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DE69428451T2 - Rekombinante herstellung von neuen polyketiden - Google Patents

Rekombinante herstellung von neuen polyketiden

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Publication number
DE69428451T2
DE69428451T2 DE69428451T DE69428451T DE69428451T2 DE 69428451 T2 DE69428451 T2 DE 69428451T2 DE 69428451 T DE69428451 T DE 69428451T DE 69428451 T DE69428451 T DE 69428451T DE 69428451 T2 DE69428451 T2 DE 69428451T2
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DE
Germany
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pks
activity
cells
vector
module
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Application number
DE69428451T
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English (en)
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DE69428451D1 (de
Inventor
Suzanne Ebert-Khosla
Hong Fu
A. Hopwood
Camilla Kao
Chaitan Khosla
Robert Mcdaniel
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Innes John Institute
Leland Stanford Junior University
Original Assignee
Innes John Institute
Leland Stanford Junior University
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Publication date
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Priority claimed from US08/238,811 external-priority patent/US5672491A/en
Application filed by Innes John Institute, Leland Stanford Junior University filed Critical Innes John Institute
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Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein Polyketide und Polyketid-Synthasen. Im besonderen betrifft die Erfindung die rekombinante Herstellung von Polyketiden unter Verwendung eines neuartigen Wirts-Vektorsystems.
    • Hintergrund der Erfindung
  • Bei Polyketiden handelt es sich um eine große, strukturell mannigfaltige Familie natürlicher Produkte. Polyketide verfügen über einen breiten Bereich biologischer Aktivitäten, einschließlich antibiotischer und pharmakologischer Eigenschaften. Zum Beispiele für die Polyketide sind Antibiotika wie Tetracycline und Erythromycin, Antitumormitteln einschließlich Daunomycin, Immunsuppressiva, z. B. FK506 und Rapamycin, und veterinärmedizinische Produkte wie Monensin und Avermectin. Polyketide kommen in den meisten Gruppen von Organismen vor und finden sich in besonders reicher Zahl in einer Klasse von Myzelbakterien, den Actinomyzeten, welche verschiedene Polyketide produzieren.
  • Polyketid-Synthasen (PKS) stellen multifunktionelle, mit Fettsäure-Synthasen (FAS) verwandte Enzyme dar. PKS katalysieren die Biosynthese von Polyketiden durch wiederholte (decarboxylative) Claisen-Kondensationen zwischen Acylthioestern, gewöhnlich Acetyl, Propionyl, Malonyl und Methylmalonyl. Im Anschluß an jede Kondensation führen sie strukturelle Veränderlichkeit in das Produkt ein, indem sie einen reduktiven Zyklus, umfassend eine Ketoreduktion, Dehydratation und Enoylreduktion an der β-Ketogruppe der wachsenden Polyketidkette entweder vollständig, teilweise oder gar nicht katalysieren. Nachdem die Kohlenstoffkette zu einer für jedes spezifische Produkt charakteristischen Länge angewachsen ist, wird sie von der Synthase durch Thiolyse oder Acyltransfer freigesetzt. So bestehen PKS aus Familien von Enzymen, die zur Produktion eines gegebenen Polyketids zusammenarbeiten. Die kontrollierte Variation der Kettenlänge, die Wahl der Kettenbildenden Einheiten und der reduktive Zyklus, der genetisch in jede PKS einprogrammiert ist, stellen die Faktoren dar, die zu der Variation beitragen, die bei natürlich vorkommenden Polyketiden anzutreffen ist.
  • Es existieren zwei allgemeine Klassen von PKS. Eine Klasse, bekannt als Typ I PKS, ist dargestellt durch die PKS für Makrolide wie Erythromycin. Diese "komplexen" oder "modularen" PKS umfassen Anordnungen verschiedener großer multifunktioneller Proteine, die zwischen sich eine Gruppe separater aktiver Zenten für jeden Schritt der Kohlenstoffketten-Zusammensetzung und -Modifikation tragen (Cortes, J. et al. Nature (1990) 348: 176; Donadio, S. et al. Science (1991) 252: 675; MacNeil, D. J. et al. Gene (1992) 115: 119). Die strukturelle Vielfalt betrifft bei dieser Klasse von Variationen die Anzahl und Art der aktiven Zenten in den PKS. Diese Klasse von PKS zeigt eine Eins-zu-Eins-Korrelation zwischen der Anzahl und der Bündelung der aktiven Zenten in der Primärsequenz der PKS und der Struktur des Polyketid-Rückgrats.
  • Die zweite Klasse von PKS, genannt Typ II PKS, ist dargestellt durch die Synthasen für aromatische Verbindungen. Die Typ II PKS weisen eine einzelne Gruppe sich wiederholend vorkommender aktiver Zenten auf (Bibb, M. J. et al. EMBO J. (1989) 8: 2727; Sherman, D. H. et al. EMBO J. (1989) 8: 2717; Fernandez-Moreno, M. A. et al. J. Biol. Chem. (1992) 267: 19278).
  • Bei Streptomyces handelt es sich um eine Actinomyzete, die in reichlicher Menge aromatische Polyketide erzeugt. Bei jeder bisher untersuchten aromatischen PKS von Streptomyces erfordert die Zusammensetzung der Kohlenstoffkette die Produkte von drei offenen Leserastern (ORF). ORF1 kodiert für ein Ketosynthase-(KS)- und ein Acyltransferase-(AT)-aktives Zentrum; ORF2 kodiert für ein Protein ähnlich dem ORF1-Produkt, dem aber die KS- und AT-Motive fehlen; und ORF3 kodiert für ein einzelnes Acyl-Trägerprotein (ACP).
  • Streptomyces coelicolor produziert das blau pigmentierte Polyketid Actinorhodin. Der Actinorhodin-Gencluster (act) wurde kloniert (Malpartida, F. and Hopwood, D. A., Nature (1984) 309: 462; Malpartida, F. and Hopwood, D. A., Mol. Gen. Genet. (1986) 205: 66) und vollständig sequenziert (Fernandez-Moreno, M. A. et al., J. Biol. Chem. (1992) 267: 19278; Hallam, S. E. et al., Gene (1988) 74; :305; Fernandez-Moreno, M. A. et al., Cell (1991) 66: 769; Caballero, J. et al., Mol. Gen. Genet. (1991) 230: 401). Der Cluster kodiert für die oben beschriebenen PKS-Enzyme, eine Cyclase und eine Reihe von gezielt aufbauenden Enzymen, die beteiligt sind an den anschließenden Modifikationsreaktionen, die zu Actinorhodin führen, als auch für Proteine, die am Export des Antibiotikums beteiligt sind, und mindestens für ein Protein, das spezifisch die Transkription des Genclusters aktiviert. Andere Gene, die für die globale Regulierung der antibiotischen Biosynthese als auch für die Zuverfügungstellung von Starter-(Acetyl-CoA)- und Extender-(Malonyl-CoA)- Einheiten für die Polyketid-Biosynthese erforderlich sind, sind an anderer Stelle im Genom lokalisiert.
  • Der Act-Gencluster von S. coelicolor wurde zur Erzeugung von Actinorhodin in S. parvulus verwendet. Malpartida, F. and Hopwood, D. A., Nature (1984) 309: 462. Bartel et al., J. Bacteriol. (1990) 172: 4816-4826, erzeugten Aloesaponarin II rekombinant unter Verwendung von S. galilaeus, der mit einem S. coelicolor-ACT- Gencluster, bestehend aus vier genetischen Loci, actI, actIII, actIV und actVII, transformiert war. Hybrid-PKS, einschließlich des zugrundeliegenden act-Gensatzes, doch mit ACP-Genen, die aus Granaticin, Oxytetracyclin, Tetracenomycin und Frenolicin-PKS stammten, wurden ebenfalls konstruiert, die zur Exprimierung funktioneller Synthasen fähig sind. Khosla, C. et al., J. Bacteriol. (1993) 175: 2197- 2204. Hopwood, D. A. et al., Nature (1985) 314: 642-644, beschreiben die Herstellung von Hybrid-Polyketiden unter Anwendung rekombinanter Methoden. Sherman, D. H. et al., J. Bacteriol. (1992) 174: 6184-6190, berichtet von der Transformation verschiedener S. coelicolor-Mutanten, denen verschiedene Komponenten des act- PKS-Genclusters fehlten, mit den entsprechenden Granaticin-(gra)-Genen von S. violaceoruber, in trans.
  • In der veröffentlichten Internationalen Patentanmeldung WO93113663 ist die homologe Rekombination des Erythromycin-Gens mit seinem Sitz im Chromosom von S. erythraea zur Erzeugung einer modifizierten modularen PKS beschrieben.
  • McDaniel et al., Science, Dez. 1993, 262, 1546-1550 beschreibt die Einführung von Nukleinsäure, die für eine aromatische Substitutions-PKS kodiert, in 5. coelicolor- Zellen, denen der native aromatische PKS-Gencluster fehlt.
    • Zusammenfassung der Erfindung
  • Mit der vorliegenden Erfindung werden neuartige Polyketide bereitgestellt, ebenso wie neuartige Verfahren zur wirksamen Herstellung sowohl neuer als auch bekannter Polyketide unter Anwendung der Rekombinationstechnologie. Insbesondere wird ein neuartiges Wirts-Vektorsystem zur Erzeugung modularer PKS verwendet, welche wiederum die Erzeugung einer Vielzahl von Polyketiden katalysieren. Diese Polyketide sind als Antibiotika, Antitumormittel, Immunsuppressiva und für eine breite Vielfalt weiterer pharmakologischer Zwecke nützlich.
  • Bei einer Ausführungsform richtet sich die Erfindung auf gentechnisch veränderte Zeilen mit eingeführter Nukleinsäure, die für eine modulare Polyketid-Synthase (PKS) kodiert, enthaltend Module, welche Module jeweils mindestens eine PKS- Acyltransferase-(AT)-Aktivität, eine PKS-Ketoacyl-Trägerprotein-Synthase-(KS)- Aktivität und eine PKS-Acyl-Trägerprotein-(ACP)-Aktivität umfassen;
  • wobei die eingeführten PKS-Modul-kodierenden Nukleotidsequenzen an mindestens eine Kontrollsequenz funktionsfähig geknüpft sind, wobei die Zellen zur Erzeugung einer funktionellen modularen PKS fähig sind
  • wobei mindestens eine der Modul-kodierenden Nukleotidsequenzen für die funktionelle modulare PKS oder eine der Kontrollsequenzen heterolog zur Wirtszelle ist.
  • Diesen gentechnisch veränderten Zellen fehlt vorzugsweise praktisch der gesamte native PKS-Gencluster.
  • Bei besonders bevorzugten Ausführungsformen sind die gentechnisch veränderten Zellen Streptomyces coelicolor und fehlt den Zellen praktisch der gesamte native Actinorhodin-PKS-Gencluster.
  • Bei einer anderen Ausführungsform richtet sich die Erfindung auf ein Verfahren zur Herstellung eines rekombinanten Polyketids, umfassend:
  • (a) Bereitstellen einer Population von Zellen, wie oben beschrieben; und
  • (b) Züchten der Zellpopulation unter Bedingungen, bei denen der in den Zellen vorhandene Substitutions-PKS-Gencluster exprimiert wird.
  • Bei noch einer anderen Ausführungsform richtet sich die Erfindung auf ein Verfahren zur Herstellung eines rekombinanten Polyketids, umfassend:
  • a. Insertieren eines ersten Abschnitts eines Substitutions-PKS-Genclusters in ein Spender-Plasmid und Insertieren eines zweiten Abschnitts eines Substitutions-PKS- Genclusters in ein Empfänger-Plasmid, wobei die ersten und zweiten Abschnitte zusammengenommen für einen vollständigen Substitutions-PKS-Gencluster kodieren, und worin außerdem:
  • i. das Spender-Plasmid ein Gen exprimiert, das für einen ersten Selektionsmarker kodiert und zur Replikation bei einer ersten, zulässigen Temperatur fähig ist und zur Replikation bei einer zweiten, nicht-zulässigen Temperatur unfähig ist;
  • ii. das Empfänger-Plasmid ein Gen exprimiert, das für einen zweiten Selektionsmarker kodiert; und
  • iii. das Spender-Plasmid Regionen der DNA umfasst, die komplementär zu Regionen der DNA im Empfänger-Plasmid sind, so dass eine homologe Rekombination zwischen dem ersten Abschnitt des Substitutions-PKS- Genclusters und dem zweiten Abschnitt des Substitutions-Genclusters stattfinden kann, wodurch ein vollständiger Substitutions-Gencluster erzeugt werden kann;
  • b. Transformieren des Spender-Plasmids und des Empfänger-Plasmids in eine Wirtszelle und Züchten der transformierten Wirtszelle bei der ersten zulässigen Temperatur und unter Bedingungen, die das Wachstum der Wirtszellen zulassen, welche die ersten und/oder die zweiten Selektionsmarker exprimieren, um eine erste Population von Zellen zu erzeugen;
  • c. Züchten der ersten Zellpopulation bei der zweiten, nicht-zulässigen Temperatur und unter Bedingungen, die das Wachstum der Zellen zulassen, welche die ersten und/oder die zweiten Selektionsmarker exprimieren, um eine zweite Population von Zellen zu erzeugen, welche Wirtszellen umfasst, die ein rekombinantes Plasmid enthalten, umfassend einen vollständigen Substitutions-PKS-Gencluster;
  • d. Transferieren des rekombinanten Plasmids aus der zweiten Population von Zellen in die ausgewählten Wirtszellen zur Exprimierung des Substiutions-PKS- Genclusters; und
  • e. Züchten der transformierten gentechnisch veränderten Zellen unter Bedingungen, bei denen der in den Zellen vorhandene Substitutions-PKS-Gencluster exprimiert wird.
    • Kurze Beschreibung der Abbildungen
  • In Abb. 1 sind die Gencluster für act-, gra- und tcm-PKS und Cyclasen gezeigt. In Abb. 2 ist die Strategie zur Herstellung von S. coelicolor CH999 gezeigt. In Abb. 2A ist die Struktur des act-Genclusters dargestellt, wie im S. coelicolor CH1-Chromosom vorhanden. In Abb. 2B ist die Struktur von pLRemEts gezeigt, und in Abb. 2C ist der Abschnitt des CH999-Chromosoms mit dem deletierten act-Gencluster gezeigt.
  • In Abb. 3 ist ein Diagramm des Plasmids pRMS gezeigt.
  • In Abb. 4 ist ein Modell für die 6-Desoxyerythronolid-Synthase (DEBS) dargestellt.
  • In Abb. 5 ist die Strategie für die Konstruktion von rekombinanten modularen PKS gezeigt.
  • In Abb. 6 ist ein Diagramm des Plasmids pCK7 gezeigt.
    • Ausführliche Beschreibung der Erfindung
  • Bei der Ausführung der vorliegenden Erfindung werden, sofern nicht anders angegeben, herkömmliche Methoden der Chemie, Mikrobiologie, Molekularbiologie und DNA-Rekombinationstechnologie im Rahmen des Stands der Technik angewandt. Diese Methoden sind in der Fachliteratur umfassend erläutert. Siehe z. B. Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (aktuelle Auflage); DNA Cloning: A Practical Approach, Bd. I & II (D. Glover, Hrg.); Oligonucleotide Synthesis (N. Gait, Hrg., aktuelle Auflage); Nucleic Acid Hybridization (B. Hames & S. Higgins, Hrg., aktuelle Auflage); Transcription and Translation (B. Hames & S. Higgins, Hrg., aktuelle Auflage).
  • Wie in dieser Beschreibung und den Ansprüchen im Anhang verwendet, umfassen die Singularformen der direkten und indirekten Artikel auch deren Formen im Plural, sofern der Kontext nicht eindeutig anderes vorgibt. So umfasst die Bezugnahme auf "ein Polyketid", ein Gemisch von Polyketiden, die Bezugnahme auf "eine Polyketid- Synthase" Gemische von Polyketid-Synthasen und ähnliches.
    • A. Definitionen
  • Bei der Beschreibung der vorliegenden Erfindung werden die folgenden Begriffe verwendet, für die die unten angegebenen Definitionen gelten sollen.
  • Mit "Substitutions-PKS-Gencluster" ist jeglicher Satz von PKS-Genen gemeint, der zur Produktion eines funktionellen PKS fähig ist, wenn unter Anleitung eines oder mehrerer kompatibler Kontrollelemente, wie unten definiert, in einer damit transformierten Wirtszelle. Ein funktionelles PKS ist ein solches, das die Synthese eines Polyketids katalysiert. Der Begriff "Substitutions-PKS-Gencluster" umfasst ein oder mehrere Gene, die für die verschiedenen Proteine kodieren, die zum Katalysieren der Produktion eines Polyketids erforderlich sind. Ein "Substitutions- PKS-Gencluster" braucht nicht all jene Gene zu umfassen, die beim entsprechenden Cluster von Natur aus vorkommen. Vielmehr braucht der Gencluster lediglich für die erforderlichen PKS-Komponenten zu kodieren, die die Produktion eines aktiven Polyketids katalysieren. Umfasst der Gencluster also z. B. acht Gene in seinem nativen Zustand und sind lediglich drei dieser Gene zur Verfügbarmachung eines aktiven Polyketids erforderlich, so brauchen lediglich diese drei Gene vorhanden zu sein, wie weiter unten erläutert. Darüber hinaus kann der Cluster PKS-Gene umfassen, die von einer einzigen Spezies stammen, oder kann von hybridischer Natur mit z. B. einem Gen sein, das aus einem Cluster für die Synthese eines bestimmten Polyketids stammt, das mit einem entsprechenden Gen aus einem Cluster für die Synthese eines anderen Polyketids substituiert ist. Hybrid-Cluster können sowohl von Typ I- als auch Typ II-PKS stammende Gene umfassen. Wie oben erläutert, umfassen Typ I-PKS mehrere große multifunktionelle Proteine, die zwischen sich einen Satz separater aktiver Zentren für jeden Schritt der Kohlenstoffketten-Zusammensetzung und -Modifikation tragen. Typ II-PKS dagegen weisen eine einzelne Gruppe wiederholt vorkommender aktiver Zentren auf. Diese Klassifikationen sind wohlbekannt. Siehe z. B. Hopwood, D. A. und Khosla, C., Secondary metabolites; their function and evolution (1992) Wiley Chichester (Ciba Foundation Symposium 171) S. 88-112; Bibb, M. J. et al., EMBO J. (1989) 8: 2727; Sherman, D. H. et al., EMBO J. (1989) 8: 2717; Fernandenz-Moreno, M. A. et al., J. Biol. Chem. (1992) 267: 19278; Cortes, J. et al., Nature (1990) 348: 176; Donadio, S. et al., Science (1991) 252: 675; MacNeil, D. J. et al., Gene (1992) 115: 119. Hybrid- Cluster sind weiter unten beispielhaft veranschaulicht und beschrieben. Die im Gencluster enthaltenen Gene brauchen nicht die nativen Gene zu sein, sondern können auch deren Mutanten oder Analoga sein. Mutanten oder Analoga können durch Deletion, Insertion oder Substitution eines oder mehrerer Nukleotide der kodierenden Sequenz erhalten werden. Methoden zur Modifikation von Nukleotidsequenzen, wie z. B. die gerichtete Mutagenese (site directed mutagenesis), sind beschrieben z. B. bei Sambrook et al., supra; DNA Cloning, Bd. I und II, supra; Nucleic Acid Hybridization, supra.
  • Ein "Substitutions-PKS-Gencluster" kann auch Gene enthalten, die für durch die PKS katalysierte Modifikationen am Kern-Polyketid kodieren, einschließlich z. B. von Genen, die für Hydroxylasen, Methylasen oder andere Alkylasen, Oxidasen, Reduktasen, Glycotransferasen, Lyasen, Ester oder Amidsynthäsen, und verschiedene Hydrolasen wie Esterasen und Amidasen kodieren.
  • Wie weiter unten erläutert, brauchen die im Substitutions-Gencluster enthaltenen Gene nicht auf demselben Plasmid zu liegen, oder können, wenn auf demselben Plasmid vorhanden, durch dieselben oder unterschiedliche Kontrollsequenzen kontrolliert werden.
  • "Gentechnisch veränderte Wirtszellen" sind Wirtszellen, bei denen der native PKS- Gencluster unter Anwendung rekombinanter DNA-Methoden deletiert wurde. Nicht von dem Begriff umfasst sind also natürlich vorkommende Mutationsereignisse. Eine "Wirtszelle" stellt eine Zelle dar, die aus einem prokaryontischen Mikroorganismus oder einer eukaryontischen Zelllinie, gezüchtet als eine unizelluläre Einheit, stammt, die als ein Empfänger für rekombinante Vektoren verwendet werden kann oder wurde, die die PKS-Gencluster der Erfindung tragen. Der Begriff umfasst die Nachkommen der ursprünglichen Zelle, welche transfiziert wurde. Natürlich brauchen die Nachkommen einer einzelnen Stammzelle hinsichtlich der Morphologie oder des genomischen oder gesamten DNA-Komplements zum ursprünglichen Eiter aufgrund einer versehentlichen oder willkürlichen Mutation nicht notwenigerweise vollkommen identisch sein kann. Die Nachkommen der Stammzelle, die dem Eiter ausreichend ähneln, um durch die relevante Eigenschaft charakterisiert zu sein, wie z. B. das Vorhandensein einer für ein gewünschtes PKS kodierenden Nukleotidsequenz, sind von dieser Definition umfasst und durch die obigen Begriffe abgedeckt.
  • Der Begriff "heterolog", sofern er Nukleinsäure-Sequenzen, z. B. kodierende Sequenzen und Kontrollsequenzen betrifft, kennzeichnet Sequenzen, die normalerweise nicht mit einer Region eines rekombinanten Konstrukts in Verbindung stehen und/oder normalerweise nicht mit einer bestimmten Zelle assoziiert sind. So handelt es sich bei einer "heterologen" Region eines Nukleinsäure-Konstrukts um ein identifizierbares Segment einer Nukleinsäure innerhalb oder gebunden an ein anderes Nukleinsäure-Molekül, das in Verbindung mit dem anderen Molekül von Natur aus nicht angetroffen wird. Zum Beispiel könnte eine heterologe Region eines Konstrukts eine kodierende Sequenz umfassen, die durch Sequenzen flankiert ist, die in Verbindung mit der codierenden Sequenz von Natur aus nicht vorkommen. Ein anderes Beispiel einer heterologen kodierenden Sequenz stellt ein Konstrukt dar, bei dem die kodierende Sequenz selbst nicht von Natur aus vorkommt (z. B. synthetische Sequenzen mit vom nativen Gen verschiedenen Codons). In ähnlicher Weise würde eine mit einem Konstrukt transformierte Wirtszelle, der normalerweise nicht in der Wirtszelle vorhanden ist, für die Zwecke dieser Erfindung als heterolog betrachtet werden. Eine allele Variation oder natürlich auftretende Mutationsereignisse ergeben keine heterologe DNA, wie hierin verwendet.
  • Bei einer "kodierenden Sequenz" oder einer Sequenz, die für eine bestimmte PKS "kodiert", handelt es sich um Nukleinsäure-Sequenz, die in vitro oder in vivo in ein Polypeptid transkribiert (im Falle von DNA) und translatiert (im Falle von mRNA) ist, wenn unter die Kontrolle geeigneter regulatorischer Sequenzen gebracht. Die Begrenzungen der kodierenden Sequenz sind durch ein Startcodon am 5'-(Amino)- Terminus und ein Translations-Stoppcodon am 3'-(Carboxy)-Terminus bestimmt. Eine kodierende Sequenz kann, ohne darauf beschränkt zu sein, cDNA aus prokaryontischer oder eukaryontischer mRNA, genomische DNA-Sequenzen aus prokaryontischer oder eukaryontischer DNA und sogar synthetische DNA- Sequenzen umfassen. Eine Transkriptions-Terminationssequenz ist gewöhnlich 3' zur kodierenden Sequenz lokalisiert.
  • Eine "Nukleinsäure"-Sequenz kann, ohne darauf beschränkt zu sein, prokaryontische Sequenzen, eukaryontische mRNA, cDNA aus eukaryontischer mRNA, genomische DNA-Sequenzen aus eukaryontischer (z. B. Säuger-) DNA und sogar synthetische DNA-Sequenzen umfassen. Der Begriff umfasst auch Sequenzen, die ein beliebiges der bekannten Basen-Analoga von DNA und RNA umfassen, wie zum Beispiel, doch ohne darauf beschränkt zu sein, 4-Acetylcytosin, 8-Hydroxy-N6-methyladenosin, Aziridinylcytosin, Pseudoisocytosin, 5-(Carboxyhydroxylmethyl)uracil, 5-Fluorouracil, 5-Bromuracil, 5-Carboxymethylaminomethyl-2- thiouracil, 5-Carboxymethylaminomethyluracil, Dihydrouracil, Inosin, N6-Isopentenyladenin, 1-Methyladenin, 1-Methylpseudouracil, 1-Methyfguanin, 1-Methylinosin, 2,2- Dimethylguanin, 2-Methyladenin, 2-Methylguanin, 3-Methylcytosin, 5-Methylcytosin, N6-Methyladenin, 7-Methylguanin, 5-Methylaminomethyluracil, 5-Methoxyaminomethyl-2-thiouracil, Beta-D-Mannosylqueosin, 5'-Methoxycarbonylmethyluracil, 5- Methoxyuracil, 2-Methylthio-N6-isopentenyladenin, Uracil-5-oxyessigsäuremethylester, Uracil-5-oxyessigsäure, Oxybutoxosin, Pseudouracil, Queosin, 2-Thiocytosin, 5-Methyl-2-thiouracil, 2-Thiouracil, 4-Thiouracil, 5-Methyluracil, N-Uracil-5-oxyessigsäuremethylester, Uracil-5-oxyessigsäure, Pseudouracil, Queosin, 2-Thiocytosin und 2,6-Diaminopurin. Eine Transkriptions-Terminationssequenz ist gewöhnlich 3' zur kodierenden Sequenz lokalisiert.
  • DNA-"Kontrollsequenzen" bezieht sich kollektiv auf Promotorsequenzen, ribosomale Bindungsstellen, Polyadenylierungssignale, Transkriptions-Terminationssequenzen, stromaufwärts gelegene regulatorische Domänen, Verstärker und ähnliches, die zusammengenommen für die Transkription und Translation einer kodierenden Sequenz in einer Wirtszelle sorgen. Nicht alle dieser Kontrollsequenzen brauchen immer in einem rekombinanten Vektor vorhanden zu sein, solange das gewünschte Gen transkribierbar und translatierbar ist.
  • "Funktionsfähig verknüpft" bezieht sich auf eine Anordnung von Elementen, worin die so beschriebenen Komponenten in einer Wiese konfiguriert sind, dass sie ihre übliche Funktion erfüllen. Folglich sind funktionsfähig an eine kodierende Sequenz geknüpfte Kontrollsequenzen zur Bewirkung der Expression der codierenden Sequenz fähig. Die Kontrollsequenzen brauchen nicht an die kodierende Sequenz angrenzend zu sein, solange sie darauf hinwirken, deren Expression zu lenken. So können z. B. intervenierende untranslatierte, jedoch transkribierte Sequenzen zwischen einer Promotorsequenz und der kodierenden Sequenz vorhanden sein und die Promotorsequenz dennoch als an die kodierende Sequenz "funktionsfähig geknüpft" betrachtet werden.
  • Mit "Selektionsmarker" ist jeglicher genetische Marker gemeint, der zur Auswahl einer Population von Zellen eingesetzt werden kann, die den Marker in ihrem Genom tragen. Zu Beispielen der Selektionsmarker zählen: auxotrophe Marker, mit denen Zellen nach ihrer Fähigkeit ausgewählt werden, auf Minimalmedien mit oder ohne einem Nährstoff oder Zusatz zu wachsen, z. B. Thymidin, Diaminopimelinsäure oder Biotin; metabolische Marker, mit denen Zellen nach ihrer Fähigkeit ausgewählt werden, auf Minimalmedien zu wachsen, die den geeigneten Zucker als der einzigen Kohlenstoffquelle enthalten, oder der Fähigkeit der Zellen, farbige Kolonien zu bilden, die die geeigneten Farbstoffe oder chromogenen Substrate enthalten; und Wirkstoffresistenz-Marker, mit denen Zellen nach ihrer Fähigkeit ausgewählt werden, auf Medien zu wachsen, die ein oder mehrere der geeigneten Wirkstoffe enthalten, z. B. Tetracyclin, Ampicillin, Kanamycin, Streptomycin oder Nalidixinsäure.
  • Unter "Rekombination" versteht man das Reassortment von Abschnitten der DNA- Sequenzen zwischen zwei DNA-Molekülen. Eine "homologe Rekombination" tritt zwischen zwei DNA-Molekülen auf, die dank homologer oder komplementärer Nukleotidsequenzen hybridisieren, wie in jedem DNA-Molekül vorhanden.
  • Der Begriff "Alkyl" bezieht sich, wie hierin verwendet, auf eine verzweigte oder unverzweigte gesättigte Kohlenwasserstoffgruppe mit 1 bis 24 Kohlenstoffatomen, wie z. B. Methyl, Ethyl, n-Propyl, Isopropyl, n-Butyl, Isobutyl, t-Butyl, Octyl, Decyl, Tetradecyl, Hexadecyl, Eicosyl, Tetracosyl und ähnliche. Hierin bevorzugte Alkylgruppen enthalten 1 bis 12 Kohlenstoffatome. Der Begriff "niederes Alkyl" meint eine Alkylgruppe mit ein bis sechs Kohlenstoffatomen, vorzugsweise ein bis vier Kohlenstoffatomen.
  • Der Begriff "Alkylen" bezieht sich, wie hierin verwendet, auf eine difunktionelle gesättigte verzweigte oder unverzweigte Kohlenwasserstoffkette, enthaltend 1 bis 24 Kohlenstoffatome, und umfasst z. B. Methylen-(-CH&sub2;-), Ethylen-(-CH&sub2;-CH&sub2;-), Propylen-(-CH&sub2;-CH&sub2;-CH&sub2;-), 2-Methylpropylen-[-CH&sub2;-CH(CH&sub3;)-CH&sub2;-], Hexylen- [-(CH&sub2;)6-] und ähnliche. "Niederes Alkylen" bezieht sich auf eine Alkylengruppe mit 1 bis 6, bevorzugt 1 bis 4 Kohlenstoffatomen.
  • Der Begriff "Alkoxy" meint, wie hierin verwendet, eine durch eine einzelne terminale Etherbindung gebundene Alkylgruppe; d. h., dass eine "Alkoxy"-Gruppe kann als -OR definiert werden kann, worin R Alkyl ist, wie oben definiert. Eine "niedere Alkoxy"- Gruppe meint eine Alkoxygruppe, die ein bis sechs, bevorzugter ein bis vier Kohlenstoffatome enthält.
  • "Halo" oder "Halogen" bezieht sich auf Fluor. Chlor, Brom oder Jod, und bezieht sich gewöhnlich auf eine Halo-Substitution für ein Wasserstoffatom in einer organischen Verbindung. Von den Halos sind Chlor und Fluor generell bevorzugt.
  • "Wahlweise" bedeutet, dass das darauffolgend beschriebene Ereignis oder der Umstand eintreten kann oder auch nicht und dass die Beschreibung Fälle umfasst, bei denen das Ereignis oder der Umstand eintritt, und andere Fälle, bei denen dies nicht der Fall ist. Zum Beispiel meint der Ausdruck "wahlweise substitutiertes Alkylen", dass eine Alkylen-Komponente substituiert sein kann oder auch nicht und dass die Beschreibung sowohl nicht-substituiertes Alkylen als auch ein Alkylen umfasst, bei dem eine Substitution vorliegt.
    • B. Allgemeine Methoden
  • Im Zentrum der vorliegenden Erfindung steht die Entdeckung eines Wirts- Vektorsystems für die wirksame rekombinante Erzeugung sowohl neuartiger als auch bekannter Polyketide. Insbesondere macht die Erfindung Gebrauch von gentechnisch veränderten Zellen, deren natürlich vorkommende PKS-Gene im wesentlichen deletiert sind. Diese Wirtszellen können mit rekombinanten Vektoren, die für eine Vielfalt von PKS-Genclustern kodieren, zur Produktion aktiver Polyketide transformiert werden. Die Erfindung ermöglicht die Erzeugung signifikanter Produktmengen zu einem geeigneten Stadium des Wachstumszyklus. Die derart hergestellten Polyketide können als Therapeutika zur Behandlung einer Reihe von Störungen in Abhängigkeit vom vorliegenden Polyketid-Typ eingesetzt werden. Zum Beispiel finden mehrere der mittels des vorliegenden Verfahrens erzeugten Polyketide Anwendung als Immunsuppressiva, als Antitumormittel, als auch zur Behandlung viraler, bakterieller und parasitärer Infektionen. Die Möglichkeit der rekombinanten Erzeugung von Polyketiden stellt auch ein wirksames Werkzeug zur Charakterisierung von PKS und ihrem Wirkmechanismus zur Verfügung.
  • Spezieller gesagt können die Wirtszellen für die rekombinante Produktion der vorliegenden Polyketide von jeglichem Organismus stammen, der die Fähigkeit zur Beherbergung eines rekombinanten PKS-Genclusters besitzt. Die Wirtszellen der vorliegenden Erfindung können also sowohl von prokaryontischen als auch eukaryontischen Organismen stammen. Bevorzugte Wirtszellen sind jedoch solche, die aus Actinomyzeten, einer Klasse von Myzelbakterien, die eine Reihe von Polyketiden in reichlicher Menge erzeugen, konstruiert sind. Eine besonders bevorzugte Gattung zur Verwendung mit dem vorliegenden System ist Streptomyces. So stellen z. B. S. ambofaciens, S. avermitilis, S. azuraeus, S. cinnamonensis, S. coelicolor, S. curacoi, S. erythraeus, S. fradiae, S. galilaeus, S. gfaucescens, S. hygroscopicus, S. lividans, S. parvulus, S. peucetius, S. rimosus, S. roseofulvus, S. thermotolerans, S. violaceoruber u. a., geeignete Wirtszellen für die vorliegende Erfindung dar, wobei S. coelicolor bevorzugt ist. (Siehe z. B. Hopwood, D. A. und Sherman, D. H., Ann. Rev. Genet. (1990) 24: 37-66; O'Hagan, D., The Polyketide Metabolites (Ellis Horwood Limited, 1991) für eine Beschreibung der verschiedenen Polyketid-produzierenden Organismen und deren natürliche Produkte.
  • Die oben beschriebenen Zellen werden durch Deletieren der natürlich vorkommenden PKS-Gene unter Anwendung standardmäßiger Methoden gentechnisch verändert, z. B. mittels homologer Rekombination. (Siehe z. B. Khosla, C. et al., Molec. Microbiol. (1992) 6: 3237). Beispielhaft veranschaulicht ist hierin eine gentechnisch veränderte S. coelicolor-Wirtszelle. Native Stämme der S. coelicolor erzeugen eine PKS, die die Biosynthese des aromatischen Polyketid-Actinorhodins katalysiert.
  • Der neuartige Stamm, S. coelicolor CH999 (Abb. 2C und in den Beispielen beschrieben), wurde durch Deletieren, über homologe Rekombination, des gesamten natürlichen act-Clusters aus dem Chromosom von S. coelicolor CH1 konstruiert (Khosla, C., Molec. Microbiol. (1992) 6: 3237), einem Stamm, dem endogene Plasmide fehlen und der eine stabile Mutation trägt, die die Biosynthese eines anderen pigmentierten S. coelicolor-Antibiotikums, d. h. Undecylprodigiosin, blockiert.
  • Die oben beschriebenen Wirtszellen können mit ein oder mehreren Vektoren transformiert werden, die gemeinsam für einen funktionellen PKS-Satz kodieren. Der/die Vektor(en) kann/können native oder Hybrid-Kombinationen von PKS- Untereinheiten oder Mutanten davon enthalten. Wie oben erläutert braucht der Substitutions-Gencluster nicht dem vollständigen nativen Gencluster zu entsprechen, sondern lediglich für die erforderlichen PKS-Komponenten zu kodieren, um die Erzeugung eines Polyketids zu katalysieren.
  • Außerdem kann/können der/die rekombinante(n) Vektor(en) Gene aus einem einzelnen PKS-Gencluster enthalten, oder kann/können Hybrid-Substitutions-PKS- Gencluster umfassen, wobei z. B. ein Gen aus einem Cluster durch das entsprechende Gen aus einem anderen Gencluster ersetzt ist. Zum Beispiel wurde festgestellt, dass ACPs ohne weiteres unter verschiedenen Synthasen ohne Auswirkung auf die Produktstruktur austauschbar sind. Darüber hinaus kann eine gegebene Ketoreduktase Polyketidketten verschiedener Kettenlängen erkennen und reduzieren. Dementsprechend sind diese Gene in den hierin beschriebenen Konstrukten frei austauschbar. Folglich können die Substitutions-Cluster der vorliegenden Erfindung aus jeglicher Kombination von PKS-Gensätzen stammen, die schließlich auf die Erzeugung eines identifizierbaren Polyketids hin wirken.
  • Die rekombinanten Vektoren, die die oben beschriebenen Gencluster beherbergen, können in bequemer Weise unter Anwendung der im Fachbereich bekannten Methoden erzeugt werden. Zum Beispiel können die PKS-Untereinheiten von Interesse von einem Organismus, der dieselben exprimiert, unter Anwendung rekombinanter Methoden erhalten werden, wie z. B. durch Screening von cDNA- oder genomischen Banken, die von das Gen exprimierenden Zellen abgeleitet sind, oder durch Ableiten des Gens von einem Vektor, der als dieses enthaltend bekannt ist. Das Gen kann dann isoliert und unter Anwendung standardmäßiger Methoden mit anderen gewünschten PKS-Untereinheiten kombiniert werden. Liegt das fragliche Gen bereits in einem geeigneten Expressionsvektor vor, so kann es in situ z. B. mit anderen PKS-Untereinheiten kombiniert werden, sofern erwünscht. Das Gen von Interesse kann auch synthetisch hergestellt und nicht kloniert werden. Die Nukleotidsequenz kann mit den geeigneten Codons für die speziell gewünschte Aminosäuresequenz entworfen werden. Im allgemeinen werden die bevorzugten Codons für den angestrebten Wirt, in dem die Sequenz exprimiert werden soll, ausgewählt. Die vollständige Sequenz wird aus überlappenden Oligonukleotiden zusammengesetzt, die mittels standardmäßiger Methoden hergestellt wurden, und diese zu einer vollständigen kodierenden Sequenz zusammengefügt. Siehe z. B. Edge (1981), Nature 292: 756; Nambair et al. (1984), Science 223: 1299; Jay et al. (1984) J. Biol. Chem. 259: 6311.
  • An den Sequenzen der nativen PKS-Untereinheiten können Mutationen vorgenommen werden und dann die Mutanten anstelle der nativen Sequenz verwendet werden, solange die Mutanten mit anderen PKS-Untereinheiten funktionsfähig sind, um gemeinsam die Synthese eines identifizierbaren Polyketids zu katalysieren. Solche Mutationen können an den nativen Sequenzen unter Anwendung herkömmlicher Methoden vorgenommen werden, wie z. B. durch Präparieren synthetischer Oligonukleotide einschließlich der Mutationen und Einführen der mutierten Sequenz in das für eine PKS-Untereinheit kodierende Gen unter Anwendung eines Restriktionsendonuklease-Verdaus. (Siehe z. B. Kunkel, T. A. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1988) 82: 448; Geisselsoder et al., BioTechniques (1987) 5: 786). Alternativ können die Mutationen unter Verwendung eines fehlgepaarten Primers (allgemein 10-20 Nukleotide lang) bewirkt werden, welcher an die native Nukleotidsequenz (allgemein cDNA entsprechend der RNA-Sequenz) bei einer Temperatur unterhalb der Schmelztemperatur des fehlgepaarten Duplex hybridisiert. Der Primer kann spezifisch gemacht werden, indem die Primerlänge und Basenzusammensetzung innerhalb relativ enger Grenzen gehalten wird und die mutante Base zentral lokalisiert bleibt. Zoller und Smith, Methods Enzymol. (1983) 100: 468. Die Primerextension wird unter Verwendung von DNA-Polymerase bewirkt, das Produkt kloniert und die Klone, enthaltend die mutierte DANN, ausgewählt und dann der Primer-verlängerte Strang aufgetrennt. Die Auswahl kann unter Verwendung des mutanten Primers als einer Hybridisierungssonde vorgenommen werden. Die Methode ist auch zur Erzeugung multipler Punktmutationen anwendbar. Siehe z. B. Dalbie-McFarland et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA (1982) 79: 6409. Auch die PCR-Mutagenese findet zur Bewirkung der gewünschten Mutationen Anwendung.
  • Die Gensequenzen, die zusammen für einen Substitutions-PKS-Gencluster kodieren, können in ein oder mehrere Expressionsvektoren unter Anwendung von Methoden insertiert werden, die den Fachleuten des Bereichs bekannt sind. Die Expressionsvektoren umfassen Kontrollsequenzen, die funktionsfähig an die gewünschte PKS-kodierende Sequenz geknüpft sind. Zu geeigneten Expressionssystemen zur Verwendung mit der vorliegenden Erfindung zählen Systeme, die in eukaryontischen und prokaryontischen Wirtszellen funktionieren. Wie oben erläutert, sind prokaryontische Systeme allerdings bevorzugt, und speziell sind Systeme, die mit Streptomyces spp. kompatibel sind, von besonderem Interesse. Zu Kontrollelementen zur Anwendung bei diesen Systemen zählen Promotoren, die wahlweise Operator-Sequenzen enthalten, und ribosomale Bindungsstellen. Zu besonders nützlichen Promotoren zählen Kontrollsequenzen, die von PKS-Genclustern abgeleitet sind, wie etwa ein oder mehrere act- Promotoren. Aber auch andere bakterielle Promotoren, wie z. B. solche, die von Zucker-verdauenden Enzymen hergeleitet sind wie Galactose, Lactose (lac) und Maltose, finden bei den vorliegenden Konstrukten Anwendung. Zu weiteren Beispielen zählen Promotor-Sequenzen, die von biosynthetischen Enzymen wie Tryptophan (trp), dem β-Lactamase-(bla)-Promotorsystem, dem Bakteriophagen Lambda PL und T5 abstammen. Darüber hinaus erfüllen auch synthetische Promotoren, wie z. B. der tac-Promotor (US-Patentschrift Nr. 4.551.433), die nicht natürlich vorkommen, in bakteriellen Wirtszellen ihre Funktion.
  • Auch andere regulatorische Sequenzen können erwünscht sein, die eine Regulierung der Expression der PKS-Substitutions-Sequenzen relativ zum Wachstum der Wirtszelle ermöglichen. Regulatorische Sequenzen sind den Fachleuten des Bereichs bekannt, wobei Beispiele solche umfassen, die das Anschalten oder Abschalten der Exprimierung eines Gens als Reaktion auf einen chemischen oder physikalischen Stimulus, einschließlich des Vorhandenseins einer regulatorischen Verbindung bewirken. Auch andere Arten der regulatorischen Elemente können im Vektor vorhanden sein, wie z. B. Verstärker-Sequenzen.
  • Auch auswählbare Marker können in die rekombinanten Expressionsvektoren aufgenommen werden. Eine Vielfalt von Markern ist bekannt, die bei der Wahl transformierter Zelllinien nützlich sind und allgemein ein Gen umfassen, dessen Expression den transformierten Zellen einen selektierbaren Phänotyp verleiht, wenn die Zellen in einem geeigneten selektiven Medium gezüchtet werden. Zu diesen Markern zählen z. B. Gene, die dem Plasmid eine Antibiotikaresistenz oder -sensibilität verleihen. Alternativ dazu sind verschiedene Polyketide von Natur aus farbig, welche Eigenschaft einen eingebauten Marker zur Auswahl von Zellen bietet, die mittels der vorliegenden Konstrukte erfolgreich transformiert wurden.
  • Die verschiedenen PKS-Untereinheiten von Interesse können in ein oder mehrere rekombinante Vektoren als individuelle Kassetten, mit separaten Kontrollelementen oder unter der Kontrolle z. B. eines einzelnen Promotors kloniert werden. Die PKS- Untereinheiten können flankierende Restriktionsstellen enthalten, um eine einfache Deletion und Insertion anderer PKS-Untereinheiten zu ermöglichen, so dass Hybrid- PKS erzeugt werden können. Das Design solcher unikaler Restriktionsstellen ist den Fachleuten des Bereichs bekannt und kann unter Anwendung der oben beschriebenen Methoden erzielt werden, wie z. B. der gerichteten Mutagenese und der PCR.
  • Die Methoden zur Einführung der rekombinanten Vektoren der vorliegenden Erfindung in geeignete Wirte sind den Fachleuten des Bereichs bekannt und umfassen typischerweise die Verwendung von CaCl&sub2; oder anderen Agentien, wie z. B. zweiwertigen Kationen und DMSO. Die DNA kann in die bakteriellen Zellen auch durch Elektroporation eingeführt werden. Sobald die PKS exprimiert sind, können die Polyketid-erzeugenden Kolonien identifiziert und unter Anwendung bekannter Methoden isoliert werden. Die produzierten Polyketide können dann weiter charakterisiert werden.
  • Die Erfindung wird im folgenden unter Bezugnahme auf 6-Desoxyerythronolid-B- Synthase (DEBS) ausführlicher beschrieben werden, welche die Biosynthese des Erythromycin-Aglykons, 6-Desoxyerythronolid B (17), katalysiert. Drei offene Leseraster (eryAI, eryAII und eryAIII) kodieren für die DEBS-Polyketide und umspannen 32 kb im ery-Gencluster des Saccharopolyspora erythraea-Genoms. Die Gene sind in sechs sich wiederholenden Einheiten organisiert, von denen jede als ein "Modul" bezeichnet wird. Jedes Modul kodiert für eine Gruppe von aktiven Zentren, der während der Polyketid-Biosynthese die Kondensation eines zusätzlichen Monomers an die wachsende Kette katalysiert. Jedes Modul umfasst eine Acyltransferase (AT), β-Ketoacyl-Trägerprotein-Synthase (KS) und ein Acyl- Trägerprotein (ACP), als auch eine Untergruppe reduktiver aktiver Zentren (β- Ketoreduktase (KR), Dehydratase (DH), Enoylreduktase (ER)) (Abb. 4). Die Zahl der reduktiven Stellen innerhalb eines Moduls entspricht dem Umfang der β- Keto-Reduktion in jedem Kondensationszyklus. Die am Ende des Moduls kodierte Thioesterase (TE) scheint die Lactonbildung zu katalysieren.
  • Aufgrund der großen Größen von eryAI, eryAII und eryAIII und des Vorhandenseins der multiplen aktiven Zenten können diese Gene bequem in ein Plasmid kloniert werden, das sich zur Expression in einer gentechnisch veränderten Wirtszelle, wie z. B. CH999, eignet, wobei eine in vivo-Rekombinationsmethodik angewandt wird. Diese Methode, wie in Beispiel 3 beschrieben und in Abb. 5 zusammengefasst, verwendet Derivate des Plasmids pMAK705 (Hamilton et al. (1989) J. Bacteriol. 171: 4617), um eine in vivo-Rekombination zwischen einem Temperaturempfindlichen Spender-Plasmid, das zur Replikation bei einer ersten, zulässigen Temperatur fähig ist und zur Replikation bei einer zweiten, nicht-zulässigen Temperatur unfähig ist, und einem Empfänger-Plasmid zu ermöglichen. Die auf diese Weise klonierten eryA-Gene ergaben pCK7, ein Derivat von pRM5 (McDaniel et al. (1993) Science 262: 1546). Ein Kontroll-Plasmid, pCK7f, wurde zur Eintragung einer Frameshift-Mutation in eryAI konstruiert. pCK7 und pCK7f besitzen ein CoIEI- Replicon für die genetische Manipulation in E. coli als auch ein verkürztes SCP2 (niedere Kopienzahl) Streptomyces-Replicon. Diese Plasmide enthalten auch das divergente actI/actIII-Promotorpaar und actII-ORF4, ein Aktivator-Gen, das zur Transkription von diesen Promotoren erforderlich ist und die Expression während des Übergangs von der Wachstums- zur stationären Phase im vegetativen Myzelium aktiviert. Eine hochgradige Expression von PKS-Genen findet beim Einsetzen der stationären Phase des Myzelwachstums statt; die rekombinanten Stämme produzieren daher "Reporter"-Polyketide als sekundäre Metaboliten in einer quasi- natürlichen Weise.
  • Die oben beschriebene Methode zur Erzeugung von durch große, modulare PKS synthetisierte Polyketide kann auch zur Erzeugung anderer Polyketide als Sekundärmetabolite, wie z. B. Zucker, β-Lactame, Fettsäuren, Aminoglycoside, Terpinoide, nicht-ribosomale Peptide, prostanoide Hormone und ähnliches, angewandt werden.
    • C. Experimente
  • Nachstehend sind Beispiele für spezifische Ausführungsformen zur Durchführung der vorliegenden Erfindung angegeben. Die Beispiele dienen lediglich den Zwecken der Veranschaulichung und sollen in keinster Weise den Rahmen der vorliegenden Erfindung einschränken.
  • Es wurden Anstrengungen unternommen, um exakte Zahlenangaben (z. B. für Mengen, Temperaturen etc.) zu gewährleisten, doch kann eine gewisse Abweichung für experimentelle Fehler natürlich nicht völlig ausgeschlossen werden.
    • Materialien und Methoden
  • Bakterienstämme, Plasmide und Kulturbedingungen. S. coelicolor CH999 wurde als ein Wirt für die Transformation durch alle Plasmide verwendet. Die Konstruktion dieses Stammes ist unten beschrieben. Die DNA-Manipulationen wurden in Escherichia coli MC1061 vorgenommen. Die Plasmide wurden durch E. coli ET12567 (dam dcm hsdS Cmr) (MacNeil, D.J., J. Bacteriol. (1988) 170: 5607) geführt, um unmethylierte DNA vor der Transformation von S. coelicolor zu erzeugen. Die E. coli-Stämme wurden unter Standardbedingungen gezüchtet. Die S. coelicolor-Stämme wurden auf R2YE-Agarplatten gezüchtet (Hopwood, D. A. et al., Genetic manipulation of Streptomyces. A laboratory manual. The John Innes Foundation: Norwich, 1985).
  • Manipulation von DNA und Organismen. Eine Polymerase-Kettenreaktion (PCR) wurde unter Verwendung von Taq-Polymerase (Perkin Eimer Cetus) unter den durch den Enzymhersteller empfohlenen Bedingungen vorgenommen. Für die DNA- Manipulationen wurden standardmäßige in vitro-Methoden angewandt (Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (aktuelle Auflage). E. coli wurde mit einem Bio-Rad-E. coli-Implsgerät unter Anwendung der durch Bio-Rad mitgelieferten Protokolle transformiert. S. coelicolor wurde mittels standardmäßiger Verfahrensweisen transformiert (Hopwood, D. A. et al., Genetic manipulation of Streptomyces. A laboratory manual. The John Innes Foundation: Norwich, 1985), und die Transformanten wurden unter Verwendung von 2 ml einer 500 mg/ml Thiostrepton-Überzugs ausgewählt.
  • Herstellung und Reinigung der Polyketide. Für das Ausgangs-Screening wurden alle Stämme bei 30ºC als zusammenfließender Rasen auf 10-30 Platten, die jeweils etwa 30 ml Agarmedium enthielten, über 6 bis 8 Tage hinweg angezüchtet. Zusätzliche Platten wurden je nach Bedarf hergestellt, um ausreichend Material zur vollständigen Charakterisierung zu erhalten. CH999 stellte beim Screening auf potentielle Polyketide eine negative Kontrolle dar. Der Agar wurde fein gehackt und mit Ethylacetat/1% Essigsäure oder Ethylacetat: Methanol (4 : 1)/1% Essigsäure extrahiert. Der konzentrierte Extrakt wurde dann durch eine Kieselgel-(Baker 40 mm)-Chromatographiesäule in Ethylacetat/1% Essigsäure gepresst. Alternativ wurde der Extrakt auf eine Florisil-Säule (Fisher Scientific) aufgebracht und mit Ethylacetat: Ethanol: Essigsäure (17 : 2 : 1) eluiert. Die gelbe Primärfraktion wurde mittels Hochleistungs-Flüssigchromatographie (HPLC) unter Verwendung eines 20 - 60% Acetonitril/Wasser/1% Essigsäure-Gradienten auf einer präparativen Umkehrphasen-(C-18)-Säule (Beckman) weiter gereinigt. Die Extinktion wurde bei 280 nm und 410 nm überwacht.
  • NMR-Spektrokopie. Alle Spektren wurden auf einer Varian XL-400 aufgezeichnet. Die ¹³C-Spektren wurden mit kontinuierlicher Breitband-Protonenentkopplung erhalten. Die Hydroxyl-Resonanzen wurden durch Zugabe von D&sub2;O (Aldrich, 99 atomare % D) und Prüfen auf das Verschwinden des Signals identifiziert.
    • Beispiel 1 Erzeugung von S. coelicolor CH999
  • Eine S. coelicolor-Wirtszelle, die zur Entfernung des nativen act-Genclusters gentechnisch manipuliert und mit CH999 bezeichnet wurde, wurde unter Verwendung von S. coelicolor CH1 unter Anwendung der in Abb. 2 dargestellten Strategie konstruiert (Khosla, C. Molec. Microbiol. (1992) 6: 3237). CH1 ist von S. coelicolor B385 abgeleitet (Rudd, B. A. M., Genetics of Pigmented Secondary Metabolites in Streptomyces coelicolor (1978) Doktorarbeit, University of East Anglia, Norwich, England). CH1 umfasst den act-Gencluster, der für Enzyme kodiert, die in der Biosythnese und dem Export des Polyketid-Antibiotikums Actinorhodin involviert sind. Der Cluster setzt sich aus den PKS-Genen, flankiert von mehreren post-PKS-biosynthetischen Genen, einschließlich der beim Cyclisieren, Aromatisieren und dem anschließenden chemischen Maßschneidern beteiligten Gene (Abb. 2A). Ebenfalls vorhanden sind die für die transkriptionelle Aktivierung der act-Gene verantwortlichen Gene. Der act-Gencluster wurde aus CH1 unter Anwendung der homologen Rekombination deletiert, wie beschrieben bei Khosla, C. et al. Molec. Microbiol. (1992) 6: 3237.
  • Im einzelnen gesagt wurde Plasmid pLRermEts (Abb. 2B) mit den folgenden Merkmalen konstruiert: einem Co1EI-Replicon von pBR322, dem Temperaturempfindlichen Replicon von pSGS (Muth, G. et al., Mol. Gen. Genet. (1989) 219: 341), Ampicillin- und Thiostrepton-Resistenzmarker, und eine Disruptionskassette einschließlich eines 2 kb BamHI/XhoI-Fragments vom 5'-Ende des act-Clusters, eines 1,5 kb ermE-Fragments (Khosla, C. et al., Molec. Microbiol. (1992) 6: 3237) und eines 1,9 kb SphI/PstI-Fragments vom 3'-Ende des act-Clusters. Das 5'-Fragment erstreckte sich von der BamHI-Stelle 1 (Malpartida, F. und Hopwood, D. A., Nature (1984) 309: 462; Malpartida, F. und Hopwood, D. A., Mol. Gen. Genet. (1986) 205: 66) stromabwärts zu einer XhoI-Stelle. Das 3'-Fragment erstreckte sich von der Pstl-Stelle 20 stromaufwärts zur SphI-Stelle 19,2 (Fernandez- Moreno, M. A. et al., J. Biol. Chem. (1992) 267: 19278). Die 5'- und 3'-Fragemente (in Abb. 2 als schraffierte DNA gezeigt) wurden in derselben relativen Orientierung wie im act-Cluster kloniert. CH1 wurde mit pLRermEtS transformiert. Das Plasmid wurde anschließend von Kandidat-Transformanten durch nicht-selektiven Abstrich bei 39ºC befreit. Verschiedene Kolonien, die Lincomycin-resistent, Thiostreptonempfindlich und zum Produzieren von Actinorhodin unfähig waren, wurden isoliert und mittels Southern Blotting geprüft. Eine von ihnen wurde als CH999 bezeichnet.
    • Beispiel 2 Erzeugung des rekombinanten Vektors pRMS
  • PRM5 (Abb. 3) wurde bei der Konstruktion von pCK7 verwendet, dem zur Exprimierung der modularen PKS in CH999 verwendeten Pendelplasmid. Er umfasst ein Co1EI-Replicon, um die gentechnische Veränderung in E. coli zu ermöglichen, ein angemessen verkürztes SCP2* (niedere Kopienzahl) Streptomyces-Replicon und das actll-ORF4-Aktivator-Gen aus dem act-Cluster, welches die Transkription von act-Promotoren während des Übergangs von der Wachstumsphase zur stationären Phase im vegetativen Myzelium induziert. Wie in Abb. 3 gezeigt, trägt pRMS das divergente actI/actIII-Promotorpaar, zusammen mit geeigneten Klonierstellen zur Erleichterung der Insertion einer Vielzahl von gentechnisch erhaltenen PKS-Genen stromabwärts beider Promotoren. pRMS fehlt der entsprechende Locus von SCP2*; als Folge dessen ist das Plasmid etwas instabil (etwa 2% Verlust bei Abwesenheit von Thiostrepton). Dieses Merkmal wurde willkürlich eingeführt, um eine schnelle Bestätigung dessen zu ermöglichen, dass ein Phänotyp von Interesse der Plasmidgetragenen mutanten PKS eindeutig zugeordnet werden konnte. Die rekombinanten PKS von pRMS werden etwa am Übergang von der exponentiellen zur stationären Wachstumsphase bei guten Ausbeuten exprimiert.
  • pRMS wurde wie folgt konstruiert. Ein 10,5 kb SphI/HindIII-Fragment von pIJ903 (enthaltend einen Abschnitt des Fertilitäts-Locus und den Replikationsursprung von SCP2* als auch den Co1EI-Replikationsursprung und das β-Lactamase-Gen von pBR327) (Lydiate, D. J., Gene (1985) 35: 223) wurde mit einer 1,5 kb HindIII/SphI-tsr- Genkassette zum Erhalt von pRM1 ligiert. pRMS wurde durch Insertieren der folgenden beiden Fragmente zwischen die einzigen Hind III- und EcoRI-Stellen von pRM1 konstruiert: ein 0,3 kb HindtII/HpaI-(stumpfes)-Fragment, das einen Transkriptionsterminator von Phage fd trägt (Khosla, C. et al., Molec. Microbiol. (1992) 6: 3237), und ein 10 kb-Fragment vom act-Cluster, das sich von der Ncol- Stelle (1 kb stromaufwärts des actII-ORF4-Aktivator-Gens) (Hallam, S. E. et al., Gene (1988) 74: 305; Fernandenz-Moreno, M. A. et al., Cell (1991) 66: 769; Caballero, J. L., Mol. Gen. Genet. (1991) 230: 401) bis zur Pstl-Stelle stromabwärts der actI-VII-IX- Gene erstreckt (Ferandenz-Moreno, M. A. et al., J. Biol. Chem. (1992) 267: 19278).
  • Um die Exprimierung jeglicher gewünschter rekombinanter PKS unter der Kontrolle des actI-Promotors zu erleichtern (die durch das actII-ORF4-Genprodukt aktiviert wird), wurden Restriktionsstellen für PacI, Nsil, XbaI und PstI in die act-DNA in intercistronischen Positionen konstruiert.
    • Beispiel 3 Konstruktion und Analyse der modularen Polyketid-Synthasen
  • Expressions-Plasmide, enthaltend rekombinante modulare DEBS-PKS-Gene, wurden konstruiert, indem zunehmend DNA von einem Temperatur-empfindlichen "Spender"-Plasmid, d. h. einem zur Replikation bei einer ersten, zulässigen Temperatur fähigen und zur Replikation bei einer zweiten, nicht-zulässigen Temperatur unfähigen Plasmid, auf einen "Empfänger"-Pendelvektor über ein doppeltes Rekombinationsereignis übertragen wurde, wie in Abb. 5 dargestellt. pCK7 (Abb. 6), ein Pendelplasmid, enthaltend die vollständigen eryA-Gene, die ursprünglich von pS1 kloniert wurden (Tuan et al. (1990) Gene 90: 21), wurde wie folgt konstruiert. Ein 25,6 kb Sphl-Fragment von pS1 wurde in die SphI-Stelle von pMAK705 insertiert (Hamilton et al. (1989) J. Bacteriol. 171: 4617), was pCK6 (CmR) ergab, ein Spender-Plasmid, enthaltend eryAII, eryAIII und das 3'-Ende von eryAI. Die Replikation dieses Temperatur-empfindlichen pSC101-Derviats tritt bei 30ºC ein, doch kommt bei 44ºC zum Stillstand. Das Empfänger-Plasmid, pCK5 (ApR, TcR), umfasst ein 12,2 kb eryA-Fragment aus dem eryAI-Startcodon (Caffrey et al. (1992) FEBS Lett. 304: 225) zur XcmI-Stelle nahe dem Beginn von eryAII, einem 1,4 kb EcoRl-Bsml pBR322-Fragment, das für das Tetracyclin-Resistenzgen (Tc) kodiert, und ein 4,0 kb Notl - EcoRl-Fragment vom Ende von eryAIII. Pacl, NdeI und die ribosomalen Bindungsstellen wurden am eryAl-Startcodon in pCK5 konstruiert. pCK5 stellt ein Derivat von pRM5 dar (McDaniel et al. (1993), supra). Die 5'- und 3'- Homologie-Regionen (Abb. 5, gestrichelte und unschattierte Flächen) sind 4,1 kb bzw. 4,0 kb lang. MC1061 E. coli wurde mit pCK5 und pCK6 transformiert (siehe Sambrook et al.; supra) und einer Carbenicillin- und Chloramphenicol-Selektion bei 30ºC unterzogen. Bei den Kolonien, die beide Plasmide (ApR, CmR) beherbergten, wurden dann nochmals Abstriche bei 44ºC auf Carbenicillin- und Chlorampenicol- Platten vorgenommen. Lediglich Kointegrate, die durch ein einzelnes Rekombinationsereignis zwischen den beiden Plasmiden entstanden waren, erwiesen sich als lebensfähig. Die überlebenden Kolonien wurden bei 30ºC unter Carbenicillin-Selektion vermehrt, wobei die Auflösung der Kointegrate über ein zweites Rekombinationsereignis erzwungen wurde. Um die pCK7-Rekombinanten anzureichern, wurden nochmals Abstriche der Kolonien auf Carbenicillin-Platten bei 44ºC vorgenommen. Etwa 20% der resultierenden Kolonien zeigten den gewünschten Phänotyp (ApR, TcS, CmS). Die endgültigen pCK7-Kandidaten wurden mittels Restriktionskartierung gründlich geprüft. Ein Kontroll-Plasmid, pCK7f, das einen Frameshift-Fehler in eryAl enthielt, wurde in ähnlicher Weise konstruiert. pCK7 und pCK7f wurden in E. coli ET12567 transformiert (MacNeil (1988) J. Bacteriol. 170: 5607), um unmethylierte Plasmid-DNA zu erzeugen, und anschließend in Streptomyces coelicolor CH999 unter Anwendung standardmäßiger Protokolle eingebracht (Hopwood et al. (1985) Genetic manipulation of Streptomyces. A laboratory manual. The John Innes Foundation: Norwich).
  • Auf die Anzüchtung von CH999/pCK7 auf R2YE-Medium hin erzeugte der Organismus reichliche Mengen zweier Polyketide.
  • Die Zugabe von Propionat (300 mg/l) zum Wachstumsmedium ergab eine etwa zweifache Zunahme der Ausbeute an Polyketid-Produkt. Protonen- und ¹³C-NMR- Spektroskopie, in Verbindung mit Experimenten unter Zugabe von Propion-1-¹³C- säure, bestätigten, dass das Hauptprodukt 6dEB (17) (> 40 mg/l) war. Das Nebenprodukt wurde als 8,8a-Desoxyoleandolid (18) (> 10 mg/l) identifiziert, was offensichtlich von einer Acetat-Startereinheit anstelle des Propionats im 6 dEB- Biosyntheseweg herrührt. Experimente unter Zugabe von ¹³C&sub2;-Natriumacetat bestätigten den Einbau von Acetat in (18). Drei hochmolekulare Proteine (> 200 kDa), vermutlich DESB1, DEBS2 und DESBS3 (Caffrey et al. (1992) FEBS Lett. 304: 225), wurden ebenfalls in den Rohextrakten von CH999/pCK7 mittels SDS- Polyacrylamid-Gelelektrophorese beobachtet. Es wurden keine Polyketid-Produkte von CH999/pCK7f beobachtet.
    • SEQUENZLISTE
  • (1) ALLGEMEINE INFORMATION:
  • (i) ANMELDER:
  • (A) NAME: THE LELAND STANFORD JUNIOR UNIVERSITY
  • (B) STRAßE: 900 Welch Road, Suite 350
  • (C) STADT: Palo Alto
  • (D) STAAT: Kalifornien
  • (E) LAND: Vereinigte Staaten von Amerika
  • (F) PLZ: 94304-1850
  • (A) NAME: JOHN INNES CENTRE
  • (B) STRAßE: Colney Lane
  • (C) STADT: Norwich
  • (E) LAND: Vereinigtes Königreich (U.K.)
  • (F) PLZ: NR4 7YH
  • (ii) TITEL DER ERFINDUNG: REKOMBINANTE HERSTELLUNG VON NEUARTIGEN POLYKETIDEN
  • (iii) ANZAHL DER SEQUENZEN: 2
  • (iv) COMPUTER-LESBARE FORM:
  • (A) MEDIUM-ART: Floppy disk
  • (B) COMPUTER: IBM PC kompatibel
  • (C) BETRIEBSSYSTEM: PC-DOS I MS-DOS
  • (D) SOFTWARE: PatentIN Release #1.0, Version #1,30 (EPO)
  • (vi) DERZEITIGE ANMELDUNGSDATEN:
  • (A) ANMELDUNGSNUMMER: EP 94928169.5
  • (2) INFORMATION FÜR SEQ ID NR. 1:
  • (i) SEQUENZ-EIGENSCHAFTEN:
  • (A) LÄNGE: 42 Basenpaare
  • (B) TYP: Nukleinsäure
  • (C) STRÄNGIGKEIT: doppelt
  • (D) TOPOLOGIE: linear
  • (ii) MOLEKÜLART: andere Nukleinsäure
  • (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 1:
  • CCACCGGACG AACGCATCGA TTAATTAAGG AGGACCATCA TG 42
  • (2) INFORMATION FÜR SEQ ID NR. 2:
  • (i) SEQUENZ-EIGENSCHAFTEN:
  • (A) LÄNGE: 25 Basenpaare
  • (B) TYP: Nukleinsäure
  • (C) STRÄNGIGKEIT: doppelt
  • (D) TOPOLOGIE: linear
  • (ii) MOLEKÜLART: andere Nukleinsäure
  • (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 2:
  • NTGAATGCAT GGAGGAGCCA TCATG 25

Claims (40)

1. Zellen mit eingeführter Nukleinsäure, die für eine modulare Polyketid-Synthase (PKS) kodiert, enthaltend Module, welche Module jeweils mindestens eine PKS- Acyltransferase-(AT)-Aktivität, eine PKS-Ketoacyl-Trägerprotein-Synthase-(KS)- Aktivität und eine PKS-Acyl-Trägerprotein-(ACP)-Aktivität umfassen;
wobei die eingeführten PKS-Modul-kodierenden Nukleotidsequenzen an mindestens eine Kontrollsequenz funktionsfähig geknüpft sind, wobei die Zellen zur Erzeugung einer funktionellen modularen PKS fähig sind,
wobei mindestens eine der Modul-kodierenden Nukleotidsequenzen für die funktionelle modulare PKS oder eine der Kontrollsequenzen heterolog zur Wirtszelle ist:
2. Zellen nach Anspruch 1, wobei die Module der funktionellen modularen PKS von mehr als einer PKS stammen.
3. Zellen nach Anspruch 1, wobei mindestens eine der eingeführten PKS-Modulkodierenden Nukleotidsequenzen eine Mutation enthält, die eine katalytische Funktion im kodierten Modul verändert.
4. Zellen nach Anspruch 1, die zur Erzeugung einer Hybrid-PKS fähig sind.
5. Zellen nach Anspruch 1, wobei mindestens eine solche Aktivität in mindestens einem Modul durch eine Aktivität aus einer unterschiedlichen PKS ersetzt ist.
6. Zellen nach Anspruch 1, wobei mindestens ein PKS-Modul umfasst:
eine PKS-Ketoreduktase-(KR)-Aktivität; oder
eine PKS-Ketoreduktase-(KR)-Aktivität
und eine PKS-Dehydratase-(DH)-Aktivität; oder
eine PKS-Ketoreduktase-(KR)-Aktivität und
eine PKS-Dehydratase-(DH)-Aktivität und
eine PKS-Enoylreduktase-(ER)-Aktivität; und
wahlweise,
eine PKS-Thioesterase-(TE)-Aktivität.
7. Zellen nach Anspruch 6, wobei mindestens eine solche Aktivität in mindestens einem Modul deletiert, insertiert oder durch eine Aktivität aus einer unterschiedlichen PKS ersetzt ist.
8. Zellen nach Anspruch 1, wobei die Kontrollsequenz heterolog zur Wirtszelle ist.
9. Zellen nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei die eingeführte Nukleinsäure für eine komplette modulare PKS kodiert.
10. Zellen nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei die Zelle so modifiziert wurde, dass ihr ein PKS-Gencluster, wie normalerweise in den unmodifizierten Wirtszellen vorhanden, im wesentlichen fehlt.
11. Zellen nach Anspruch 10, wobei die Zellen Actinomyzeten sind.
12. Zeilen nach Anspruch 11, wobei die Zellen Streptomyces sind.
13. Zellen nach Anspruch 12, wobei die Zellen S. coelicolor oder S. lividans sind.
14. Zellen nach Anspruch 13, wobei die Zellen S. coelicolor CH999 sind.
15. Zellen nach Anspruch 1 bis 9, wobei mindestens ein Modul ein 6-Desoxyerythronolid-B-Synthase-Modul ist.
16. Zellen nach Anspruch 15, wobei die eingeführte Nukleinsäure den kompletten 6-Desoxyerythronolid-B-Synthase-Gencluster umfasst.
17. Verfahren zur Herstellung einer funktionellen Polyketid-Synthase (PKS), welches Verfahren das Züchten der Zellen nach einem der Ansprüche 1 bis 16 unter solchen Bedingungen umfasst, dass die Module exprimiert werden.
18. Verfahren zur Herstellung einer funktionellen Polyketid-Synthase (PKS), welches Verfahren das Züchten der Zellen nach einem der Ansprüche 2, 4 oder 5 unter solchen Bedingungen umfasst, dass die Module exprimiert werden.
19. Nicht-native funktionelle modulare PKS, wie mittels des Verfahrens nach Anspruch 18 erzeugt.
20. Verfahren zur Herstellung eines Polyketids, welches Verfahren das Züchten von Zellen nach einem der Ansprüche 1 bis 16 unter solchen Bedingungen umfasst, dass die Module zur Erzeugung eines funktionellen PKS-Proteins exprimiert werden, um dadurch das Polyketid zu erhalten.
21. Verfahren zur Herstellung eines Polyketids, welches Verfahren das Züchten von Zellen nach einem der Ansprüche 2 bis 5 unter solchen Bedingungen umfasst, dass die Module zur Erzeugung eines funktionellen PKS-Proteins exprimiert werden, um dadurch das Polyketid zu erhalten.
22. Rekombinanter Vektor, der modulare PKS-umfassende Module kodiert, wobei jedes Modul mindestens eine PKS-Acyltransferase-(AT)-Aktivität, eine PKS-Ketoacyl-Trägerprotein-Synthase-(KS)-Aktivität und eine PKS-Acyl- Trägerprotein-(ACP)-Aktivität umfasst;
die PKS-Modul-kodierenden Nukleotidsequenzen des Vektors mit ein oder mehreren Kontrollsequenzen zur Herstellung jedes der Module funktionsfähig verknüpft ist, um eine funktionelle PKS zu erzeugen;
wobei mindestens eine Kontrollsequenz heterolog zu mindestens einer der kodierenden Nukleotidsequenzen ist.
23. Vektor nach Anspruch 22, wobei die Module von mehr als einem PKS stammen.
24. Vektor nach Anspruch 22, wobei mindestens eine der kodierenden Nukleotidsequenzen eine Mutation enthält, die eine katalytische Funktion im kodierten Modul verändert.
25. Vektor nach Anspruch 22, welcher eine Nukleotidsequenz umfasst, die für eine Hybrid-PKS kodiert.
26. Vektor nach Anspruch 22, wobei mindestens eine solche Aktivität in mindestens einem kodierten Modul durch eine Aktivität aus einer unterschiedlichen PKS ersetzt ist.
27. Vektor nach Anspruch 22, der für mindestens ein Modul kodiert, umfassend:
eine PKS-Ketoreduktase-(KR)-Aktivität; oder
eine PKS-Ketoreduktase-(KR)-Aktivität
und eine PKS-Dehydratase-(DH)-Aktivität; oder
eine PKS-Ketoreduktase-(KR)-Aktivität und
eine PKS-Dehydratase-(DH)-Aktivität und
eine PKS-Enoylreduktase-(ER)-Aktivität; und
wahlweise,
eine PKS-Thioesterase-(TE)-Aktivität.
28. Vektor nach Anspruch 27, wobei mindestens eine solche Aktivität in mindestens einem kodierten Modul deletiert, insertiert oder durch eine Aktivität aus einer unterschiedlichen PKS ersetzt ist.
29. Vektor nach Anspruch 22, welcher einen kompletten modularen PKS-Gencluster umfasst.
30. Vektor nach einem der Ansprüche 22 bis 29, wobei mindestens ein Modul ein Modul des 6-Desoxyerythronolid-B-Synthase-Genclusters ist.
31. Vektor nach einem der Ansprüche 22 bis 30, umfassend eine Nukeotidsequenz, die mindestens einen Polyketid-Synthase-(PKS)-Promotor umfasst.
32. Vektor nach Anspruch 31, wobei der Promotor ein Streptomyces-PKS- Gencluster-Promotor ist.
33. Vektor nach Anspruch 32, wobei der Strepfomyces-Promotor ein act-Gencluster- Promotor ist.
34. Vektor nach Anspruch 33, wobei der act-Promotor der actI-Promotor, der actIII- Promotor oder sowohl der actI- als auch der acfIII-Promotor ist.
35. Vektor nach einem der Ansprüche 31 bis 34, wobei das Plasmid außerdem ein Aktivatorgen umfasst.
36. Rekombinanter Vektor nach Anspruch 35, wobei das Aktivatorgen ein act- Aktivatorgen ist.
37. Vektor nach einem der Ansprüche 31 bis 36, welcher außerdem einen Streptomyces-Replikationsursprung umfasst.
38. Vektor nach Anspruch 30, welcher pCK7 ist, wie in Abb. 6 gezeigt und in Beispiel 3 beschrieben.
39. Zellen, die dahingehend modifiziert wurden, den rekombinanten Vektor nach einem der Ansprüche 22 bis 38 zu enthalten.
40. Verfahren zur Herstellung einer PKS, welches Verfahren das Züchten von Zellen nach Anspruch 39 unter solchen Bedingungen umfasst, dass jedes der besagten Module erzeugt wird.
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