen mehr enthält und von dem festen Träger abgespalten oder abgetrennt ist, als ein Oligopeptidsatz, ein Oligopeptidgemischsatz, durch eine ähnliche Bezeichnung oder einfacher als ein "Satz" bezeichnet. Getrennt von dem festen Träger besitzt ein Vorläufer-Oligopeptidsatz keinen Träger mehr und infolge des Verfahrens zu seiner Synthese ist ein derartiger Satz linear.
Ein Vorläufer-Oligopeptidgemischsatz umfasst ein Gemisch äquimolarer Mengen von Oligopeptidketten, die die gleiche Anzahl von Aminosäureresten in jeder Kette enthalten, d. h. sie besitzen die gleiche Kettenlänge von 2 bis etwa 10 Resten und besonders bevorzugt von etwa 5 bis etwa 8 Resten. Ähnlich ist ein entsprechender linearer Oligopeptidsatz ein Gemisch von peralkylierten Peptiden der gleichen Länge mit der gleichen Anzahl von 2 bis etwa 10 peralkylierten Resten und bevorzugt von 5 bis etwa 8 peralkylierten Resten. Das Amino-terminale Ende jedes der peralkylierten Oligopeptide im Satz ist eine quaternäre Alkylammonium-, Amino-, N-Alkylamino-, eine C&sub1;-C&sub1;&sub8;-Kohlenwasserstoffoylalkylamid- oder eine Pyroglytamoylgruppe und das Carboxy-terminale Ende ist eine Mono- oder Dialkylamid-, Alkylcarboxylat- oder eine Carboxylgruppe. Eine C&sub1;-C&sub7;-Alkylgruppe an dem N- oder C-terminalen Ende ist eine C&sub1;-C&sub7;-Alkylgruppe, die die gleiche wie die anderen in jedem Molekül vorhandenen C&sub1;-C&sub7;-Alkylgruppen sein kann oder von diesen verschieden sein kann.
Ein Vorläufer-Oligopeptidsatz besitzt einen oder mehrere (mindestens einen) vorbestimmte (besonders definierte) Aminosäurereste an der gleichen einen oder den gleichen mehreren (mindestens einen) vorbestimmten (besonders definierten) Position(en) der Oligopeptidkette und äquimolare Mengen von mindestens sechs verschiedenen Aminosäureresten, besonders bevorzugt von mindestes zehn verschiedenen Resten und insbesondere bevorzugt von etwa 15 bis etwa 20 verschiedenen Aminosäureresten an einer oder mehreren (mindestens einer) vorbestimmten (besonders definierten) anderen Position(en) der Kette, wobei der eine oder die mehreren vorbestimmte(n) Rest(e) einer der mindestens sechs verschiedenen Reste ist, die in äquimolaren Mengen vorhanden sind. Ist mehr als ein vorbestimmter Aminosäurerest an mehr als einer vorbestimmten Position der Kette vorhanden, können diese Reste die gleichen der verschiedenen sein. Ein entsprechender Oligopeptidsatz weist einen oder mehrere (mindestens einen) vorbestimmten peralkylierten Aminosäurerest an der gleichen einen oder den gleichen mehreren (mindestens einen) vorbestimmten Position(en) der peralkylierten Oligopeptidkette und äquimolare Mengen von mindestens sechs verschiedenen peralkylierten Aminosäureresten an einer oder mehreren (mindestens einer) vorbestimmten Position(en) der Kette auf.
Die Anzahl der Aminosäurereste für die äquimolaren Gemischpositionen und somit die Anzahl der verschiedenen Sätze beträgt mindestens sechs und besonders bevorzugt etwa zehn. Die Anzahl beträgt besonders bevorzugt etwa 15 bis etwa 20. Das Gleiche ist für die peralkylierten Aminosäurereste in einem peralkylierten Satz der Fall. Es ist häufig bevorzugt, 18 (t-Boc-synthestisierte) oder 19 (Fmoc- synthetisierte) Sätze für jede Bibliothek zu verwenden, d. h. es werden die natürlich vorkommenden 20 Aminosäuren verwendet, ausgenommen Cystein, das zur Vernetzung neigt und Tryptophan, das schwierig zu kuppeln ist und ebenfalls vernetzen kann. Tryptophan wird jedoch häufig an einer vorbestimmten endständigen Position sogar dann als der mindestens eine vorbestimmte Aminosäurerest eines Satzes verwendet, wenn man bedenkt, das er nicht einer der in äquimolaren Gemischpositionen verwendeten Reste ist.
Zudem kann in dem Fall, in dem es erwünscht ist, Tryptophan in einem Vorläufer- Oligopeptidsatz oder -Bibliothek zu verwenden, Tryptophan zu einem wachsenden, an eine feste Phase gebundenem Oligopeptid mittels Nα-t-BOC-N-Formyl- Tryptophan, das von Bachem, Inc., Torrence, CA kommerziell verfügbar ist, hinzugefügt werden. Die Verwendung der Formylgruppe schützt vor den vorstehend diskutierten Nebenreaktionen.
In dem Fall, in dem die Alkylierung nach der Abspaltung von dem Festträger erfolgt, kann die N-Formylgruppe während des üblichen Schritts der Entfernung der Seitenketten-Schutzgruppen durch die Zugabe eines Mercaptan-enthaltenden Reagenzes, wie Ethandithiol, während der hier diskutierten "Nieder HF"-Reaktion zur Entfernung der Schutzgruppen entfernt werden. Die N-Formylgruppe kann auch während der Entfernung der Seitenketten-Schutzgruppen erhalten bleiben, indem das Mercaptan-enthaltende Reagenz während dieses Schritts nicht zugegen ist, sodass in diesem Fall die N-Formylgruppe infolge der Alkylierung durch eine Alkylgruppe ersetzt wird. In dem Fall, in dem ein Vorläufer-Oligopeptidsatz alkyliert wird, während er noch an den festen Träger gebunden ist, wird die N-Formylgruppe ersetzt und das Aza-Stickstoffatom des Indolrings wird alkyliert.
Ein bevorzugter Oligopeptidgemischsatz enthält den einen oder die mehreren vorbestimmten Rest(e) an einer oder mehreren vorbestimmten Position(en), die ein Kettenende, besonders bevorzugt das N-terminale Ende, einschließen. Ein derartiger Satz schließt auch eine äquimolare Menge der mindestens sechs verschiedenen Aminosäurereste an einer oder mehreren vorbestimmten Kettenposition(en) ein und besonders bevorzugt sind jene Kettenpositionen einander benachbart. Bei der besonders bevorzugten Ausführung befinden sich diese benachbarten äquimolaren Gemischpositionen an einem Ende der Oligopeptidkette und dieses Ende ist besonders bevorzugt das C-terminale Ende. Das gleiche Gemisch von Resten ist bevorzugt an jeder vorbestimmten Position vorhanden.
In anderen Ausführungsformen sind die zwei N-terminalen Vorläufer-Reste vorbestimmte Reste innerhalb des Satzes, die drei N-terminalen Reste sind vorbestimmt oder die vier N-terminalen Reste sind vorbestimmt, wenn ein Satz sechs Reste lang oder länger ist, wobei die anderen Positionen durch äquimolare Gemische von Resten besetzt sind. Somit sind eine oder mehrere vorbestimmte Kettenposition(en) am Vorläufer des N-terminalen Endes durch vorbestimmte Reste besetzt und eine oder mehrere Kettenposition(en) am C-terminalen Ende ist bzw. sind durch ein äquimolares Gemisch von Resten besetzt.
In einem entsprechenden linearen peralkylierten Oligopeptidsatz ist es bevorzugt, dass sich der eine oder die mehreren (mindestens einer) peralkylierten Aminosäurerest(e) am N-terminalen Ende befindet(en), wobei die äquimolar peralkylierten Restgemischpositionen bevorzugt das C-terminale Ende einschließen. Es ist auch bevorzugt, dass die äquimolar peralkylierten Gemischpositionen zueinander benachbart sind.
Für einen Vorläufer-Satz, der sechs Reste lang oder länger ist, enthält ein beispielhafter Oligopeptidgemischsatz äquimolare Mengen von mindestens sechs verschiedenen Aminosäureresten an den Positionen 1, 2, 3, 4 oder 5 des Carboxyterminalen Endes der Oligopeptidkette (d. h. die Positionen 2, 3, 4, 5 und 6 des Amino-terminalen Endes eines 6-mers) als besonders definierte Position(en). Mindestens eine andere Position und vorzugsweise mehr als eine andere Position der Kette eines solchen Vorläufer-Oligopeptidgemischsatzes wird durch einen vorbestimmten Aminosäurerest besetzt, dessen Identität die gleiche wie an einer analogen Position in der Kette für jeden Satz ist und diese vorbestimmten Aminosäurereste befinden sich besonders bevorzugt an einer Amino-terminalen Position der Kette, einschließlich des Amino-terminalen Endes der Kette. Obwohl die Identität jedes vorbestimmten Restes an einer festgelegten Position in der Kette innerhalb des Satzes die gleiche ist, ist verständlich, dass jede derartige Kettenposition durch den gleichen oder einen sich zwischen den Sätzen unterscheidenden Rest besetzt ist.
Beispielhafte Vorläufer-Oligopeptidgemischsätze schließen ein Dipeptid, dessen eine Position vorbestimmt und dessen andere Gemisch ist; ein Tripeptid, dessen zwei Positionen durch vorbestimmte Reste besetzt sind und dessen andere Gemisch ist oder umgekehrt; ein Tetrapeptid, das eine vorbestimmte Position, z. B. Position 1 und drei Gemischpositionen aufweist; ein 5-mer, dessen erste Position definiert (vorbestimmt) ist und dessen verbleibende Positionen durch Gemische besetzt sind; ein 5-mer, dessen erste und fünfte Position definiert sind und dessen zweite, dritte und vierte Position durch Gemische besetzt sind; ein 6-mer, dessen erste beide Positionen vorbestimmt sind und dessen letzten vier Positionen durch Gemische besetzt sind; ein Hexamer, dessen erste drei Positionen vorbestimmt sind und dessen letzte drei Positionen durch Gemische besetzt sind; ein 7-mer, dessen erste Position und die Positionen 4-7 Gemische sind und dessen zweite und dritte Position vorbestimmt sind; ein 7-mer, dessen erste, dritte und vierte Position vorbestimmt sind und dessen verbleibende Positionen Gemische sind; ein 8-mer, dessen dritte und vierte Position vorbestimmt sind und dessen verbleibende Positionen durch Gemische von Resten besetzt sind; ein 8-mer, dessen erste vier Positionen vorbestimmt sind und dessen letzte vier Positionen Gemische sind; ein 9-mer, dessen vierte und fünfte Position vorbestimmt sind und dessen verbleibende Positionen Gemische sind; ein 10-mer dessen Positionen 3-7 vorbestimmt sind und dessen verbleibende Positionen durch Gemische besetzt sind; ein 10-mer, dessen erste Position vorbestimmt ist, wobei die übrigen Positionen durch Gemische besetzt werden; ein 10-mer, dessen Positionen 7-9 vorbestimmt sind, wobei die übrigen Positionen durch Gemische besetzt werden und ähnliche ein, worin jedes Gemisch ein äquimolares Gemisch aus einer Vielzahl von gekuppelten Aminosäureresten ist, die mindestens 6 und besonders bevorzugt mindestens etwa 10 und insbesondere bevorzugt etwa 15 bis etwa 20 verschiedene Aminosäurereste, wie vorstehend diskutiert, einschließen.
Für jeden der vorstehend genannten Sätze werden entsprechende lineare peralkylierte Oligopeptidsätze betrachtet.
Vorläufer-Oligopeptidgemischsätze, die zwei Kettenpositionen mit vorbestimmten Aminosäureresten und vier oder mehr Positionen mit äquimolaren Gemischen entlang der Kette enthalten, gehören zu denen, die bevorzugt sind. Für 6-mers weisen diese Sätze die nachstehend dargestellten Konfigurationen vorbestimmter einzelner Aminosäuren und äquimolarer Gemische auf:
Werden die zwanzig natürlich vorkommenden Aminosäuren verwendet, definiert jede dieser positionalen Konfigurationen 400 Gemischsätze. Es ist bevorzugt, dass die vorbestimmten Reste, O, sich in der Kette benachbart zueinander befinden.
Auch die Vorläufer-Oligopeptidgemischsätze, die drei vorbestimmte Positionen entlang der Kette und drei oder mehr äquimolare Gemischpositionen besitzen, sind bevorzugt. Sechs-mer der vorbestimmten, einzelnen Aminosäure und Gemische sind nachstehend dargestellt:
Wird eine bevorzugte Position in der Kette durch die zwanzig natürlichen Aminosäuren besetzt, definiert jede der vorstehend genannten positionalen Konfigurationen 8000 Oligopeptidgemischsätze. Es ist bevorzugt, dass die drei vorbestimmten Reste sich in der Kette zueinander benachbart befinden.
Werden beispielsweise die zwanzig natürlichen Aminosäuren verwendet, weist ein 6- mer-(Hexapeptid) Gemischsatz, in dem nur die erste Position durch einen vorbestimmten Rest besetzt ist, zwanzig Mitgliedersätze auf, von denen jeder 3,2 Millionen Oligopeptidmitglieder enthält. Ein Vorläufer-Satz, in dem die ersten beiden Positionen durch vorbestimmte Reste besetzt sind, schließt 400 Mitgliedersätze ein, von denen jeder 160 000 Oligopeptidmitglieder einschließt.
Die Diskussion bezüglich der Vorläufer-Oligopeptidsätze sollte für die entsprechenden Sätze von linearen peralkylierten Oligopeptiden gelten, so wie auch die vorstehend diskutierten Vorzüge für die entsprechenden peralkylierten Sätze gelten sollten.
In einer anderen besonders bevorzugten Ausführungsform umfasst jeder Vorläufer- Satz äquimolare Mengen von linearen Oligopeptidketten, die die gleiche Anzahl von zwei bis etwa zehn Aminosäureresten in jeder Kette enthalten. Jeder Satz und seine Mitglieder weisen nur einen einzigen vorbestimmten Aminosäurerest z. B., Ala, D-Val, Ser usw. an einer einzigen vorbestimmten Position der Oligopeptidkette, z. B. an den Positionen 1, 2, 3 ... 10, ausgehend vom Amino-terminalen Ende, auf.
Somit weist jede Vielzahl von Vorläufer-Sätzen äquimolare Mengen der gleichen der mindestens sechs verschiedenen Aminosäurereste an anderen Positionen als die der einzelnen vorbestimmten Aminosäure, die sich an der vorbestimmten Kettenposition befindet, auf und dieser einzelne Rest ist vorzugsweise einer der gleichen der mindestens sechs verschiedenen Aminosäurereste. Jede der Vielzahl von Sätzen unterscheidet sich von den anderen Sätzen durch die einzelne vorbestimmte Aminosäure an der vorbestimmten Kettenposition.
Die Positionen des vorbestimmten einzelnen Rests und die Positionen der äquimolaren Gemische von Resten bei Verwendung eines 6-mers als Beispiel sind nachstehend dargestellt.
Es gibt somit einen Satz von Vorläufer-Peptiden für jeden einzelnen vorbestimmten Aminosäurerest an Position 1. Da in den Gemischpositionen mindestens sechs Aminosäurereste verwendet werden und jeder von ihnen gleichfalls bevorzugt an Position 1 verwendet wird, beträgt die Anzahl der Pluralität der Position-1-Sätze sechs. Das gleiche trifft auf jede der anderen Positionen zu. Die Sätze, die anhand der Positionen der einzelnen vorbestimmten Aminosäurereste definiert sind, können als positionale Sätze bezeichnet werden.
Diese positionalen Sätze von 6-mers können auch infolge ihrer fünf Gemischpositionen als 5X-Sätze bezeichnet werden. In dem Fall, in dem die Peptide fünf Reste lang sind oder sie vier Gemischpositionen besitzen, können sie als 4X-Sätze bezeichnet werden usw..
Da es in dem 6-mer sechs Positionen gibt, beträgt die Anzahl der Bibliotheken der Vorläufer-Sätze für die vorstehend genannte Gruppe von positionalen Sätzen 6 mal 6 oder 36. Durch diese Bibliothek von Sätzen werden jedoch insgesamt 6&sup6; oder 46 656 Oligopeptide dargestellt. Die Verwendung von 20 Aminosäureresten für die Gemischpositionen eines 6-mers liefert 6 mal 20 oder 120 positionale Sätze und insgesamt 64 000 000 einzelne Oligopeptide.
Die einzelne vorbestimmte Aminosäure an der vorbestimmten Kettenposition wird in dem äquimolaren Gemisch von Aminosäureresten, die an diesen anderen Positionen vorhanden sind, verwendet. Ist dieser einzelne vorbestimmte Rest in den Gemischpositionen nicht vorhanden, verlieren die Ergebnisse des Bindungsassays einer Bibliothek von peralkylierten Oligopeptiden bezüglich dieses Restes etwas an Bedeutung.
Entsprechende lineare peralkylierte positionale Oligopeptid-Sätze weisen einen einzelnen vorbestimmten peralkylierten Aminosäurerest an einer einzelnen vorbestimmten Wiederholungseinheitsposition mit äquimolaren Mengen von mindestens sechs verschiedenen peralkylierten Aminosäureresten an den anderen Wiederholungseinheitspositionen der Ketten auf. Jeder der peralkylierten Sätze unterscheidet sich von den anderen peralkylierten Sätzen durch den vorbestimmten peralkylierten Aminosäurerest an der vorbestimmten Kettenposition.
Aus der vorangegangenen Diskussion sollte ersichtlich sein, dass auch eine Vielzahl von Sätzen von linearen peralkylierten Oligopeptidsätzen denkbar ist. Eine derartige Vielzahl von Sätzen wird als Bibliotheken von Sätzen bezeichnet. Jedes peralkylierte Oligopeptidmitglied jedes Satzes der Bibliothek weist einen oder mehrere vorbestimmte peralkylierte Aminosäurerest(e) an einer oder mehreren vorbestimmten Position(en) der peralkylierten Oligopeptidkette, die gleichen Enden und die gleiche Sequenz von äquimolaren Mengen der mindestens sechs verschiedenen peralkylierten Aminosäureresten an einer oder mehreren vorbestimmten Positionen in der peralkylierten Oligopeptidkette auf. Die Sätze der peralkylierten Oligopeptidsätze der Bibliothek unterscheiden sich darin, dass mindestens ein vorbestimmter peralkylierter Rest, der sich an einer vorbestimmten Position innerhalb jedes Satzes befindet, sich zwischen den Sätzen unterscheidet.
Beispielhafte Bibliotheken von Sätzen sind jene, die den vorstehend diskutierten 400 Oligopeptidsätzen entsprechen, deren erste zwei peralkylierte Oligopeptidpositionen jeweils durch einen der zwanzig natürlich vorkommenden peralkylierten Aminosäurereste besetzt sind und deren verbleibende Positionen 3-6 durch äquimolare Gemische besetzt sind. Jedes Mitglied dieser 400 Bibliotheken besitzt zwei vorbestimmte peralkylierte Aminosäureseitenketten (O&sub1; und O&sub2;) an einer oder mehreren vorbestimmten Position(en) (z. B. den ersten beiden N-terminalen Positionen) und äquimolare Mengen der mindestens sechs verschiedenen peralkylierten Reste an einer oder mehreren vorbestimmten Position(en) (z. B. die vier C-terminalen Positionen).
In einem anderen beispielhaften 6-mer-Satz von peralkylierten Oligopeptidsätzen sind die zwei ersten N-terminalen Positionen durch vorbestimmte peralkylierte Reste besetzt und die übrigen Positionen sind durch Gemische von peralkylierten Resten besetzt. In ähnlichen Sätzen von Sätzen sind die Positionen 1-3 durch spezifische vorbestimmte peralkylierte Reste besetzt, die vierte Position ist durch einen der in der Studie verwendeten peralkylierten Aminosäurereste besetzt und die Positionen 5 und 6 sind durch Gemische von peralkylierten Resten besetzt. In einem anderen Satz von Sätzen sind die ersten vier Positionen definiert, die fünfte ist durch jeden der verwendeten peralkylierten Aminosäurereste besetzt und die sechste Position ist ein Gemisch.
Die vorstehend genannte Bibliothek von Sätzen umfasst somit Satzmitglieder, von denen jedes ein Gemisch von äquimolaren Mengen von linearen peralkylierten Oligopeptidketten umfasst, das die gleiche Anzahl von peralkylierten Resten in jeder peralkylierten Oligopeptidkette enthält; d. h. hier besitzt jeder Satz eine Sequenzlänge sechs Widerholungseinheiten. In den Mitgliedern jedes Satzes sind die N-terminalen Positionen eins bis vier durch den gleichen vorbestimmten peralkylierten Aminosäurerest besetzt (die O&sub1;-, O&sub2;-, O&sub3;-Positionen, usw.) und die entsprechenden C- terminalen Positionen vier bis eins sind durch äquimolare Mengen der verwendeten, mindestens sechs verschiedenen peralkylierten Aminosäurereste besetzt (die äquimolaren Gemischpositionen, X). Die in jedem Satz verbleibende jeweilige Position ist die Position, die zwischen den vorstehend nummerierten auftritt und sie ist durch einen jeden der peralkylierten Aminosäurereste besetzt, der an dieser Position verwendet wird.
Die Anzahl der Sätze innerhalb einer Bibliothek von Sätzen wird durch die Anzahl der verschiedenen peralkylierten Aminosäurereste, die an der vorstehend genannten einzelnen verbleibenden Position verwendet werden, bestimmt. In dem Fall, in dem die zwanzig natürlich vorkommenden Aminosäurereste verwendet werden, enthält jeder Satz somit 20 Gemische. Die Anzahl der einzelnen peralkylierten Oligopeptide in jedem Gemisch eines Satzes wird bestimmt, indem die Anzahl der an jeder äquimolaren Gemischposition verwendeten peralkylierten Aminosäurereste multipliziert wird.
Die linearen peralkylierten positionalen Oligopeptidsätze von beispielhaften 6-mer- Sätzen (erhalten durch die Alkylierung der vorstehend diskutierten entsprechenden 120 6-mer Oligopeptidsätze), von denen jeder eine vorbestimmte Position und fünf Gemischpositionen enthält, kommen ebenfalls in Betracht und sie veranschaulichen eine besonders bevorzugte Bibliothek von peralkylierten Oligopeptidsätzen. Jeder Satz enthält hier wiederum eine Sequenzlänge von sechs Wiederholungseinheiten. Eine Position in jedem Satz ist durch einen der mindestens sechs vorbestimmten peralkylierten Aminosäureresten besetzt, die für diese Position verwendet werden. Die verbleibenden fünf Positionen in jedem Satz sind durch äquimolare Mengen der mindestens sechs verschiedenen peralkylierten Aminosäurereste besetzt. Die Anzahl der Mitglieder jedes Satzes wird wiederum durch die Anzahl der verwendeten vorbestimmten peralkylierten Reste bestimmt und die Anzahl der peralkylierten Oligopeptide in jedem Satz wird bestimmt, indem die Anzahl der an jeder äquimolaren Gemischposition verwendeten peralkylierten Aminosäurereste multipliziert wird.
Die vorstehend diskutierten Gemische mit äquimolaren Mengen an mindestens sechs verschiedenen peralkylierten Aminosäureresten, die die vier C-terminalen Positionen besetzen, bilden gleichfalls eine Bibliothek von Sätzen. Der Satz enthält hier eine Sequenzlänge von fünf bis zehn peralkylierten Resten. Der N-terminale peralkylierte Rest in jedem Satz ist durch einen jeden der an dieser Position (O) verwendeten vorbestimmten peralkylierten Aminosäurereste besetzt. Die Wiederholungseinheitssequenz zwischen dem nummerierten N-terminalen Ende und den vier C-terminalen Positionen ist in jeder Bibliothek von einer C-terminalen Richtung in eine N-terminale Richtung die gleiche.
Noch weitere Sätze von peralkylierten Oligopeptiden werden dem Fachmann aus der vorstehend genannten Diskussion ersichtlich und es muss hier nicht weiter darauf eingegangen werden.
Es ist gegenwärtig unmöglich, ein Gemisch zu bestimmen, das die hier beschriebene Komplexität aufweist. Ein Fachmann kann jedoch mittels der vorstehend diskutierten Syntheseverfahren einen gemischten Vorläufer-Oligopeptidsatz konstruieren, der nach der Hydrolyse und der Aminosäureanalyse Molverhältnisse von jeder Aminosäure zu einer anderen im Bereich von etwa 0,5 bis etwa 1,5 aufweist, d. h. das Molverhältnis eines Aminosäurerestes zu einem anderen beliebigen Rest beträgt 1 : 1 ± etwa 0,5, besonders bevorzugt beträgt dieses Verhältnis 1 : 1 ± etwa 0,25, wobei sich die Verhältnisse bis zu den linearen peralkylierten Oligopeptiden übertragen.
Jede Kette eines Satzes ist ebenfalls in einer äquimolaren Menge vorhanden und sie weist die gleiche Länge auf, (enthält die gleiche Anzahl von peralkylierten Resten) wie die anderen im Satz vorhandenen Ketten. Es ist unmöglich, diese Äquimolarität direkt zu messen. Indem jedoch jede Reaktion bis zur Vollständigkeit durchgeführt wird und die vorstehend diskutierte Äquimolarität beibehalten wird, kann man Ketten herstellen, die die gleiche Länge aufweisen und die in äquimolaren Mengen vorhanden sind.
Ein an einen festen Träger gebundener (-gekuppelter) Vorläufer-Oligopeptidsatz kann auch direkt unter Bildung eines an einen festen Träger-gebundenen peralkylierten Oligopeptidsatzes durch Anwendung des vorstehend diskutierten Reduktions- Verfahrens alkyliert werden. Die Alkylierung des an einen festen Träger-gebundenen Peptids erleichtert die Reinigung des entstehenden Satzes von den unerwünschten Reaktionsprodukten.
Ein derartiger Träger gebundener Satz kann anschließend in einem hier im nachfolgenden diskutierten Assay zur Bindung an einen löslichen Reaktor wie einem Antikörper oder einem externen Zellrezeptor, wie ELAM-1, verwendet werden, er ist jedoch für allgemeine Assays für Zellrezeptoren nicht so geeignet wie ein freier Satz.
Es kann auch sinnvoll sein, dass ein peralkylierter Oligopeptidsatz eine Markierung enthält. Eine radioaktive Markierung, wie ³H, kann als Teil einer N-terminalen Acylgruppe jedes peralkylierten Oligopeptidmitglieds verwendet werden.
Andere betrachtete Markierungen schließen Chromophore, wie die 2,4-Dinitrophenyl- oder 4-Nitrophenylgruppen, und fluoreszierende Moleküle, wie eine Dansylgruppe, die an eine N-terminale Aminogruppe eines peralkylierten Oligopeptids mittels Dansylchlorid (5-Dimethylamino-1-naphthalinsulfonylchlorid) gekuppelt sein kann, ein.
Eine 2,4 Dinitrophenyl- oder 4-Nitrophenylgruppe kann mittels eines geeigneten Halogenderivats, wie eine Chlor- oder Fluorgruppe, an eine N-terminale Aminogruppe eines peralkylierten Oligopeptids gekuppelt werden. Die entstehenden Nitrophenylanilinderivate weisen eine gelbe bis gelb/orange Farbe auf, die leicht wahrgenommen werden kann.
Es ist auch denkbar, dass eine photoreaktive Markierung an einen peralkylierten Oligopeptidsatz gekuppelt sein kann, insbesondere an das N-terminale Ende. Beispielhafte photoreaktive Markierungen schließen die 4-Azidobenzoyl- und 4- Azidosalicylgruppen ein, die als N-terminale Amide vorliegen und durch Reaktion des N-Hydroxysuccinimidesters von jeder Gruppe mit der freien N-terminalen Aminogruppe hergestellt wurden. Jeder der Ester ist von Sigma Co., St. Louis, MO, kommerziell verfügbar.

Assay-Verfahren und peralkylierte Oligopeptide

Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Bestimmung der Sequenz eines linearen peralkylierten Oligopeptidliganden, der vorzugsweise (optimal) und spezifisch an den Akzeptor (Rezeptor) bindet. Ein derartiges Verfahren kann mit den Sätzen, die an einen für die Synthese verwendeten festen Träger gekuppelt sind, durchgeführt werden oder mit den Sätzen die nicht an einen für die Synthese verwendeten Träger gekuppelt sind.

In Übereinstimmung mit einem derartigen Verfahren

(a) wird eine Bibliothek von Sätzen von linearen peralkylierten Oligopeptiden bereitgestellt, in denen jeder Satz ein Gemisch von äquimolaren Mengen von linearen C&sub1;- C&sub7;-Alkyl-peralkylierten Oligopeptidkettenmitgliedern umfasst, das die gleiche Anzahl von zwei bis etwa zehn peralkylierten Aminosäureresten in jeder peralkylierten Oligopeptidkette enthält. Das Peptidylaminostickstoffatom jedes peralkylierten Aminosäurerests, ausgenommen Prolin, ist mit einer C&sub1;-C&sub7;-Alkylgruppe alkyliert. Wie vorstehend diskutiert, weisen die Kettenmitglieder von jedem Satz einen oder mehrere (mindestens einen) von mindestens sechs verschiedenen vorbestimmten peralkylierten Aminosäureresten an einer oder mehreren (mindestens einer) vorbestimmten Position(en) der peralkylierten Oligopeptidkette auf und jeder Satz weist äquimolare Mengen von mindestens sechs verschiedenen peralkylierten Aminosäureresten an der gleichen einen oder den gleichen mehreren (mindestens einen) anderen Position(en) der peralkylierten Oligopeptidkette auf. Es werden vorzugsweise die gleichen der mindestens sechs peralkylierten Reste an den Gemischpositionen und der vorbestimmten Position verwendet. In einigen Fällen sind die eine oder mehreren Position(en) dieser Sätze jedoch durch peralkylierte Reste besetzt, die nicht in den Gemischpositionen verwendet werden. Das Amino-terminale Ende jedes dieser peralkylierten Oligopeptide in dem Satz ist eine quaternäre Alkylammonium-, Amino-, N-Alkylamino- oder eine C&sub1;-C&sub1;&sub8;-Kohlenwasserstoffoylamidgruppe und das Carboxy-terminale Ende ist eine Mono- oder Dialkylamid-, Alkylcarboxylat- oder Carboxylgruppe. Eine C&sub1;-C&sub7;-Alkylgruppe an dem N- oder C-terminalen Ende ist eine C&sub1;- C&sub7;- Alkylgruppe, die die gleiche wie die anderen in jedem Molekül vorhandenen C&sub1;- C&sub7;-Alkylgruppen sein kann oder sie kann von diesen verschieden sein. Die Sätze der Bibliothek unterscheiden sich darin, dass der eine oder die mehreren (mindestens eine) vorbestimmte(n) peralkylierte(n) Aminosäurerest(e), die sich an der einen oder den mehreren (mindestens einen) vorbestimmten Kettenposition(en) innerhalb des Satzes befinden, sich zwischen den Sätzen unterscheiden.
(b) Jeder Satz der Bibliothek von Sätzen wird mit dem Akzeptor gesondert in einem wässrigen Medium mit einer festgelegten Konzentration von etwa 0,1 Milligramm (mg) pro Liter zu etwa 100 Gramm pro Liter und vorzugsweise von etwa 1 mg pro Liter zu etwa 100 g pro Liter und bevorzugter von etwa 100 mg pro Liter zu etwa 20 Gramm pro Liter angemischt. Die Bindung jedes Satzes an den Akzeptor wird gesondert untersucht und der eine oder die mehreren Sätze der Vielzahl von Sätzen, der bzw. die eine optimale oder bevorzugte, spezifische Bindung im Vergleich zu den anderen untersuchten Sätzen aufweist/aufweisen, wird bestimmt, wodurch der eine oder die mehreren peralkylierten Sätze identifiziert werden, die eine optimale oder bevorzugte Bindung an die eine oder die mehreren vorbestimmten Positionen bereitstellen.
(c) Eine zweite Bibliothek von Sätzen von linearen peralkylierten Oligopeptiden wird bereitgestellt, in denen jeder Satz ein Gemisch äquimolarer Mengen der C&sub1;-C&sub7;-Alkylperalkylierten linearen Oligopeptidkettenmitglieder umfasst, das die gleiche Anzahl von zwei bis etwa zehn peralkylierten Resten in jeder peralkylierten Oligopeptidkette (die die gleiche Kettenlänge aufweisen) wie die Ketten der erst genannten Bibliothek von Sätzen enthält. Das Peptidylaminostickstoffatom von jedem peralkylierten Aminosäurerest, ausgenommen Prolin, ist mit einer C&sub1;-C&sub7;-Alkylgruppe alkyliert. Die Mitglieder jeder zweiten Bibliothek von Sätzen enthalten den einen oder die mehreren peralkylierten Aminosäurereste der ersten Bibliothek von Sätzen, die in den erst genannten Sätzen als eine optimale oder bevorzugte, spezifische Bindung in der einen oder den mehreren vorbestimmten besetzten Kettenpositionen aufweisend identifiziert wurden und sie weisen einen von mindestens sechs verschiedenen vorbestimmten peralkylierten Aminosäureresten an einer anderen vorzugsweise benachbarten vorbestimmten Position der peralkylierten Oligopeptidkette auf, die sich von der Position der einen oder mehreren vorbestimmten Positionen der erst genannten Bibliothek von Sätzen unterscheidet. Jede der zweiten Bibliothek von Sätzen besitzt äquimolare Mengen der gleichen von mindestens sechs verschiedenen peralkylierten Aminosäureresten wie die erst genannten Sätze an der gleichen einen oder den gleichen mehreren anderen Position(en) der alkylierten Oligopeptidkette, die nicht durch den einen oder die mehreren identifizierten oder vorbestimmten peralkylierten Rest(e) besetzt sind. Die Amino- und Carboxyterminalen Enden der peralkylierten Oligopeptide der zweiten Bibliothek von Sätzen sind die gleichen wie die der erst genannten Sätze. Die zweite Bibliothek von Sätzen unterscheidet sich somit von der ersten Bibliothek von Sätzen darin, dass mindestens zwei Kettenpositionen innerhalb der zweiten Satz-Bibliothek identifiziert und vorbestimmt (definiert) sind und dass die zweite Satz-Bibliothek eine Gemischposition weniger als die erste Bibliothek enthält.
(d) Jeder Satz aus der zweiten Bibliothek von Sätzen (von Schritt c) wird mit dem Akzeptor gesondert in einem wässrigen Medium mit einer Konzentration von etwa 0,1 Milligramm pro Liter bis etwa 100 Gramm pro Liter und vorzugsweise etwa 1 Milligramm pro Liter bis etwa 100 Gramm pro Liter angemischt. Die Bindung jedes zweiten Bibliothek-Satzes an den Akzeptor wird gesondert untersucht und der eine oder die mehreren Sätze, die eine optimale oder bevorzugte, spezifische Bindung im Vergleich zu den anderen untersuchten Sätzen zeigen, werden wie vorstehend diskutiert bestimmt, sodass ein anderer peralkylierter Rest, der eine optimale oder bevorzugte Bindung aufweist, bestimmt wird.
(e) Die Schritte (c) und (d) können mit weiteren Bibliotheken von Sätzen, z. B. einer dritten, vierten, fünften usw., wiederholt werden bis die erwünschte Anzahl von Satz- Bibliotheken, z. B. zwei bis sieben (im Allgemeinen mindestens drei für ein 3-mer) untersucht worden sind, wobei jede dieser Satz-Bibliotheken sich von der unmittelbar vorhergehenden Bibliothek darin unterscheidet, dass sie eine definierte (vorbestimmte) Position mehr besitzen, die durch einen von mindestens sechs vorbestimmten peralkylierten Resten besetzt ist und eine vorbestimmte Wiederholungseinheitsposition weniger, die durch äquimolare Mengen von mindestens sechs peralkylierten Resten besetzt ist. Die Durchführung der Schritte (c) und (d) kann alternativ wiederholt werden, bis die letzte untersuchte Bibliothek keinen Anstieg in der bevorzugten, spezifischen Bindung im Vergleich zu dem unmittelbar vorausgegangenen wiederholten Assay aufweist. Ist dies der Fall, kann die Sequenz bestimmt werden. Im Allgemeinen wird das Verfahren jedoch fortgesetzt und einzelne peralkylierte Oligopeptide werden hergestellt und wie hier im nachfolgenden diskutiert untersucht. Die besondere Position, die untersucht wird, kann beispielsweise eine redundante Position innerhalb einer längeren Sequenz sein, deren andere bislang undefinierte Positionen, sind sie einmal definiert, für die Bindung benötigt werden. Eine bessere Bindung oder ein anderweitig synthetisch geeigneter Rest wird anschließend an der Position verwendet, die keine bevorzugte Bindung aufwies.
Jede dieser weiteren Bibliotheken von Sätzen von linearen peralkylierten Oligopeptiden von (e) umfasst ein Gemisch von äquimolaren Mengen von linearen C&sub1;-C&sub7;- Alkyl-peralkylierten Oligopeptidkettenmitgliedern, das gleiche Anzahl von zwei bis etwa zehn peralkylierten Aminosäureresten in jeder peralkylierten Oligopeptidkette wie in den Ketten der erst genannten Bibliothek von Sätzen enthält. Das Peptidylaminostickstoffatom von jedem peralkylierten Aminosäurerest, ausgenommen Prolin, ist mit einer C&sub1;-C&sub7;-Alkylgruppe alkyliert. Die Kettenmitglieder jeder weiteren Bibliothek von Sätzen enthalten die peralkylierten Aminosäurereste in den peralkylierten Oligopeptidkettenpositionen, die eine bevorzugte, spezifische Bindung in der unmittelbar vorher verwendeten Bibliothek von Sätzen aufweisen und auch einen von mindestens sechs verschiedenen vorbestimmten peralkylierten Aminosäureresten an einer anderen benachbarten vorbestimmten Position der peralkylierten Oligopeptidkette, die sich von den Positionen der identifizierten peralkylierten Aminosäurereste der unmittelbar vorher verwendeten Bibliothek von Sätzen unterscheiden. Jede nachfolgende Bibliothek von Sätzen enthält somit jeden der vorher identifizierten peralkylierten Reste in den peralkylierten Oligopeptidkettenpositionen, die eine bevorzugte, spezifische Bindung aufweisen, als auch einen bevorzugten benachbarten vorbestimmten peralkylierten Rest an einer Position in der peralkylierten Oligopeptidkette, die vorher durch eine äquimolare Gemischposition besetzt war. Jeder dieser weiteren Bibliothek-Mitgliedersätze weist auch die gleichen Enden wie die erst genannten Sätze auf und er weist äquimolare Mengen der mindestens sechs verschiedenen peralkylierten Aminosäurereste der erst genannten Sätze an der gleichen einen oder den gleichen mehreren Position(en) der peralkylierten Oligopeptidkette auf, die nicht durch identifizierte peralkylierte Aminosäurereste oder die vorbestimmten peralkylierten Aminosäurereste besetzt sind.
Wie vorstehend bemerkt, ist es bevorzugt, dass die eine oder die mehreren vorbestimmten Position(en) der Bibliotheken von (a) sich an dem einen oder dem anderen Ende der peralkylierten Oligopeptidkette, besonders bevorzugt am N-terminalen Ende, befinden. Es ist auch bevorzugt, dass jede neue bevorzugte Position in den nachfolgend verwendeten Sätzen eine Position ist, die der Position benachbart ist, deren peralkylierter Aminosäurerest der ist, der in dem unmittelbar vorangegangenen Assay identifiziert wurde. Somit wird in dem Maße, in dem jeder Schritt (c) und (d) mit neuen Bibliotheken von Sätzen wiederholt wird, eine weitere Position in der Sequenz identifiziert und die Sätze enthalten eine Gemischposition weniger.
Bei der üblichen Ausführung werden, wenn die bevorzugten oder optimal, spezifisch bindenden peralkylierten Aminosäurereste für alle, außer der letzten Position, bestimmt worden sind, mindestens sechs einzelne lineare peralkylierte Oligopeptidketten bereitgestellt. Diese Moleküle enthalten die gleiche Anzahl von C&sub1;-C&sub7;-Alkylperalkylierten Resten und die gleichen Enden wie die Ketten der erst genannten Bibliothek von Sätzen und sie enthalten die peralkylierten Aminosäurereste in der durch die vorstehend genannten Assays bestimmten Sequenz, d. h. die Moleküle enthalten jeden der identifizierten peralkylierten Reste an ihren Positionen, die eine bevorzugte Bindung in den vorherigen Assays aufwiesen und jeweils einen der mindestens sechs peralkylierten Aminosäurereste, die in der Endposition verwendet werden.
Diese mindestens sechs peralkylierten Oligopeptide werden mit dem Akzeptor gesondert angemischt und wie vorstehend diskutiert, bezüglich der bevorzugten oder optimalen, spezifischen Bindung untersucht. Die Bestimmung des peralkylierten Rests, der bei der Auswertung dieser Gruppe von Assays im Vergleich zu den anderen untersuchten peralkylierten Resten eine bevorzugte, spezifische Bindung aufweist, liefert den letzten peralkylierten Rest der Sequenz und damit eine bevorzugte Bindungssequenz für das lineare peralkylierte Oligopeptid.
In der üblichen Praxis wird eine peralkylierte Oligopeptidlänge, d. h. die Anzahl der peralkylierten Reste in der Kette, ausgewählt und eine vollständige Sequenz eines bevorzugt, spezifisch bindenden peralkylierten Oligopeptids bestimmt. In einigen Bereichen steigt die bevorzugte spezifische Bindung, wie vorstehend bemerkt, nicht an, wenn eine weitere Bibliothek bestimmt wird; d. h. wenn anstelle der Gemische von peralkylierten Resten zusätzliche bekannte peralkylierte Reste verwendet werden. Im letzten Fall wird somit die bevorzugte, spezifische Bindungssequenz bestimmt und es ist nicht notwendig, die mindestens sechs einzelnen peralkylierten Reste, wie vorstehend diskutiert, zu verwenden. Steigt bei der Verwendung und Untersuchung jeder weiteren Bibliothek die bevorzugte spezifische Bindung an, werden die vorstehend diskutierten einzelnen peralkylierten Oligopeptide hergestellt und verwendet.
Das vorstehend genannte Assayverfahren ist besonders bei Sätzen geeignet, die aus den vorstehend diskutierten 400 entsprechenden 6-mer Oligopeptidsätzen, in denen zwei Positionen eine bekannte Sequenz aufweisen, hergestellt werden. Nach der Durchführung des ersten Assays werden somit die zwei N-terminalen bevorzugt, spezifisch bindenden peralkylierten Reste bestimmt. In Schritt (d) wird die dritte Position hinsichtlich der bevorzugten, spezifischen Bindung gescannt. Dieses Verfahren wird fortgesetzt bis die Sequenz der fünf N-terminalen peralkylierten Reste bekannt ist. Anschließend werden üblicherweise einzelne peralkylierte Oligopeptide verwendet, um die Bestimmung der gesamten bevorzugten, spezifischen Bindungssequenz für die letzte Position dieses beispielhaften 6-mers abzuschließen.
Es sind auch Sätze und Satz-Bibliotheken bevorzugt, die 5-10 peralkylierte Reste lang sind und deren entsprechenden vier C-terminalen Positionen durch Gemische peralkylierter Aminosäureseitenketten besetzt sind und deren entsprechende Aminoterminale Positionen durch vorbestimmte peralkylierte Reste besetzt sind. Jeder vorstehend genannte Satz kann aus einer einzelnen Präparation von an feste Träger gekuppelten 4-mer-Oligopeptidgemischen hergestellt werden, an die ein oder mehrere vorbestimmte Aminosäurereste gekuppelt, anschließend peralkyliert und nach jedem Akzeptor-Bindungsassay abgespalten werden.
Es können beispielsweise, beginnend mit einem Ansatz eines an feste Träger gekuppelten 4-mer-Oligopeptidgemisches, dessen Positionen alle äquimolare Gemische sind, durch die gesonderte Kupplung von jeder der zwanzig natürlichen Aminosäuren an einen gesonderten Teil des Ansatzes zwanzig Gemische hergestellt werden. Nach der Peralkylierung des so hergestellten und abgespaltenen, an einen festen Träger gekuppelten Vorläufer-Gemischpools wird ein Bindungsassay mit einem monoklonalen Antikörper durchgeführt, um die bevorzugte Bindung zu bestimmen. Anschließend wird eine andere Bibliothek von zwanzig Sätzen unter Verwendung des gleichen 4-mer-Ansatzes mit einem optimalen Bindungsrest (nach der Peralkylierung) an der Position 2 in der Sequenz, ausgehend von dem entsprechenden N- terminalen Ende, und jeden der zwanzig Reste in der Position 1 hergestellt. Nach der Peralkylierung und der Abspaltung wird erneut das Bindungsassay durchgeführt und die optimale Bindung wird bestimmt. Dieses Verfahren wird fortgeführt bis eine vorbestimmte peralkylierte Oligopeptidsequenz einer erwünschten Länge vollständig ist. Die Verwendung von C-terminalen Gemischpositionen, die während der gesamten Gemische verbleiben, verbessert die Löslichkeit des Satzes.
Ein besonders bevorzugtes Assayverfahren nutzt Bibliothek-Sätze, die aus den positionalen Vorläufer-Oligopeptidsätzen, wie aus der vorstehend diskutierten Bibliothek von 120 6-mer-Sätzen hergestellt wurden. Hier
(a) wird eine Bibliothek von Sätzen linearer peralkylierter Aminosäureresteenthaltender Oligopeptide bereitgestellt, in der jede Bibliothek ein Gemisch von äquimolaren Mengen von C&sub1;-C&sub7;-Alkyl-peralkylierten Oligopeptidketten umfasst, die die gleiche Anzahl von zwei bis zehn peralkylierten Resten in jeder peralkylierten Oligopeptidkette enthalten. Wie vorstehend diskutiert, weisen die Mitglieder jedes Satzes der Bibliothek einen von mindestens sechs verschiedenen vorbestimmten peralkylierten Aminosäureresten an einer einzigen vorbestimmten Wiederholungseinheitsposition der peralkylierten Oligopeptidkette und N- und C-terminale Enden, wie vorstehend diskutiert, auf. Das Peptidylamidstickstoffatom von jedem peralkylierten Aminosäurerest, ausgenommen Prolin, ist mit einer C&sub1;-C&sub7;-Alkylgruppe alkyliert. Jeder Satz weist äquimolare Mengen dieser gleichen mindestens sechs verschiedenen peralkylierten Aminosäurereste an den gleichen anderen Positionen der peralkylierten Oligopeptidkette auf. So wie es bei allen hier diskutierten Sätzen der Fall ist, ist es bevorzugt, etwa 10 oder mehr und besonders bevorzugt, etwa 15 bis etwa 20 verschiedene peralkylierte Aminosäurereste zu verwenden. Eine C&sub1;-C&sub7;- Alkylgruppe an dem N- oder C-terminalen Ende ist eine C&sub1;-C&sub7;-Alkylgruppe, die die gleiche wie die anderen, in jedem Molekül vorhandenen C&sub1;-C&sub7;-Alkylgruppen sein kann oder sie kann von diesen verschieden sein. Die Sätze der Bibliothek unterscheiden sich darin, dass der einzige vorbestimmte peralkylierte Aminosäurerest, der sich an einer einzigen vorbestimmten Kettenposition innerhalb jedes Satzes befindet, sich zwischen den Sätzen unterscheidet.
(b) Jeder Satz der Bibliothek von Sätzen wird mit dem Akzeptor gesondert in einem wässrigen Medium mit einer festgelegten Konzentration von etwa 0,1 Milligramm pro Liter bis etwa 100 Gramm pro Liter und vorzugsweise von etwa 1 mg pro Liter bis etwa 100 g pro Liter angemischt. Die Bindung jedes Satzes an den Akzeptor wird gesondert untersucht und der eine oder die mehreren Sätze der Bibliothek von Sätzen der bzw. die eine bevorzugte, spezifische Bindung im Vergleich zu den anderen untersuchten Sätzen aufweisen, werden bestimmt, wodurch der eine oder die mehreren peralkylierten Reste identifiziert werden, der bzw. die eine bevorzugte Bindung an die einzelne vorbestimmte Position aufweisen.
(c) Eine zweite Bibliothek von Sätzen von linearen peralkylierten Oligopeptiden wird bereitgestellt, in denen jeder Satz ein Gemisch äquimolarer Mengen von linearen C&sub1;- C&sub7;-Alkyl-peralkylierten linearen Oligopeptidketten umfasst, das die gleiche Anzahl von zwei bis zehn peralkylierten Resten in jeder peralkylierten Oligopeptidkette (die die gleiche Kettenlänge besitzt) wie die erst genannte Bibliothek von Sätzen enthält.
Das Peptidylamidstickstoffatom jedes peralkylierten Aminosäurerests, ausgenommen Prolin, ist mit einer C&sub1;-C&sub7;-Alkylgruppe alkyliert. Die Mitglieder jeder zweiten Bibliothek von Sätzen weisen die gleichen N- und C-terminalen Enden wie die Kettenmitglieder des ersten Bibliothek-Satzes auf und sie weisen einen der gleichen von mindestens sechs verschiedenen vorbestimmten peralkylierten Aminosäurereste der erst genannten Sätze an einer anderen einzelnen vorbestimmten Position der peralkylierten Oligopeptidkette auf, die sich von der Position der erst genannten Bibliothek von Sätzen unterscheidet und jeder dieser Sätze weist äquimolare Mengen der gleichen von mindestens sechs verschiedenen peralkylierten Aminosäurereste an den gleichen anderen Positionen der peralkylierten Oligopeptidkette auf. Die zweite Bibliothek von Sätzen unterscheidet sich von der ersten Bibliothek von Sätzen darin, dass die einzelne vorbestimmte Kettenposition innerhalb jeden Satzes, die den gleichen von mindestens sechs verschiedenen peralkylierten Resten enthält, zwischen den Bibliotheken unterschiedlich ist.
Gesondert betrachtet, weist die zweite Bibliothek von Sätzen die gleiche Länge und die gleichen Enden wie die erste Bibliothek auf und sie weist äquimolare Mengen der mindestens sechs verschiedenen peralkylierten Reste an der peralkylierten Kettenposition auf, die durch den einzelnen peralkylierten Rest in der erst genannten Satz- Bibliothek besetzt ist und einen einzelnen peralkylierten Rest in einer Position, die in den erst genannten Bibliothek-Sätzen durch äquimolare Mengen von peralkylierten Resten besetzt ist. Die erst genannte Bibliothek von Sätzen kann beispielsweise ihren einzelnen einen von mindestens sechs verschiedenen vorbestimmten peralkylierten Aminosäureresten an Position 1 aufweisen, während die anderen Positionen durch Gemische besetzt sind, wohingegen die zweite Bibliothek von Sätzen ihre einzelnen vorbestimmten peralkylierten Aminosäurereste an jeder beliebigen Position von 2-10 und äquimolare Mengen der mindestens sechs verschiedenen peralkylierten Aminosäurereste an Position 1 und den anderen verbleibenden Kettenpositionen, die nicht durch den einzelnen peralkylierten Rest besetzt sind, aufweist.
(d) Jeder Satz der zweiten Bibliothek von Sätzen (von Schritt c) wird mit dem Akzeptor gesondert in einem wässrigen Medium mit einer Konzentration von etwa 0,1 Milligramm pro Liter zu etwa 100 g pro Liter und vorzugsweise von etwa 1 Milligramm pro Liter zu etwa 100 Gramm pro Liter angemischt. Die Bindung jedes zweiten Satzes an den Akzeptor wird gesondert untersucht und der eine oder die mehreren Sätze dieser zweiten Bibliothek von Sätzen, die im Vergleich zu den anderen untersuchten Sätzen eine bevorzugte, spezifische Bindung aufweisen, wird bestimmt, wodurch ein peralkylierter Aminosäurerest identifiziert wird, der eine bevorzugte Bindung an die vorbestimmte Position in der peralkylierten Oligopeptidkette liefert.
(e) Die Schritte (c) und (d) werden mit den dritten, vierten, fünften usw., bis zur Anzahl der Reste in der Kettenlänge, Bibliotheken von Sätzen, wiederholt bis die erwünschte Anzahl von Satz-Bibliotheken untersucht worden ist, wobei sich jede dieser Satz-Bibliotheken von den anderen Bibliotheken durch die Position unterscheidet, die den einen der mindestens sechs verschiedenen peralkylierten Aminosäurereste enthält. Es sollte auch klar sein, dass in dem Fall, in dem peralkylierte Dipeptide verwendet werden, das Verfahren beendet ist, sodass die Schritte (c) und (d) null mal wiederholt werden können.
Die Identität und Position des C&sub1;-C&sub7;-Alkyl-peralkylierten Aminosäurerestes von jeweils einem oder mehreren Sätzen, die eine bevorzugte oder optimale, spezifische Bindung liefern, die für jede Bibliothek von Sätzen so bestimmt wurde, liefern die Identität einer peralkylierten Restsequenz für den Liganden, der bevorzugt, spezifisch an den Akzeptor bindet. Da somit jede der Bibliotheken der untersuchten positionalen Sätze die Identität einen der peralkylierten Reste liefert, der eine erhöhte Bindung für diese Position liefert und da es eine äquimolare Darstellung aller der anderen peralkylierten Reste an den Gemischpositionen gibt, liefert die Kenntnis der Identität und der Position der peralkylierten Reste, die eine erhöhte Bindung für die verwendeten Positionen aufweisen, eine Sequenz für einen Liganden oder ein Donor-peralkyliertes Oligopeptid, das eine erhöhte Bindung liefert.
Es sollte selbstverständlich sein, dass die Bestimmung der Identität und der Position von zwei peralkylierten Resten, die eine stark erhöhte Bindung liefern, äußerst nützlich sein kann, wenn vollständig peralkylierte Peptide hergestellt werden, da einige wenige solcher peralkylierten Peptide hergestellt werden müssen. Die Kenntnis von drei Identitäten und Positionen ist besonders bevorzugt und die Kenntnis von vier ist noch mehr bevorzugt, usw..
Das vorstehend genannte Verfahren wird als Scanning-Verfahren bezeichnet, da die peralkylierten Reste an jeder Position einer Sequenz einzeln gescannt werden.
Es ist bevorzugt, dass die einzelnen vorbestimmten, sich wiederholenden Einheitspositionen als Gruppe betrachtet, zueinander benachbart sind. Es werden somit beispielhafte Sätze für die Positionen 1-3 eines Trimers oder die Positionen 2-6 eines Hexamers verwendet oder es werden die Positionen 1-6 eines peralkylierten Oligopeptiddecamers im Vergleich zu den Positionen 1, 2 und 4-8 eines Octamers verwendet.
Es sollte selbstverständlich sein, dass, obwohl es bevorzugt ist, zueinander benachbarte Wiederholungseinheitspositionen zu scannen, man nicht die Vielzahl der Sätze in jeder beliebigen Ordnung bezüglich der Position nutzen muss. Man muss somit nicht, obwohl zweckmäßig, die Bibliotheken von Sätzen, die den einen der mindestens sechs verschiedenen vorbestimmten peralkylierten Rest an Position 1 enthalten, gefolgt von den Bibliotheken mit der einen der mindestens sechs verschiedenen vorbestimmten Seitenketten an Position 2, usw. verwenden.
Zudem besteht keine Notwendigkeit, die Bibliotheken von positionalen Sätzen in beliebiger Ordnung zu nutzen, es ist auch nicht notwendig, eine einzelne Bibliothek von positionalen Sätzen, gefolgt von einer anderen, gefolgt von einer anderen, usw. zu nutzen. Man kann stattdessen die einzelnen Sätze in beliebiger Reihenfolge nutzen, da die Position und Identität des einen einzelnen der mindestens sechs verschiedenen vorbestimmten peralkylierten Aminosäurereste jeder Bibliothek bekannt ist. Dies steht im Gegensatz zu dem vorstehend diskutierten Verfahren, in dem es bevorzugt ist, einen vorbestimmten peralkylierten Rest, der einem identifizierten peralkylierten Rest benachbart ist, zu verwenden.
Es kommt somit auch ein allgemeineres Scanning-Verfahren in Betracht. Hier wird (a) eine Bibliothek oder Vielzahl von Sätzen von linearen peralkylierten Oligopeptiden bereitgestellt. Jeder Satz dieser Bibliothek oder Vielzahl von Sätzen umfasst ein Gemisch von äquimolaren Mengen von linearen C&sub1;-C&sub7;-Alkyl-peralkylierten Oligopeptidketten, die die gleiche Anzahl von zwei bis etwa zehn peralkylierten Resten in jeder Kette enthalten und die gleichen, wie vorstehend diskutierten N- und C- terminalen Enden aufweisen. Das Peptidylamidstickstoffatom jedes peralkylierten Aminosäurerests, ausgenommen Prolin, ist mit einer C&sub1;-C&sub7;-Alkylgruppe alkyliert. Jeder Satz weist einen einzelnen von mindestens sechs verschiedenen vorbestimmten Aminosäureresten an einer einzelnen vorbestimmten Position der peralkylierten Oligopeptidkette auf und weist äquimolare Mengen von jeder der gleichen von mindestens sechs verschiedenen peralkylierten Aminosäureresten an den gleichen anderen Positionen der peralkylierten Oligopeptidkette auf. Eine C&sub1;-C&sub7;-Alkylgruppe an dem N- oder C-terminalen Ende ist eine C&sub1;-C&sub7;-Alkylgruppe, die die gleiche wie die anderen, in jedem Molekül vorhandenen C&sub1;-C&sub7;-Alkylgruppen sein kann oder sie kann von diesen verschieden sein. Jeder Satz unterscheidet sich von den anderen Sätzen darin, dass die Identität und Kettenposition des einen von mindestens sechs verschiedenen vorbestimmten peralkylierten Aminosäureresten, der sich an der einzelnen vorbestimmten Kettenposition innerhalb jedes Satzes befindet, zwischen den Sätzen unterschiedlich ist. Die maximale Anzahl der bereitgestellten Sätze ist gleich dem Produkt aus der Anzahl der verschiedenen Aminosäurereste, die sich an den vorbestimmten Kettenpositionen befinden, die den einen der mindestens sechs verschiedenen Reste enthalten, mal der Anzahl der verschiedenen Kettenpositionen, die den einen der mindestens sechs verschiedenen vorbestimmten peralkylierten Aminosäurereste enthalten.
(b) Jeder Satz wird mit dem Akzeptor gesondert in einem wässrigen Medium mit einer festgelegten Konzentration von etwa 0,1 Milligramm pro Liter zu etwa 100 Gramm pro Liter und vorzugsweise von etwa 1 Milligramm pro Liter zu etwa 100 Gramm pro Liter angemischt. Die Bindung jedes Satzes an den Akzeptor wird für jeden Satz gesondert untersucht. Der eine oder die mehreren Sätze, die eine bevorzugte, spezifische Bindung für jede verschiedene Kettenposition liefert, wird bestimmt.
Die Identität und Position des C&sub1;-C&sub7;-Alkyl-peralkylierten Rests von jedem des einen oder der mehreren Sätze, die eine bevorzugte, spezifische Bindung aufweisen, liefert die peralkylierte Restsequenz für den Liganden, der bevorzugt an den Akzeptor bindet.
Obwohl ein vorstehend genanntes Verfahren mit peralkylierten Dipeptid-Sätzen durchgeführt werden kann, ist es bevorzugt, Sätze von mindestens Pentameren zu verwenden. Es werden somit im Allgemeinen mindestens fünf Bibliotheken von positionalen Sätzen genutzt (gescannt). Es ist bevorzugt, jedoch nicht notwendig, dass diese fünf Bibliotheken von Sätzen, als eine Gruppe betrachtet, einzelne, vorbestimmte peralkylierte Reste an benachbarten Positionen in der Sequenz enthalten. In einem 5-mer könnten diese Positionen beispielsweise die Positionen 1-5 sein. In einem 10-mer könnten diese Positionen jedoch die Positionen 6-10, 5-9, 3-7 oder ähnliche sein. Man erhält natürlich eine weitaus exaktere Information bezüglich der Sequenzidentifikation, wenn benachbarte Positionen der peralkylierten Oligopeptidkette bestimmt werden sollen und wenn die Identität des peralkylierten Rests, der eine erhöhte Bindung für jede Kettenposition aufweist, bestimmt wird.
Diese identifizierten C&sub1;-C&sub7;-Alkyl-peralkylierten Reste, die eine bevorzugte Bindung, etwa innerhalb eines Faktors von zwei bei einer ausgezeichnet bindenden Seitenkette, an der Position aufweisen, werden im Allgemeinen als bevorzugt oder als optimal, spezifisch bindend angesehen und sie werden verwendet, um ein oder mehrere peralkylierte Oligopeptide mittels der anderen identifizierten peralkylierten Reste an den anderen Positionen herzustellen, um zu bestimmen, welche Kombination optimale oder bevorzugte Gesamteigenschaften liefert. Obwohl man nicht in der Lage ist, eine einzelne optimale Sequenz aus 64 000 000 Sequenzen zu bestimmen, ist das Gebiet somit bei Verwendung eines 6-mers als Beispiel im Allgemeinen auf etwa 5-50 oder manchmal Tausende Sequenzen eingeschränkt, die infolge ihrer Sequenzähnlichkeiten mittels des in US-Patent 4 631 211 diskutierten SMPS- Verfahrens und durch die nachfolgende Reduktion schnell hergestellt werden können. Sogar in dem Fall, in dem das Scanning-Verfahren sich den möglichen optimal bindenden linearen peralkylierten Oligopeptidsequenzen von mehreren tausend nähert, hat sich der Kenntnisstand des Fachmanns verbessert und er oder sie können ein in WO 92/09300 oder Houghten et al., Nature, 345: 84 (1991), in den US- Patenten 5 010 175, 5 182 366 oder 5 144 392 beschriebenes Verfahren verwenden, dem die Peralkylierung folgt, um die Sequenz zu vervollständigen oder neue optimale Bindungssequenzen zu erhalten.
In einem hier diskutierten beliebigen Assay können alle der mindestens sechs verschiedenen vorbestimmten peralkylierten Reste an einer vorbestimmten Position eine ähnliche spezifische Bindung liefern. Dieses Phänomen wird als positionale Redundanz oder als Redundanz bezeichnet und jeder beliebige zweckmäßige peralkylierte Rest wird an dieser Position verwendet, wenn ein peralkylierter Oligopeptidligand synthetisiert wird.
Das in einem Assay verwendete wässrige Medium kann äußerst variiert werden und es schließt Leitungswasser, destilliertes oder entionisiertes Wasser ebenso ein wie eine Pufferlösung wie sie für Antikörper-Bindungsstudien verwendet wird oder ein Zellwachstumsmedium wie es für die Züchtung von Bakterien, Hefen, Pilzen, Pflanzen- oder Tierzellen geeignet ist, die dem Fachmann alle gut bekannt sind.
Die Konzentration eines linearen peralkylierten Oligopeptidsatzes in dem wässrigen Medium wird so gewählt, dass der peralkylierte Oligopeptidsatz in Konzentrationen von etwa 0,1 Milligramm pro Liter bis etwa 100 Gramm pro Liter, vorzugsweise von etwa 1,0 ug/ml bis etwa 100 mg/ml und besonders bevorzugt von etwa 0,1 mg/ml bis etwa 20 mg/ml vorliegt. Wird somit jedes peralkylierte Oligopeptidgemisch aus 3,2 Millionen einzelnen peralkylierten Oligopeptiden hergestellt; z. B. ein permethyliertes C-N-Methylamid-6-mer-Oligopeptid unter Verwendung der zwanzig natürlichen Aminosäurereste, dann ist jedes peralkylierte 6-mer-Oligopeptid innerhalb jeden Gemisches in einer bevorzugten Konzentration von etwa 1,0 ug/ml/3 200 000 = 0,31 pg/ml bis etwa 100 mg/ml/3 200 000 = 31, 25 ng/ml anwesend. Angenommen, das durchschnittliche Molekulargewicht eines permethylierten C-terminalen 6-mer-N- Methylamid-peralkylierten Peptids beträgt etwa 800 g/Mol, dann sind die einzelnen Hexamere bei 1,0 ug/ml in einer Konzentration von etwa 0,4 pMolar anwesend und bei 100 mg/ml sind die einzelnen Hexamere in einer Konzentration von etwa 40 mMolar anwesend. Besonders bevorzugt werden Konzentrationen von etwa 0,5 mg/ml bis etwa 10 mg/ml verwendet.
Obwohl nicht erforderlich, ist es bevorzugt, dass ein peralkylierter Oligopeptidgemischsatz in dem verwendeten wässrigen Medium löslich sein sollte. Die permethylierten N-terminalen quaternerisierten Oligopeptidsätze sind im Allgemeinen in den meisten wässrigen Medien löslich, wohingegen Sätze, die mit hydrophoberen Alkylgruppen alkyliert sind, milchige Dispersionen bilden. Derartige Dispersionen sind trotzdem geeignet. Das freie N-terminale Amino-perbenzylierte einzelne Peptid Gly- GlyPheLeu SEQ ID-Nr.: 36 bildete z. B. eine undurchsichtige Dispersion in Wasser, die bei 1 mg/ml 10 Volumenprozent DMSO enthält. Von den Peralkylierungen mit Ethyl- und Allylgruppen wurden ähnliche Dispersionen hergestellt.
Wie bekannt, ist für einen Arzneistoff eine vollständige Wasserlöslichkeit nicht erforderlich, obwohl viele standardmäßig verwendete Arzneistoffe, wie Steroide, in Wasser, wässrigen Assay-Medien oder Körperflüssigkeiten im Wesentlichen unlöslich sind, sind sie trotzdem äußerst wertvolle Medikamente. So führt beispielsweise der Merck Index, 10. Ausg. sowohl Progesteron und Testesteron als in Wasser unlöslich und Östradiol als in Wasser nahezu unlöslich an.
Es sollte klar sein, dass der vorstehend spezifizierte weite Konzentrationsbereich den in Betracht gezogenen Bereich der peralkylierten Oligopeptidsätze, welche bis zu neun Positionen als Gemische, eine bis etwa vier Alkylgruppen pro Rest, Alkylgruppen mit variierendem Molekulargewicht enthalten können und die Tatsache berücksichtigen soll, dass große Konzentrationsbereiche häufig zur Bestimmung der IC&sub5;&sub0; und Ki-Werte verwendet werden.
Ein peralkylierter Oligopeptidsatz und seine einzelnen Mitglieder können bei der Bildung eines Donor-Akzeptor (Rezeptor)-Bindungskomplexes als Donor (Ligand) angesehen werden. Beispielhafte Akzeptormoleküle sind Antikörperorte-enthaltende Moleküle, wie ganze Antikörper, F(ab)-, F(ab')&sub2;- und Fv-Antikörper-Fragmente, lösliche oder nicht-lösliche Zelloberflächenrezeptormoleküle, wie der lösliche CD4- Rezeptor, intra-Zellrezeptoren und virale Proteinrezeptoren, alle diese Antikörperorte-enthaltenden Moleküle werden jedoch gemeinsam als "Zellrezeptoren" bezeichnet. "Zellrezeptoren" schließen auch lebende Zellen ein, die Rezeptoren enthalten, welche mit einer peralkylierten Oligopeptid-Bibliothek als Ligand (Donor) in Wechselwirkung treten.
Die hier untersuchten Wechselwirkungen hinsichtlich der Bindung sind derartige spezifische Bindungswechselwirkungen, wie die zwischen Antikörper und Antigen. Derartige spezifische Bindungswechselwirkungen sollten mit der nicht-spezifischen Bindung verglichen werden, die zwischen den meisten Proteinen und dem in Mikrotiterplatten verwendeten Plastikmaterial beobachtet werden.
Jedes beliebige gut bekannte Bindungs- oder Bindungshemmungs-Assayformat kann angewendet werden. Es kommt beispielsweise ein Festphasen-Assay in Betracht, das einen an einen Festphase gebundenen Antikörperbindungsort und einen radioaktiv markierten peralkylierten Oligopeptidsatz verwendet. Auch ein kompetetives Bindungsassay, in dem ein Protein oder Polypeptid als ein Antigen an eine feste Phase gebunden ist und ein an das Antigen bindender monoklonaler Antikörper einem peralkylierten Oligopeptidgemisch zugesetzt ist, kommt in Betracht. Die Hemmung der Bindung des monoklonalen Antikörpers durch den peralkylierten Oligopeptidsatz liefert ein Maß der Bindung zwischen den peralkylierten Oligopeptiden und dem monoklonalen Antikörper. Die monoklonalen Antikörper-Bindungshemmung und die Hemmung der anderen Akzeptorbindungen, die mittels Enzym- oder radioaktiven Markierungen untersucht werden kann, ist gut bekannt.
Es ist häufig der Fall, dass man Rezeptoren (Akzeptoren), wie Antikörper für einen besonderen Liganden, wie an ein Antigen besitzt, der spezifische Ligand (Antigen), der an diese Antikörper bindet, ist jedoch nicht bekannt. Unter diesen Umständen können übliche Festphasen-Assays, in denen der Ligand an die Platte oder eine andere Festphasenmatrix fixiert ist, nicht durchgeführt werden, da die hier betrachteten verhältnismäßig kurzen Oligopeptidsätze nicht gut an die Mikrotiterplatte und ähnliche Festphasenmatrices binden.
Avidin bindet gut an Mikrotiterplatten und ähnliche Materialien. Diese Tatsache und auch der gut bekannte Bindungspartner Biotin kann für die Assays, in denen der an den Liganden bindende Rezeptor nicht bekannt oder anderweitig nicht verfügbar ist, genutzt werden.
Somit wird eine Festphasenmatrix, wie eine Mikrotiterplatte, mittels gut bekannter Verfahren, wie der Adsorption mit Avidin, beschichtet. Biotin, das eine freie Carboxylgruppe enthält, wird an das N-terminale Amin eines vorher beschriebenen peralkylierten Oligopeptidsatzes mittels der üblichen, für die Kupplung von Aminosäuren hier beschriebenen Kupplungschemie über die Carboxylgruppe des Biotins gekuppelt. Der biotinylierte Satz wird in einem wässrigen Medium gelöst und der Avidinbeschichteten Festphasenmatrix unter Bildung eines Fest-/Flüssigphasen-Gemisches zugesetzt. Dieses Gemisch wird über einen Zeitraum, der für den Avidin- und biotinylierten peralkylierten Oligopeptidsatz-Komplex geeignet, im Allgemeinen fünf Minuten bis etwa fünf Stunden inkubiert und bildet einen biotinylierten peralkylierten Oligopeptidsatz, der einen festen Träger sowie eine um das biotinylierte peralkylierte Oligopeptid reduzierte flüssige Phase enthält. Die feste und die flüssige Phase werden anschließend getrennt und der feste Träger wird im Allgemeinen gewaschen.
Der so hergestellte feste Träger, der einen fixierten peralkylierten Oligopeptidsatz enthält, wird anschließend in standardmäßigen Festphasen-Assays mit dem Rezeptor (Akzeptor) verwendet. Ist der Rezeptor ein Antikörper, werden übliche Detektionssysteme, wie radioaktiv-markierte oder Enzym-gebundene Anti-Antikörper, wie Ziege-Antimaus-Antikörper, in denen die Rezeptoren Maus-Antikörper sind zum Nachweis der Bindung verwendet. Ist der Rezeptor ein Zellrezeptor, sind in den Rezeptor durch die Züchtung von Zellen in einem radioaktiv-markierte Aminosäuren enthaltenden Medium eingebaute radioaktive Markierungen im Allgemeinen das Nachweismittel der Wahl.
Es ist häufig günstig, eine Spacergruppe zwischen den peralkylierten Oligopeptiden eines Satzes und dem Biotin zu verwenden. Beispielhafte Spacer schließen einen bis etwa fünf Glycinreste, geradkettige C&sub2;-C&sub6;-ω-Aminosäuren, wie Glycin, α-Alanin, 4-Aminobuttersäure (GABA) oder 4-Aminocapronsäure, ein.
Es kommt somit auch ein anderer, als der vorher beschriebene N-terminale biotinylierte peralkylierte Oligopeptidsatz in Betracht. Des weiteren kann dieser biotinylierte peralkylierte Oligopeptidsatz einen oder etwa fünf geradkettige C&sub2;-C&sub6;-ω- Aminosäurereste zwischen dem N-terminalen Amin der peralkylierten Oligopeptide und der Biotin-Gruppe einschließen.
Für einen vorstehend diskutierten Chromophor- oder Fluoreszenz-markierten Oligopeptidsatz kann der Kontakt zwischen dem Akzeptor und peralkylierten Oligopeptidsatz mit dem an dem festen Träger, wie Sepharose oder Agarose, gebundenen Akzeptor durchgeführt werden. Die nicht-bindenden und weniger bindenden Sätze können von den an einen festen Träger gebundenen Akzeptormolekülen durch Waschen mit ansteigenden Salzkonzentrationen bis zu einer vorbestimmten Konzentration, die verwendet wird, um ein besser oder bevorzugt bindendes peralkyliertes Oligopeptid zu definieren, getrennt werden. Die chromophore oder fluoreszierende Markierung kann verwendet werden, um den Elutionsverlauf zu kontrollieren. Wird beispielsweise 2,4-Dinitrophenyl-Chromophor verwendet, weist die Anwesenheit einer gelben bis gelb/orangen Farbe an dem festen Träger für einen vorgegebenen Satz nach dem Waschen auf einen optimal bindenden Satz hin.
Ein beispielhaftes Assay, das eine photoreaktive Markierung nutzt, kann mit einem Enzym, das ein bekanntes Substrat besitzt, durchgeführt werden. Hier werden das Enzym als Akzeptor und ein photoreaktiv-markierter peralkylierter Oligopeptidsatz gemischt und das Gemisch wird inkubiert, sodass die Bindung erfolgen kann. Bekanntlich wird das Gemisch anschließend unter Verwendung von ausreichend Licht mit einer geeigneten Wellenlänge bestrahlt, was die Zersetzung der photoreaktiven Gruppe, wie einer Azidgruppe, und das Einfügen des entstehenden peralkyliertes Oligopeptid enthaltenden Radikals in das Enzym-Polypeptidgerüst bewirkt. Diese Einfügung verbindet das peralkylierte Oligopeptid mit dem Enzym und blockiert die Reaktion mit Enzymsubstrat. Ein Assay bezüglich der enzymatischen Aktivität nach der Bestrahlung liefert somit eine Bestimmung, welcher peralkylierte Oligopeptidsatz optimal gebunden hat, wobei eine verringerte Aktivität auf eine erhöhte Bindung hinweist.
Die Zellrezeptormoleküle werden für dieses Assay-System auch als besonders geeignet angesehen. Der Zellrezeptor, dessen Bindung für das Assay betrachtet wird, muss nicht isoliert vorliegen, sondern er kann Teil einer intakten lebenden Zelle, wie Bakterien-, Hefe-, Pilz-, Säugetier- oder Pflanzenzellen oder von Viren, sein. Werden derartige intakte lebende Zellen verwendet, können die relativen Bindungsmengen durch das Wachstum oder die Hemmung des Wachstums der zugesetzten untersuchten Zellen bestimmt werden. Das wässrige Medium ist hier ein Wachstums- oder Kulturmedium, von dem bekannt ist, dass es das Wachstum der untersuchten Zellen fördert.
Die Konzentration der freien Akzeptormoleküle, einschließlich der aus den Zellpräparationen erhaltenen oder der in intakten lebenden Zellen vorhandenen, die bei derartigen Bindungsassays angewendet wird, ist eine Assay-wirksame Menge, wie sie für derartige Assays normal ist und sie ist in dem Fachgebiet gut bekannt. Es ist verständlich, dass verschiedene Konzentrationen an freien oder den in intakten lebenden Zellen vorhandenen Akzeptormolekülen bei jedem untersuchten Akzeptor variieren können.
Ein vorstehend beschriebenes Assay kann in vitro als auch in vivo durchgeführt werden. Für in vivo-Assays sind lebende Pflanzen, wie Tabak, Alfalfa, Getreide (Mais), Zinien und ähnliche in Betracht kommende Wirte, wohingegen kleine Labortiere, wie Ratten, Mäuse, Meerschweinchen, Kaninchen und Hunde, für Tierassays in Betracht kommende Wirte sind.
Eine einen C&sub1;-C&sub7;-Alkyl-peralkylierten Oligopeptidsatz enthaltende Zusammensetzung kann verabreicht werden und sie kann ein C&sub1;-C&sub7;-peralkyliertes Oligopeptid sein, das mit den Akzeptoren intern oder extern in Pflanzen durch Wässern, Besprühen von Laub oder durch Injektion in Kontakt gebracht wurde. Bei Tieren kann eine Zusammensetzung innerlich, oral oder durch Injektionen, wie als intraperitoneale, subkutane oder intramuskuläre Injektion, oder äußerlich durch Auftragen auf die Haut verabreicht werden, damit der Kontakt zwischen Donor und Akzeptor stattfinden kann.
Die Bindung kann hier durch die verhältnismäßige Wachstumsrate (positiv oder negativ) oder durch den Einfluss der Zusammensetzung auf ein oder mehrere Gewebe als auch durch die mikroskopische Untersuchung, die Körpertemperatur bei Verwendung pathogen-infizierter Tiere und ähnliche gut bekannte Verfahrensweisen bestimmt werden.

Peralkylierte Oligopeptide

Mehrere einzelne peralkylierte Oligopeptide wurden auf Grundlage der hier nachstehend diskutierten Studien hergestellt. Es wurde festgestellt, dass zehn permethylierte Hexamere, ein Pentamer, Heptamer und Octamer besonders und selektiv wirksam gegen Gram-positive Bakterien [Staphylococcus (S.) aureus, ein Methicillin-resistenter Stamm von S. aureus, und Streptococcus (S.) sanguis] sind, während sie im Wesentlichen keine Wirksamkeit gegen E. coli, Gram-negative Bakterien oder Candida albicans, eine Hefe, besitzen; IC50's > 600 ug/ml. Diese permethylierten Oligopeptide bewirken im Wesentlichen auch keine Lyse von humanen roten Blutzellen bei Konzentrationen, die ihren IC&sub5;&sub0;-Werten gleich sind und keine bis eine geringe Lyse bei einer Konzentration, die etwa 10- bis etwa 100-fach größer als ihre IC&sub5;&sub0;-Werte sind; d. h. bei 350 ug/ml. Durch Verwendung eines MTT- [3-(4,5- Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid; Mosmann, J. Immunol. Methods, 65: 55-63 (1983)]-Assays wurde für diese Materialien auch eine Abwesenheit von in vitro-Toxizität gegenüber McCoy-Zellen (ATCC 1696-CRL) nachgewiesen. Diese Tatsachen, verbunden mit der beobachteten Stabilität von permethylierten Peptiden gegenüber proteolytischen Enzymen, der ausgezeichneten Wasserlöslichkeit, die diese Peptide aufweisen, und der vorteilhaften wässrigen/organischen Lösungsmittelbeteiligung steigern den Wert dieser permethylierten Oligopeptide als Gram-positive antibakterielle Mittel.
Diese besonders bevorzugten permethylierten Oligopeptide werden nachstehend unter Verwendung des auf die Permethylierung hinweisenden Prefix "PerM-" aufgeführt. Jedes permethylierte Oligopeptid enthält ein C-terminales N-Methylamid, das nicht dargestellt ist und eine N-terminale Trimethylammoniumgruppe, die gleichfalls nicht dargestellt ist.
PerM-LeuPheIlePhePhePhe (SEQ ID-Nr.: 26);
PerM-PhePheIlePhePhePhe (SEQ ID-Nr.: 27);
PerM-PhePhePhePhePhePhe (SEQ ID-Nr.: 23);
PerM-LeuPhePhePhePhePhe (SEQ ID-Nr.: 28);
PerM-PhePhePhePheHisPhe (SEQ ID-Nr.: 29);
PerM-LeuPheIlePhePheHis (SEQ ID-Nr.: 30);
PerM-LeuPhePhePheHisPhe (SEQ ID-Nr.: 31);
PerM-LeuPheIlePheHisPhe (SEQ ID-Nr.: 32);
PerM-LeuPhePhePhePheHis (SEQ ID-Nr.: 33);
PerM-PhePheIlePhePheHis (SEQ ID-Nr.: 34);
PerM-PhePhePhePhePhe (SEQ ID-Nr.: 22);
PerM-PhePhePhePhePhePhePhe (SEQ ID-Nr.: 24);
und
PerM-PhePhePhePhePhePhePhePhe (SEQ ID-Nr.: 25).
Die ersten zehn permethylierten Oligopeptide entsprechen der Formel
Xaa&sub1;PheXaa&sub3;PheXaa&sub5;Xaa&sub6; (SEQ ID-Nr.: 35),
worin Xaa&sub1; an der ersten Position ein N-Trimethylammonium-Leu- oder -Phe-Rest ist;
Xaa&sub3; an der dritten Position Ile oder Phe ist;
Xaa&sub5; an der fünften Position His oder Phe ist und
Xaa&sub6; an der sechsten Position ein C-terminaler N-Methylcarboxamid-His- oder -Phe- Rest ist, mit der Maßgabe, dass mindestens einer von Xaa&sub5; und Xaa&sub6; Phe ist. Wenn jeder von Xaa&sub1;, Xaa&sub3;, Xaa&sub5; und Xaa&sub6; Phe ist, entsteht ein permethyliertes Peptid der SEQ ID-Nr.: 23.
Die vorstehend genannte Liste veranschaulicht auch, dass permethyliertes C- terminales N-Methylamid-Oligophenylalanin (oligoPhe) mit 5 bis 8 Phe-Resten ebenfalls in Betracht kommt. Diese permethylierten Oligopeptide besitzen auch eine α-N-terminafe Trimethylammoniumgruppe. Von diesen permethylierten oligoPhe C- terminalen N-Methylamidpeptiden sind Verbindungen mit 6, 7 oder 8 Phe-Resten besonders bevorzugt, d. h. SEQ ID-Nr.: 23, 24 und 25.
Die nachfolgenden Beispiele sollen die vorliegende Erfindung veranschaulichen, jedoch nicht einschränken.

Beispiel 1: Beispielhafte Synthese von einem Satz gemischter Oligopeptide mit äquimolaren Mengen an den zwanzig natürlich vorkommenden Aminosäureresten

Aliquote von fünf Gramm (4,65 mMol) p-Methylbenzhydrylaminhydrochlorid-(MBHA)- Harz werden in zwanzig poröse Polypropylen-Beutel gegeben. Diese Beutel werden in einen gebräuchlichen Behälter gegeben und dreimal (jeweils drei Minuten) mit 1,0 Liter CH&sub2;Cl&sub2; gewaschen, dann erneut dreimal (jeweils drei Minuten) mit 1,0 Liter 5 Prozent DIEA/CH&sub2;Cl&sub2; gewaschen (DIEA = Diisopropylethylamin; CH&sub2;Cl&sub2; = DCM). Die Beutel werden anschließend mit DCM gespült und in gesonderte Reaktionsgefäße gegeben, die jeweils 50 ml (0,56 M) des jeweiligen t-BOC-Aminosäure/DCM enthalten. Jedem Behälter wird als Kupplungsmittel N,N-Diisopropylcarbodiimid (DIPCDI; 25 ml; 1,12 M) zugesetzt.
In 50/50 (v/v) DMF/DCM werden an das Harz gesondert zwanzig Aminosäurederivate gekuppelt. Nach einstündigem kräftigen Schütteln wird Gisen's Pikrinsäure-Test [Gisen, Anal. Chem. Acta, 58: 248-249 (1972)] durchgeführt, um die Vollständigkeit der Kupplungsreaktion zu überprüfen. Bei Bestätigung der Vollständigkeit der Reaktion werden anschließend alle Harz-Päckchen mit 1,5 Liter DMF und weitere zwei Male mit 1,5 Liter CH&sub2;Cl&sub2; gewaschen.
Nach dem Spülen werden die Harze aus ihren gesonderten Päckchen entfernt und unter Bildung eines Pools in einem gemeinsamen Beutel zusammengemischt. Das entstehende Harzgemisch wird anschließend getrocknet und gewogen, erneut in 20 gleiche Teile (Aliquote) geteilt und in 20 weitere Polypropylen-Beutel gegeben (eingeschlossen). In einem gemeinsamen Reaktionsgefäß werden die nachfolgenden Reaktionen durchgeführt:
(1) Die Entfernung der Schutzgruppen von den eingeschlossenen Aliquoten wird über einen Zeitraum von dreißig Minuten mit 1,5 Liter 55 Prozent TFA/DCM durchgeführt und (2) die Neutralisation wird durch dreimaliges Waschen mit jeweils 1,5 Liter 5 Prozent DIEA/DCM durchgeführt.
Jeder Beutel wird in eine gesonderte Lösung aus aktiviertem t-BOC-Aminosäurederivat gegeben und die Kupplungsreaktion wird wie vorstehend genannt bis zur Vollständigkeit durchgeführt. Alle Kupplungsreaktionen werden mittels des vorstehend genannten quantitativen Pikrinsäure-Assays verfolgt. Als nächstes werden die Beutel geöffnet, die entstandenen t-BOC-geschützten Dipeptid-Harze werden unter Bildung eines Pools zusammen gemischt, aus dem Pool werden Aliquote entnommen, diese werden eingeschlossen, die Schutzgruppen werden entfernt und weitere Reaktionen werden durchgeführt.
Dieses Verfahren kann beliebige Male durchgeführt werden, wobei jeder Schritt eine äquimolare Darstellung der erwünschten Anzahl von Aminosäureresten in der Peptidkette liefert. Die wesentlichen Verfahrensschritte werden geeigneterweise als eine Teilen-Kuppel-Kombinieren (DCR) Synthese bezeichnet.
Nach der Durchführung der erwünschten Zahl derartiger Kupplungen und Gemische werden die Polypropylen-Beutel gesondert aufbewahrt, um hier die zwanzig Sätze bereitzustellen, die den Amino-terminalen Rest als dem einzelnen vorbestimmten Rest besitzen, wobei z. B. die Positionen 2-4 durch äquimolare Mengen der zwanzig Reste besetzt sind. Um Sätze herzustellen, die den einzelnen vorbestimmten Aminosäurerest an dem anderen als dem Amino-terminalen Ende besitzen, wird der Inhalt der Beutel nach der Anfügung eines Restes an der erwünschten vorbestimmten Position nicht gemischt. Der Inhalt von jedem der zwanzig Beutel wird in 20 Aliquote aufgetrennt, die Schutzgruppen werden entfernt und sie reagieren anschließend gesondert mit den zwanzig Aminosäurederivaten. Danach wird der Inhalt der zwanzig Beutel, die den jeweiligen so hergestellten Satz enthalten, miteinander gemischt und wie vorstehend beschrieben behandelt, bis die erwünschte Oligopeptidlänge erreicht ist.
Die mit α-Amino-terminalen t-BOC- und Fmoc-Schutzgruppen verwendeten Seitenkettenschutzgruppen sind üblicherweise unterschiedlich. Die für den einen oder anderen Synthesetyp verwendeten Seitenkettenschutzgruppen sind in der nachstehenden Tabelle dargestellt. Für beide Synthesetypen werden auch andere gebräuchliche Seitenschutzgruppen verwendet. Seitenkettenschutzgruppe
*Arginin und Histidin werden in Gegenwart von N-Hydroxylbenztriazol gekuppelt [Hruby et al., Anaew. Chem. Int. Ed. Engl., 10; 336-339 (1971)].
** Mtr = 4-Methoxy-2,3,6-trimethylbenzolsulfonyl.
Für Vorläufer-Oligopeptidgernischsätze, die keine N-terminale C&sub1;-C&sub1;&sub8;-Acyl- (z. B. Acetyl)-Gruppe besitzen, wird zur Entfernung der Seitenkettenschutzgruppen von N- t-BOC-geschützten Oligopeptidketten das nachfolgende Verfähren angewendet. Die vollständig geschützten, an feste Träger gekuppelten Oligopeptidgemische werden vor der HF-Behandlung mit 55 Prozent Trifluoressigsäure in Methylenchlorid behandelt, um die endgültige t-BOC-Schutzgruppe zu entfernen. Anschließend werden die geschützten, an feste Träger gekuppelten Oligopeptidgemische, die sich in Päckchen aus Polypropylennetzen befinden [Houghten, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 82: 5131-5135 (1985)], abwechselnd durch Waschen mit DCM und Isopropanol gespült und vierundzwanzig Stunden unter vermindertem Druck getrocknet.
Wird die Abspaltung von dem festen Träger vor der Alkylierung durchgeführt, wird der Nieder-HF-Schritt [Tam et al., J. Am. Chem. Soc., 195: 6442-6455 (1983)] in einem zwei-Liter-Polypropylen-Reaktionsgefäß unter Verwendung einer Lösung aus 60 Prozent Dimethylsulfid, 25 Prozent HF, 10 Prozent p-Kresol und 5 Prozent Ethylendithiol durchgeführt. Das Ethandithiol wird verwendet, um die N-Formylgruppen von den Tryptophan-Resten abzuspalten. Ist es nicht erwünscht, die N- Formylgruppen abzuspalten, wird in diesem Gemisch kein Ethandithiol verwendet und es-wird durch HF ersetzt. Nα-t-BOC-N-Formyltryptophan ist von Bachem, Inc., Torrence, CA kommerziell verfügbar.
HF wird bei -78ºC kondensiert. Nach der Kondensation wird die HF-Fängerlösung sorgfältig in ein Reaktionsgefäß überführt, das die Harz-enthaltenden Päckchen enthält. Die Nieder-HF-Lösung wird so hergestellt, dass 5 ml pro 0,1 mMol Oligopeptid entstehen. Nach der Zugabe der Reagenzien wird das Reaktionsgefäß in ein Eisbad gegeben und zwei Stunden geschüttelt. Die Nieder-HF-Lösung wird entfernt und die Päckchen, die die Peptidharze nach der Entfernung der Schutzgruppen enthalten, werden schnell mit eiskaltem DCM gewaschen. Das Waschen mit DCM wird neunmal wiederholt (jeweils eine Minute), gefolgt von zehnmaligem abwechselndem Waschen mit Isopropanol und DCM. Abschließend wird das Harz fünfmal mit DMF und dann weitere zwei Male mit DCM gewaschen. Die keine Schutzgruppenenthaltenden Peptidharz-Päckchen werden unter vermindertem Druck getrocknet. Nachdem dieses Verfahren abgeschlossen ist, sind die keine Schutzgruppenenthaltenden Peptide fertig für die Abspaltung mit wasserfreier HF.
Die N-terminalen Fmoc-Schutzgruppen der eingeschlossenen, geschützten, an einen festen Träger gekuppelten Oligopeptidgemische werden durch zehnminütige Behandlung mit zwanzig Prozent Piperidin in DMF entfernt. Anschließend werden die entstandenen, keine N-terminalen Schutzgruppen enthaltenden Seitenkettengeschützten Peptidharze in den Polypropylen-Päckchen zweimal mit DMF gewaschen (jeweils fünf Minuten), gefolgt von zweimaligem Spülen mit DCM (jeweils eine Minute) und vierundzwanzig Stunden im Vakuum getrocknet.
Die Entfernung der Seitenketten-Schutzgruppen wird in einem zwei-Liter-Polypropylen-Reaktionsgefäß unter Verwendung von 85 Prozent TFA, 5 Prozent Phenol, 4 Prozent Thioanisol, 4 Prozent entionisiertem H&sub2;O und 2 Prozent Ethandithiol durchgeführt. Die Harze werden 3,5 Stunden bei Raumtemperatur geschüttelt. Die Reaktionslösung wird entfernt und die Päckchen, die die an feste Träger gekuppelten Oligopeptidgemische enthalten, von denen die Schutzgruppen vollständig entfernt wurden, werden schnell mit eiskaltem Ether gewaschen. Das Waschen mit Ether wird neunmal wiederholt (jeweils eine Minute), gefolgt von abwechselndem Waschen mit Isopropanol und DCM. Abschließend werden die an feste Träger gekuppelten Oligopeptidgemische fünfmal mit DMF und anschließend weitere zwei Male mit DCM gewaschen. Die an feste Träger gekuppelten Oligopeptidgemische, von denen die Schutzgruppen entfernt sind, und ihre einschließenden Päckchen werden unter vermindertem Druck getrocknet. Nachdem dieses Verfahren abgeschlossen ist, sind die keine Schutzgruppen-enthaltenden Peptide fertig für die Abspaltung mit wasserfreier HF.
In dem Fall, in dem an dem Oligopeptidgemischsatz eine N-Acylgruppe, wie eine Acetylgruppe, vorhanden ist, wird die endgültige t-BOC- oder Fmoc-Schutzgruppe wie vorstehend genannt entfernt, ein Überschuss an Essigsäureanhydrid wird zugesetzt und die Reaktion wird fortgesetzt bis keine freien Aminogruppen mehr vorhanden sind, wie es hier bereits diskutiert wurde. Anschließend werden die vorstehend genannten Spül- und Trocknungsschritte durchgeführt, gefolgt von der Entfernung der Schutzgruppen und Abspaltung des Oligopeptidgemischsatzes von dem festen Träger.
Wie bereits früher für Peralkylierungen, die nach der Abspaltung erfolgen, festgestellt wurde, liefert die Verwendung eines Benzhydrylamin-Harzes als fester Träger und von wasserfreiem HF/Anisol zur Abspaltung des Oligopeptidgemischsatzes eine C-terminale Amidgruppe in dem hergestellten Oligopeptidgemischsatz. Die Verwendung eines Ester-gebundenen festen Harzträgers und dieses Abspaltungsverfahren liefert eine C-terminale Carbonsäure. Die Verwendung von Disulfidenthaltenden Verbindungsgruppen zwischen dem festen Träger und den Oligopeptidketten, wie sie in US-Patent 4 031 211 diskutiert wird und die diskutierte Abspaltung mit einem Disulfidbindungen aufbrechendem Mittel liefert eine an die Oligopeptidketten Amid-gebundene C-terminale Mercaptan-Verbindungsgruppe. Die nachfolgende Peralkylierung liefert C-terminale Dialkylamid-, Alkylester- und Alkylthioether- Gruppen.
In einer beispielhaften bevorzugten Peralkylierung wird gleichzeitig mehr als ein Peptid-gebundener fester Träger (Harz) permethyliert, indem jedes Peptid-gekuppelte Harz in einem gesonderten Polypropylennetz-Päckchen eingeschlossen wird. Die Mengen der verschiedenen Reagenzien und Lösungen werden auf Grundlage der vorhandenem Gesamtmenge an aktiven Wasserstoff verwendet. Eine beispielhafte Synthese für ein einzelnes peralkyliertes Peptid wird nachstehend diskutiert.
Diese Synthese betrifft das permethylierte Peptid PerA-AGGFL, dessen N-terminales α-Amin in eine quaternäre Trimethylammoniumgruppe umgewandelt wurde und dessen C-terminales Carboxyl in ein N-Methylcarboxamid umgewandelt wurde. In einer 250 ml-Polypropylen-Flasche mit einem belüftbaren Schraubdeckel wurden 0,60 g von 60 Prozent NaH/Öl [etwa 25 Milliäquivalente (mÄq)] zu 100 ml DMSO zugesetzt, wodurch eine Endkonzentration von 0,25 M NaH vorlag. Nach etwa 30minütigem Schütteln zur Auflösung von NaH wurden der Flasche 500 mg des Vorläufer-Peptidgekuppelten Harzes (etwa 2,5 mÄq an aktivem Wasserstoff) in einem Polypropylennetz-Päckchen zugesetzt.
Die Flasche und ihr Inhalt wurden auf einem Umkehr-Schüttler 14 h geschüttelt. Nach dieser Zeit wurden der Flasche und ihrem Reaktionsgemisch 4,66 ml CH&sub3;J (etwa 30 mÄq) zugesetzt. Das entstandene Gemisch wurde weitere 15 Minuten geschüttelt.
Die Lösung wurde ausgegossen und das Päckchen und sein Inhalt wurden jeweils mit 100 ml Aliquoten an DMSO, DMF, Isopropanol, zweimal mit Dichlormethan und anschließend mit Methanol gewaschen. Die so peralkylierten Harz-gekuppelten Peptide wurden anschließend unter Hochvakuum getrocknet und die peralkylierten Peptide wurden mittels des vorstehend diskutierten standardmäßigen hoch HF- Verfahrens abgespalten.
Die Ergebnisse für eine ähnliche Peralkylierung dieses Peptidgekuppelten Harzes werden im Beispiel 4 gemeinsam mit den Ergebnissen für neunzehn ähnliche Peralkylierungen diskutiert.

Beispiel 2: Chemische Gemischsynthese

Diese Synthesen, die 18 der 20 natürlich vorkommenden Aminosäurederivate verwenden (Cys und Trp werden weglassen), werden im Wesentlichen, wie in US- Patent 4 631 211 und in Beispiel 1 beschrieben, durchgeführt.
Ein vernetztes Polystyrol-Harz, das auch 0,93 Milliäquivalente (mÄq) Benzylhydrylamingruppen pro Gramm einschließt, wird als fester Träger verwendet. Das feste Trägerharz wird im Allgemeinen in einer Menge von 300 Milligramm (mg) verwendet, sodass bei jeder Reaktion anfänglich 2,79 mÄq an Harz-Amin bereitgestellt werden.
Zur Bereitstellung N-terminaler Amin-(freier Amin)-Gruppen wird für jede Kupplung das in der nachstehenden Tabelle 2 aufgeführte Gemisch aus Aminosäurederivaten mit einer Konzentration von 0,5 M in 4 ml Dimethylformamid (DMF) verwendet, das entspricht einem etwa 7-fachen molaren Überschuss über der Menge an vorhandenem Amin, das als Harz-Amin oder nach der Entfernung der Schutzgruppen vorliegt. Pro Äquivalent an gemischtem Aminosäurederivat wird ein Äquivalent DIPCDI als Kupplungsmittel und ein Äquivalent N-Hydroxylbenztriazol-H&sub2;O verwendet, sodass beide auch in einem 7-fachen molaren Überschuss, bezogen auf die vorhandenen freien Amingruppen, vorhanden sind.

Tabelle 2¹

Aminosäure / Gewicht²

Ala 19 mg
Asp (Bn) 33 mg
Glu (Bn) 36 mg
Phe 20 mg
Gly 15 mg
His (DNP) 50 mg
Ile 123 mg
Lys (Cl-CBZ) 76 mg
Leu 36 mg
Met 18 mg
Asn 37 mg
Pro 27 mg
Gln 39 mg
Arg (Tsl) 82 mg
Ser (Bn) 24 mg
Thr (Bn) 44 mg
Val 72 mg
Tyr (Br-CBZ) 60 mg
¹ Die eingeklammerten Bezeichnungen in der linken Spalte werden jeweils verwendet, wenn keine andere eingeklammerte Schutzgruppe dargestellt wird. Bn = Benzyl; DNP = Dinitrophenyl; Tsl = Toluolsulfonyl; CBZ = Benzyloxycarbonyl; Cl-CBZ = o- Chlorbenzyloxycarbonyl; Br-CBZ = o-Brombenzyloxycarbonyl.
² Milligramm (mg) an jedem in einem chemischen Gemisch vorhandenen Schutzgruppen-enthaltendem Aminsäurederivat pro 1 Milliäquivalent an Harz-NH&sub2;- Gruppen.
Als Kupplungsmittel wird Diisopropylcarbodiimid (DIPCD) verwendet.
Jede Kupplung wird bei Raumtemperatur durchgeführt bis keine freien Amingruppen verbleiben, wie in Beispiel 1; etwa eine Stunde. Die Entfernung der Schutzgruppen und die Neutralisation werden ebenfalls wie in Beispiel 1 durchgeführt.
Jede Position des äquimolare Mengen Aminosäurereste enthaltenden Vorläufer- Oligopeptids wird wie vorstehend beschrieben zugesetzt. Bei Verwendung eines beispielhaften 6-mers, dessen fünfte Position durch einen von achtzehn vorbestimmten Aminosäureseitenketten besetzt ist, liefert die vorstehend genannte Kupplung ein Träger gekuppeltes ein-mer-Peptid der Formel X-B.
Dieses Träger-gekuppelte Produkt wird in mindestens 18 Aliquote gleichen Gewichts geteilt, geringe Teile der Präparation werden häufig für analytische Zwecke zurückbehalten. Diese Aliquote werden, wie in Beispiel 1 diskutiert, in markierte poröse Päckchen eingeschlossen und die 18 einzelnen Aminosäurederivate werden nach der Entfernung der Schutzgruppen und der Neutralisation gesondert mit diesen Aliquoten unter Bildung von 18 Träger gekuppelten Produkten der Formel O&sub5;X-B umgesetzt.
Von diesen 18, das O&sub5;X-B Träger-gekuppelte Produkt enthaltenden markierten porösen Päckchen werden anschließend gemeinsam die Schutzgruppen entfernt und sie werden neutralisiert und diese Produkte werden, während sie in ihren Päckchen verbleiben, erneut, wie vorstehend diskutiert, gemeinsam mit den gemischten Aminosäurederivaten umgesetzt, unter Bildung von 18 Sätzen an Träger- gekuppelten Produkten der Formel XO&sub5;X-B. Dieses Verfahren wird weitere drei Male wiederholt, unter Bildung der 18 Träger gekuppelten 6-mer-Sätze, deren fünfte Position, ausgehend vom N-terminalen Ende, durch jeden der 18 verschiedenen vorbestimmten Aminosäurereste besetzt ist und deren andere Positionen durch äquimolare Mengen der 18, in den Reaktionsgemischen vorhandenen Aminosäureresten besetzt sind.
In dem Fall, in dem N-terminale Acetylgruppen verwendet werden sollen, werden die N-terminaien t-BOC-Gruppen entfernt, die entstehenden freien Amine neutralisiert und die Träger-gekuppelten 6-mers werden dann mit Essigsäureanhydrid unter Bildung von N-Acetyl-(Ac)-Gruppen umgesetzt. Die N-Acetyl-gekuppelten Peptide werden anschließend peralkyliert und von dem festen Träger, unter Bildung einer Vielzahl (18) von peralkylierten 6-mer-Oligopeptidsätzen abgespalten.
Falls geeignet, werden die vorstehend genannten Verfahren ähnlicherweise verwendet, um die verbleibenden fünf Bibliotheken von 18 Sätzen (andere 90 Sätze) herzustellen, die einen der achtzehn vorbestimmten peralkylierten Aminosäurereste an den vorbestimmten Positionen 1-4 und 6 und Gemische gleicher molarer Mengen der 18 peralkylierten Aminosäurereste an den anderen peralkylierten Oligopeptidkettenpositionen besitzen.
Die verhältnismäßige Äquimolarität der Kupplung in den Vorläufer-Oligopeptidsätzen unter Anwendung des vorstehend genannten Verfahrens im Vergleich zu den physikalischen Gemisch-Verfahren wurde durch Aminosäureanalyse der Träger- gekuppelten Produkte aus einer einzelnen Kupplungsreaktion bestimmt. Für diese Assays wurde ein herkömmlicher Aminosäure-Analyzer verwendet. Die angewendeten besonderen Vorgehensweisen werden hier nachstehend diskutiert.
Es ist gut bekannt, dass sogar kommerziell verfügbare Aminosäure-Analyzer, infolge mehrerer Faktoren einschließlich der Zersetzung von Aminosäuren keine genauen Bestimmungen liefern und die verschiedenen Reaktionen und die Ansprechbarkeit der Geräte muss geprüft werden. Andererseits liefert das physikalische Gemisch- Verfahren äquimolare Gemische mit einer Genauigkeit, die sehr viel größer ist, als die nur durch das Gerät erhaltene.
Wie in Beispiel 1 wurde so mittels des physikalischen Gemisch-Verfahrens durch eine Kupplungsreaktion ein Träger gekuppeltes Produkt (X-B) hergestellt, von dem die Schutzgruppen entfernt wurden, das vom festen Trägerharz abgespalten und gewonnen wurde. Durch das chemische Gemisch-Verfahren dieses Beispiels wurde ein ähnliches, an einen festen Träger gekuppeltes X-B-Produkt hergestellt. Von diesem X-B-Produkt wurden in ähnlicher Weise die Schutzgruppen entfernt, es wurde von dem festen Trägerharz abgespalten und gewonnen. Diese Proben wurden anschließend der Aminosäureanalyse zugeführt.
Genauer wurden nachdem jedes der vorstehend genannten t-BOC-Seitenkettengeschützten Gemische hergestellt wurde, die t-BOC-Gruppen und die Seitenketten- Schutzgruppen entfernt. Jeder der zwei gemischten Aminosäure-gekuppelten festen Träger (X-B) wurde getrocknet und 20 mg jedes Harz-gebundenen Produkts wurden in eine 5 ml Glasampulle gegeben. Jeder Ampulle wurde ein Milliliter Propionsäure HCl (50 : 50, v/v) zugesetzt. Aus den Ampullen wurde mit einer Vakuumpumpe die Luft entfernt, wobei sorgfältig darauf geachtet wurde, den Inhalt der Ampullen nicht anzusaugen. Anschließend wurde jede Ampulle im evakuierten Zustand mit einer Propangasflamme verschlossen. Die verschlossenen Ampullen wurden in einen Trockenschrank gegeben und zwei Stunden bei 130ºC gehalten, um die umgesetzten Aminosäuren von dem festen Trägerharz abzuspalten und Hydrolysate zu bilden.
Nach dem Abkühlen auf Raumtemperatur werden die Ampullen aufgebrochen und ihr Inhalt wird in gesonderte 12-75 mm-Kulturröhrchen gegeben. Aliquote (20 ul) der Hydrolysate wurden jeweils in zwei 5-50 mm-Kulturröhrchen gegeben. Diese Proben wurden verschlüsselt, getrocknet und verschlossen.
Für die Aminosäureanalyse wurden die verschlossenen, verschlüsselten Proben an Core Laboratories, New Orleans, LA geschickt. Die Ergebnisse dieser Analyse werden nachstehend für jede Probe dargestellt. Da bekannt ist, dass das physikalische Gemisch-Verfahren genauere Ergebnisse als die Aminosäureanalyse liefert, wurde zudem der prozentuale Anteil der Abweichung von der Äquimolarität für das chemische Gemisch-Verfahren bestimmt, unter der Annahme, dass der aus dem physikalischen Gemisch-Verfahren für die einzelnen Aminosäurereste erhaltene Wert dem korrekten Wert von eins-achtzehn Molprozent (5,56 Prozent) entsprach. Es wird angemerkt, dass Glu und Gly ebenso wie Asp und Asn zusammen analysiert werden, da die Abspaltung vom Harz die Gln- und Asn-Amidbindungen unter Ausbildung von Glu bzw. Asp zerstört. Molprozent

Beispiel 3: Synthese von Peptidgemischen auf Baumwollträgern

Zwanzig, aus kommerziell verfügbarem Baumwollstoff geschnittene Scheiben (Durchmesser 4,7 cm) werden 15 Minuten in 50 ml Dichlormethan (DCM), das 25 Prozent Trifluoressigsäure (TFA) enthält, geschüttelt. Anschließend werden die Scheiben entnommen und in flache Keramiktrichter, die den gleichen Durchmesser wie die Baumwollscheiben besitzen, gegeben. Der Trichter wird auf eine 1000 ml- Absaugflasche, die eine Verbindung zu einer Vakuumpumpe besitzt, aufgesetzt. Das 25 Prozent TFA/DCM wird unter vermindertem Druck von den Baumwollscheiben in die Absaugflasche gesaugt. Anschließend werden die Baumwollscheiben mit DCM (2 · 10 ml), 5 Prozent DIEA enthaltendem DCM (2 · 10 ml) und erneut mit DCM (2 · 10 ml) gewaschen. Die Waschschritte werden durch Zugabe der Waschlösung auf den Trichter mit den Baumwollscheiben und durch Entfernung des Lösungsmittels mit einer Vakuumpumpe ausgeführt. Nach dem letzten Waschschritt werden die Baumwollscheiben entfernt und luftgetrocknet. Wenn nicht anders angeführt, werden alle Arbeitsschritte bei Raumtemperatur durchgeführt.

A. Manuelle Synthese

Fmoc-Glycin (1,118 g, 4 mMol), N-Hydroxybenztriazol (HOBt) (540 mg, 4 mMol), N- Methylimidazol (NMI) (656 ul, 8 mMol) und DIPCDI (626 ul, 4 mMol) werden in 6,7 ml DMF gelöst. Dies entspricht einer Lösung von 0,5 M Fmoc-GIy/HOBt/DIPCDI, 1 M NMI. Die Baumwollscheiben wurden in einem 20 ml-Szintillationsröhrchen in diese Lösung eingetaucht und drei Stunden darin belassen. Nach der Übertragung der Baumwollscheiben auf den Keramiktrichter wurden Baumwollträger mit DMF (3 · 10 ml) und DCM (2 · 10 ml) wie vorstehend beschrieben gewaschen. Dieses Verfahren wird in der gleichen Weise einmal wiederholt.
Das allgemeine Peptidgemisch und das einzelne vorbestimmte Peptidkupplungsverfahren sind wie folgt:
1. Entfernung der Fmoc-Schutzgruppen: 20 Prozent Piperidin/DMF, 15 Minuten,
2. Waschschritte: 3 · DMF, 3 · DCM
3. Kupplung: 0,3 M Fmoc-Aminosäure/HOBt/DIC in DMF, 90 Minuten - zwei Stunden
4. Waschschritt: 3 · DMF, 2 · DCM
Insbesondere werden die zwanzig Baumwollscheiben, die sich auf dem Keramiktrichter befinden, in 10 ml 20 Prozent Piperidin/DMF eingetaucht und 15 Minuten darin belassen. Nach der Entfernung des 20 Prozent Piperidin/DMF werden die Baumwollscheiben mit DMF (3 · 10 ml) und DCM (2 · 10 ml) wie vorstehend beschrieben gewaschen.

(a) Kupplung der gleichen Aminosäure an alle Baumwollscheiben

Die zu kuppelnde Fmoc-Aminosäure (2,4 mMol), HOBt (324 mg, 2,4 mMol) und DIPCDI (380 ul, 2,4 mMol) werden in 7,6 ml DMF gelöst. Dies entspricht einer 0,3 M Fmoc-Aminosäure/HOBt/DIC-Lösung. Die Baumwollscheiben werden in einem 20 ml-Szintillationsröhrchen in diese Lösung eingetaucht und 90 Minuten darin belassen. Nach der Übertragung der Scheiben auf den Keramiktrichter wird die Kupplungslösung entfernt und die Baumwollträger werden wie vorstehend genannt mit DMF und DCM gewaschen.

(b) Kupplung einer anderen Aminosäure an jede Baumwollscheibe (O-Kupplung)

Die 20 natürlichen Aminosäuren (jeweils 0,12 mMol) werden gesondert in 0,4 ml einer 0,3 M Lösung aus HOBt und DIPCDI in DMF (324 mg HOBt und 380 ul DIP- CDI, gelöst in 7,6 ml DMF) gelöst. Die Baumwollscheiben werden zur Identifizierung der Aminosäuren mit den Buchstaben A bis Y markiert, in die Aminosäurelösung, die mit dem Buchstaben der Aminosäurelösung markiert ist, eingetaucht und 90 Minuten darin belassen. Nach der Übertragung der Scheiben auf den Keramiktrichter werden die Baumwollscheiben wie vorstehend genannt mit DMF und DCM gewaschen.

(c) Kupplung des Aminosäuregemisches (X-Kupplung)

Es wird eine 0,3 M Lösung der 20 natürlichen Aminosäuren, ausgenommen Cys, in dem Molverhältnis der Tabelle 2 und HOBt in DMF hergestellt und in aliquote Mengen eingeteilt. Die aliquoten Mengen (jeweils 7,6 ml) werden bei -20ºC gelagert. Vor der Kupplung wird das aliquote Gemisch auf Raumtemperatur erwärmt, gefolgt von der Zugabe von 380 ul DIPCDI. Nach 20 Minuten (Voraktivierung) werden die 19 Baumwollscheiben in die Lösung eingetaucht und zwei Stunden darin belassen. Nach ihrer Übertragung in den Keramiktrichter werden die Baumwollscheiben, wie vorstehend beschrieben, mit DMF und DCM gewaschen.
Nach der Kupplung der letzten (N-terminalen) Aminosäure oder dem Gemisch werden die Fmoc-Schutzgruppen von den Baumwollscheiben entfernt und sie werden gewaschen. Die Baumwollscheiben, von denen die Schutzgruppen entfernt wurden, werden in 8 ml eines Gemisches aus Essigsäureanhydrid/Pyridin/DMF 1 : 2 : 3 (v/v/v) eingetaucht und 60 Minuten darin belassen. Nach ihrer Übertragung in den Keramiktrichter werden die Baumwollscheiben, wie vorstehend beschrieben, mit DMF und DCM gewaschen.
Die acetylierten Baumwollscheiben werden in eine Flasche gegeben, die 30 ml 50 Prozent TFA, 5 Prozent Triisobutylsilan in DCM enthält, und für zwei Stunden darin belassen. Nach dem Ausgießen der Lösung werden 100 ml DCM zugesetzt und die Flasche wird zwei Minuten geschüttelt. Dieser Waschschritt wird zweimal mit DCM, anschließend dreimal mit 5 Prozent DIEA/DCM und erneut dreimal mit DCM wiederholt. Die Baumwollscheiben werden entnommen, zwischen Schichten aus Filterpapier abgetupft und luftgetrocknet. Die trockenen Baumwollscheiben werden mit einer gewöhnlichem Lochstanze in schmale Scheiben (Durchmesser 7 mm) geschnitten, markiert und eingefroren.
Anschließend wird die Peralkylierung wie vorstehend diskutiert ausgeführt.

B. Maschinelle Synthese

Die Synthese wird wie in US-Patent 5 202 418 gemäß Lebl beschrieben und wie vorstehend genannt durchgeführt. Der wesentliche Unterschied zwischen der manuellen Synthese der Peptidgemische und der Synthese der einzelnen Peptide mit einem Synthesizer ist der folgende: Die manuell hergestellten Gemische werden unmittelbar auf der Glycin-Baumwolle durchgeführt. Infolge der alkalischen Hydrolyse des Glycin-Baumwolle-Esters enthalten die von der Baumwolle abgespaltenen Peptide deshalb einen zusätzlichen C-terminalen Gly-Rest. Im Fall der Synthese der einzelnen Peptide mittels eines automatischen Synthesizers wird ein TFA-abspaltbares Bindeglied, in diesem Fall für die Synthese von Peptidamiden, N-Fmoc-2,4- Dimethoxy-4'-(carboxylmethyloxy)-benzhydrylamin an die Aminogruppe des Glycin- Baumwolle-Esters gekuppelt. Nach der Entfernung der Fmoc-Schutzgruppen von dem Bindeglied wird die erste Aminosäure des Peptids an die Aminogruppe des Bindeglieds (Linkers) gekuppelt. Infolge der Abspaltung der Peptide mit TFA, die gleichzeitig mit der Entfernung der Seitenketten-Schutzgruppen erfolgt, bildet sich der Satz von Oligopeptidamiden, wobei das Bindeglied und Glycin an der Baumwolle gebunden bleiben. Anschließend wird die Peralkylierung der abgespaltenen Sätze durchgeführt. Die Peralkylierung kann auch durchgeführt werden, während das Vorläufer-Peptid an dem festen Träger gebunden ist.

Beispiel 4: Pentamer-Permethylierung

Zwanzig modellhafte pentamere, an feste Träger gebundene Oligopeptide wurden, wie in US-Patent 4 631 211 beschrieben, hergestellt. Die vier C-terminalen Positionen waren jeweils identisch, wobei der N-terminale Rest zwischen den zwanzig natürlich vorkommenden Aminosäureresten variierte. Die Träger gebundenen Vorläufer-Pentamere wurden, wie vorstehend diskutiert, peralkyliert.
Kurz dargestellt, die Träger gebundenen Pentamere (jeweils 50 mg), die sich jeweils in ihren eigenen Polypropylennetz-Behältern befanden, wurden 16 Stunden bei Raumtemperatur in einer DMSO-Lösung aus 0,25 molarem Natriumhydrid (24 ml, 8 mÄq) geschüttelt. Anschließend wurde der Lösung ein 4-facher Überschuss, bezogen auf die Molarität der Base, an Methyljodid (unverdünnt 1,1 ml, 24 mÄq) zugesetzt. Die Peralkylierungsreaktion konnte über einen Zeitraum von 15 Minuten fortgesetzt werden oder bis das Reaktionsgemisch sich auf Raumtemperatur erwärmt hatte. Nach dem Waschen mit DMF (3 · 5 ml), Isopropanol (IPA; 2 · 5 ml), DCM (3 · 5 ml) und Methanol (1 · 5 ml) wurden die peralkylierten, an feste Träger gebundenen Peptide unter Hochvakuum getrocknet. Die peralkylierten Oligopeptide wurden von dem Trägerharz durch eineinhalbstündige Behandlung mit 7,5 Prozent Anisol in HF (5 ml) bei Null Grad C abgespalten, unter Hochvakuum getrocknet, mit 10 ml Wasser extrahiert und gefriergetrocknet. Die Verwendung von 10 Volumenprozent Essigsäure in Wasser für die Extraktion liefert mit hydrophoberen Alkylgruppen ein schnelleres Ergebnis.
Die einzelnen peralkylierten Oligopeptide wurden gewonnen und der Umkehrphasen- Hochdruckflüssigkeits-Chromatografie (RP-HPLC) unterzogen und durch Laser- Desorption-Massenspektralanalyse (Kratos) identifiziert. Die analytische RP-HPLC wurde mit einer C&sub1;&sub8;-Bydac-Säule (Hesperia, CA) unter Verwendung eines Beekman System GoldTM HPLC-Systems bei 215 nm durchgeführt; Lösungsmittel A, 0,05 Prozent TFA/H&sub2;O; Lösungsmittel B, 0,05 Prozent TFA/CH&sub3;CN; Gradient, 5-65 Prozent B. Die präparative RP-HPLC wurde mit einer C&sub1;&sub8;-Waters-Säule (5 cm · 25 cm) unter Verwendung eines Waters Delta PrepTM HPLC-Systems bei 215 nm durchgeführt; Lösungsmittel A und B wie vorstehend genannt. Die Ergebnisse dieser Analysen sind nachstehend in Tabelle 3 dargestellt, wobei für die peralkylierten (permethylierten) Reste die einbuchstabige Bezeichnung der nicht-alkylierten Aminosäuren verwendet wird. Tabelle 3 Modellhafte Peptidseitenketten-Modifikationen
¹ Jedes peralkylierte Oligopeptid enthielt ein N-terminales Trimethylammonium- Stickstoffatom, eine Methylgruppe an jedem Amidstickstoff des Gerüsts, geeignete methylierte Seitenketten und eine C-terminale N-Methylcarboxamidgruppe, die nicht in den vorstehend genannten peralkylierten Sequenzen dargestellt sind.
² Das Methionin war als Methioninsulfoxid vorhanden.
³ Die Reinheit der Rohprodukte wurde durch analytische RP-HPLC bestimmt.

Beispiel 5: Bindung an Opioid-Rezeptoren

Die Enkephaline waren die ersten beschriebenen natürlichen Liganden für die Opioid-Rezeptoren. Diese Moleküle binden mit unterschiedlichen Affinitäten an drei bekannte Rezeptor-Subklassen (u, δ und κ) [beschrieben in Schiller, Progress in Medicinal Chemistry, Ellis et al., Hrsg., Elsevier Science Publishers, GB (1990) Seiten 301-340]. In den kompetetiven Bindungsstudien wird hier ein radioaktivmarkiertes Analoges von met-Enkephalin, [³H]-[D-Ala², MePhe&sup4;, Gly-OJ&sup5;]Enkephalin (DAGO) verwendet, von dem bekannt ist, dass es in den kompetetiven Bindungsstudien mit positionalen Bibliotheken von peralkylierten Hexamersätzen, d. h. peralkylierten 5X-Sätzen, spezifisch an den u-Rezeptor bindet.
Für diese Assays wurden zwei Bibliotheken von Bibliotheken von Sätzen verwendet. Die erste enthielt eine N-terminale Pyroglutamoylgruppe (von Pyrrolidon-Carbonsäure) und die zweite Bibliothek enthielt eine α-quaternäre Trimethylammoniumgruppe. Beide Bibliotheken wurden permethyliert und sie enthielten jede der 20 natürlichen Aminosäuren, wobei Met als das Sulfoxid und C-terminale N- Methylcarboxamid-Ende vorhanden waren.
Diese Bibliotheken wurden, wie in Beispiel 1 diskutiert, hergestellt und, wie vorstehend diskutiert, permethyliert.

A. N-Pyroglutamoyl-terminierte Bibliotheken

Das Scannen der ersten oder N-terminalen Position (die 1-Position) zeigte, dass permethylierte Asp, Glu, Gly, Lys, Met, Asn, Pro, Gln, Ser, Thr und Val die größte Hemmung, zwischen 50 und 60 Prozent, lieferten, wobei permethylierte Thr und Glu die größte Hemmung lieferten.
Das Scannen der 2-Position zeigte, dass permethylierte Asp, Glu, Gly, Ile, Asn, Pro, Gln und Thr die größte Hemmung zwischen 50 und 60 Prozent lieferten, wobei permethyliertes Asn die besten Ergebnisse lieferte.
Das Scannen der 3-Position zeigte, dass nur permethyliertes Glu eine Hemmung von mehr als 60 Prozent lieferte, wobei die neun anderen permethylierten Ala-, Asp-, Gly-, Met-, Asn-, Pro, Gln-, Ser- und Thr-Reste Hemmungen zwischen 50 und 60 Prozent lieferten.
Der Scan der 4-Position zeigte, dass permethylierte Asp, Glu und Met etwa 60 Prozent Bindungshemmung und acht weitere permethylierte Reste Hemmungen zwischen 50 und 60 Prozent aufweisen, d. h. Ala, Gly, Asn, Pro, Gln, Ser, Thr und Val.
Das Scannen der 5-Position zeigte, dass permethyliertes Glu eine Hemmung von mehr als 60 Prozent lieferte, wobei permethylierte Met, Ser und Thr eine Hemmung von nahezu 60 Prozent aufwiesen.
Das Scannen der 6-Position, dem C-terminalen Ende zeigte, dass permethyliertes Glu eine Bindungshemmung von nahezu 100 Prozent lieferte, wobei kein anderer permethylierter Rest mehr als 70 Prozent Hemmung lieferte.
Permethyliertes His wies an jeder Position eine Hemmung von 20 Prozent oder weniger auf. Permethylierte Trp, Phe und Arg waren an jeder gescannten Position ebenfalls einheitlich schlechte Inhibitoren.
Sowohl die Enkephaline als auch DAGO enthalten zwei aromatische Reste. Die vorstehend genannten Ergebnisse weisen somit darauf hin, dass peralkylierte aromatische Reste hier für die Bindung keine Bedeutung besitzen, wodurch der Weg für neue, verhältnismäßig stabile Enkephalin-Rezeptoren frei ist.

B. Trimethylammonium-terminierte Bibliotheken

Die gleichen, wie vorstehend angeführt, in A verwendeten, an feste Träger gebundenen Vorläufer-Peptide, denen jedoch die N-Pyroglutamoylgruppe fehlt, wurden, wie vorstehend diskutiert, permethyliert und von dem Trägerharz abgespalten, wodurch sechs Bibliotheken von 20 Bibliothek-Sätzen von 5X-Oligopeptiden bereitgestellt wurden. Die N-terminalen Reste besaßen hier α-Trimethylammonium-Gruppen.
Das Scannen der 1-Position zeigte, dass nur permethyliertes Glu eine Bindungshemmung aufwies, die mehr als 40 Prozent betrug. Permethylierte Met, Pro, Gln und Ser wiesen Hemmungen zwischen 30 und 40 Prozent auf.
Das Scannen der 2-Position zeigte erneut, dass nur permethyliertes Glu eine Hemmung von mehr als 40 Prozent aufwies. Permethylierte Asp, Gly, Met, Asn, Pro, Gln und Thr wiesen Hemmungen zwischen 30 und 40 Prozent auf.
Die Position 3 zeigte erneut, dass permethyliertes Glu die beste Hemmung zwischen etwa 30 und 35 Prozent lieferte, wobei permethylierte Met und Gln auch eine Hemmung aufwiesen, die mehr als 30 Prozent betrug.
Permethyliertes Met lieferte die beste Hemmung an Position 4, gefolgt von permethylierten Asn, Glu, Gln und Gly. Jede Hemmung betrug etwa 30 Prozent oder mehr, jedoch weniger als 40 Prozent.
Der Scan der 5-Position zeigte, dass nur permethyliertes Gln eine Hemmung von mehr als 40 Prozent aufwies. Permethylierte Ala, Asp, Met, Asn, Ser und Thr zeigten Hemmungen zwischen 30 und 40 Prozent.
Der Scan der 6-Position zeigte, dass permethylierte Gly, Met und Thr Hemmungen zwischen etwa 40 Prozent und etwa 50 Prozent aufwiesen.
Permethylierte His, die Aromaten, Cys, Arg und Lys wiesen in diesen Assays alle an jeder Position eine geringe Bindungshemmung auf.
Die durch diese Bibliotheken gezeigten Bindungshemmungen waren im Allgemeinen geringer als die von den vorstehend dargestellten. Diese Bibliotheken wiesen etwas größere Unterschiede in den Bindungshemmungen auf.
Die vorstehend genannten Assays wurden unter Verwendung der Opiod-Rezeptoren durchgeführt, die aus Rattenhirn wie folgt hergestellt wurden.
Besondere Membranen wurden mittels einer Modifikation des von Pasternak et al., Mol. Pharm., 11: 340-351 (1975), beschriebenen Verfahrens hergestellt. Die in flüssigem Stickstoff eingefrorenen Rattenhirne wurden von Rockland Inc. (Gilbertsville, PA) erhalten. Die Hirne wurden aufgetaut, das Kleinhirn wurde entfernt und das verbleibende Gewebe wurde gewogen. Jedes Gehirn wurde einzeln in 40 ml Tris-HCl- Puffer (50 mM, pH 7,4, 4ºC) homogenisiert und zehn Minuten zentrifugiert (Sorvall RCSC SA-600 16000 U/min). Die Pellets wurden in frischem Tris-HCl-Puffer resuspendiert und 40 Minuten bei 37ºC inkubiert. Nach der Inkubation wurden die Suspensionen wie vorstehend genannt zentrifugiert, die entstehenden Pellets wurden in 100 Volumen Tris-Puffer resuspendiert und die Suspensionen wurden vereinigt. Die Membransuspensionen wurden am gleichen Tag hergestellt und verwendet. Der Proteingehalt der ungereinigten Homogenisate, der durch die Anwendung des von Bradford, Anal. Biochem., 72: 248-254 (1976) beschriebenen Verfahrens bestimmt wurde, lag im Bereich von 0,15-0,2 mg/ml.
Die Bindungsassays wurde in Polypropylen-Röhrchen durchgeführt. Jedes Röhrchen enthielt 0,5 ml der Membransuspension, 8 nM [³H]-[D-Ala², MePhe&sup4;, Gly- Ol]Enkephalin (DAGO) (spezifische Aktivität = 36 Ci/mMol, 160 000 cpm/Röhrchen, erhalten von Multiple Peptide Systems, Inc., San Diego, CA durch NIDA Drug Distribution Program 271-90-7302) und 2 mg/ml des permethylierten Peptidgemisches und Tris-Puffer in einem Gesamtvolumen von 0,65 ml. Die Assay-Röhrchen wurden 60 Minuten bei 25ºC inkubiert. Die Reaktion wurde durch Filtration durch GB-B-Filter an einem Tomtec-Harvester (Orange, CT) beendet. Die Filter wurden unverzüglich mit 6 ml Tris-HOI-Puffer, 4ºC, gewaschen. Die gebundene Radioaktivität wurde mit einem LKB Beta-Platten-Flüssig-Scintillationszähler bestimmt und in Counts pro Minute (cpm) ausgedrückt. Um die inter- und intra-Assay-Variationen zu bestimmen, wurden in jede Platte jedes Assays (es wurde ein 96-Well-Format verwendet) Standardkurven, in denen [³H]-DAGO in Anwesenheit verschiedener Konzentrationen an unmarkiertem DAGO (0,13-3900 nM) inkubiert wurde, mit einbezogen.

Beispiel 6: Antimikrobielle Wirksamkeit gegen S. aureus

Die zwei Typen von Bibliotheken von positionalen Bibliotheken des Beispiels 5 wurden ebenfalls gegen Staphylococcus aureus als Gram-positives Bakterium gescannt. Es wurden die Konzentrationen jener 5X permethylierten Peptidgemische bestimmt, bei denen das Zellwachstum um 50 Prozent (IC&sub5;&sub0;-Werte) gehemmt wurde.
Es werden nachstehend die Reste jedes Bibliothek-Typs und die Satzmitglieder dargestellt, deren IC&sub5;&sub0;-Werte innerhalb eines Faktors von etwa zwei der am meisten wirksamen Reste lagen. Die IC&sub5;&sub0;-Werte werden in mg/ml angegeben. A. N-Pyroglutamoyl-terminierte Bibliotheken¹
¹ Es wurden Ausgangskonzentrationen von 2500 ug/ml an permethylierten Sätzen verwendet. Jeder IC&sub5;&sub0;-Wert ist ein Mittelwert aus den Ergebnissen von zwei Assays.
² Es wurde nur ein Assay durchgeführt.
Die vorstehend genannten Ergebnisse weisen darauf hin, dass die permethylierten aromatischen Reste Tyr und Trp, die in den Assays des Beispiels 5 ohne Bedeutung waren, sich in diesen Assays nahe dem N-terminalen Ende als ziemlich bedeutend erwiesen. Ähnlich ist His, das der schlechteste Rest bezüglich der Bindungshemmung in Beispiel 5 war, nahe oder am C-terminalen Ende von Bedeutung. Ähnlich zeigten die permethylierten Asp, Glu, Asn, Gln, Ser, Thr und Gly, die in den Assays des Beispiels 5 bedeutend waren, im Allgemeinen die höchsten IC&sub5;&sub0;-Werte. B. N-Trimethylammonium-terminierte Bibliotheken¹
¹ Für die wenig wirksamen permethylierten Sätze wurden Ausgangskonzentrationen von 2500 ug/ml verwendet, die Ausgangskonzentrationen für die höher wirksamen Sätze betrug 1250 ugg/ml. Die IC&sub5;&sub0;-Werte sind der Mittelwert aus den Ergebnissen von zwei Assays.
In der Hemmung des Wachstums dieses Bakteriums waren die am meisten wirksamen dieser letzten N-Trimethylammonium-terminierten Sätze etwa zwei- bis etwa fünfmal wirksamer als die früheren Sätze. Diese letzteren Sätzen zeigten auch eine Bedeutung der permethylierten aromatischen Reste, insbesondere von Phenylalanin (Phe), nahe dem N-terminalen Ende, die sich für jede Position fortsetzte. Histidin befand sich ebenfalls nahe dem C-terminalen Ende dieser Sätze, allerdings in einer weniger klaren Weise als es in den ersten untersuchten Sätzen der Fall war. Die gleichen Reste, die in Beispiel 5 als bedeutend nachgewiesen wurden, die sich jedoch gegen S. aureus in dem ersten Assay dieses Beispiels als unbedeutend erwiesen, wurden auch hier als unbedeutend bestimmt. Methioninsulfoxid, das in Beispiel 5 auch bedeutend war, erwies sich hier als verhältnismäßig unbedeutend.

Beispiel 7: Permethylierte Oligo-Phe-Peptide

Im Hinblick auf die augenscheinliche Bedeutung der permethylierten Phe-Reste an jeder Position der Scans des Beispiels 6 wurden eine Reihe von permethylierten C- terminalen homoPhe-N-Methylamid-Peptiden hergestellt, wie auch das permethylierte Phe-N-Methylamid selbst. Jedes permethylierte Peptid und die permethylierte Aminosäure enthielten eine N-terminale Trimethylammoniumgruppe und eine C-terminale N-Methylamidgruppe.
Es war denkbar, dass die beobachtete Bevorzugung für peralkylierte Phe-Reste sich auf eine tatsächliche Bevorzugung für einen oder zwei derartige Reste, die durch einen Frameshift (Leserahmenverschiebung) in den positionalen Scans bewiesen wurde, zurückführen lässt. Zur Veranschaulichung und um die Möglichkeit zu untersuchen, ob die Ergebnisse sich auf einen Frameshift zurückführen lassen, wurden somit eine einzelne peralkylierte Aminosäure und einzelne peralkylierte Peptide anstatt Sätze oder Bibliotheken von Sätzen hergestellt und untersucht.
Die permethylierte(n) Aminosäure und Peptide wurden, wie nachstehend beschrieben, gegen S. aureus und Streptococcus sanguis abgesucht und es wurden die IC&sub5;&sub0;- und MIC-Werte (minimale Hemmkonzentration; minimale Konzentration, die benötigt wird, um das Bakterienwachstum zu etwa 100 Prozent zu hemmen) bestimmt. Die Mittelwerte der Ergebnisse aus dieser Untersuchung sind nachstehend in den Tabellen 4 und 5, gemeinsam mit den Ergebnissen für die Antibiotika Oxacillin und Erythromycin und N-Acetyl-hexaPhe-Amid (N-Ac-hexaPhe) als Kontrollen in der S. aureus-Untersuchung dargestellt. Tabelle 4 Assay gegen S. aureus
¹ Jedes peralkylierte Oligopeptid enthält ein N-terminales Trimethylammonium- Stickstoffatom, eine Methylgruppe an jedem Amidstickstoff des Gerüsts, geeignete methylierte Seitenketten und eine C-terminale N-Methylcarboxamidgruppe, die nicht in den vorstehend genannten peralkylierten Sequenzen dargestellt sind. Tabelle 5 Assay gegen S. sanguis
¹ Jedes peralkylierte Oligopeptid enthält ein N-terminales Trimethylammonium- Stickstoffatom, eine Methylgruppe an jedem Amidstickstoff des Gerüsts, geeignete methylierte Seitenketten und eine C-terminale N-Methylcarboxamidgruppe, die nicht in den vorstehend genannten peralkylierten Sequenzen dargestellt sind.
Wie aus den vorstehend genannten Daten ersichtlich, lieferte das positionelle Scanning-Verfahren eine Grundlage zur Gewinnung eines permethylierten Oligopeptids, dessen Wirksamkeit zwar gering, jedoch der der anerkannten Antibiotika ähnlich war. Die vorstehend genannten Ergebnisse weisen auch darauf hin, dass die Scanning-Ergebnisse korrekt waren und nicht infolge eines Frameshifts zustande kamen. Diese Ergebnisse wurden erhalten, indem eine nicht-optimierte Sequenz verwendet wurde, in der Phe nicht der optimale Rest an jeder Position des positionalen Scans des Beispiels 6 war, er war jedoch nahezu optimal und die Verwendung von homo- Phe-permethyliertem Heptapeptid war zur Veranschaulichung geeignet. Auch wenn bedacht wird, dass homoPhe-permethyliertes Heptapeptid als Veranschaulichung verwendet wurde, zeigte sich bei der Zugabe jeden Restes ein Anstieg in der Wirksamkeit des permethylierten Peptids mit einem Gesamtanstieg in der Wirksamkeit von 2 Ordnungen über der dargestellten Größenordnung.
Staphylococcus areus (ATCC 29213) wurde über Nacht (etwa 18 Stunden) bei 37ºC in Kation-eingestellten Mueller-Hinton (CAMH) Nährlösung gezüchtet. Diese Kultur wurde erneut beimpft und zur Erreichung der exponentiellen Phase des Bakterienwachstums bei 37ºC inkubiert, d. h. bis die Bakteriensuspension etwa 10&sup5; bis 5 · 10&sup5; Kolonie-bildende Einheiten (CFU)/ml enthielt. Die Zellkonzentration wurde eingestellt, indem 100 ul der verschiedenen Verdünnungen der Kulturlösung (z. B. 10&supmin;², 10&supmin;³ und 10&supmin;&sup4;) auf feste Agarplatten ausplattiert wurden. Nach der Inkubation über Nacht (etwa 18 Stunden) bei 37ºC, wurden die so gebildeten CFU auf jeder Agarplatte ausgezählt.
Es wurden 96-Well-Gewebekulturplatten verwendet, wobei acht Wells pro Platte nur Medium als Kontrollen enthielten, wohingegen acht andere Wells Medium plus Zellen als positive Wachstumskontrolle enthielten. Diese Kontrollen wurden verwendet, um mögliche Verunreinigungen des Mediums festzustellen und die Messung des nicht-gehemmten Wachstums der Mikroorganismen sicherzustellen.
Zur Bestimmung der IC&sub5;&sub0;-Werte (Konzentrationen, die notwendig sind, um das Bakterienwachstum um 50 Prozent um hemmen) wurden der Bakteriensuspension die peralkylierten Oligopeptidsätze in den vorstehend erwähnten Konzentrationen zugesetzt. Die Platten wurden über Nacht (etwa 18 Stunden) bei 37ºC inkubiert und nach verschiedenen Inkubationszeiten wurde die optische Dichte (OD) bei 620 nm bestimmt. Anschließend wurden aus den OD-Daten die IC&sub5;&sub0;-Werte bestimmt.

Beispiel 8: Einzelne permethylierte Oligopeptide

Basierend auf den in Beispiel 6 dargestellten Ergebnissen gegen S. aureus unter Anwendung der 120 N-Trlmethylammonium-terminierten permethylierten C-terminalen Methylamid-Oligopeptidsätze zum Scannen wurden einzelne Peptide synthetisiert, die alle Kombinationen der für die erste Position ausgewählten sechs Aminosäuren (Trp, Phe, Tyr, His, Ile und Leu); Phe für die zweite Position; Trp, Ile und Phe für die dritte Position, Trp und Phe für die vierte Position und Phe und His sowohl für die fünfte als auch für die sechste Position aufwiesen. Nach ihrer Synthese wurden die entstandenen 144 einzelnen permethylierten Peptide (6 · 1 · 3 · 2 · 2 · 2) bezüglich ihrer antimikrobiellen Wirksamkeit untersucht. Von den 144 hergestellten Peptiden besaßen 41 IC50's < 50 ug/ml, während 51 IC50's > 250 ug/ml gegen S. aureus besaßen. Tabelle 6 listet die 10 am meisten wirksamen Sequenzen und die sich aus ihrer Anwendung ergebenden Daten auf. Tabelle 6 Antimikrobielle und hämolytische Wirkungen permethylierter Peptide¹
¹ Alle numerischen Daten sind in ug/ml.
² Jedes peralkylierte Oligopeptid enthielt ein N-terminales Trimethylammonium- Stickstoffatom, eine Methylgruppe an jedem Amidstickstoff des Gerüsts, geeignete methylierte Seitenketten und eine C-terminale N-Methylcarboxamidgruppe, die nicht in den vorstehenden peralkylierten Sequenzen dargestellt sind.
Es wurde festgestellt, dass die permethylierten Formen von FFIFFF-NH&sub2;, FFFFFF- NH&sub2; und LFIFFF-NH&sub2; (SEQ ID-Nr.: 27, 23 und 26) die größte Wirksamkeit innerhalb der Reihe aufwiesen, wobei jede einen MIC-Wert besitzt, der kleiner als 15 ug/ml ist. Die permethylierten hepta- und octa-Phe-Peptide (SEQ ID-Nr.: 24 und 25) des Beispiels 7 zeigten ähnliche Aktivitäten gegen MRSA. Im Gegensatz dazu zeigten die quaternären Ammoniumsalze von nichtpermethylierten FFFFFF-NH&sub2; (SEQ ID- Nr.: 35) keine Wirksamkeit (IC&sub5;&sub0; > 250 ug/ml). Gegen MRSA und S. sanguis (Tabelle 6) wurden ähnliche Wirksamkeiten nachgewiesen, wohingegen keines der permethylierten Peptide oder Peptidgemische Wirksamkeit gegen E. coli oder C. albicans besaß (IC50's > 600 ug/ml). Auch besaß weder keines der Gemische noch ein beliebiges der einzelnen permethylierten Peptide eine wesentliche Toxizität, wie durch die Lyse von roten Blutzellen (RBC's) nachgewiesen wurde (Tabelle 6). Die Wirksamkeit dieser neuen Verbindungen erscheint daher hoch spezifisch gegen Gram-positive Bakterien.
Diese Verbindungen zeigten Wirksamkeiten, die im Bereich der früher beschriebenen, aus L-Aminosäuren hergestellten Peptide lagen [Houghten et al., Nature, 354: 84-86 (1991); Houghten et al., Biotechniques, 13: 412-421 (1992) und Houghten et al., in Innovationen and Perspectives in Solid Phase Synthesis, Epton Hrsg., Solid Phase Conference Coordination, Andover, GB (1992), S. 237-239] und sie scheinen im Gegensatz zu diesen L-Aminosäure-Peptiden vollständig stabil gegenüber proteolytischen Enzymen zu sein (darauf wird hier im nachfolgenden hingewiesen). Die physikalisch-chemischen Eigenschaften dieser Verbindungen (erhöhte Resistenz gegenüber proteolytischen Enzymen, ausgezeichnete Wasserlöslichkeit, bevorzugte wässrige/organische Charakteristika) verstärken den Wert ihrer Wirksamkeit als führende therapeutische Mittel. Überraschenderweise wurde nachgewiesen, dass nur eine geringe Anzahl von permethylierten Peptiden, die entweder Trp oder Tyr in ihren Sequenzen besitzen, wirksam sind. In Erfahrung mit der L-Aminosäure-Bibliothek wurde folgerichtig festgestellt, dass Trp- und Tyrenthaltende Peptide antimikrobielle Wirksamkeit besitzen, was nicht der Fall war, wenn die Peptide permethyliert sind [Houghten et al., Nature, 354: 84-86 (1991); Houghten et al., Biotechniques, 13: 412421 (1992) und Houghten et al., in Innovationen and Perspectives in Solid Phase Synthesis, Epton Hrsg., Solid Phase Conference Coordination, Andover, GB (1992), S. 237-239]. Dies ist gesondert, unter Anwendung des gleichen iterativen Ansatzes, der zur Identifizierung der Wirksamkeit der L-Aminosäure-Peptide angewendet wurde, untersucht worden.
Die Assays unter Verwendung von S. aureus wurden, wie vorstehend beschrieben, ausgeführt. Methicillin-resistente Staphylococcus aureus (MRSA) ATCC 33591, Streptococcus sanguis ATCC 10566, Escherichia coli ATCC 25922 und Candida albicans ATCC 10231 wurden in den Bioassays (ATCC, Rockville, MD) verwendet. Um die exponentielle Phase des Bakterienwachstums vor Ausführung der Assays zu initiieren, wurde eine Probe des Bakteriums, das über Nacht (etwa 18 Stunden) bei 37ºC in Kation-eingestellter Mueller-Hinton-Nährlösung (CAMH, für E. coli und S. aureus - Becton Dickinson Microbiology Systems, Cockeysville, MD) oder in Hirn- Herz-Infusions-Nährlösung (BHI, für S. sanguis) gezüchtet wurde, erneut in eine 2X- Nährlösung geimpft und bei 37ºC inkubiert. MRSA wurde in ähnlicher Weise bei 35ºC in Kationen-eingestellter MH-Nährlösung gezüchtet. Vor Ausführung der Assays wurden zwei Kolonien der neu gewachsenen C. albicans Kultur in 5 ml Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS - 35 mM Phosphatpuffer, 0,15 mM NaCl - pH 7,0) geimpft und in Hefe-Nährmedium verdünnt. Die Bakterien- und Hefesuspensionen wurden turbidometrisch so eingestellt, dass in allen Assays eine Endkonzentration von 10&sup5; bis 5 · 10&sup5; Kolonie-bildenden Einheiten (CFU)/ml verwendet wurde.
Die Assays wurden in 96-Well-Gewebekulturplatten (Costar, Pleasanton, CA) durchgeführt, wie von Blondelle et al. in, Biochemistry, 31: 12688-12694 (1992), die hier als Literaturangabe einbezogen ist, beschrieben. Kurz dargestellt, die Bakteriensuspension wurde zu einem gleichen Volumen an dem Gemisch der permethylierten Verbindungen gegeben, die in H&sub2;O auf Konzentrationen verdünnt wurden, die sich von den serienmäßigen zweifachen Verdünnungen ableiten, die von 2500 ug/ml bis 1 ug/ml variieren. Anschließend wurden die Platten über Nacht bei 37ºC inkubiert. Das für jede Verbindung (oder Gemisch von Verbindungen) nachgewiesene prozentuale Wachstum wurde dann anhand der optischen Dichte bei 620 nm (OD&sub6;&sub2;&sub0;) mittels einer Titertek Multiskan Plus Apparatur (Flow Laboratories, Molean, VA) bestimmt. Anschließend wurde die Konzentration, die zur Hemmung des Bakterienwachstums um 50 Prozent (IC&sub5;&sub0;) notwendig ist, durch Anwendung des Software- Programms GRAPHARD (ISI, San Diego, CA) berechnet. Die minimalen Hemmkonzentrationen (MIC's) wurden als die minimale Konzentration der Peptide definiert, bei der im Zeitraum zwischen 0 und 21 Stunden kein Wechsel im OD&sub6;&sub2;&sub0;- Wert auftrat. In einer ähnlichen Weise wurden die C. albicans enthaltende Suspension 48 Stunden bei 30ºC inkubiert.
Die hämolytischen Wirkungen der Peptide wurden unter Verwendung roter Blutzellen (RBC's) bestimmt. Die Assays wurden in 96-Well-Gewebekulturplatten gegen eine 0,25 prozentige RBC-Suspension durchgeführt, wie von Blondelle et al., in Biochim. Biophys. Acta, 1202: 331-336 (1993), die hier als Literaturangabe aufgeführt ist, beschrieben. Kurz dargestellt, wurden einzelne permethylierte Peptide oder Peptidgemische zu der RBC-Lösung, bei Konzentrationen, die sich von den serienmäßigen zweifachen Verdünnungen ableiten, welche von 650 bis 64 ug/ml variieren, gegeben. Nach der einstündigen Inkubation bei 37ºC wurden die Platten 5 Minuten bei 2800 U/min zentrifugiert. Die Überstände wurden von den Pellets abgetrennt und ihre OD wurde bei 414 nm gemessen. Als 100 Prozent bzw. 0 Prozent Hämolysekontrollen wurden Triton (1 Prozent) bzw. PBS verwendet.

Beispiel 9: Racemisieruncisstudie

Ausgehend von der Literatur wurde erwartet, das die hier bei der Permethylierung angewendeten Bedingungen zu einer minimalen Racemisierung oder Cα- Methylierung führen [Challis et al., The Chemistrv of Amides, Zabicky Hrsg., Interscience, New York (1970) S. 731-857; Goggins et al., Can. J. Chem., 49: 1968-1971 (1971)]. Da die erhöhte Azidität des Cα-Wasserstoffs in aromatischen Aminosäuren, wie Phe [Challis et al., The Chemistry of Amides, Zabicky Hrsg., Interscience, New York (1970) S. 731-857; Coggins et al., Can. J. Chem., 49: 1968-1971 (1971)], sie für die Racemisierung und/oder Cα-Methylierung anfälliger machen, wurde eine Testreihe entwickelt, in der vier mögliche Stereoisomere von GlyGlyPheLeu-NH&sub2; (SEQ ID-Nr.: 36) synthetisiert und durch RP-HPLC analysiert wurde.
Es wurde festgestellt, dass jedes Peptid erwartungsgemäß gemeinsam mit seinem Enatiomer eluiert, es war jedoch ersichtlich, dass jedes Enantiomerenpaar eine Basislinientrennung (> 2,0 Minuten) von dem anderen Enantiomerenpaar besitzt. Daher wurde ein Aliquot des GGFL-NH&sub2;-Harzes mit Natriumhydrid in Dimethylsulfoxid unter Bildung der Amidanionen behandelt und anschließend durch Waschen mit 1 Prozent Wasser/Dimethylsulfoxid abgeschreckt. Nach der Abspaltung von dem Harz betrug der maximale prozentuale Anteil des DIL-, L/D-Enantiomerenpaars weniger als 0,75 Prozent, wie durch die RP-HPLC nachgewiesen wurde, was begründet, dass der Racemisierungsgehalt und damit die wirksame Ca-Methylierung weniger als 1 Prozent betrug.

Beispiel 10: Enzymatische Empfindlichkeit

Die Stabilität der N-permethylierten Verbindungen gegenüber der Proteolyse wurde für zwei permethylierte Sequenzen, AlaGlyGlyPheLeu-NH&sub2; (SEQ ID-Nr.: 37) und ArgGlyGlyPheLeu-NH&sub2; (SEQ ID-Nr.: 38) bestimmt wurde, wobei ihre nichtpermethylierten Äquivalente als Kontrolle verwendet wurden. Die Behandlung dieser Verbindungen mit Trypsin und Chymotrypsin wurde durch RP-HPLC und Massenspektralanalyse verfolgt. Es wurde eine sehr schnelle Spaltung von AGGFL-NH&sub2; (SEQ ID-Nr.: 37) durch Chymotrypsin und von RGGFL-NH&sub2; (SEQ ID-Nr.: 38) durch Trypsin beobachtet (< 1 Stunde), wohingegen für die äquivalenten permethylierten Peptide nach der Enzymeinwirkung über Nacht eine Spaltung von weniger als 1 Prozent festgestellt wurde. Diese Ergebnisse stimmen mit der Annahme überein, dass N-alkylierte Amide gegenüber dem enzymatischen Abbau weitaus weniger anfällig sind [Simon et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 9367-9371 (1992)].
Die Assays wurden in 1 ml 0,1 M NH&sub4;HCO&sub3;, pH 7,8 bei Raumtemperatur über einen Zeitraum von 16 Stunden mit einer Peptidkonzentration von 1 mg/ml durchgeführt. Die Konzentration an Enzym zu Peptid betrug 1 : 50.

Beispiel 11: Verwendung einer N-terminalen Tritylchlorid-Blockierungsgruppe

Aus Gründen der Einfachheit und des besseren Verständnis wird für die Synthesen dieses und jener nachfolgender Beispiele ein Dipeptid verwendet. Es sollte jedoch klar sein, dass die offenbarten Reaktionen in gleicher Weise auf Oligopeptidgemischsätze und insbesondere auf Oligopeptidgemischsätze mit einer Länge von mehr als zwei Resten angewendet werden können.
Ein Polypropylennetz-Päckchen, das 100 mg des festen Phe-Leu-Trägers [Methylbenzyhydrylamin- (MBHA) Harz; 0,7202 mMol/g primäre Aminogruppen] enthält, wurde mit DGM (1 · 1 Minute · 5 ml), 5 Prozent DIEA/DCM (3 · 2 Minuten · 5 ml) und DCM (2 · 1 Minute · 5 ml) gewaschen. Danach wurden dem Peptid-Harz 3,6 ml DCM und 0,364 ml DIEA (2,0886 mMol) zugesetzt, gefolgt von der Zugabe von 100,4 mg Tritylchlorid (TrtCl) (0,3601 mMol). Das Reaktionsgemisch wurde eine Stunde geschüttelt. Das Peptid-Harz wurde mit DMF (2 · 1 Minute · 5 ml), 5 Prozent DIEA/DCM (1 · 2 Minuten · 5 ml), DCM (3 · 1 Minute · 5 ml) und MeOH (1 · 1 Minute · 5 ml) gewaschen. Eine kleine Probe des Peptid-Harzes wurde mittels des Bromphenolblau-Tests [Krchnak et al., Collect. Czech. Chem. Commun., 53: 2542-2548 (1988)] auf verbliebene freie Aminogruppen untersucht. War eine weitere TrtCl- Kupplung erforderlich, wurde ein Lösungsmittelgemisch von DCM/DMF 9 : 1 oder 8 : 2 verwendet. Das gebildete Trt-Phe-Leu-MBHA-Harz wurde im Hochvakuum getrocknet (Gefriertrocknungsanlage).
Alle Arbeitsschritte wurden unter Stickstoffatmosphäre und wasserfreien Bedingungen ausgeführt. Dem in einem Polypropylennetz-Päckchen enthaltenen Trt-Phe-Leu- MBHA-Harz (0,07202 mMol Peptid, 0,14404 mMol Amidgruppen) wurde Lithium-tert- butoxid in THF (5,76 ml, 0,5 M; 2,8808 mMol) zugesetzt und das Reaktionsgemisch wurde 15 Minuten bei Raumtemperatur geschüttelt. Die basische Lösung wurde durch eine Spritze entfernt. Es wurden 5,76 ml DMSO und das Alkylierungsreagenz, hier 0,538 ml Jodmethan (8,6424 mMol), zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde 15 Minuten bei Raumtemperatur geschüttelt. Bei der Anwendung von Alkylierungsmitteln, wie Allylbromid oder Benzylbromid, betrug die Reaktionszeit zwei Stunden. Das Peptid-Harz wurde mit DMF (3 · 1 Minute · 5 ml), IPA (2 · 1 Minute · 5 ml), DCM (3 · 1 Minute · 5 ml) und MeOH (1 · 1 Minute · 5 ml) gewaschen und im Hochvakuum getrocknet (Gefriertrocknungsanlage). Das gesamte Alkylierungsverfahren wurde wiederholt.
Das alkylierte N-Trityl-blockierte Peptid-Harz wurde mit DCM (1 · 1 Minute · 5 ml) gewaschen und nachfolgend mit 2 Prozent TFA in DMF (1 · 2 Minuten · 5 ml und 1 · 30 Minuten · 5 ml) behandelt, gefolgt von den einminütigen Waschschritten mit DCM (1 · 5 ml), IPA (2 · 5 ml), DCM (2 · 5 ml) und MeOH (1 · 5 ml). Das entstehende, deblockierte Peptid stand dann zur N-terminalen Alkylierung oder zur Verwendung als freies Amin zur Verfügung. Das entstehende Träger gebundene Peptid kann als Phe-(NMe)Leu-(NMe)-MBHA-Harz bezeichnet werden.

Beispiel 12: N-terminale reduktive Alkylierung

Das in Beispiel 11 hergestellte Phe-(NMe)Leu-(NMe)-MBHA-Harz (0,07202 mMol primäres Amin) befand sich in einem Polypropylennetz-Päckchen und es wurde mit DCM (1 · 1 Minute · 5 ml), 5 Prozent DIEA/DCM (3 · 2 Minuten · 5 ml) und DCM (2 · 1 Minute · 5 ml) gewaschen. Danach wurden dem Peptid-Harz 8,6 ml DCM und 0,1455 ml DIEA (0,835 mMol) zugesetzt, gefolgt von der Zugabe von 37,825 mg 4,4'-Dimethoxydiphenylmethylchlorid (DodCl) (0,14404 mMol). Das Gemisch wurde 30 Minuten geschüttelt. Das Peptid-Harz wurde mit DMF (2 · 1 Minute · 5 ml), 5 Prozent DIEA/DCM (1 · 2 Minuten · 5 ml) und DCM (3 · 1 Minute · 5 ml) gewaschen. Eine Probe des Peptid-Harzes wurde mittels des Bromphenolblau-Tests auf verbliebene freie Aminogruppen getestet. Falls erforderlich, wurde die Reaktion durch eine verlängerte Kupplung (1 Stunde) wiederholt. Das so hergestellte blockierte, Träger- gekuppelte Peptid kann als Dod-Phe-(NMe)Leu-(NMe)-MBHA-Harz bezeichnet werden.
Formaldehyd (10 ml, 37 Gew.-% in Wasser), 90 ml DMF und 30 g wasserfreies Magnesiumsulfat wurden gemischt und über Nacht geschüttelt, zentrifugiert und der Überstand wurde wie folgt für die reduktive Methylierung verwendet. Die so hergestellte Formaldehyd-Lösung (8,5 ml) wurde dem Dod-Phe-(NMe)Leu-(NMe)-MBHA- Harz (0,07202 mMol Peptid), das sich in einem Polypropylennetz-Beutel befand, zugesetzt und 5 Minuten geschüttelt. Die Lösung wurde ausgegossen. Es wurden weitere 8,5 ml Formaldehyd-Lösung mit 0,085 ml Essigsäure zugesetzt und geschüttelt. Nach 5 Minuten wurden 85 mg Natrimcyanoborhydrid zugesetzt und das Gemisch wurde eine Stunde geschüttelt. Das Peptid-Harz wurde mit DMF (3 · 1 Minute · 5 ml), IPA (2 · 1 Minute · 5 ml), DCM (3 · 1 Minute · 5 ml) und MeOH (1 · 1 Minute · 5 ml) gewaschen. Das so hergestellte blockierte, N-alkylierte (N-methylierte) Träger-gekuppelte Peptid kann als Me-Dod-Phe-(NMe)Leu-(NMe)-MBHA-Harz bezeichnet werden.
Das Peptid-Harz wurde mit DCM (1 · 1 Minute · 5 ml) gewaschen und anschließend mit 55 Prozent TFA in DCM (1 · 5 Minuten · 5 ml und 1 · 30 Minuten · 5 ml) behandelt, gefolgt von den einminütigen Waschschritten mit DCM (1 · 5 ml), IPA (2 · 5 ml) und DCM (2 · 1 ml). Das so gebildete Peptid-Harz kann als Me-Phe-(NMe)Leu-(NMe)- MBHA-Harz bezeichnet werden.
Es sollte augenscheinlich sein, dass das Methyl in der vorstehend genannten reduktiven Alkylierungsreaktion durch jede beliebige der anderen in Betracht kommenden C&sub2;-C&sub7;-Alkylgruppen ersetzt werden kann, indem geeignete Aldehyde oder Ketone verwendet werden. Das N-terminale monoalkylierte Peptid oder die Bibliothek von Peptiden, die durch die vorstehend genannten Verfahren entstehen, können einzelnen verwendet werden, wenn so hergestellt, als Gemisch verwendet werden oder sie können an einen anderen Aminosäurerest gebunden werden und die Kette verlängern.
Die vorstehenden Ausführungen sind als Veranschaulichung der vorliegenden Erfindung zu verstehen, jedoch nicht als deren Einschränkung. Eine Vielzahl von Variationen und Modifizierungen können erfolgen, ohne vom Umfang der Erfindung, wie er in den Ansprüchen definiert wird, abzuweichen.

Sequenzliste (Sequence Listing)

(1) Allgemeine Information:
(1) Anmelder: Houghten, Richard A.
Ostrech, John M.
Blondelle, Sylvie
(ii) Titel der Erfindung: Peralkylierte Oligopeptidgemische
(iii) Anzahl der Sequenzen: 38
(iv) Korrespondenzadresse:
(A) Adressat: Welsh & Katz, Ltd.
(B) Straße: 135 South LaSalle Street, Suite 1625
(C) Stadt: Chicago
(D) Staat: Illinois
(E) Land: USA
(F) PLZ: 60603
(v) Computerlesbare Form:
(A) Mediumtyp: Floppy Disk
(B) Computer: IBM PC-kompatibel
(C) Betriebssystem: PC-DOS/MS-DOS
(D) Software: PatentIn Release #1,0, Version #1,25
(vi) Derzeitige Anmeldedaten:
(A) Anmeldungsnummer:
(B) Datum der Anmeldung:
(C) Klassifikation:
(vii) Voranmeldedaten:
(A) Anmeldungsnummer: US 08/079 144
(B) Datum der Anmeldung: 13. Juni 1993
(viii) Anwalt/Agenturinformation:
(A) Name: Gamson, Edward P.
(B) Registriernummer: 29 381
(ix) Telekommunikationsinformation:
(A) Telefon: 312-781-9470
(B) Telefax: 312-781-9548
(2) Information zu SEQ ID-Nr.: 1:
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(i) Sequenzcharakteristika:
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(ii) Molekültyp: Peptid
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(i) Sequenzcharakteristika:
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(i) Sequenzcharakteristika:
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(i) Sequenzcharakteristika:
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(i) Sequenzcharakteristika:
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(B) Lokalisation: 1 .. 6
(D) Andere Information:/Bemerkung: "Dies ist ein permethyliertes Peptid" (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID-Nr.: 28:
(2) Information zu SEQ ID-Nr.: 29:
(i) Sequenzcharakteristika:
(A) Länge: 6 Aminosäuren
(B) Typ: Aminosäure
(D) Topologie: linear
(ii) Molekültyp: Peptid
(ix) Merkmal:
(A) Name/Schlüssel: Peptid
(B) Lokalisation: 1 .. 6
(D) Andere Information:/Bemerkung: "Dies ist ein permethyliertes Peptid" (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID-Nr.: 29:
(2) Information zu SEQ ID-Nr.: 30:
(i) Sequenzcharakteristika:
(A) Länge: 6 Aminosäuren
(B) Typ: Aminosäure
(D) Topologie: linear
(ii) Molekültyp: Peptid
(ix) Merkmal:
(A) Name/Schlüssel: Peptid
(B) Lokalisation: 1 .. 6
(D) Andere Information:/Bemerkung: "Dies ist ein permethyliertes Peptid" (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID-Nr.: 30:
(2) Information zu SEQ ID-Nr.: 31:
(i) Sequenzcharakteristika:
(A) Länge: 6 Aminosäuren
(B) Typ: Aminosäure
(D) Topologie: linear
(ii) Molekültyp: Peptid
(ix) Merkmal:
(A) Name/Schlüssel: Peptid
(B) Lokalisation: 1 .. 6
(D) Andere Information:/Bemerkung: "Dies ist ein permethyliertes Peptid" (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID-Nr.: 31:
(2) Information zu SEQ ID-Nr.: 32:
(i) Sequenzcharakteristika:
(A) Länge: 6 Aminosäuren
(B) Typ: Aminosäure
(D) Topologie: linear
(ii) Molekültyp: Peptid
(ix) Merkmal:
(A) Name/Schlüssel: Peptid
(B) Lokalisation: 1 .. 6
(D) Andere Information: /Bemerkung: "Dies ist ein permethyliertes Peptid" (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID-Nr.: 32:
(2) Information zu SEQ ID-Nr.: 33:
(i) Sequenzcharakteristika:
(A) Länge: 6 Aminosäuren
(B) Typ: Aminosäure
(D) Topologie: linear
(ii) Molekültyp: Peptid
(ix) Merkmal:
(A) Name/Schlüssel: Peptid
(B) Lokalisation: 1 .. 6
(D) Andere Information:/Bemerkung: "Dies ist ein permethyliertes Peptid" (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID-Nr.: 33:
(2) Information zu SEQ ID-Nr.: 34:
(i) Sequenzcharakteristika:
(A) Länge: 6 Aminosäuren
(B) Typ: Aminosäure
(D) Topologie: linear
(ii) Molekültyp: Peptid
(ix) Merkmal:
(A) Name/Schlüssel: Peptid
(B) Lokalisation: 1 .. 6
(D) Andere Information:/Bemerkung: "Dies ist ein permethyliertes Peptid" (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID-Nr.: 34:
(2) Information zu SEQ ID-Nr.: 35:
(i) Sequenzcharakteristika:
(A) Länge: 6 Aminosäuren
(B) Typ: Aminosäure
(D) Topologie: linear
(ii) Molekültyp: Peptid
(ix) Merkmal:
(A) Name/Schlüssel: Peptid
(B) Lokalisation: 1 .. 5
(D) Andere Information:/Bemerkung: "Dies ist ein permethyliertes Peptid. Xaa kann in der ersten Position entweder Trimethylammonium-Leu oder Trimethylammonium-Phe sein; Xaa kann in der dritten Position entweder His oder Phe sein; Xaa kann in der fünften Position entweder Ile oder Phe sein und Xaa kann in der sechsten Position entweder Methylcarboxamid-His oder Methylcarboxamid- Phe sein. Wenigstens einer von Xaa in der fünften oder sechsten Position ist Phe." (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID-Nr.: 35:
(2) Information zu SEQ ID-Nr.: 36:
(i) Sequenzcharakteristika:
(A) Länge: 4 Aminosäuren
(B) Typ: Aminosäure
(D) Topologie: linear
(ii) Molekültyp: Peptid
(ix) Merkmal:
(A) Name/Schlüssel: Peptid
(B) Lokalisation: 1 .. 4
(D) Andere Information:/Bemerkung: "Dies ist ein permethyliertes Peptid" (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID-Nr.: 36
(2) Information zu SEQ ID-Nr.: 37:
(i) Sequenzcharakteristika:
(A) Länge: 5 Aminosäuren
(B) Typ: Aminosäure
(D) Topologie: linear
(ii) Molekültyp: Peptid
(ix) Merkmal:
(A) Name/Schlüssel: Peptid
(B) Lokalisation: 1 .. 5
(D) Andere Information:/Bemerkung: "Dies ist ein permethyliertes Peptid" (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID-Nr.: 37:
(2) Information zu SEQ Ip-Nr.: 38:
(i) Sequenzcharakteristika:
(A) Länge: 5 Aminosäuren
(B) Typ: Aminosäure
(D) Topologie: linear
(ii) Molekültyp: Peptid
(ix) Merkmal:
(A) Name/Schlüssel: Peptid
(B) Lokalisation: 1 .. 5
(D) Andere Information:/Bemerkung: "Dies ist ein permethyliertes Peptid" (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID-Nr.: 38:

Claims

1. Satz linearer peralkylierter Oligopeptidketten, wobei jedes Mitglied des Satzes die gleiche Anzahl von zwei bis zehn peralkylierten Aminosäureresten in jeder Kette enthält, das Peptidylaminostickstoffatom jedes peralkylierten Aminosäurerests, ausgenommen Prolin, mit einer C&sub1;-C&sub7;-Alkylgruppe alkyliert ist, es eine oder mehrere vorbestimmte Positionen der peralkylierten Oligopeptidketten gibt, in der alle von den Mitgliedern des Satzes miteinander die gleichen peralkylierten Aminosäurereste ("vorbestimmte Reste") aufweisen und es eine oder mehrere andere Positionen der peralkylierten Oligopeptidketten gibt, in denen es mindestens sechs verschiedene peralkylierte Aminosäurereste in den Mitgliedern des Satzes gibt ("variable Reste"), die verschiedenen Mitglieder des Satzes in äquimolaren Mengen vorhanden sind, das amino-terminale Ende jedes peralkylierten Oligopeptids aus der Gruppe, bestehend aus einer quaternären C&sub1;-C&sub7;-Alkylammoniumgruppe, einer Aminogruppe, einer N-C&sub1;-C&sub7;- Alkylamino-, einer N-C&sub1;-C&sub7;-Alkyl-N-C&sub1;-C&sub1;&sub8;-kohlenwasserstoffoyl- und einer Pyroglutamoylgruppe ausgewählt ist, und das carboxy-terminale Ende aus der Gruppe, bestehend aus einem C&sub1;-C&sub7;-Alkylcarbonsäureester, Mono- oder Di-N- C&sub1;-C&sub7;-alkylcarboxamid und einer Carboxylgruppe, ausgewählt ist.

2. Satz peralkylierter Oligopeptidketten nach Anspruch 1, wobei sich einer oder mehrere der vorbestimmten Reste an einer vorbestimmten Position, die zu einem Ende benachbart ist, befinden.

3. Satz peralkylierter Oligopeptidketten nach Anspruch 2, wobei das eine Ende das amino-terminale Ende ist.

4. Satz peralkylierter Oligopeptidketten nach Anspruch 3, wobei die ersten zwei vorbestimmten Reste dem amino-terminalen Ende benachbart sind.

5. Satz peralkylierter Oligopeptidketten nach Anspruch 1, wobei die variablen Reste sich an einer oder mehreren Positionen befinden, die zu einem Ende benachbart sind.

6. Satz peralkylierter Oligopeptidketten nach Anspruch 5, wobei das eine Ende das carboxy-terminale Ende ist.

7. Satz peralkylierter Oligopeptidketten nach Anspruch 1, wobei jede Kette fünf bis acht peralkylierte Aminosäurereste enthält.

8. Satz peralkylierter Oligopeptidketten nach Anspruch 1, wobei jeder vorbestimmte Rest einer von mindestens zehn verschiedenen peralkylierten Aminosäureresten ist und die Mitglieder des Satzes die gleichen mindestens zehn verschiedenen peralkylierten Aminosäurereste an der einen oder den mehreren anderen Positionen der peralkylierten Oligopeptidketten aufweisen.

9. Bibliothek linearer peralkylierter Oligopeptide, die eine Vielzahl von Sätzen an linearen C&sub1;-C&sub7;-Alkyl-peralkylierten Oligopeptidketten nach Anspruch 1 umfasst, worin das lineare peralkylierte Oligopeptidketten-Mitglied jedes Satzes die gleiche Anzahl von zwei bis zehn peralkylierten Aminosäureresten in jeder peralkylierten Oligopeptidkette enthält, wobei sich jeder Satz der Bibliothek von den anderen Sätzen in:

(a) der Position des einen oder der mehreren vorbestimmten Reste,

(b) der Identität des einen oder der mehreren vorbestimmten Reste, oder

(c) sowohl der Position als auch der Identität des einen oder der mehreren vorbestimmten Reste unterscheidet.

10. Bibliothek nach Anspruch 9, wobei jeder peralkylierte Oligopeptid-Satz Kettenmitglieder mit einer Länge von fünf bis acht peralkylierten Aminosäureresten enthält.

11. Bibliothek nach Anspruch 9, wobei die Identität des einen oder der mehreren vorbestimmten Reste zwischen den Sätzen verschieden ist.

12. Bibliothek nach Anspruch 11, wobei jeder Satz nur eine einzige, durch einen vorbestimmten Rest besetzte Kettenposition besitzt, wobei die verbleibenden Kettenpositionen durch die variablen Reste besetzt werden und jeder Satz eine Kettenlänge von mindestens fünf peralkylierten Aminosäureresten aufweist.

13. Bibliothek nach Anspruch 11, wobei der eine oder die mehreren vorbestimmten Reste eines Satzes sich an einer vorbestimmten Position befinden, die zu einem Ende benachbart ist.

14. Bibliothek nach Anspruch 9, wobei sich jede der Vielzahl von Sätzen von den anderen Sätzen durch sowohl die Position in der peralkylierten Oligopeptidkette als auch die Identität des einen oder der mehreren vorbestimmten Reste unterscheidet.

15. Bibliothek nach Anspruch 14, wobei jede der peralkylierten Oligopeptidketten eine Länge von fünf bis acht peralkylierten Aminosäureresten besitzt.

16. Verfahren zur Bestimmung der Sequenz eines linearen peralkylierten Oligopeptids, das vorzugsweise an einen Akzeptor bindet, umfassend die Schritte:

(a) Bereitstellung einer Bibliothek nach Anspruch 9, wobei sich die Sätze darin unterscheiden, dass der eine oder die mehreren vorbestimmten Reste in jedem Satz sich zwischen den Sätzen unterscheiden;

(b) gesonderte Anmischung jedes Satzes der Bibliothek mit dem Akzeptor in einem wässrigen Medium bei einer festgelegten Konzentration von 0,1 Milligramm pro Liter bis 100 Gramm pro Liter, gesondertes Assay der Bindung jedes Satzes an den Akzeptor und Bestimmung eines Satzes, der eine in Bezug auf die anderen Sätze bevorzugte spezifische Bindung aufweist, wodurch ein peralkylierter Aminosäurerest, der eine bevorzugte Bindung an die eine oder die mehreren vorbestimmten Position(en) liefert, identifiziert wird;

(c) Bereitstellung einer zweiten Bibliothek nach Anspruch 9, wobei die linearen peralkylierten Oligopeptidketten-Mitglieder die gleiche Anzahl von zwei bis zehn peralkylierten Aminosäureresten in jeder peralkylierten Oligopeptidkette wie die Ketten der erstgenannten Bibliothek von Sätzen enthalten, wobei die Kettenmitglieder von jeder der zweiten Bibliothek von Sätzen den einen oder die mehreren peralkylierten Aminosäurerest(e) des erstgenannten Satzes, der bzw. die als eine bevorzugte, spezifische Bindung in derselben einen oder denselben mehreren vorbestimmten Kettenposition(en) des erstgenannten Satzes aufweisend identifiziert wurde(n), enthalten, wobei die Kettenmitglieder des zweiten Satzes eine vorbestimmte der mindestens sechs verschiedenen peralkylierten Aminosäureseitenketten an einer anderen vorbestimmten Position der peralkylierten Oligopeptidkette, die sich von der einen oder den mehreren Positionen des identifizierten peralkylierten Aminosäurerests der erstgenannten Bibliothek von Sätzen unterscheidet, aufweisen, wobei jeder der Sätze der zweiten Bibliothek äquimolare Mengen der mindestens sechs verschiedenen peralkylierten Aminosäurereste der erstgenannten Sätze an der gleichen einen oder den gleichen mehreren Positionen der peralkylierten Oligopeptidkette, die nicht von dem einen oder den mehreren identifizierten peralkylierten Aminosäureresten oder den vorbestimmten peralkylierten Aminosäureresten besetzt sind, aufweist, mit einer der weniger peralkylierten Oligopeptidpositionen, die durch äquimolare Mengen von mindestens sechs verschiedenen peralkylierten Aminosäureresten besetzt sind, und mit den gleichen amino- und carboxy-terminalen Enden wie in den peralkylierten Oligopeptiden des erstgenannten Satzes;

(d) gesonderte Anmischung jedes Satzes der zweiten Bibliothek von Sätzen mit dem Akzeptor in einem wässrigen Medium bei einer festgelegten Konzentration von 0,1 Milligramm pro Liter bis 100 Gramm pro Liter, gesondertes Assay der Bindung jedes Satzes an den Akzeptor und Bestimmung eines zweiten Satzes, der eine bevorzugte spezifische Bindung zeigt, wodurch eine peralkylierte Aminosäureseitenkette identifiziert wird, die eine bevorzugte Bindung an die andere vorbestimmte Position in der peralkylierten Oligopeptidkette liefert;

(e) Wiederholung der Schritte (c) und (d) unter Verwendung von null bis sieben weiteren Bibliotheken nach Anspruch 9 anstelle der zweiten Bibliothek von Sätzen oder bis eine bevorzugte, spezifische Bindung nicht mehr ansteigt, wenn eine weitere Bibliothek untersucht wird, wobei jede weitere Bibliothek von Sätzen lineare peralkylierte Oligopeptidketten- Mitglieder umfasst, welche die gleiche Anzahl von zwei bis zehn peralkylierten Aminosäureresten in jeder peralkylierten Oligopeptidkette wie die Ketten der erstgenannten Bibliothek von Sätzen enthalten, wobei die Kettenmitglieder der Sätze von jeder weiteren Bibliothek die peralkylierten Aminosäurereste in den peralkylierten Oligopeptidkettenpositionen, die eine bevorzugte Bindung in einer der unmittelbar vorher verwendeten Bibliothek von Sätzen aufweisen und einen vorbestimmten der mindestens sechs verschiedenen peralkylierten Aminosäurereste an einer anderen vorbestimmten Position der peralkylierten Oligopeptidkette, die sich von den Positionen der identifizierten peralkylierten Aminosäurereste der unmittelbar vorher verwendeten Bibliothek von Sätzen unterscheidet, enthalten, wobei jede der weiteren Bibliothek von Sätzen äquimolare Mengen der mindestens sechs verschiedenen peralkylierten Aminosäurereste der erstgenannten Sätze in der gleichen einen oder den gleichen mehreren Positionen der peralkylierten Oligopeptidkette, die nicht durch die identifizierten peralkylierten Aminosäurereste oder die vorbestimmten peralkylierten Aminosäurereste besetzt sind, aufweist, mit den gleichen amino- und carboxy-terminalen Enden wie in den peralkylierten Oligopeptiden des erstgenannten Satzes;

(f) wenn die zuletzt untersuchte Bibliothek von Sätzen eine erhöhte bevorzugte spezifische Bindung im Vergleich zu der unmittelbar vorher verwendeten Bibliothek aufweist und eine Position der peralkylierten Oligopeptidkette, die eine bevorzugte spezifische Bindung liefert, nicht identifiziert ist, Bereitstellen von mindestens sechs peralkylierten Oligopeptidketten, in denen jede Kette die gleiche Anzahl von zwei bis zehn peralkylierten Aminosäureresten in jeder peralkylierten Oligopeptidkette, wie die Ketten der erstgenannten Bibliothek von Sätzen enthält, wobei jede peralkylierte Oligopeptidkette die identifizierten peralkylierten Aminosäurereste in den peralkylierten Oligopeptidkettenpositionen, die eine erhöhte bevorzugte spezifische Bindung in dem unmittelbar vorangegangenen Assay von Schritt (e) aufweisen und eine vorbestimmte der mindestens sechs verschiedenen peralkylierten Aminosäurereste an einer anderen vorbestimmten Position in der peralkylierten Oligopeptidkette, die sich von den Positionen der identifizierten peralkylierten Aminosäurereste, die in dem unmittelbar vorausgegangenen Assay von Schritt (e) verwendet wurden, unterscheidet, enthält, mit den gleichen amino- und carboxy-terminalen Enden wie in den peralkylierten Oligopeptiden des erstgenannten Satzes; und

(g) gesonderte Anmischung jedes der mindestens sechs peralkylierten Oligopeptide von Schritt (f) mit dem Akzeptor in einem wässrigen Medium bei einer Konzentration an peralkyliertem Oligopeptid von 0,1 Milligramm bis 100 Gramm pro Liter, gesondertes Assay der Bindung jedes peralkylierten Oligopeptids und Bestimmung des peralkylierten Oligopeptids, das eine bevorzugte spezifische Bindung aufweist, wodurch die Sequenz eines linearen peralkylierten Oligopeptids, das bevorzugt an den Akzeptor bindet, bestimmt wird.

17. Verfahren nach Anspruch 16, wobei die identifizierten und vorbestimmten peralkylierten Aminosäurereste zu den peralkylierten Resten benachbart sind.

18. Verfahren nach Anspruch 17, wobei der eine oder die mehreren vorbestimmten der mindestens sechs peralkylierten Aminosäurereste an einer oder mehreren vorbestimmten Positionen von (a) eine terminale Wiederholungseinheitsposition der peralkylierten Oligopeptidkette einschließen.

19. Verfahren nach Anspruch 17, wobei die erstgenannten peralkylierten Oligopeptidketten fünf bis acht peralkylierte Aminosäurereste enthalten.

20. Verfahren nach Anspruch 17, wobei anstelle von mindestens sechs mindestens zehn verschiedene peralkylierte Aminosäurereste verwendet werden.

21. Verfahren nach Anspruch 17, wobei der eine oder die mehreren vorbestimmten mindestens sechs verschiedenen peralkylierten Aminosäurereste in einer oder mehreren vorbestimmten Positionen der Sätze von (a) die gleichen sind wie die mindestens sechs verschiedenen, in äquimolaren Mengen vorhandenen peralkylierten Aminosäurereste.

22. Verfahren nach Anspruch 16, wobei der Akzeptor ein zellulärer Rezeptor ist.

23. Verfahren nach Anspruch 22, wobei der zelluläre Rezeptor in einem Bakterium oder in einer Hefezelle, in Wachstumsmedium gezüchtet, vorhanden ist.

24. Verfahren nach Anspruch 22, wobei jeder peralkylierte Oligopeptidsatz an einen festen Träger gekuppelt bereitgestellt wird.

25. Verfahren zur Bestimmung der Sequenz eines linearen peralkylierten Oligopeptids, das bevorzugt an einen Akzeptor bindet, umfassend die Schritte:

(a) der Bereitstellung gesonderter Vielzahlen von Sätzen linearer peralkylierter Oligopeptide nach Anspruch 1, wobei die Mitglieder jedes Satzes dieser Vielzahlen die gleiche Anzahl von zwei bis zehn peralkylierten Aminosäureresten in jeder Kette enthalten;

(b) der gesonderten Anmischung jedes Satzes mit dem Akzeptor in einem wässrigen Medium bei einer festgelegten Konzentration von 0,1 Milligramm pro Liter bis 100 Gramm pro Liter und gesondertes Assay der Bindung von jedem Satz an den Akzeptor;

wobei der peralkylierte Aminosäurerest, der eine bevorzugte spezifische Bindung an jeder peralkylierten Position der peralkylierten Oligopeptidkette von jedem Satz aufweist, die Sequenz eines peralkylierten linearen Oligopeptids, das bevorzugt an den Akzeptor bindet, bereitstellt.

26. Verfahren nach Anspruch 25, wobei die einzelnen vorbestimmten Positionen der Vielzahl von Sätzen, als Gruppe genommen, in der peralkylierten Oligopeptidkette zueinander benachbart sind.

27. Verfahren nach Anspruch 25, wobei jede peralkylierte Oligopeptidkette fünf bis acht peralkylierte Aminosäurereste enthält.

28. Verfahren nach Anspruch 25, wobei der einzige vorbestimmte peralkylierte Aminosäurerest jeder peralkylierten Oligopeptidkette einer von mindestens zehn verschiedenen peralkylierten Aminosäureresten ist und die gleichen mindestens zehn verschiedenen peralkylierten Aminosäurereste in äquimolaren Mengen an den anderen peralkylierten Oligopeptidpositionen jedes Satzes vorhanden sind.

29. Permethyliertes Oligopeptid der Formel

Xaa&sub1;PheXaa&sub3;PheXaa&sub5;Xaa&sub6; (SEQ ID Nr. 35),

worin Xaa&sub1; an der ersten Position ein α-Trimethylammonium-Leu- oder -Phe- Rest ist;

Xaa&sub3; an der dritten Position Ile oder Phe ist;

Xaa&sub5; an der fünften Position His oder Phe ist; und

Xaa&sub6; an der sechsten Position ein C-terminales N-Methylcarboxamid-His oder -Phe ist, mit der Maßgabe, dass mindestens eines von Xaa&sub5; und Xaa&sub6; Phe ist, wobei Leu, Phe, Ile und His permethylierte Leucin-, Phenylalanin-, Isoleucin- bzw. Histidinreste darstellen.

30. Permethyliertes Oligopeptid nach Anspruch 29, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus den SEQ ID Nr. 23, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33 und 34, nämlich

Phe-Phe-Phe-Phe-Phe-Phe

Leu-Phe-Ile-Phe-Phe-Phe

Phe-Phe-Ile-Phe-Phe-Phe

Leu-Phe-Phe-Phe-Phe-Phe

Phe-Phe-Phe-Phe-His-Phe

Leu-Phe-Ile-Phe-Phe-His

Leu-Phe-Phe-Phe-His-Phe

Leu-Phe-Ile-Phe-His-Phe

Leu-Phe-Phe-Phe-Phe-His

Phe-Phe-Ile-Phe-Phe-His

31. Permethyliertes α-N-terminales Trimethylammonium C-terminales N- Methylamidoligophenylalanin mit 5 bis 8 permethylierten Phenylalaninresten.

32. Permethyliertes Oligophenylalanin nach Anspruch 31 mit 6, 7 oder 8 permethylierten Phenylalaninresten.

33. Satz linearer peralkylierter Oligopeptidketten nach Anspruch 1, wobei jedes der Mitglieder des Satzes an einen festen Träger durch eine selektiv trennbare Bindung gebunden ist.

34. Satz an einen festen Träger gebundener peralkylierter Oligopeptidketten nach Anspruch 33, wobei der eine oder die mehreren vorbestimmten Reste sich an einer vorbestimmten Position, die zu einem Ende benachbart ist, befinden.

35. Satz an einen festen Träger gebundener peralkylierter Oligopeptidketten nach Anspruch 33, wobei die variablen Reste sich an einer oder mehreren Position(en), die zu einem Ende benachbart sind, befinden.

36. Satz an einen festen Träger gebundener peralkylierter Oligopeptidketten nach Anspruch 33, wobei jede Kette fünf bis acht peralkylierte Aminosäurereste enthält.

37. Satz an einen festen Träger gebundener peralkylierter Oligopeptidketten nach Anspruch 33, wobei der eine oder die mehreren vorbestimmten Reste einer von mindestens zehn verschiedenen peralkylierten Aminosäureresten ist und die Mitglieder des Satzes die gleichen mindestens zehn verschiedenen peralkylierten Aminosäurereste an der einen oder den mehreren anderen Positionen der peralkylierten Oligopeptidketten aufweisen.

38. Satz an einen festen Träger gebundener peralkylierter Oligopeptidketten nach Anspruch 33, wobei eine Kettenposition von einem von mindestens sechs verschiedenen der peralkylierten Aminosäurereste besetzt ist und alle anderen Kettenpositionen von den äquimolaren Mengen der mindestens sechs verschiedenen Aminosäurereste besetzt sind.