DE69429419T2

DE69429419T2 - Ein inhibitor der collagenstimulierten plättchenaggregation

Info

Publication number: DE69429419T2
Application number: DE69429419T
Authority: DE
Inventors: Juergen Hemberger; Guido Melzer
Original assignee: Merck Patent GmbH
Current assignee: Merck Patent GmbH
Priority date: 1993-07-01
Filing date: 1994-06-28
Publication date: 2002-08-01
Anticipated expiration: 2014-06-29
Also published as: EP0662088A1; PT662088E; CZ52895A3; AU7383694A; NO950732L; SK282961B6; RU2160280C2; WO1995001375A1; KR20040030124A; HU9500613D0; NO320150B1; PL307726A1; CZ287472B6; ZA944738B; ATE210679T1; SK27095A3; ES2169080T3; KR100445309B1; HU214580B; DE69429419D1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein neues Protein mit einer starken Inhibitorwirkung auf die Kollagenstimulierte Blutplättchenaktivierung und -aggregation und vor allem mit einer Fähigkeit zur Verhinderung von Wechselwirkungen zwischen Kollagen und von-Willebrand- Faktor.
Die normale Blutstillung bei Menschen wird über eine komplexe Folge miteinander verwandter Mechanismen reguliert, an denen sowohl zellulare als auch humorale biochemische Bestandteile beteiligt sind. Auf dem biochemischen Reaktionsweg liegen Verletzung von intakten Endothelzellen, Stimulierung der Blutplättchen und Aktivierung von Blutgerinnungsmechanismen. Eines der ersten Ereignisse nach Beschädigung einer Gefäßwand ist, daß das Subendothelium dem Blut ausgesetzt wird. Man nimmt an, daß subendotheliales Kollagen eines der frühesten Stimuli ist, die zur Anhaftung von Blutplättchen mit nachfolgender Formänderung, Aggregation und Thrombusbildung führen.
Daher ist ein therapeutischer Eingriff auf der Ebene der Blutplättchenanhaftung und/oder Blutplättchenaggregation zur Prevention oder Behandlung der meisten thrombotischen Erkrankungen geeignet.
Es ist bekannt, daß der Speichel von Blutegeln mehrere Stoffe enthält, die in der Lage sind, die Blutplättchenaggregation zu inhibieren:
Eine gut bekannte Verbindung ist beispielsweise Hirudin (Merck Index 1983, Nr. 4613; FEBS Lett. 165, 180 (1984)). Hirudin verhindert Thrombin-induzierte Blutplättchenaggregation durch Bindung an Thrombin in einem 1 : 1-stöchiometrischen Komplex. Dies wiederum inhibiert die Thrombin-katalysierte Umsetzung von Fibrinogen zu Fibrin.
Ein aus dem Speichel von Hirudinidae abgeleiteter, niedrigmolekularer Antagonist zum Rezeptor-vermittelten blutplättchenaktivierenden Faktur (platelet activating factor = PAF) mit einer inhibierenden Aktivität gegen von Aggregationsmitteln wie PAF-acether induzierter Blutplättchenaggregation ist in EP-A-0348208 offenbart. Eine Kollagenase, die Kollagen mittels hydrolytischer Spaltung von Peptidbindungen in helikalen Bereichen des Kollagenmoleküls spezifisch abbaut, ist in WO 87/00860 offenbart.
Der medizinische Blutegel (Hirudo medicinalis) benutzt nicht nur Hirudin, um Thrombusbildung an der Bißstelle zu vermeiden. Ein sehr ausgeprägtes Merkmal eines Bisses durch diesen Blutegel ist, daß die Blutung mehr als 10 und bis zu 24 Std. anhält, wohingegen Hirudin innerhalb von 15 bis 30 min aus der Wunde herausgewaschen zu werden scheint. Daher müssen neben Hirudin andere Prinzipien für diesen Effekt verantwortlich sein.
Kürzlich wurde ein Protein aus Hirudo medicinalis mit einem Molekulargewicht von 65 kD und unter dem Namen "Calin" beschrieben (WO 92/07005), das in der Lage ist, Kollagen-stimulierte Blutplättchenaggregation zu verhindern.
Ein weiterer niedrigmolekularer (16 kD) Inhibitor der Kollagen-induzierten Blutplättchenaggregation mit dem Namen LAPP wurde in Haementeria officinalis gefunden (EP-A-0480651).
Für keines dieser Proteine konnte gezeigt werden, daß sie das wichtige Merkmal der von-Willebrand- Faktor- (vWF-)vermittelten Blutplättchenanhaftung beeinflussen.
Dieser Faktor ist ein komplexes multimeres Glycoprotein, das eine wesentliche Rolle bei der Funktion von Blutplättchen spielt. Er wird für die normale Anhaftung von Blutplättchen an exponiertes Subendothelium und für normale Blutplättchen-Pfropfbildung an Stellen mit verletzten Gefäßen benötigt. Die vWF-Wirkung ist besonders wichtig bei Gefäßen mit kleinem Durchmesser, in denen Bedingungen von hoher Wandschergeschwindigkeit vorherrschen. Man hat jetzt erkannt, daß die der vWF-Wirkung zugrundeliegenden Mechanismen eine Wechselwirkung sowohl mit Bestandteilen des Subendotheliums als auch mit spezifischen Rezeptoren auf der Blutplättchenmembran umfassen (Ruggeri et al., 1992, Meth. Enz. 215, 263- 275).
Daher würde eine negative Einwirkung eines entsprechenden Proteins auf vWF einen zusätzlichen Vorteil in therapeutischen Anwendungen liefern.
Es hat sich nun herausgestellt, daß ein neues Protein mit einem Molekulargewicht von 14,5-15 kD eine starke Inhibitorwirkung auf Kollagen-stimulierte Blutplättchenaggregation und -anhaftung bewirkt und vor allem Wechselwirkungen zwischen Kollagen und vWF verhindert.
Es ist daher die Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein weitgehend reines Protein mit einer Fähigkeit zur Inhibierung von Kollagen-stimulierter Blutplättchenaggregation und zur Verhinderung von Wechselwirkungen zwischen Kollagen und vWF bereitzustellen, das aus dem Speichel des medizinischen Blutegels Hirudo medicinalis erhältlich ist.
Das neue erfindungsgemäße Protein hat ein Molekulargewicht von 14,5-15,0 kD (abhängig von den verwendeten Methoden) und verhindert Wechselwirkungen zwischen Kollagen und vWF. Verglichen mit diesen Ergebnissen, hat das bekannte LAPP ein Molekulargewicht von 16 kD und ist aus Haementeria officinalis isoliert worden. Ein Einfluß von LAPP auf vWF konnte bis jetzt nicht gezeigt werden. Ein weiteres wichtiges Merkmal ist, daß die Aminosäuresequenzen von LAPP und dem erfindungsgemäßen Protein (Brandinin) unterschiedlich sind.
Diese und andere weiter unten veranschaulichten Unterschiede unterscheiden das Protein gemäß der vorliegenden Erfindung von anderen Proteinen mit Blutplättchenaggregation inhibierender Aktivität.
Das Protein der vorliegenden Erfindung schließt Variationen des offenbarten gereinigten Proteins, die die Aktivität des isolierten Proteins bewahren, mit ein, einschließlich Fragmenten, Untereinheiten, natürlich vorkommenden Mutationen und willkürlich erzeugten künstlichen Mutanten. Hybridproteine wie etwa aus dem offenbarten Protein abgeleitete Fusionsproteine sind ebenfalls mit eingeschlossen.
Ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist weiterhin eine Methode zur Herstellung des neuen Proteins unter Verwendung per se bekannter Standardtechniken.
Daher ist ein Gegenstand der Erfindung die Bereitstellung eines Verfahrens zur Herstellung eines weitgehend reinen Proteins mit einer Fähigkeit zur Inhibierung Kollagen-stimulierter Blutplättchenaggregation und zur Verhinderung von Wechselwirkungen zwischen Kollagen und von-Willebrand-Faktor und mit einem Molekulargewicht von 14,5 bis 15 kD, dadurch gekennzeichnet, daß es aus dem Speichel des medizinischen Blutegels Hirudo medicinalis, gegebenenfalls durch eine Ein-Schritt-Reinigung über präparative Elektrophorese, isoliert und gereinigt wird.
Ein typisches erfindungsgemäßes Verfahren besteht in der Rekonstituierung von lyophilisiertem Rohspeichel von Hirudo medicinalis in einem herkömmlichen Puffersystem bei pH 7,5-8,5 und Reinigung durch wenigstens einen herkömmlichen Chromatographieschritt, vorzugsweise einer Gelpermeationschromatographie.
Die vorliegende Erfindung betrifft zusätzlich pharmazeutische Formulierungen und medizinische Vorrichtungen.
Somit ist ein weiterer Gegenstand der Erfindung die Bereitstellung einer pharmazeutischen Formulierung, die als aktiven Bestandteil ein wie oben und in den Ansprüchen definiertes Protein umfaßt, das mit einem oder mehreren pharmazeutisch tolerierbaren Trägern, Hilfsstoffen oder Verdünnungsmitteln dafür assoziiert ist.
Die erfindungsgemäßen pharmazeutischen Formulierungen können gegebenenfalls zusätzliche aktive Bestandteile wie Antikoagulantien, wie z. B. Hirudin oder Heparin, oder thrombolytische Mittel, wie z. B. Plasminogenaktivator oder Hementin, umfassen.
Das neue Protein bzw. die pharmazeutischen Formulierungen der vorliegenden Erfindung können für die Behandlung verschiedener Thromboembolieerkrankungen, einschließlich Venenthrombose, peripherer Arterienthrombose, zerebrovaskulärer Thrombose und Myocardinfarkt, als auch für Patienten mit arteriovenösen Shunts oder vor einer koronaren Bypassoperation verwendet werden. Die Formulierungen können auch für die Behandlung von Autoimmunkrankheiten, einschließlich Lupus erythematodes, rheumatoider Arthritis und Polyarthritis nodosa, verwendet werden. Die Formulierungen dieser Erfindung sind auch zur Simulierung des Phänomens der langanhaltenden Blutung, die nach Blutegelbissen beobachtet wird, geeignet und können daher Blutegel vollständig oder teilweise in solchen Anwendungen, die gegenwärtig für eine Blutegeltherapie indiziert sind, ersetzen.
Das erfindungsgemäße neue Protein kann mit beliebigen nichttoxischen, organischen oder anorganischen Säuren pharmazeutisch tolerierbare Salze bilden. Bei den anorganischen Säuren handelt es sich beispielsweise um Salz-, Bromwasserstoff-, Schwefel- oder Phosphorsäure und um Metallsalze von Säuren, wie z. B. Dinatriumhydrogenphosphat und Kaliumhydrogensulfat. Bei den organischen Säuren handelt es sich beispielsweise um Mono-, Di- und Tricarbonsäuren wie z. B. Essig-, Glykol-, Milch-, Brenztrauben-, Malon-, Bernstein-, Glutar-, Fumar-, Äpfel-, Wein-, Zitronen-, Ascorbin-, Malein-, Hydroxymalein-, Benzoe-, Hydroxybenzoe-, Phenylessig-, Zimt-, Salicyl- und Sulfonsäure, wie z. B. Methansulfonsäure. Zu den Salzen des carboxyterminalen Aminosäureanteils zählen die nichttoxischen Carbonsäuresalze, die mit beliebigen geeigneten anorganischen oder organischen Basen gebildet werden. Zu diesen Salzen zählen beispielsweise Alkalimetalle wie z. B. Natrium und Kalium, Erdalkalimetalle wie z. B. Calcium und Magnesium, Leichtmetalle der Gruppe IIIA einschließlich Aluminium und organische primäre, sekundäre und tertiäre Amine wie z. B. Trialkylamine, einschließlich Triethylamin, Procain, Dibenzylamin, 1-Ethenamin, N,N'-Dibenzylethylendiamin, Dihydroabietylamin und N-Alkylpiperidin.
Die erfindungsgemäßen Formulierungen können als Dosierungseinheiten, die herkömmliche nichttoxische pharmazeutisch tolerierbare Träger, Verdünnungsmittel, Adjuvantien und für die parenterale Verabreichung typische Hilfsmittel enthalten, verabreicht werden. Der Ausdruck "parenteral" schließt hierbei subkutane, intravenöse, intraarterielle und intratracheale Injektions- und Infusionstechniken mit ein. Die erfindungsgemäßen Dosierungseinheiten können die täglich benötigten Mengen an erfindungsgemäßem Protein oder deren die gewünschte Dosis bildenden Bruchteile enthalten. Die optimale therapeutisch vertretbare Dosis für einen bestimmten Patienten (Säugetiere, einschließlich Mensch) hängt von verschiedenen Faktoren ab, wie z. B. der Aktivität des eingesetzten spezifischen aktiven Materials, dem Alter, Körpergewicht, allgemeinen Gesundheitszustand, Geschlecht, Ernährung, Verabreichungszeitpunkt und -weg, Clearancegeschwindigkeit, usw. Daher liegt die für die Inhibierung der Stimulierung der Blutplättchenaggregation durch Kollagen notwendige Blutkonzentration vorzugsweise in einem Bereich von 0,1 mg/l-50 mg/l.
Der hier verwendete Ausdruck "pharmazeutisch tolerierbarer Träger" bedeutet ein inertes, nichttoxisches festes oder flüssiges Füll-, Verdünnungs- oder Umhüllungsmaterial, das keinen negativen Effekt auf die wirksame Verbindung oder auf den Patienten hat. Geeignete, vorzugsweise flüssige Träger sind im Stand der Technik gut bekannt, z. B. steriles Wasser, Kochsalzlösung, wäßrige Dextrose- und Zuckerlösungen, Ethanol, Glykole und Öle, einschließlich derjenigen auf Petroleumbasis oder von tierischer, pflanzlicher oder synthetischer Herkunft, z. B. Erdnußöl, Sojaöl und Mineralöl. Erfindungsgemäße Träger sind auch pharmazeutisch tolerierbare Gele oder Cremes, die zur Beschichtung von medizinischen Vorrichtungen, die üblicherweise aus Kunststoff und synthetischen Fasern bestehen (siehe unten), vor Gebrauch geeignet sind.
Ein weiterer Gegenstand dieser Erfindung ist die Bereitstellung einer implantierbaren oder extrakorporalen medizinischen Vorrichtung zur Verwendung bei Kontakt mit Körperflüssigkeiten, welche, um die Vorrichtungsoberfläche weitgehend thromboresistent zu machen, mit einem wie oben und in den Ansprüchen definierten immobilisierten Protein beschichtet wird. Das erfindungsgemäße Protein wird so auf der medizinischen Vorrichtung immobilisiert, daß es die Oberfläche biokompatibel und thromboresistent macht. Solche Vorrichtungen besitzen manchmal benetzbare Oberflächen, die typischerweise Blutplättchenaggregation induzieren, was nachteilig für ihre beabsichtigte Verwendung in implantierbaren und extrakorporalen Vorrichtungen, die in Kontakt mit Blut oder anderen Körperflüssigkeiten stehen, ist. Bei solchen Vorrichtungen handelt es sich beispielsweise um Prothesen, künstliche Organe, Nähte, künstliche Gefäßabschnitte, Katheter, Dialyseapparate, Röhrchen und blutbeinhaltende Gefäße.
Die Methoden zur Beschichtung der medizinischen Vorrichtungen und zur Immobilisierung der Proteine werden nach Standardtechniken durchgeführt (z. B. US 4.885.207).
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist schließlich die Verwendung eines wie oben und in den Ansprüchen definierten Proteins für die Herstellung eines Medikaments zur Verhinderung Kollagenstimulierter Blutplättchenaggregation und der Bindung von vWF an Kollagen in vitro und in vivo und für extrakorporale Behandlungen.

Kurzbeschreibung der Abbildungen:

Fig. 1: Reinigung von Brandinin aus Blutegelspeichel durch Gelpermeationschromatographie. Einzelheiten sind in Beispiel 2 wiedergegeben. Die dunkelschraffierten Bereiche zeigen die aktiven Fraktionen an. Die Zahlen unter der Kurve (3-14) bezeichnen die Fraktionen.
Fig. 2: Reinigung von Brandinin durch SDS-Gelelektrophorese. Einzelheiten sind in Beispiel 4 wiedergegeben. Bezeichnet sind die Fraktionsnummern (8-12) und Marker (M). Im Assay gemäß Beispiel 1 sind die Fraktionen 10 und 11 positiv.
Fig. 3: Eichkurve der kollagenolytischen Aktivität, gemessen mit AzocollR. Einzelheiten sind in Beispiel 4 wiedergegeben. Vertikale Achse: optische Dichte (OD) bei 560 nm; Horizontale Achse: Kollagenaseaktivität (mU/Assay).
Fig. 4a: Dosisabhängige Inhibierung der Kollagenstimulierten Blutplättchenaggregation. Einzelheiten sind in Beispiel 5 wiedergegeben. Vertikalachse: % Aggregation, Horizontalachse: Brandininkonzentration (nM).
Fig. 4b: Spezifität von Kollagen für die Inhibierung der Blutplättchenaggregation. Einzelheiten sind in Beispiel 5 wiedergegeben. Vertikalachse: % Aggregation, Horizontalachse: 1 = Kontrolle, 2 = Kollagen, 3 = ADP.
Fig. 5: Dosisabhängige Inhibierung der Bindung von vWF an Kollagen. Einzelheiten sind in Beispiel 6 wiedergegeben. Vertikalachse: optische Dichte (OD) bei 405 nm; Horizontalachse: Konzentration des gereinigten Proteins (nM). ---- ---- Gereinigtes Protein; ---- ---- Kontrolle ohne Protein
Die vorliegende Erfindung wird durch die folgenden Beispiele näher beschrieben:

Beispiel 1

In-vitro-Aktivität des Proteins aus Hirudo medicinalis als Inhibitor der Kollagen-stimulierten Blutplättchenaggregation

Im Rohspeichel von Hirudo medicinalis kann man eine Aktivität nachweisen, die in einer dosisabhängigen Weise die Aggregation von Blutplättchen in blutplättchenreichem Plasma (platelet-rich plasma = PRP), verursacht durch die Anwesenheit von Kollagen, inhibiert.
Von Freiwilligen wurde Blut mit Natriumcitrat in einer Endkonzentration von 0,38% entnommen. Blutplättchenreiches und blutplättchenarmes Plasma wurden über Differentialzentrifugation hergestellt.
Die Blutplättchenaggregation wurde im Aggregometer PAP-4 (Biodata) durchgeführt, indem unterschiedliche Konzentrationen an Kollagen hormR (Hormonchemie) zugegeben wurden. Als Parameter diente die maximale Extinktion nach Zugabe des Kollagens. Antithrombosemittel setzen die Werte herab.
Der oben beschriebene Assay wurde in allen Experimenten verwendet, um die Reinigung des Proteins zu verfolgen bzw. das reine erfindungsgemäße Protein zu charakterisieren.

Beispiel 2

Isolierung und chromatographische Reinigung des Proteins

Das erfindungsgemäße Protein konnte aus Rohspeichel von Hirudo medicinalis isoliert werden. Lyophilisierter Speichel wurde in 20 mM Tris-HCl, 10 mM CaCl&sub2; pH 8,0 (TC-Puffer) in einer Konzentration von 20 mg/ml rekonstituiert. Der Speichel wurde auf eine CM-FraktogelR-Säule (E. Merck, Darmstadt, BRD) aufgetragen und mit einem NaCl-Gradienten im gleichen Puffer eluiert. Die in dem in Beispiel 1 beschriebenen Blutplättcheninhibierungsassay aktiven Säulenfraktionen enthielten keine weitere Hirudinaktivität. Die abschließende Reinigung wurde mit einer Gelpermeationschromatographie auf einer Diol-modifizierten Kieselgelsäule in 20 mM Tris-HCl, 10 mM CaCl&sub2;, 200 mM NaCl pH 8,0 (TCN-Puffer) durchgeführt. Ein typisches Beispiel dieses Reinigungsschrittes ist in Fig. 1 dargestellt. Die Ausbeute an gereinigtem Protein war 5%, bezogen auf die Menge an Protein im Rohspeichel. In weiteren Experimenten wurden Ausbeuten zwischen 2 und 7% erreicht.

Beispiel 3

Ein-Schritt-Reinigung des Proteins durch präparative Elektrophorese

In einem alternativen Verfahren konnte das Protein durch präparative Elektrophorese in einem Schritt erfolgreich isoliert werden. Ein zylinderförmiges Polyacrylamidgel mit typischerweise 10% Acrylamid wurde in die "Prep-Cell"R-Apparatur (Biorad, München, BRD) gemäß den Angaben des Herstellers polymerisiert. Die Probe wurde in Elektrophoresepuffer aufgetragen. Während der Elektrophorese diente eine zur Elektrophoreserichtung senkrechte Pufferströmung dazu, eluierte Proteine zu einem Fraktionssammler zu transportieren. Die Fraktionen wurden über analytische SDS-Polyacrylamid-Elektrophorese analysiert und gemäß dem Molekulargewicht von 15,0 kD gepoolt. In einem weiteren veränderten Experiment wurde ein Molekulargewichtswert von 14,5 kD bestimmt.

Beispiel 4

Charakterisierung des Proteins

Das gereinigte Protein mit einer Aktivität gemäß Beispiel 1 zeigte ein Molekulargewicht von ungefähr 15000 D in einer SDS-PAGE unter reduzierenden Bedingungen. Fig. 2 zeigt aktive Fraktionen einer typischen Gelpermeationschromatographie, beschrieben in Beispiel 2. Die Proteinbanden auf dem Gel wurden durch Silberfärbung sichtbar gemacht.
Unter Verwendung einer unten beschriebenen bevorzugten Assaymethode konnten wir bei dem gereinigten Protein keine proteolytische Aktivität nachweisen. Durch resorufinR (Boehringer, Mannheim, BRD) kovalent modifiziertes Kasein wurde als Substrat verwendet, mit Proteinase K als positiver Kontrolle. 50 ul einer Lösung aus 0,4% resorufinmarkiertem Kasein wurden mit 50 ul 200 mM Tris, 20 mM CaCl&sub2; pH 7,8 und 100 ul Probenlösung versetzt. Nach Inkubation von bis zu 24 Std. bei 37ºC wurde die Reaktion durch Zugabe von 450 ul einer 5% Trichloressigsäurelösung beendet. Die Reaktionsmischung wurde zentrifugiert, und 400 ul des Überstands wurden in eine Küvette mit 600 ul 500 mM Tris pH 8, 8 überführt. Unmittelbar danach wurde die Absorption bei 574 nm abgelesen. 24stündige Inkubationen zeigten signifikante proteolytische Aktivität im Rohspeichel, wohingegen beim gereinigten Protein leicht unterhalb des Hintergrundniveaus liegende Absorptionswerte beobachtet wurden (Tab. 1, siehe unten).
Neben der oben beschriebenen proteolytischen Aktivität hat der Rohspeichel auch kollagenolytische Aktivität. Eine bevorzugte Methode, um diese Aktivität zu messen, ist die Verwendung von Azocoll, einem nichtspezifischen chromogenen Kollagenasesubstrat, in der folgenden Weise. AzocollR (Calbiochem) wurde in 50 mM Tris, 200 mM NaCl, 0,1% Brij 35, 0,01% NaN&sub3; pH 8,0 (Puffer A) in einer Konzentration von 20 mg/ml suspendiert und zweimal über Zentrifugation, Absaugen und Resuspendierung gewaschen. 100 ul der Probe oder der Pufferkontrolle wurden in die Vertiefungen einer 96-Well- Mikrotiterplatte als Verdünnungsreihe in Puffer A pipettiert, gefolgt von 100 ul Azocollsuspension. Diese Mischung wurde bei 37ºC typischerweise 18 Std. inkubiert. Um die Reaktion zu beenden, wurde unverdautes Substrat durch Zentrifugation bei 1000 xg 10 min lang sedimentiert. Die Überstände wurden auf eine neue Mikrotiterplatte überführt und die Absorption wurde bei 560 nm abgelesen. Kollagenase aus Clostridium histolyticum (Sigma) wurde zur Herstellung von Eichkurven verwendet (Fig. 3). Tab. 1: Proteolytische Aktivität in Speichel und gereinigtem Protein
bedeutet +/- Standardabweichung, n = 3 Experimente
Tab. 2 enthält die Ergebnisse von typischen Messungen mit diesem Assay. Im Gegensatz zu Rohspeichel und einem weiteren Hirudo-Protein mit Namen Calin (WO 92/07005), das Aktivität im Azocoll-Assay zeigte, wurde überraschenderweise gefunden, daß das gereinigte Protein gemäß der vorliegenden Erfindung keine signifikante kollagenolytische Aktivität oberhalb des Hintergrundniveaus besaß. Tab. 2: Kollagenolytische Aktivität im Azocoll-Assay

Beispiel 5

Dosisabhängige Inhibierung der Blutplättchenaggregation durch das gereinigte Protein

Blutplättchenreiches Plasma wurde 2 Minuten bei 37ºC mit der Testverbindung inkubiert und durch Zugabe von Kollagen in einer Endkonzentration von 1,25 ug/ml aggregiert. Das Protein der vorliegenden Erfindung (Brandinin) zeigte einen IC&sub5;&sub0; von etwa 15 nM. In weiteren Experimenten wurden Ergebnisse zwischen 0,5 und 100 nM erhalten. Der Speichel-Rohextrakt zeigte Inhibierung von Kollagen-stimulierter ebenso wie von ADP-stimulierter Blutplättchenaggregation. Im Gegensatz dazu war Brandinin in der höchsten verfügbaren Konzentration unwirksam. Einzelheiten sind den Fig. 4a und 4b zu entnehmen.

Beispiel 6

Inhibierung der Bindung von vWF an Kollagen in vitro durch das gereinigte Protein

Neben der Inhibierung der direkten Wechselwirkung von Blutplättchen mit Kollagen hat das gereinigte Protein gemäß der vorliegenden Erfindung die überraschende zusätzliche Fähigkeit, mit der Bindung von vWF zu interferieren.
Dies wurde durch Beschichtung von 96-Well-Mikrotiterplatten mit 5 ug Kollagen Typ I aus Pferdesehne pro Vertiefung gezeigt. Kollagen wurde in 0,1 M Essigsäure gelöst und 18 Std. gegen Phosphatpuffer pH 7,2 dialysiert. Nach 1stündiger Inkubation bei 37ºC wurden die Vertiefungen mit 250 ul 10 mg/ml BSA in PBS-Puffer blockiert und dreimal mit BSA-freiem PBS-Puffer gewaschen. 25 ul Probe mit dem Protein gemäß der vorliegenden Erfindung und anschließend 75 ul Humanplasma, 1 : 80 verdünnt in PBS mit 5 mM EDTA, 0,1% BSA, 0,001% Tween 80 pH 7,4 wurden zugegeben und 2 Std. bei 37ºC inkubiert. Nach abermaligem Waschen wurde das gebundene vWF mit 100 ul 1/4000-verdünntem, mit Meerrettichperoxidase konjugiertem, polyklonalem Kaninchen-Anti-vWF-Antiserum (Dako, Kopenhagen, Dänemark) nachgewiesen. Das Antiserum wurde 1 Std. bei 37ºC inkubiert. Die Farbentwicklung erfolgte mit ABTS bei 37ºC für 30 min und die Messung bei 405 nm. In einigen Experimenten wurde anstelle von Humanplasma gereinigter vWF-Faktor (Servio, Remagen, BRD) verwendet, mit gegenüber der Plasmamessung sehr ähnlichen Ergebnissen.
Die Bindung von vWF sowohl aus Plasma als auch in gereinigter Form ließ sich durch Brandinin, dem gereinigten Protein gemäß der vorliegenden Erfindung, in einer dosisabhängigen Art und Weise verhindern. 50% Inhibierung unter Standardbedingungen entsprach ungefähr 40 nM (Bereich von 0,5 nM bis 100 nM) (Fig. 5).
Über die Bindung an Kollagen umfaßt Brandinin nicht nur die Inhibierung der Wechselwirkung von Blutplättchen mit Kollagen, sondern auch der Bindung von von- Willebrand-Faktor an diese subendotheliale Matrixkomponente.

Claims

1. Weitgehend reines Protein mit einer Fähigkeit zur Inhibierung Kollagen-stimulierter Blutplättchenaggregation und zur Verhinderung von Wechselwirkungen zwischen Kollagen und von Willebrand-Faktor (vWF), wobei das Protein ein Molekulargewicht von 14,5 bis 15 kD besitzt und aus dem Speichel des medizinischen Blutegels Hirudo medicinalis erhältlich ist.

2. Verfahren zur Herstellung eines weitgehend reinen Proteins mit einer Fähigkeit zur Inhibierung Kollagen-stimulierter Blutplättchenaggregation und zur Verhinderung von Wechselwirkungen zwischen Kollagen und von-Willebrand-Faktor (vWF) und mit einem Molekulargewicht von 14,5 bis 15 kD, dadurch gekennzeichnet, daß es aus dem Speichel des medizinischen Blutegels Hirudo medicinalis isoliert und gereinigt wird.

3. Verfahren gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Protein aus dem Rohmaterial über präparative Elektrophorese in einem Schritt isoliert wird.

4. Pharmazeutische Formulierung umfassend als aktiven Bestandteil ein Protein gemäß Anspruch 1, welches mit einem oder mehreren pharmazeutisch tolerierbaren Trägern, Hilfsstoffen oder Verdünnungsmitteln dafür assoziiert ist.

5. Pharmazeutische Formulierung gemäß Anspruch 4, weiterhin umfassend ein thrombolytisches Mittel oder ein Antikoagulans.

6. Pharmazeutische Formulierung gemäß Anspruch 4 oder 5, wobei der Träger eine Gelbasis oder Creme umfaßt, die zur Beschichtung einer medizinischen Vorrichtung vor Gebrauch geeignet ist.

7. Implantierbare oder extrakorporale medizinische Vorrichtung zur Verwendung bei Kontakt mit Körperflüssigkeiten, welche, um die Vorrichtungsoberfläche weitgehend biokompatibel und thromboresistent zu machen, mit einem immobilisierten Protein gemäß Anspruch 1 beschichtet ist.

8. Verwendung eines Proteins gemäß Anspruch 1 für die Herstellung eines Medikaments zur Verhinderung von Blutplättchenaggregation in vitro und in vivo und für extrakorporale Behandlungen.

9. Verwendung eines Proteins gemäß Anspruch 1 für die Herstellung eines Medikaments zur Verhinderung der Bindung von von-Willebrand-Faktor (vWF) an Kollagen in vitro und in vivo und für extrakorporale Behandlungen.