DE69423601T2

DE69423601T2 - Elektrochemische Bestimmungsmethode und neue p-Phenylendiamin-Verbindung

Info

Publication number: DE69423601T2
Application number: DE69423601T
Authority: DE
Inventors: Hideyuki Terasawa; Tadakazu Yamauchi
Original assignee: Mochida Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Mochida Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1993-12-29
Filing date: 1994-12-29
Publication date: 2000-07-06
Anticipated expiration: 2014-12-30
Also published as: EP0663446A2; ES2148272T3; CA2139293A1; US5609749A; DE69423601D1; PT663446E; ATE191010T1; EP0663446B1; EP0663446A3; DK0663446T3

Description

GEBIET DER ERFINDUNG

Diese Erfindung betrifft ein elektrochemisches Assayverfahren, bei dem ein Elektronenvermittler oder Elektronentransfer-Vermittler verwendet wird und sie betrifft eine neue p-Phenylendiamin-Verbindung.
Insbesondere betrifft sie ein elektrochemisches Assayverfahren, bei dem eine zu untersuchende Substanz oder ein Analyt in einer Flüssigkeitsprobe gemessen wird, wobei man sich eines Systems bedient, das mindestens ein Oxidations-Reduktions- Enzym, eine Elektrode und einen speziellen Elektronenvermittler umfasst, so wie einen Enzym-Elektroden-Assay, einen spezifischen Bindungsassay oder ein ähnliches Verfahren und sie betrifft eine neue p-Phenylendiamin-Verbindung, die in dem elektrochemischen Assayverfahren anwendbar ist.

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Bei einem Enzym-Elektroden-Assayverfahren, wird eine interessierende chemische Substanz selektiv gemessen, wobei man sich der Moleküle erkennenden Fähigkeit des jeweiligen Enzyms bedient, wobei im allgemeinen eine Vorrichtung verwendet wird, die eine Enzym-immobilisierte Membran und eine Elektrode umfasst. Auf dem Gebiet der biochemischen Assayverfahren sind einfache und schnelle Messverfahren entwickelt worden, die sich enzymatischer Sensoren und ähnlicher Dinge bedienen und die bereits offenbart wurden, z. B. in der JP-B 02-59424 (die Bezeichnung "JP-B" wie hier verwendet bezieht sich auf eine "geprüfte japanische Patentveröffentlichung), der JP-A- 60-17346 (die Bezeichnung "JP-A", wie hier verwendet, bezieht sich auf eine "ungeprüfte veröffentlichte japanische Patentanmeldung) und der JP-A 60-17347.
Es gibt eine Anzahl bekannter spezifischer Bindungs-Assayverfahren, wie z. B. einen Immunoassay, bei dem eine Antigen-Antikörper-Reaktion verwendet wird, einen Rezeptor-Assay, bei dem ein Rezeptor verwendet wird und einen Assay auf der Basis von Nukleinsäuresonden, bei dem eine Hybridisierung von komplementären Nukleinsäuresequenzen verwendet wird. Aufgrund der hohen Spezifität werden diese Assayverfahren häufig und auf verschiedenen Gebieten, einschließlich der klinischen Chemie und ähnlichen verwendet.
Andererseits sind viele Versuche unternommen worden, um elektrochemische Sensoren auf das spezifische Bindungsassayverfahren anzuwenden. Die JP-A 58-58467 offenbart z. B. eine spezifische Bindungsreaktion auf der Oberfläche einer Elektrode auf die eine Enzym-(Katalase) markierte Antikörper Präparation aufgebracht wird, die JP-A-2- 179461 offenbart eine kompetitive spezifische Bindungsreaktion auf der Oberfläche einer Elektrode, auf die eine Enzym-(Glucoseoxidase) markierte Substanz aufgebracht wird und die JP-A 60-17360 offenbart eine spezifische Bindungsreaktion, die durch die Verwendung eines Oxidations-Reduktionsenzyms (Glucoseoxidase oder ähnliche) und eines Elektronenvermittlers (ein Ferrocen-Derivat oder ähnliches) bewirkt wird.
Ähnliche Techniken wurden z. B. auch in der JP-A 3-25360, der JP-A 60-127450, der JP- A 60-242361, der JP-A- 63-139248, der JP-W 61-500706 (die Bezeichnung "JP-W", wie hier verwendet, bedeutet eine "ungeprüfte, veröffentliche japanische Übersetzung einer internationalen PCT Patentanmeldung), dem U. S. Patent Nr. 4, 963, 245, dem U. S. Patent Nr. 5, 066, 372, Anal. Chem. Bd. 56, S. 2355-2360 (1984) und Clin. Chem. Bd. 31, S. 1449-1452 (1985) offenbart.
Von diesen Enzym-Elektrodenverfahren und spezifischen Bindungsassayverfahren, verwendet ein amperometrisches Enzym-Elektrodenverfahren, ein elektrochemisches Sensor-unterstütztes spezifisches Bindungsassayverfahren oder ein ähnliches im allgemeinen eine niedrigmolekulare Verbindung, einen sogenannten Elektronenvermittler, der zwischen einer biologischen Oxidations-Reduktions-Reaktion, wie z. B. derjenigen zwischen einem Enzym und einer Elektrode, vermittelt. In anderen Worten ist der Elektronenvermittler eine Verbindung, die einen Elektronentransfer zwischen einer enzymatischen Reaktion und einer Elektrodenreaktion in einem Assaysystem vermittelt, das mindestens ein Oxidations-Reduktions-Enzym und eine Elektrode umfasst, die fähig ist, Elektronen in dem System zu übertragen.
Ein solcher Elektronenvermitler wird durch die Enzymreaktion "reduziert/oxidiert" und durch die Elektrodenreaktion "oxidiert/reduziert". Indem er zwischen diesen beiden Reaktionen zirkuliert, vermittelt er den Transfer von Elektronen von der enzymatischen Reaktion zu der Elektrodenreaktion oder von der Elektrodenreaktion zu der enzymatischen Reaktion.
Aufgrund dieser Tatsache muss ein solcher Elektronenvermittler eine Verbindung sein, die bestimmte Eigenschaften aufweist, wie z. B. dass sie
(1) durch die enzymatische Reaktion effizient oxidiert oder reduziert wird, dass sie
(2) durch die Elektrodenreaktion oxidiert oder reduziert wird und dann zu dem Zustand zurückgeführt werden kann, in dem sie in der enzymatischen Reatkion verwendbar ist, und dass sie
(3) stabil ist, wenn sie durch das Enzym oder die Elektrodenreaktion oxidiert oder reduziert wird.
Ausserdem sollte der Elektronenvermittler, der den Elektronentransfer zwischen den enzymatischen Reaktionen und den Elektrodenreaktionen vermittelt, bei einem elektrischen Potential oxidiert oder reduziert werden, das innerhalb eines messbaren Bereichs der Arbeitselektrode liegt.
Der messbare Bereich einer Elektrode variiert abhängig von den Arten der Elektrode und den Lösungsbedingungen. In dem Fall einer Kohlenstoffelektrode, kann er im allgemeinen bei -1,2 V bis + 1,0 V (vs. SCE) liegen.
Es gibt eine große Anzahl solcher Elektronenvermittler, die auf dem Fachgebiet bekannt sind, einschließlich organischer Metall-Verbindungen, wie z. B. Ferrocen-Derivaten und ähnlichen (britisches Patent 8132034), anorganischen Verbindungen, wie z. B. Kalium- Eisen (III) (oder Eisen (II)) Cyanid und ähnlichen und organischen Verbindungen, wie z. B. p-Phenylendiamin (PPD) Derivaten und ähnlichen.
Es ist z. B. bekannt, dass ein p-Phenylendiamin (PPD) Derivat, N,N,N',N'-Tetramethyl -p-phenylendiamin (TMPD) einen Elektronentransfer zwischen einer Elektrode und einer Sulfit-Oxidase vermittelt, die die Oxidation von Sulfit-Ionen zu Sulfat-Ionen katalysiert (Anal. Chem., Bd. 65, S. 242-246, 1993). Ausserdem offenbart die WO 92/07263 ein Benzol-Derivat, das eine Aminogruppe, eine Alkylaminogruppe, eine Dialkylaminogruppe, eine Morpholinylgruppe oder eine Piperidylgruppe an der 1,4- Stellung aufweist, als Elektronenvermittler, dessen reduzierter Zustand in Wasser etwas löslich ist.
Andererseits wurden N,N,N',N',-Tetrakis- 2'-hydroxyethyl)-p-phenylendiamin (THEPD) und N,N,N',N',-Tetrakiscarboxymethyl-p-phenylendiamin (TCPD) als andere PPD Derivate als photoempfindliche Materialien und Chelatbildner verwendet (Photographic Science and Engineering, Bd. 6, Nr. 1, S. 39, 1962; Nature, Bd. 204, S. 180, 1964; Z. Chem., Bd. 4, Nr. 11, S. 436, 1964; Z. Chem., Bd. 4, Nr. 12, S. 463, 1964; An. Quin. Ser. 8., Bd. 59, Nr. 7-8; S. 501, 1963; An. Quin. Ser. B., Bd. 61, Nr 5, S. 717, 1965; An. Quin. Ser 8., Bd. 61, Nr. 5, S. 723, 1965; An. Quin. Ser. B., Bd. 59, Nr. 7 -8, S. 493; 1963; An. Quin. Ser. 8., Bd. 82, Nr. 2, S. 133, 1986; Research Disclosure, Bd. 212, S. 428, 1981). Es ist auch bekannt, dass THEPD als Färbereagenz einer Peroxidasereaktion verwendet werden kann, da seine Reaktion in Gegenwart von Peroxidase, einem Naphtol-Derivat und einem Wasserstoffperoxid zu der Bildung einer Farbsubstanz aufgrund der Bindung seines freien Radikals an das Naphtol-Derivat (EP 0504663) führt. Es war jedoch nicht bekannt, dass THEPD und TCPD als Elektronenvermittler wirken können, die die oben genannten Merkmale aufweisen.
In diesem Zusammenhang, und da die vorherrschende Verwendung von Elektronenvermittlern auf dem Gebiet gemäß dem Stand der Technik in Elektronen- Vermittler-unterstützten Assayverfahren die Enzymelektroden sind, sind die bevorzugten Elektronenvermittler solche, die in Wasser unlöslich sind oder wenig löslich, wie beschrieben in der oben genannten WO/07263. Das heisst, dass es nötig ist, um ein stabiles elektrochemisches Signal durch Vermittlung eines Elektronentransfers zwischen einer Elektrode und einem Oxidations-Reduktions-Enzym, das an der Elektrode immobilisiert oder unlöslich gemacht ist, zu erhalten, eine Effusion des Elektronenvermittler in eine Hauptlösung der Testprobe zu verhindern, indem man es dem Vermittler ermöglicht, nahe an der Elektrode zu existieren.
Es ist ausserdem notwendig, wenn der Elektronenvermittler eine Verbindung ist, die wahrscheinlich einem Einfluss von störenden Substanzen unterliegt, die in den Testproben enthalten sind, wie z. B. Ascorbinsäure, Harnsäure, Haemoglobin, Sauerstoff und ähnlichen, seinen Kontakt mit den störenden Substanzen zu verhindern, indem der Elektronenvermittler in seine wasserunlösliche Form übertragen wird und indem er innerhalb der Elektrode angeordnet wird. Dieses Verfahren weist jedoch Nachteile auf, da der Elektronenvermittler in der Elektrode angeordnet ist, nämlich darin, dass das Reaktionsfeld begrenzt ist, dass nur ein Enzym, das in der Lage ist den Elektronenvermittler, der in der Elektrode angeordnet ist, effizient zu kontaktieren, an der Reaktion teilnehmen kann und dass die Signalstärke in der Regel schwach ist.
In der letzten Zeit sind Enzym-Elektroden-Chips vom Wegwerftyp entwickelt worden, bei denen ein wasserlöslicher Elektronenvermittler, wie z. B. Kalium-Ferricyanid oder ähnliche verwendet werden (siehe JP-A 1- 156658). Da ein solcher wasserlöslicher Elektronenvermittler einen Transfer von Elektronen zwischen einer Elektrode und einem Enzym vermitteln kann, das in einer bestimmten Entfernung von der Elektrode angeordnet ist, steigt die effektive Zahl der Enzymmoleküle an und eine Verbesserung der Eigenschaften der Enzymelektrode wird möglich.
Ein anderes Beispiel für diesen Typ von Vermittler ist in der EP 0 441 222 offenbart, wobei Alanin-Derivate mit einer Aminogruppe, die an einen Phenylring gebunden ist, als Elektronenvermittler verwendet werden, die zwischen einem Redoxenzym und einer Elektrode zyklisieren.
In dem Fall solcher wegwerfbaren Enzym-Elektrodenchips, ist es wünschenswert, die notwendigen Bestandteile für die Funktion der Elektrode in die Chips im vorhinein einzubauen, so dass die Messung durchgeführt werden kann, indem einfach nur eine Testprobe zu dem Assaysystem zugefügt wird. Aufgrund dieser Tatsache ist es wünschenswert, dass ein solcher Elektronenvermittler eine hohe Löslichkeit in Wasser aufweist, einfach getrocknet werden kann und im trockenen Zustand stabil ist. Wasserlösliche Elektronenvermittler von Metallkomplexen, wie z. B. ein Ferrocen- Derivat, Kaliumferricyanid, ein Osmium-Komplex und ähnliche können diese Bedingungen zu einem gewissen Grad erfüllen. Da sie jedoch nur eine geringe Transferrate für Elektronen zu oder von dem Enzym aufweisen, ist es notwendig, die Elektronenvermittler in einer großen Menge zu benutzen. Zusätzlich sind diese wasserlöslichen Elektronenvermittler häufig einem Einfluss von störenden Substanzen ausgesetzt, die in den Testproben enthalten sind, wie z. B. Ascorbinsäure, Harnsäure, Haemoglobin, Sauerstoff und ähnliche, da sie in den Lösungen der Testproben reagieren. Aufgrund dieser Tatsache sollte eine Verbindung entwickelt werden, die weniger Einflüssen von störenden Substanzen ausgesetzt ist.
Zusätzlich zu dem oben Gesagten wurde in der letzten Zeit ein spezifisches Bindungsassayverfahren entwickelt, insbesondere der Vermittler Diffusions-kontrollierte Immunoassay (der hier als MEDIA Assayverfahren abgekürzt werden wird), wobei ein Oxidations-Reduktionsenzym als Markierungssubstanz verwendet wird und wobei die Markierungssubstanzen in einer Matrix mit einer flüssigen Probe entwickelt werden um Verteilungen mit unterschiedlichen Entfernungen von jeder Markierungssubstanz zu der Elektrode durch eine spezifische Bindungsreaktion eines Analyten in der flüssigen Probe mit einer spezifischen Bindungssubstanz zu bilden. Die Signal-Substanzen oder deren Elektronenvermittler diffundieren zu der Elektrode und die Diffusion ist der die Geschwindigkeit festlegende Schritt bei diesem Assayverfahren. Die Stromstärken der Signalsubstanzen oder der Elektronenvermittler werden an der Elektrode gemessen um die Konzentration des Analyten in der flüssigen Probe zu bestimmen. Die Entfernungs- Verteilung kann durch die Stromstärke nachgewiesen werden und die Stromstärke korrespondiert mit der Konzentration des Analyten in der Probe (siehe JP-A 5-264552 (EP 0 525 723 A2)). Ein solches Assayverfahren benötigt auch die Entwicklung eines Elektronenvermittlers, der einen stabilen Transfer von Elektronen zwischen dem Enzym und der Elektrode in flüssigen Proben vermitteln kann, so wie Blut, Urin und ähnlichen, die störende Substanzen enthalten.
Es ist eine Aufgabe gemäß der vorliegenden Erfindung, ein elektrochemisches Assayverfahren für die Messung von Substanzen in einer Flüssigkeit bereitzustellen, das die Probleme eines begrenzten Reaktionsfeldes, der Notwendigkeit einer sehr hohen Konzentration eines Vermittlers und den störenden Einfluss der störenden Substanzen überwindet.
Diese Aufgabe wird gelöst durch die Bereitstellung eines elektrochemischen Assayverfahrens, das das Messen einer zu untersuchenden Substanz in Flüssigkeitsproben umfasst, wobei man sich mindestens eines Oxidations-Reduktions- Enzyms bedient, wobei ein Oxidations-Reduktions-Enzym, ein Elektronen-Vermittler und eine Elektrode, die in der Lage ist, mit dem Elektronen-Vermittler einen Elektronentransfer durchzuführen, in dem Assay angeordnet sind und eine durch die folgende Formel [I] dargestellte Verbindung oder ein Salz davon als Elektronen- Vermittler verwendet wird:
wobei R¹, R², R³ und R&sup4; dieselben oder unterschiedlich voneinander sein können und jeweils eine lineare oder verzweigte Alkylgruppe mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen bedeuten, die eine Substituentengruppe aufweisen kann, mit der Maßgabe, dass mindestens einer der Reste R¹, R², R³ und R&sup4; mindestens eine Gruppe aufweist, ausgewählt aus der Klasse, bestehend aus Hydroxyl, Mercapto, Carboxyl, Phosphonooxy und Sulfo.
Auf diese Weise gelingt es der Erfindung die oben genannten Probleme, die im Stand der Technik auftreten, zu überwinden, wobei ein elektrochemisches Assayverfahren bereitgestellt wird, bei dem ein wasserlöslicher Elektronenvermittler verwendet wird, wie z. B. ein Enzym-Elektroden-Verfahren oder ein spezifisches Bindungsassayverfahren, z. B. das MEDIA Verfahren, das eine ausgezeichnete Detektions-Sensibilität (Reaktivität) aufweist, das die Messung stabil mit hoher Reproduzierbarkeit selbst im Falle von Blut, Urin und ähnlichen Proben durchführen kann, die störende Substanzen enthalten und das in geeigneter Weise für die Verwendung in der Trockenchemie verwendet werden kann, wie auch eine neue p-Phenylendiamin-Verbindung, die als Elektronenvermittler in dem Assayverfahren verwendet wird.
Bei einem Assayverfahren, bei dem ein Elektronenvermittler verwendet wird, insbesondere bei einem Assayverfahren, bei dem eine zu untersuchende Substanz in einer Flüssigkeitsprobe quantitativ bestimmt wird, wobei eine Elektrode und mindestens ein Oxidations-Reduktions-Enzym verwendet wird, werden die folgenden Oxidations- Reduktions-Enzyme als typische Beispiele verwendet:

(1) Oxidasen

Diese Enzyme enthalten ein Flavin-Coenzym, ein Metallatom, ein Häm oder ähnliches und verwenden Sauerstoff als den Elektronenakzeptor im lebenden Körper.
Beispiele: Glucose-Oxidase, Aminosäure-Oxidase, Lactat-Oxidase, Urat-Oxidase, Xanthin-Oxidase, Ascorbat-Oxidase und ähnliche.

(2) Hydroperoxidasen

Im lebenden Körper verwenden sie Wasserstoffperoxid als Akzeptor.
Beispiele: Peroxidase, Katalase und ähnliche.

(3) Dehydrogenasen

Im lebenden Körper verwenden sie NAD(H) und NADP(H) als Akzeptor (oder Donor).
Beispiele: Alkohol-Dehydrogenase, Lactat-Dehydrogenase und ähnliche.
Unter diesen Oxidations-Reduktions-Enzymen wird Glucose-Oxidase (GOD) bei Enzymelektroden für die Messung von Blut-Glucose-Niveaus und Meerrettich- Peroxidase (HRPO) als Markierungsenzym in spezifischen Bindungsassays wie z. B. einer DNA Hybridisierung, einem Immunoassay und ähnlichen verwendet. Gemäß den von den vorliegenden Erfindern durchgeführten Experimenten zeigten sowohl Glucose Oxidase als auch Meerettich Peroxidase eine überlegene Stromstärke-Reaktion in einem Puffer, wenn Hydrochinonen (HQ)/Benzochinon (BQ) als Elektronenvermittler verwendet wurden, wenn man mit der Verwendung von konventionellen Elektronenvermittlern; wie z. B. Ferrocen-Derivaten, anorganischen Ionen, Metall- Komplexen und ähnlichen verglich. Diese Elektronenvermittler waren jedoch nicht in der Lage eine stabile und reproduzierbare Reaktion in Gegenwart von Blut, Urin und ähnlichem zu zeigen, und zwar aufgrund der darin enthaltenen störenden Substanzen.
Eine ähnliche Interferenz in Gegenwart von Blut, Urin und ähnlichem wurde auch im Falle von p-Phenylendiamin (PPD) abgeleiteten Elektronenvermittlern, wie z. B. PPD, TMPD, N,N,N',N'-Tetraethyl-p-phenylendiamin (TEPD) und ähnlichen gefunden, die eine ausgezeichnete Stromstärkereaktion in einer Pufferlösung aufweisen.
Ausserdem haben die gegenwärtigen Erfinder versucht, Chips vom Trockenchemie-Typ herzustellen, indem sie ein Stück eines Cellulose-Filterpapiers oder eines Glasfilterpapiers mit einer Lösung von HQ, PPD, TMPD oder TEPD tränkten und das resultierende Stück auf einer Elektrode trockneten (durch Gefriertrocknen, Vakuum- Trocknen, Trocknen an der Luft oder ähnliches) oder indem sie es auf einer Elektrode nach dem Trocknen anordneten, sodass der getränkte Elektronenvermittler sich zum Zeitpunkt der Messung in einer flüssigen Probe lösen kann. Jedoch zeigten diese Chips eine geringe Stromstärkereaktion und sehr schlechte Eigenschaften.
Die Ergebnisse der detaillierten Studien, die von den Erfindern der vorliegenden Erfindung durchgeführt wurden, haben nahegelegt, dass die folgenden Probleme als zugrundeliegende Ursache solcher Phänomene anzunehmen sind:
(1) eine niedrige Wasserlöslichkeit des oxidierten oder reduzierten Typs der Verbindung, die als Elektronenvermittler verwendet werden soll,
(2) eine geringe Stabilität nach dem Trocknen der Verbindung, die als Elektronenvermittler verwendet werden soll, da sie einen hohen Dampfdruck aufweist und
(3) eine geringe Stabilität in einer biologische Probe, wie z. B. Blut oder Urin der oxidierten Form (oder dem Radikal-Zustand) oder der reduzierten Form der Verbindung, die als Elektronenvermittler verwendet werden soll

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Mit dem Ziel, die oben genannten Probleme, die mit dem Stand der Technik verbunden sind, zu überwinden, haben die Erfinder der vorliegenden Erfindung ausgedehnte Studien durchgeführt und haben im Ergebnis festgestellt, dass ein Assaysystem, das aus einem Oxidations-Reduktions-Enzym, einem Elektronenvermittler, der durch das Oxidations-Reduktions-Enzym erzeugte Elektronen vermittelt und einer Elektrode besteht, die in der Lage ist, einen Elektronentransfer zwischen dem Enzym und dem Elektronenvermittler durchzuführen, in geeigneter Weise für die Messung verschiedener biologischer Komponenten verwendet werden kann, wenn eine Verbindung, wie dargestellt durch die folgende Formel (I), Formel (II) oder ein Salz davon als Elektronenvermittler verwendet wird.
Anders ausgedrückt haben die Erfinder der vorliegenden Erfindung als Ergebnis ihrer ausgedehnten Studien festgestellt, dass die Verbindung der Formel (I), der Formel (II) oder ein Salz davon ausgezeichnete Eigenschaften in elektrochemischen Assays, wie z. B. dem Enzym-Elektrodenverfahren, einem spezifischen Bindungsassayverfahren, z. B. dem MEDIA Verfahren und ähnlichen zeigen: z. B. wirkt sie als ausgezeichneter Elektronenvermittler und ist in Wasser hoch löslich; sie kann einfach getrocknet werden (durch Gefriertrocknen; durch Vakuum-Trocknen oder durch Trocknen an der Luft oder ähnliches) und ist stabil im trocknen Zustand; sie zeigt eine hohe Elektronentransfer- Rate mit den Enzymen; und sie funktioniert als ein Elektronenvermittler, der kaum Einflüssen von störenden Substanzen unterliegt, die in den Testproben wie Blut, Urin und ähnlichem enthalten sind. Die vorliegende Erfindung wurde auf der Grundlage dieser Feststellungen gemacht.
Es wird also gemäß der vorliegenden Erfindung ein elektrochemisches Assayverfahren bereitgestellt, das das Messen einer zu untersuchenden Substanz in Flüssigkeitsproben umfasst, wobei man sich mindestens eines Oxidations-Reduktions-Enzyms bedient, wobei ein Oxidations-Reduktions-Enzym, ein Elektronen-Vermittler und eine Elektrode, die in der Lage ist, mit dem Elektronen-Vermittler einen Elektronentransfer durchzuführen, in dem Assay angeordnet sind und eine durch die folgende Formel [I] oder [II] dargestellte Verbindung oder ein Salz davon als Elektronen-Vermittler verwendet wird:
wobei R¹, R², R³ und R&sup4; dieselben oder unterschiedlich voneinander sein können und jeweils eine lineare oder verzweigte Alkylgruppe mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen bedeuten, die eine Substituentengruppe aufweisen kann, mit der Maßgabe, dass mindestens einer der Reste R¹, R², R³ und R&sup4; mindestens eine Gruppe aufweist, ausgewählt aus der Klasse, bestehend aus Hydroxyl, Mercapto, Carboxyl, Phosphonooxy und Sulfo.
Dabei weist mindestens einer der Reste, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus R¹, R², R³ und R&sup4;, vorzugsweise eine Hydroxylgruppe oder eine Carboxylgruppe auf.
Insbesondere ist die Verbindung, die durch die Formel (I) dargestellt wird, mindestens eine Verbindung, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: Formel (II)
wobei R&sup5;, R&sup6;, R&sup7; und R&sup8; dieselben oder unterschiedlich voneinander sein können und jeweils ein Wasserstoffatom, eine lineare oder verzweigte Alkylgruppe mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen bedeuten, die eine Substituentengruppe aufweisen kann, mit der Maßgabe, dass mindestens einer der Reste R&sup5;, R&sup6;, R&sup7; und R&sup8; eine Alkylgruppe ist, die mindestens eine Gruppe aufweist, ausgewählt aus der Klasse, bestehend aus Hydroxyl, Mercapto, Carboxyl, Phosphonooxy und Sulfo und dass mindestens einer der Reste R&sup5;, R&sup6;, R&sup7; und R&sup8; Wasserstoff ist.
Dabei weist der mindestens eine, aus der Gruppe, bestehend aus R&sup5;, R&sup6;, R&sup7; und R&sup5; ausgewählte Rest vorzugsweise eine Hydroxylgruppe auf.
Insbesondere ist die Verbindung, die durch die Formel (II) dargestellt wird, mindestens eine Verbindung, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus:
Vorzugsweise ist die zu untersuchende Substanz ein Substrat, ein Inhibitor, ein Cofaktor oder ein Aktivator des Oxidations-Reduktions-Enzyms, und es wird eine Modulation der Enzymreaktion, erzeugt in Reaktion auf die Menge des Substrats, des lnhibitors, des Cofaktors oder des Aktivators als eine Modulation eines elektrochemischen Signals an der Elektrode nachgewiesen.
Es wird bevorzugt, die zu untersuchende Substanz durch einen spezifischen Bindungsassay zu messen, wobei man sich des Oxidations-Reduktions-Enzyms als Markierung bedient sowie mindestens einer Bindungssubstanz, die für die zu untersuchende Substanz spezifisch ist.
Es ist ebenso zu bevorzugen, die zu untersuchende Substanz durch ein MEDIA Verfahren zu messen, das das elektrochemische Assayverfahren bewirkt, indem eine Vorrichtung verwendet wird, die eine Matrix als einen Bereich umfasst, wo eine Flüssigkeitsprobe, die vermutlich die zu untersuchende Substanz enthält, entwickelt wird, sowie ein Probeneingabevorrichtung, durch die die Probe in die Matrix eingeführt wird, und eine Elektrode benachbart zu der Matrix, wobei eine Probe in die Probeneingabevorrichtung eingeführt wird, damit die zu untersuchende Substanz in der Probe in der Matrix mit einer ersten spezifischen Bindungssubstanz und einer zweiten spezifischen Bindungssubstanz reagieren kann, die mit einem Oxidations- Reduktionsenzym markiert ist, das in der Lage ist, eine Elektronentransferart zu bilden, die ein Signal an dem Elektrodenteil erzeugt oder wobei eine Probe in die Matrix eingebracht wird, nachdem man der zu untersuchenden Substanz in der Probe die Möglichkeit gegeben hat, in einem äußeren Bereich der Matrix mit einer ersten spezifischen Bindungssubstanz und einer zweiten spezifischen Bindungssubstanz zu reagieren, die mit einem Oxidations-Reduktionsenzym markiert ist, das in der Lage ist, eine Elektronentransferart zu bilden, die ein Signal an dem Elektrodenteil erzeugt, wodurch Veränderungen in der Verteilung von mindestens einer molekularen Spezies in einem Komplex des Oxidations-Reduktionsenzyms - markierter zweiter spezifischer Bindungssubstanz und der zu untersuchenden Substanz, einem Komplex des Oxidations-Reduktions-Enzym - markierter zweiter spezifischer Bindungssubstanz, der zu untersuchenden Substanz und der ersten spezifischen Bindungssubstanz und einer freien Form des Oxidations-Reduktionsenzyms - markierter zweiter spezifischer Bindungssubstanz bewirkt werden, und woraufhin Veränderungen der Verteilung in Reaktion auf die Menge der zu untersuchenden Substanz in der Probe als Signalmodulation an der Elektrode nachgewiesen werden, was durch den Massentransfer der Elektronentransferart, erzeugt durch das Oxidations-Reduktions- Enzym, begrenzt ist.
Es ist auch vorzuziehen, die zu untersuchende Substanz durch ein anderes MEDIA Verfahren zu messen, wobei das elektrochemische Assayverfahren bewirkt wird, wobei eine Vorrichtung verwendet wird, die eine Matrix als einen Bereich umfasst, wo eine Flüssigkeitsprobe, die vermutlich die zu untersuchende Substanz enthält, entwickelt wird, eine Vorrichtung zur Probeneingabe, von der die Probe in die Matrix eingeführt wird und eine Elektrode, benachbart zu der Matrix, wobei entweder eine spezifische Bindungssubstanz, die für die zu untersuchende Substanz spezifisch ist oder eine Substanz, die mit der zu untersuchenden Substanz um die spezifische Bindungssubstanz kompetitiert, mit einem Oxidations-Reduktions-Enzym markiert ist, das in der Lage ist, eine Elektronentransferart zu bilden, die ein Signal an dem Elektrodenteil erzeugt und wobei eine Probe in die Vorrichtung für die Probeneingabe eingeführt wird, um der zu untersuchenden Substanz in der Probe zu ermöglichen, in kompetitiver Weise in der Matrix mit einer spezifischen Bindungssubstanz oder einer Substanz, die mit der zu untersuchenden Substanz um die spezifische Bindungsubstanz kompetitiert, zu reagieren oder wobei die Probe in die Matrix eingeführt wird, nachdem man der zu untersuchenden Substanz in der Probe ermöglicht hat, in einem äusseren Bereich der Matrix in einer kompetitiven Weise mit einer spezifischen Bindungssubstanz oder einer Substanz, die mit der zu untersuchenden Substanz um die spezifische Bindungssubstanz kompetitiert, zu reagieren, wodurch Veränderungen in der Verteilung von mindestens einer mit dem Oxidations-Reduktions-Enzym markierten molekularen Spezies in einem Komplex der spezifischen Bindungssubstanz und der zu untersuchenden Substanz, einem Komplex der spezifischen Bindungssubstanz und der Substanz, die mit der zu untersuchenden Substanz um die spezifische Bindungssubstanz kompetitiert, einer freien Form der spezifischen Bindungssubstanz und einer freien Form der Substanz, die mit der zu untersuchenden Substanz um die spezifische Bindungssubstanz kompetitiert, bewirkt werden, und wobei die in Reaktion auf die Menge der zu untersuchenden Substanz in der Probe auftretenden Verteilungsveränderungen als eine Signalmodulation an der Elektrode nachgewiesen werden, die durch den Massentransfer der Elektronentransferart, die durch das Oxidations-Reduktionsenzym erzeugt wird, begrenzt ist.
Andere Aufgaben und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden sich ergeben, wenn die Beschreibung fortschreitet.

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

Fig. 1(a) und (b) sind jeweils konzeptionelle Zeichnungen, die die Aktionen des Elektronenvermittlers zeigen.
Fig. 2 ist eine allgemeine perspektivische Explosionsansicht, die ein Beispiel der (spezifischen Bindungs-) Assayvorrichtung für die Verwendung in der Praxis des elektrochemischen Assayverfahrens der vorliegenden Erfindung darstellt.
Fig. 3 ist eine konzeptionelle Zeichnung, die einen Teil der Anordnung der (spezifischen Bindungs-) Assayvorrichtung gemäß Fig. 2 darstellt.
Fig. 4 ist eine Illustration, die eine allgemeine Draufsicht einen Elektrodenteils der (spezifischen Bindungs-) Assayvorrichtung gemäß Fig. 2 zeigt.
Fig. 5 ist eine Graphik, die den Dampfdruck von TEPD und THEPD zeigt.
Fig. 6 ist eine Graphik, die eine zyklische Voltampermetrie (Potential Scanning Bereich - 500 mV bis + 800 mV) von TEPD zeigt.
Fig. 7 ist eine Graphik, die eine zyklische Voltampermetrie (Potential Scanning Bereich - 200 mV bis + 300 mV) von TEPD zeigt.
Fig. 8 ist eine Graphik, die eine zyklische Voltampermetrie (Potential Scanning Bereich - 500 mV bis + 800 mV) von TCPD zeigt.
Fig. 9 ist eine Graphik, die eine zyklische Voltampermetrie (Potential Scanning Bereich - 200 mV bis + 300 mV) von TCPD zeigt.
Fig. 10 ist eine Graphik, die eine zyklische Voltampermetrie (Potential Scanning Bereich - 500 mV bis + 800 mV) von THEPD zeigt.
Fig. 11 ist eine Graphik, die eine zyklische Voltampermetrie (Potential Scanning Bereich - 200 mV bis + 300 mV) von THEPD zeigt.
Fig. 12 ist eine Graphik, die eine zyklische Voltampermetrie (Potential Scanning Bereich - 500 mV bis + 800 mV) von TDHPD zeigt.
Fig. 13 ist eine Graphik, die eine zyklische Voltampermetrie (Potential Scanning Bereich - 200 mV bis + 300 mV) von TDHPD zeigt.
Fig. 14 ist eine Graphik, die die Elektronentransferaktivität von TEPD zeigt.
Fig. 15 ist eine Graphik, die die Elektronentransferaktivität von TCPD zeigt.
Fig. 16 ist eine Graphik, die die Elektronentransferaktivität von THEPD zeigt.
Fig. 17 ist eine Graphik, die die Elektronentransferaktivitä von TDHPD zeigt.
Fig. 18 ist eine Graphik, die ein anderes Beispiel der Elektronentransferaktivität von TEPD zeigt.
Fig. 19 ist eine Graphik, die ein anderes Beispiel der Elektronentransferaktivität von TCPD zeigt.
Fig. 20 ist eine Graphik, die ein anderes Beispiel der Elektronentransferaktivität von THEPD zeigt.
Fig. 21 ist eine Graphik, die ein anderes Beispiel der Elektronentransferaktivität von TDHPD zeigt.
Fig. 22 ist eine Graphik, die ein Assayergebnis eines erfindungsgemäßen Beispiels zeigt, das unter Verwendung des Elektronenvermittlers gemäß der vorliegenden Erfindung durchgeführt wurde.
Fig. 23 ist eine Graphik, die ein Assayergebnis eines Vergleichsbeispiels darstellt, durchgeführt unter Verwendung eines konventionellen Elektronenvermittlers.
Fig. 24 ist eine Graphik, die den Dampfdruck von PPD, TMPD, TEPD, TCPD, THEPD und TDHPD bei 25ºC zeigt.
Fig. 25 ist eine Graphik, die eine zyklische Voltampermetrie (Potential Scanning Bereich - 500 mV bis + 800 mv) von HTEPD zeigt.
Fig. 26 ist eine Graphik, die eine zyklische Voltampermetrie (Potential Scanning Bereich - 200 mV bis + 300 mv) von HTEPD zeigt.
Fig. 27 ist eine Graphik, die eine zyklische Voltampermetrie (Potential Scanning Bereich - 500 mV bis + 800 mV) für N, N - BHDPD zeigt.
Fig. 28 ist eine Graphik, die eine zyklische Voltampermetrie (Potential Scanning Bereich - 200 mV bis + 300 mV) von N,N-BHDPD zeigt.
Fig. 29 ist eine Graphik, die eine zyklische Voltampermetrie (Potential Scanning Bereich - 500 mV bis + 800 mV) von N,N'-BHDPD zeigt.
Fig. 30 ist eine Graphik, die eine zyklische Voltampermetrie (Potential Scanning Bereich - 200 mV bis + 300 mV) von N,N'-BHDPD zeigt.
Fig. 31 ist eine Graphik, die eine zyklische Voltampermetrie (Potential Scanning Bereich - 500 mV bis + 800 mV) eines p-Phenylendiamin-Derivats mit einer mono-substituierten Aminogruppe zeigt, erhalten durch Reaktion von p-Phenylendiamin mit Propylenoxid (HPPD).
Fig. 32 ist eine Graphik, die eine zyklische Voltampermetrie (Potential Scanning Bereich - 200 mV bis + 300 mV) eines p-Phenylendiamin-Derivats mit einer mono-substituierten Aminogruppe zeigt, erhalten durch die Reaktion von p-Phenylendiamin mit Propylenoxid (HPPD).
Fig. 33 ist eine Graphik, die eine zyklische Voltampermetrie (Potential Scanning Bereich - 500 mV bis + 800 mV) eines p-Phenylendiamin-Derivats mit einer di-substituierten Aminogruppe oder zwei Aminogruppen zeigt, erhalten durch die Reaktion von p- Phenylendiamin mit Propylenoxid.
Fig. 34 ist eine Graphik, die eine zyklische Voltampermetrie (Potential Scanning Bereich - 200 mV bis + 300 mV) eines p-Phenylendiamin-Derivats mit einer di-substituierten Aminogruppe oder zwei Aminogruppen zeigt, erhalten durch die Reaktion von p- Phenylendiamin mit Propylenoxid.
Fig. 35 ist eine Graphik, die eine zyklische Voltampermetrie (Potential Scanning Bereich - 500 mV bis + 800 mV) eines p-Phenylendiamin-Derivats mit tri-substituierten Aminogruppen zeigt, erhalten durch die Reaktion von p-Phenyfendiamin mit Propylenoxid.
Fig. 36 ist eine Graphik, die eine zyklische Voltampermetrie (Potential Scanning Bereich - 200 mV bis + 300 mV) eines p-Phenylendiamin-Derivats mit tri-substituierten Aminogruppen zeigt, erhalten durch die Reaktion von p-Phenylendiamin mit Propylenoxid.
Fig. 37 ist eine Graphik, die die Elektronentransferaktivität von HTEPD zeigt.
Fig. 38 ist eine Graphik, die die Elektronentransferaktivität von N,N-BHDPD zeigt.
Fig. 39 ist eine Graphik, die die Elektronentransferaktivität von N,N'-BHDPD zeigt.
Fig. 40 ist eine Graphik, die die Elektronentransferaktivität eines p- Phenylendiaminderivats mit einer monosubstituierten Aminogruppe zeigt, erhalten aus der Reaktion von p-Phenylendiamin mit Propylenoxid (HPPD).
Fig. 41 ist eine Graphik, die die Elektronentransferaktivität eines p- Phenylendiaminderivats mit einer di-substituierten Aminogruppe oder zwei Aminogrupen zeigt, erhalten aus der Reaktion von p-Phenylendiamin mit Propylenoxid.
Fig. 42 ist eine Graphik, die die Elektronentransferaktivität eines p- Phenylendiaminderivats mit tri-substituierten Aminogruppen zeigt, erhalten durch die Reaktion von p-Phenylendiamin mit Propylenoxid.
Fig. 43 ist eine Graphik, die ein anderes Beispiel der Elektronentransferaktivität von HTEPD zeigt.
Fig. 44 ist eine Graphik, die ein anderes Beispiel der Elektronentransferaktivität von N,N-BHDPD zeigt.
Fig. 45 ist eine Graphik, die ein anderes Beispiel der Elektronentransferaktivität von N,N'-BHDPD zeigt.
Fig. 46 ist eine Graphik, die ein anderes Beispiel der Elektronentransferaktivität eines p- Phenylendiaminderivats mit einer mono-substituierten Aminogruppe zeigt, erhalten durch die Reaktion von p-Phenylendiamin mit Propylenoxid (HPPD).
Fig. 47 ist eine Graphik, die ein anderes Beispiel der Elektronentransferaktivität eines p- Phenylendiaminderivats mit einer di-substitutierten Aminogruppe oder zwei Aminogruppen zeigt, erhalten durch die Reaktion von p-Phenylendiamin mit Propylenoxid.
Fig. 48 ist eine Graphik, die ein anderes Beispiel der Elektronentransferaktivität eines p- Phenylendiaminderivats mit tri-substituierten Aminogruppen zeigt, erhalten durch die Reaktion von p-Phenylendiamin mit Propylenoxid.
In diesen Figuren sind Teile der Assayvorrichtung durch Zahlen wie folgt angezeigt: 10, eine obere Abdeckung; 10a, eine Probeneingabeöffnung; 12, ein Filter; 14, ein mit einer Markierung imprägniertes Glied; 16, ein mit einem Elektronenvermittler imprägniertes Glied; 16a und 24a, Versiegelungsmittel; 18, ein Kommunikationsvorrichtung; 20, ein Elektrodenteil; 22, eine Matrix; 24, ein Absorptionsmittel; 26, ein unterer Träger; 28, ein Träger; 30, eine durchgehende Öffnung; 32, eine Referenzelektrode; 34, eine Arbeitselektrode; 36, eine Isoliervorrichtung und 38, ein Probeneingabemittel.

DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Das elektrochemische Assayverfahren gemäß der vorliegenden Erfindung und die neue p-Phenylendiaminverbindung, die in dem Assayverfahren verwendet werden kann werden im folgenden im Detail beschrieben.
Wie bereits oben beschrieben enthält das elektrochemische Assayverfahren (das hiernach als "Assayverfahren" bezeichnet werden wird) gemäß der vorliegenden Erfindung in seinem Assaysystem mindestens ein Oxidations-Reduktions-Enzym, einen Elektronenvermittler und eine Elektrode, die in der Lage ist einen Elektronentransfer mit dem Elektronenvermittler durchzuführen und verwendet eine Verbindung, die durch die folgende Formel (I) oder (II) dargestellt wird oder ein Salz davon als den Elektronenvermittler:
wobei R¹, R², R³ und R&sup4; dieselben oder unterschiedlich voneinander sein können und jeweils eine lineare oder verzweigte Alkylgruppe mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen bedeuten, die eine Substituentengruppe aufweisen kann, mit der Maßgabe, dass mindestens einer der Reste R¹, R², R³ und R&sup4; mindestens eine Gruppe aufweist, ausgewählt aus der Klasse, bestehend aus Hydroxyl, Mercapto, Carboxyl, Phosphonooxy und Sulfo.
wobei R&sup5;, R&sup6;, R&sup7; und R&sup8; dieselben oder unterschiedlich voneinander sein können und jeweils ein Wasserstoffatom, eine lineare oder verzweigte Alkylgruppe mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen bedeuten, die eine Substituentengruppe aufweisen kann, mit der Maßgabe, dass mindestens einer der Reste R&sup5;, R&sup6;, R&sup7; und R&sup8; eine Alkylgruppe ist, die mindestens eine Gruppe aufweist, ausgewählt aus der Klasse, bestehend aus Hydroxyl, Mercapto, Carboxyl, Phosphonooxy und Sulfo und dass mindestens einer der Reste R&sup5;, R&sup6;, R&sup7; und R&sup8; Wasserstoff ist.
Als Ergebnis intensiver Studien haben die Erfinder der vorliegenden Erfindung zum ersten Mal festgestellt, dass die durch die obige Formel (I) oder (II) dargestellte Verbindung ausgezeichnet als Elektronenvermittler in dem elektrochemischen Assay wirkt. Es wurde ebenso festgestellt, dass, wenn mindestens einer der Reste R¹ bis R&sup8; der Verbindung gemäß der Formel (I) oder (II) mindestens eine Gruppe aufweist, die ausgewählt ist aus der Klasse, bestehend aus Hydroxyl, Mercapto, Carboxyl, Phosphonooxy und Sulfo, die resultierende Verbindung einen niedrigen Dampfdruck aufweist und in Wasser hochlöslich wird, so dass sie leicht getrocknet werden kann (durch Gefriertrocknen, durch Vakuum-Trocknen, durch Trocknen an der Luft oder ähnliches), und ausserdem unter trockenen Bedingungen stabil ist und sich in einer flüssigen Probe schnell löst, zu der sie hinzugefügt wird, wodurch sie eine ausgezeichnete Reaktion zeigt. Anders ausgedrückt hat sich herausgestellt, dass diese Verbindung ausgezeichnete Eigenschaften aufweist, die für Elektronenvermittler benötigt werden: sie kann z. B. in geeigneter Weise für die Trockenchemie verwendet werden, indem poröse Materialien, wie z. B. verschiedene Arten von Filterpapier und ähnliches mit der Verbindung imprägniert werden, woraufhin sie getrocknet werden; sie kann die Interferenz reduzieren, die durch störende Substanzen, die in den Testproben wie z. B. Blut, Urin und ähnlichen enthalten sind, verursacht werden; und sie zeigt eine ausgezeichnet elektrische Stromstärke-Reaktion aufgrund der geringen Störung in ihrer Elektronen-Reaktion mit den Enzymen.
Dementsprechend ist bei dem Assayverfahren der vorliegenden Erfindung, bei dem die Verbindung der vorstehenden Formel (I) oder (II) als Elektronenvermittler verwendet wird, die Detektions-Sensibilität (Reaktivität) ausgezeichnet, sie kann in geeigneter Weise für eine Wegwerf-Verwendung verwendet werden und eine stabile Messung kann konstant mit guter Reproduzierbarkeit selbst im Fall von Blut, Urin und ähnlichen Proben, die störende Substanzen enthalten, durchgeführt werden.
Im Hinblick auf R¹, R², R³, und R&sup4; der Verbindung der Formel (I) können alle bekannten Gruppe, die die vorstehenden Anfordemisse erfüllen, verwendet werden, wobei illustrative Beispiele die folgenden umfassen: Methyl, Ethyl, Propyl, Hydroxymethyl, 1- Hydroxyethyl, 2-Hydroxyethyl, 1,2-Dihydroxyethyl, 1-Hydroxypropyl, 2-Hydroxypropyl, 3- Hydroxypropyl, 2-(1-Hydroxy)propyl, 2,3-Dihydroxypropyl, 2-(1,3-Dihydroxy)propyl, 3- Hydroxy-2-methylpropyl, Mercaptomethyl, Carboxymethyl, Phosphonooxymethyl, Sulfomethyl und ähnliche Gruppen, wobei Hydroxymethyl, 1-Hydroxyethyl, 2- Hydroxyethyl, 1-Hydroxypropyl, 2-Hydroxypropyl, 3-Hydroxypropyl, 2-(1-Hydroxy)propyl, 2,3-Dihydroxypropyl, Carboxymethyl und ähnliche Gruppen besonders bevorzugt werden.
Im diesem Fall können die Gruppen R¹, R², R³ und R&sup4; dieselben sein oder sich voneinander unterscheiden.
Im Hinblick auf die Reste R&sup5;, R&sup6;, R&sup7; und R&sup8; der Verbindung der Formel (II) können alle bekannte Gruppen verwendet werden, die den obigen Anfordernissen genügen, wobei die illustrativen Beispiele die folgenden umfassen: Wasserstoff, Methyl, Ethyl, Propyl, Hydroxymethyl, 1-Hydroxyethyl, 2-Hydroxyethyl, 1,2-Dihydroxyethyl, 1-Hydroxypropyl, 2- Hydroxypropyl, 3-Hydroxypropyl, 2-(1-Hydroxy)propyl, 2,3-Dihydroxypropyl, 2-(1,3- Dihydroxy)propyl, 3-Hydroxy-2-methylpropyl, Mercaptomethyl, Carboxymethyl, Phosphonooxymethyl, Sulfomethyl und ähnliche Gruppen, wobei Hydroxymethyl, 1- Hydroxyethyl, 2-Hydroxyethyl, 1-Hydroxypropyl, 2-Hydroxypropyl, 3-Hydroxypropyl, 2-(1- Hydroxy)propyl, 2,3-Dihydroxypropyl, Carboxymethyl und ähnliche Gruppen besonders bevorzugt werden.
Im diesem Fall können die Gruppen R&sup5;, R&sup6;, R&sup7; und R&sup8; dieselben sein oder sich voneinander unterscheiden, aber mindestens einer der Reste ist eine Alkylgruppe und mindestens einer der Reste ist Wasserstoff.
Die folgenden Verbindungen sind illustrative Beispiele der Verbindungen der Formel (I) oder (II), die in dem Assayverfahren gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden können:
Von den oben genannten umfassen besonders geeignete Verbindungen N,N,N',N'- Tetrakis (2'-hydroxyethyl)-p-Phenylendiamin (THEPD), dargestellt durch die Formel (1), N,N,N',N'-Tetrakiscarboxymethyl-p-phenylendiamin (TCPD), dargestellt durch die Formel (2), N,N,N',N'-Tetrakis(2',3'-dihydroxypropyl)-p-phenylendiamin (TDHPD), dargestellt durch die Formel (3), N-2'-Hydroxyethyl-N,N',N'-triethyl-p-Phenylendiamin (HTEPD), dargestellt durch die Formel (11), N,N-bis-(2'-Hydroxyethyl)-N,N'-diethylp-phenylendiamin (N, N-BHDPD), dargestellt durch die Formel (12), N,N' - Bis -(2'- hydroxyethyl)-N,N'-Diethyl-p-phenylendiamin (N,N'-BHPD), dargestellt durch die Formel (13), und ähnliche.
Von den obigen umfassen besonders geeignete Verbindungen N,N'-Bis-(2'- hydroxyethyl)-p-phenylendiamin (N,N'-BHPD), dargestellt durch Formel (21), N-2'- Hydroxypropyl-p-phenylendiamin (HPPD), dargestellt durch Formel (24) und ähnliche.
Ausserdem werden besonders geeignete Verbindungen durch die folgenden Formeln dargestellt:
Diese Elektronenvermittler, die durch die Formel (I) oder (II) dargestellt werden, können in Übereinstimmung mit verschiedenen bekannten Verfahren hergestellt werden. Es kann z. B. eine Verbindung von Interesse erhalten werden, indem p-Phenylendiamin und ein Halogenid einer Verbindung, die mit R¹, R², R³, R&sup4;, R&sup5;, R&sup6;, R¹ und R&sup8; korrespondiert, in einem Alkohol oder einem ähnlichen Lösungsmittel gelöst werden, woraufhin die Lösung im Rückfluss erhitzt wird um die Reaktion zu bewirken, woraufhin die so erhaltene Verbindung durch Filtration, Säulenchromatographie und ähnliche Mittel getrennt und gereinigt wird. Ausserdem kann auch eine Verbindung mit einer Hydroxylgruppe an dem Kohlenstoffatom an 2-Stellung von R¹ bis R&sup8; synthetisiert werden, indem p-Phenylendiamin und ein Ethylenoxidderivat in einem Lösungsmittel gelöst werden, woraufhin die Lösung im Rückfluss erhitzt wird, um die Reaktion zu bewirken und wonach die so erhaltene Verbindung von Interesse durch Filtration, Säulenchromatographie und ähnliche Mittel abgetrennt und gereinigt wird.
Bei dem Assayverfahren gemäß der vorliegenden Erfindung können Salze der Elektronenvermittler gemäß Formel (I) oder (II) ebenfalls in geeigneter Weise verwendet werden. Illustrative Beispiele solcher Salze umfassen Hydrochlorid, Nitrat, Sulfat, Perchlorat, p-Toluofsulfonate und ähnliche. Ausserdem können die Natriumsalze, Kafiumsalze und ähnliches in geeigneter Weise verwendet werden, wenn die Elektronenvermittler der Formel (I) oder (II) eine oder mehrere Gruppen enthalten, ausgewählt aus der Klasse, bestehend aus einer Carboxylgruppe, einer Phosphonooxygruppe und einer Sulfogruppe. Insbesondere können in besonders geeigneter Weise THEPD Hydrochlorid, TCPD Hydrochlorid, TDHPD Hydrochlorid und ähnliche verwendet werden.
Der durch die Formel (I) oder (II) dargestellte Elektronenvermittler wird durch ein Oxidations-Reduktions-Enzym oder eine Elektrode oxidiert oder reduziert und in eine Elektronentransferart im oxidierten oder reduzierten Zustand umgewandelt. Wenn eine Elektronentransferart im oxidierten Zustand durch die Oxidations-Reduktionsreaktion des Oxidations-Reduktions-Enzyms gebildet wird, wird die so gebildete Elektronentransferart im oxidierten Zustand durch eine Elektrodenreaktion in den reduzierten Zustand zurückgeführt, während die Reduktionsstromstärke als ein Signal an der Elektrode nachgewiesen wird (siehe Fig. 1(a)). Andererseits, wenn eine Elektronentransferart im reduzierten Zustand durch die Oxidations-Reduktionsreaktion des Oxidations-Reduktions-Enzym gebildet wird, wird die so gebildete Elektronentransferart im reduzierten Zustand durch eine Elektrodenreaktion in ihren oxidierten Zustand zurückgeführt, wobei die Oxidationsstromstärke als ein Signal an der Elektrode nachgewiesen wird (siehe Fig. 1(b)). Anders ausgedrückt, kann durch das Assayverfahren gemäß der vorliegenden Erfindung ein ähnlicher Effekt erhalten werden, wenn die Reaktion beginnend mit der Elektronentransferart in ihrem oxidierten oder in ihrem reduzierten Zustand gestartet wird, wie dargestellt in den Fig. 1(a) und (b). Demzufolge umfasst der Elektronenvermittler gemäß der Formel (I) oder (II) eine Elektronentransferart, die ein oxidierter Zustand des Vermittlers ist und eine andere Elektronentransferart, die ein reduzierter Zustand des Vermittlers ist.
Gemäß dem Assayverfahren der vorliegenden Erfindung ist die Menge des Elektronenvermittlers der Formel (I) oder (II), die verwendet werden sollte, nicht besonders begrenzt und die Entscheidung über die Menge kann abhängig von der Art, der Quantität und ähnlichen Parametern der verwendeten Elektrode, des Oxidations- Reduktionsenzyms und der zu untersuchenden Substanz gewählt werden.
Ausserdem kann gemäß dem Assayverfahren der vorliegenden Erfindung der Elektronenvermittler der Formel (I) oder (II) unter verschiedenen Bedingungen verwendet werden. Der Vermittler kann z. B. durch ein Verfahren verwendet werden, bei dem er direkt in dem Assaysystem gelöst wird oder damit vermischt wird, ein Verfahren, bei dem er getrocknet oder gefriergetrocknet wird und dann zum Zeitpunkt der Messung gelöst wird, ein Verfahren, bei dem er in einem verdickten Elektrolyten enthalten ist oder ein Verfahren, bei dem er in einem Puffer oder ähnlichem gelöst ist, auf ein Filterpapier imprägniert wird, das danach getrocknet wird und dann wieder in einer Probenlösung oder ähnlichem zum Zeitpunkt der Messung gelöst wird. In jedem dieser Fälle kann ein ausgezeichneter elektrochemischer Assay realisiert werden, und zwar aufgrund der ausgezeichneten Wasserlöslichkeit, Trockenfähigkeit, Trockenstabilität und elektrischen Stromstärke-Verlässlichkeit des Elektronenvermittlers, wie auch des geringen Einflusses störender Substanzen in den Testproben.
Bei dem Assayverfahren gemäß der vorliegenden Erfindung wird eine elektrochemische Messung durchgeführt, wobei man sich mindestens eines Oxidations- Reduktionsenzyms bedient. Das Oxidations-Reduktions- Enzym, das in der vorliegenden Erfindung verwendet werden soll, ist nicht besonders begrenzt und es können verschiedene Oxidations-Reduktions-Enzyme ausgewählt und verwendet werden, abhängig von der Art der zu untersuchenden Substanz und anderen Bedingungen. Illustrative Beispiele solcher Enzyme umfassen Glucose-Oxidase, Peroxidase, wie z. B. Meerettich-Peroxidase, Galactose-Oxidase, Aminosäure-Oxidase, NAD (P) Oxidase, Lactat-Oxidase, Pyruvat-Oxidase, Alkohol-Oxidase, Urat-Oxidase, Cholesterin-Oxidase, Cholin-Oxidase, Xanthin-Oxidase, Nucleosid-Oxidase, Ascorbat- Oxidase, Diaphorase und ähnliche. Von diesen werden Glucose-Oxidase für die Verwendung bei einer Messung des Blut-Glucose-Niveaus und Meerettich-Peroxidase als Markierungsenzym für die Verwendung in spezifischen Bindungsassays besonders bevorzugt verwendet. Die Menge des zu verwendenden Enzyms ist nicht besonders begrenzt und kann abhängig von der Art, der Menge und ähnlichem der verwendeten Elektrode, des Elektronenvermittlers und der zu untersuchenden Substanz gewählt werden.
Verschiedene, in elektrochemischen Assays, wie z. B. den Enzym-Elektroden-Verfahren, den spezifischen Bindungsassayverfahren und ähnlichen häufig verwendete Elektroden, können in dem Assayverfahren gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Illustrative Beispiele solcher Elektroden umfassen Kohlenstoff-Elektroden, wie Glas- Kohlenstoff-Elektroden, pyrolytische Graphit-Elektroden, Kohlenstoff-Elektroden mit verdickten Elektrolyten, Kohlenstoff-Faserelektroden und ähnliche, leitende transparente Elektroden, wie z. B. Platin-Elektroden, Gold-Elektroden, ITO Elektroden und ähnliche, Oxid-Elektroden, wie z. B. aus TiO&sub2; und ähnliche, und modifizierte Elektroden, die mit funktionellen Verbindungen modifiziert sind. Bei dem Assayverfahren gemäß der vorliegenden Erfindung wird eine Elektrode, die durch Druck eines Musters auf ein Substrat durch Siebdruck oder ähnliches unter Verwendung einer leitenden Kohlenstofftinte erzeugt wird, im Hinblick auf ihre breite Anwendbarkeit besonders bevorzugt verwendet.
Die Form der Elektrode (ebene Elektrode, poröse Elektrode oder ähnliches) und ihre Größe sind nicht besonders begrenzt und können abhängig von der Art und der Menge von der zu untersuchenden Substanz, der Menge und den Eigenschaften (z. B. Viskosität und ähnliches) der jeweiligen Testprobe und dem Zweck und den Bedingungen des Assays gewählt werden.
Das Assayverfahren gemäß der vorliegenden Erfindung, das unter Verwendung eines Systems, bestehend aus einem solchen Oxidations-Reduktions-Enzym, einem Elektronenvermittler und einer Elektrode durchgeführt wird, kann in geeigneter Weise grundlegend für verschiedene bekannte elektrochemische Assays, wie die Enzym- Elektroden-Verfahren, die spezifischen Bindungsassayverfahren und ähnliche verwendet werden. Es kann z. B. für Enzymsensoren vom Ampere-metrischen Typ verwendet werden, ausserdem für Immunosensoren, Nukleinsäuresensoren und ähnliche. Insbesondere kann es für die Messung der folgenden Beispiele verwendet werden: Blut-Glucose, Cholesterin, Harnsäure, Milchsäure und ähnliche, wobei man sich Enzymsensoren bedient; verschiedene Hormone, wie z. B. dem menschlichen Chorion- Gonadotropin (hCG), dem luteinisierenden Hormon (LH), dem menschlichen Plazenta Lactogen (hPL), Östrogen und ähnlichen, wobei man sich der spezifischen Bindungsassayverfahren bedient; verschiedene mit Viren verbundene Antigene und Antikörper, wie z. B. HBs Antikörper, HBs Antigen, HBe Antikörper, HBe Antigen, HCV Antikörper, HIV Antikörper und ähnliche, spezifische IgE Antikörper gegen verschiedene Allergene; Tumormarker von AFP, CEA und ähnliche; verschiedene Blutproteine und Arzneimittel wie ß&sub2;m, CRP und ähnliche und die Stoffwechselprodukte davon; und mit Viren und Tumoren verbundene Polynukleotidsequenzen.
Gemäß dem Assayverfahren der vorliegenden Erfindung können verschiedene bekannte elektrochemische Assays, wie z. B. die Enzym-Elektroden-Verfahren, die spezifischen Bindungsassayverfahren und ähnliche in derselben Weise wie konventionelle Assayverfahren durchgeführt werden. Das Assayverfahren der vorliegenden Erfindung kann in besonders geeigneter Weise für eine Assayvorrichtung vom Trockenchemietyp verwendet werden, wobei ein Stück eines Zellulose- Filterpapiers, eines Glasfilterpapiers oder ähnliches mit einer Lösung des Elektronenvermittlers getränkt und dann getrocknet wird, um ein Assaystück herzustellen und wobei der so getränkte Elektronenvermittler durch eine flüssige Probe zum Zeitpunkt der Messung gelöst wird, wodurch es dem Vermittler ermöglicht wird, in einer Matrix zu diffundieren und zu wandern, so dass er als eine Substanz wirkt, die Elektronen transferiert, die als ein Signal verwendet werden sollen, wobei man sich der ausgezeichneten Wasserlöslichkeit, den Eigenschaften und der Stabilität im trockenen Zustand und ähnliches des Elektronenvermittlers der Formel (I) oder (II) bedient.
Fig. 2 zeigt eine spezifische Bindungsassayvorrichtung vom Trockenchemietyp zur Verwendung bei der Durchführung des Assayverfahrens der vorliegenden Erfindung, z. B. des MEDIA Verfahrens. In diesem Zusammenhang sind die die Vorrichtung bildenden Teile und Assayverfahren, die sich dieser Vorrichtung bedienen, im Detail in der EP 0 525 723 A2 (USSN 243095) beschrieben, die hier deshalb durch Bezugnahme enthalten sein soll.
Die in Fig. 2 dargestellte Assayvorrichtung besteht aus, ausgehend von ihrem oberen Bereich, einer oberen Abdeckung 10, einem Filter 12, einem mit einem markierten Antikörper imprägnierten Teil 14, einem mit einem Elektronenvermittler imprägnierten Teil 16, einer Kommunikationsvorrichtung 18, einem Elektrodenteil 20, einer Matrix 22, einer Absorptionsvorrichtung 24 und einem unteren Träger 26 und diese Teile sind in dieser Reihenfolge übereinander angeordnet um eine im Fig. 3 dargestellte Kombination zu bilden. Eine Vorrichtung zur Probeneingabe 38 wird durch den Filter 12, das mit einem markierten Antikörper imprägnierte Glied 14, das mit einem Elektronenvermittler imprägnierte Glied 16 und die Kommunikationsvorrichtung 18 gebildet. In diesem Zusammenhang sind die Assayvorrichtungen zur Verwendung in dem Assayverfahren gemäß der vorliegenden Erfindung nicht auf diejenigen begrenzt, die alle diese Teile enthalten und in der oben erwähnten EP 0 525 723 A2 (USSN 243095) offenbarten Konstruktionen können ebenfalls verwendet werden und sind hier daher durch Inbezugnahme mit aufgenommen.
Die obere Abdeckung 10 wird durch verschiedene synthetische Harze, wie z. B. Acrylharzderivate, Polyvinylchlorid, Polystyrol, ABS Harz, Epoxy Harz und ähnliche gebildet wie auch durch Glasfasern und ihr zentraler Bereich weist eine Probeneingabeöffnung 10a auf, von der die Probe injiziert wird.
Der Filter 12, allgemein gebildet aus einem gewebten oder Vlies-Material wird verwendet um unnötige feste Materialien (störende Substanzen), die in den Proben enthalten sind, zu entfernen und um gleichzeitig eine einheitliche Einführung der Probe zu gewährleisten.
Das mit einem markierten Antikörper imprägnierte Glied 14 wird durch Imprägnieren eines Stücks eines Glasfaser Filterpapiers, eines Zellulosefaser-Filterpapiers, eines Vliesmaterials oder ähnlichem mit einer Lösung eines mit einem Oxidations-Reduktions- Enzym markierten Antikörpers bewirkt, der eine der Komponenten der vorliegenden Erfindung darstellt und indem das imprägnierte Stück getrocknet wird. Das heisst, wenn eine Probe durch das mit dem markierten Antikörper imprägnierte Glied 14 geführt wird, wird der mit dem Oxidations-Reduktions-Enzym markierte Antikörper aus dem Glied eluiert und mit einer zu untersuchenden Substanz gemischt oder die Reaktion beginnt.
Das mit einem Elektronenvermittler imprägnierte Glied 16 wird hergestellt, indem ein Stück eines Glasfaser-Filterpapiers, eines Zellulosefaser-Filterpapiers, eines Vliesmaterials oder ähnliches mit einer Lösung eines Elektronenvermittlers, der ein kennzeichnendes Element der vorliegenden Erfindung ist, imprägniert wird und woraufhin das imprägnierte Stück getrocknet wird. Das heisst, wenn eine Probe durch das mit dem Elektronenvermittler imprägnierte Glied 16 geführt wird, wird der Elektronenvermittler aus dem Glied eluiert und mit der Probe gemischt. Wie oben beschrieben weist der Elektronenvermittler ausgezeichnete Eigenschaften und Stabilität im trockenen Zustand auf und wird schnell eluiert und vermischt, da die Verbindung der Formel (I) oder (II) als Elektronenvermittler in dem Assayverfahren der vorliegenden Erfindung verwendet wird.
Als bevorzugte Form der illustrierten Assayvorrichtung wird ein Versiegelungsmittel 16a, durch die kein Wasser gelangen kann, in dem oberen zentralen Bereich des mit dem Elektronenvermittler imprägnierten Glieds 16 ausgebildet. Durch eine solche Anordnung dieses Versiegelungsmittels 16a kann ein genauerer Assay durchgeführt werden, und zwar weil der vertikale Fluss der Probe bis hin zu dem mit dem markierten Antikörper imprägnierten Glied 14 in eine horizontale Richtung geändert werden kann, was es möglich macht, die Zeit des Probenflusses zu verlängern um ausreichende Zeit für die Reaktion und eine Verbesserung der Reaktionseffizienz durch den Mischeffekt bereitzustellen. Material und Methoden für die Bildung des Versiegelungsmittels 16a sind nicht besonders begrenzt und sie kann gebildet werden, indem ein Stück eines wasserundurchlässigen Materials, wie z. B. Vinylchlorid, Zelluloseacetat oder ähnliches an den zentralen Bereich des mit dem Elektronenvermittler imprägnierten Glieds 16 über ein Haftmittel, wie z. B. ein Acryl-Haftmittel oder ähnliches angehaftet wird.
In der dargestellten Assayvorrichtung werden das mit dem markierten Antikörper imprägnierte Glied 14, das einen mit einem Oxidations-Reduktions-Enzym markierten Antikörper enthält und das mit dem Elektronenvermittler imprägnierte Glied 16, das einen Elektronenvermittler enthält, separat gebildet, aber die in der vorliegenden Erfindung zu verwendende Assayvorrichtung kann auch anstelle dieser Glieder ein mit einem Reagenz imprägniertes Glied umfassen, dass sowohl den mit einem Oxidations- Reduktions-Enzym markierten Antikörper als auch den Elektronenvermittler enthält. Zusätzlich und obwohl der Elektronenvermittler in der dargestellten Assayvorrichtung in dem mit dem Elektronenvermittler imprägnierten Glied 16 enthalten ist, können auch gute Messergebnisse erhalten werden, wenn er in der Matrix 22 oder dem Absorptionsmittel 24 enthalten ist und zwar aufgrund der ausgezeichneten Eigenschaften im trockenen Zustand und der Wasserlöslichkeit des Elektronenvermittler, dargestellt durch die Formel (I) oder (II).
Die Kommunikationsvorrichtung 18 wird aus einem Glasfaser-Filterpapier, einem Zellulosefaser-Filterpapier oder ähnlichem gebildet und wird verwendet um eine Probe und ähnliches einzuführen, die durch das mit dem Elektronenvermittler imprägnierte Glied 16 in die Matrix 22 über einen vorbestimmten Bereich des Elektrodenteils 20 durchgeführt wird. Die Kommunikationsvorrichtung 18 ist angeordnet, indem sie in eine durchgehende Öffnung 30 des Elektrodenteils 20 eingeführt ist.
Der Elektrodenteil 20 enthält eine Arbeitselektrode, die eine der Komponenten der vorliegenden Erfindung ist. In dem Elektrodenteil 20 der dargestellten Assayvorrichtung, wie gezeigt in den Fig. 2 und 4, wird die zirkuläre, durchgehende Öffnung 30 auf einem isolierenden Träger 28 ausgebildet, eine Referenzelektrode (Gegenelektrode) 32 und ihr Ende 32a sind an der Peripherie der durchgehenden Öffnung 30 auf der oberen Oberfläche des Trägers 28 ausgebildet und eine Arbeitselektrode (Nachweiselektrode) 34 und ihre Ende 34a sind an der Peripherie der durchgehenden Öffnung 30 auf der unteren Fläche des Trägers 28 ausgebildet. Zum Zeitpunkt der Messung sind die Ende der beiden Elektroden mit einer externen Messausrüstung verbunden. Zusätzlich, wie dargestellt in Fig. 4 durch einen schattierten Bereich, ist eine isolierende Schicht 36 sowohl auf der oberen als auch der unteren Fläche des Trägers 28 des Efektrodenteils 20 ausgebildet, wo das mit dem Elektronenvermittler imprägnierte Glied 16 und die Matrix 22, mit Ausnahme der Referenzelektrode 34 und der Arbeitselektrode 36, mit den Oberflächen in Kontakt stehen.
Die Arbeitselektrode 34, die als Nachweiselektrode verwendet werden soll, kann aus den vorher erwähnten verschiedenen Materialien gebildet werden. Die Referenzelektrode 32 ist eine Silber/Silberchlorid-Elektrode oder eine ähnliche. Der Träger 28 wird aus verschiedenen bekannten isolierenden Materialien, wie z. B. PET (Polyethylenterephtalat), Polyvinylchlorid, Polyimid, Polyester und ähnlichem gebildet. Die isolierende Schicht 36 wird aus verschiedenen bekannten isolierenden Tintenmateiralien, wie z. B. Acryl-Harz, Polyester und ähnlichen gebildet.
In diesem Fall können die Arbeitselektrode 34, die Referenzelektrode 32 und die isolierende Schicht 36 in der dargestellten Assayvorrichtung durch bekannte Film- Bildungstechniken gebildet werden, die z. B. Verfahren zur Bildung dicker Filme umfassen, wie z. B. der Siebdruckverfahren, das Abstreif-Messer und ähnliche und auch Verfahren zur Bildung dünner Filme, wie z. B. ein Zerstäuben, CVD und ähnliche.
Die Matrix 22 ist ein Bereich zur Verwendung bei der Verteilung des mit einem Enzym markierten Körpers, gebildet aus der spezifischen Bindung einer zu untersuchenden Substanz in einer Flüssigkeitsprobe und dem mit dem Oxidations-Reduktions-Enzym markierten Antikörper und eine Entfernungsverteilung des markierten Körpers von der Arbeitselektrode 34 wird als ein elektrischer Stromstärkewert über den vorher erwähnten Elektronenvermittler gemessen. Die Matrix 22 wird z. B. durch ein Verfahren hergestellt, bei dem ein Antikörper, ein Antigen, eine Nukleinsäure oder ähnliches, die in der spezifischen Bindungsreaktion verwendet werden sollen, auf einer porösen Membran oder ähnlichem unlöslich gemacht und getrocknet wird. Wenn eine Probe in die Matrix 22 fließt tritt eine spezifische Bindungsreaktion zwischen dem unlöslich gemachten Antikörper und der zu untersuchenden Substanz auf die Verteilung des mit dem Enzym markierten Körpers ändert sich und eine durch die Enzymreaktion gebildete Elektronentransferart diffundiert und wandert, woraufhin sie durch die Arbeitselektrode 34 als eine elektrochemische Modulation in Reaktion auf diese Reaktion nachgewiesen werden kann. In diesem Fall passiert eine überschüssige Menge der Probe durch die Matrix 22 und wird durch das Absorptionsmittel 24 absorbiert.
Das Absorptionsmittel 24 absorbiert überschüssige Probe, die durch die Matrix 22 gelaufen ist, wie oben beschrieben, und wird z. B. aus einem Chromatographie Filterpapier oder einem ähnlichen Zellulose-Filterpapier oder einem Polymer mit einer hohen Wasserabsorptionskraft hergestellt. In der dargestellten Assayvorrichtung hält ein solches Material der Absorptionsvorrichtung 24 ein Enzym - Reaktionssubstrat, wie z. B. Wasserstoffperoxid-Harnstoff in getrockneter Mischung oder ähnliches zurück, so dass es auch als ein mit dem Enzymreaktionssubstrat imprägniertes Teil wirkt.
Als eine bevorzugte Ausführungsform der dargestellten Assayvorrichtung ist eine Versiegelungsmittel 24a, durch das kein Wasser passieren kann, auf dem oberen zentralen Bereich des Absorptionsmittels 24 ausgebildet. Ähnlich wie im Fall des vorher erwähnten Versiegelungsmittefs 16a kann durch die Anordnung des Versiegelungsmittels 24a ein genauerer Assay durchgeführt werden, da der vertikale Fluss der Probe in eine horizontale Richtung geändert werden kann, was es möglich macht, die Zeitspanne des Probenflusses zu verlängern, was zu einer Verbesserung der Effizienz der spezifischen Bindungsreaktion und einer klaren Verteilung des markierten Körpers in der Matrix führt. Das Versiegelungsmittel 24a kann in derselben Weise wie im Fall des vorher erwähnten Versiegelungsmittels 16a hergestellt werden.
Die dargestellte Assayvorrichtung ist konstruiert, indem diese Teile auf dem unteren Träger 26 in der in den Fig. 2 und 3 dargestellten Reihenfolge übereinander angeordnet sind. Der untere Träger 26 wird aus verschiedenen Harzmaterialien, wie z. B. Acryl-Harz, hergestellt, ähnlich wie im Fall der oberen Abdeckung 10.
Bei einer solchen Assayvorrichtung wird jede Probe durch die Probeneingabeöffnung 10a, die in der oberen Abdeckung 10 ausgebildet ist, injiziert. Die so injizierte Probe passiert von der Probeneingabeöffnung 10a durch den Filter 12, wo unerwünschte Substanzen und ähnliches entfernt werden und fließt in das mit dem markierten Antikörper imprägnierte Glied 14. In dem mit dem markierten Antikörper imprägnierten Glied 14 wird der getrocknete und zurückgehaltene mit dem Oxidations- Reduktionsenzym markierte Antikörper durch die fließende Probe eluiert und damit vermischt oder beginnt eine spezifische Bindungsreaktion mit einer zu untersuchenden Substanz in der Probe.
Die Probe wird dann in das mit dem Elektronenvermittler imprägnierte Glied 16 transferiert. Da ein Elektronenvermittler getrocknet und in dem mit dem Elektronenvermittler imprägnierten Glied 16 zurückgehalten wird, wie oben beschrieben, wird der Elektronenvermittler durch die fließende Probe eluiert und mit ihr vermischt. Da das Versiegelungsmittel 16a auf der oberen Fläche des mit dem Elektronenvermittler imprägnierten Glieds 16 in der dargestellten Assayvorrichtung ausgebildet ist, verändert sich der vertikale Fluss in eine horizontale Richtung, um damit eine ausreichende Reaktionszeit sicherzustellen, wie bereits vorher beschrieben.
Die so durch das mit dem Elektronenvermittler imprägnierte Glied 16 geführte Probe fließt in die Matrix 22 und zwar über die Kommunikationsvorrichtung 18 und durch die durchgehende Öffnung 30 des Elektrodenteils 20. Wenn die Probe in die Matrix 22 fließt, wird die Verteilung des mit dem Oxidations-Reduktionsenzyms markierten Körpers in der Matrix 22 durch eine spezifische Bindungsreaktion der zu untersuchenden Substanz in der Flüssigkeitsprobe mit dem unlöslich gemachten Antikörper bestimmt und eine Elektronentransferart, die durch die Enzymreaktion des mit dem Oxidations-Reduktionsenyzm markierten Körpers gebildet wird und die eine Elektrodenreaktion durchlaufen kann, erreicht die Arbeitselektrode 34 durch Diffusion. Das heisst, dass die Verteilung der zu untersuchenden Substanz in der radialen Richtung der Arbeitselektrode 34 durch die Arbeitselektrode 34 als elektrochemische Modulation in Antwort auf die Enzymreaktion nachgewiesen wird. Eine überschüssige Probenmenge passiert die Matrix 22 und wird durch die Absorptionsvorrichtung 24 absorbiert.
Gemäß der obigen Assayvorrichtung bestimmt dementsprechend das Ergebnis der spezifischen Bindungsreaktion einer zu untersuchenden Substanz mit dem unlöslich gemachten Antikörper in der Matrix 22 die Verteilung des mit dem Enzym markierten Körpers, der durch die obige spezifische Bindungsreaktion in Antwort auf die Menge der zu untersuchenden Substanz in der Probe gebildet wird, wobei Elektronen durch eine Diffusionswanderung der Elektronentransferart zu der Arbeitselektrode 34 transferiert werden, wobei diese durch den obigen mit einem Enzym markierten Körper gebildet werden und der durch die Elektrodenreaktion ausgelöste Elektronentransfer wird als eine elektrochemische Modulation nachgewiesen. Im Ergebnis wird die zu untersuchende Substanz in der Probe durch Messung der Verteilung der spezifischen Bindungsreaktion in der radialen Richtung der Matrix 22 bestimmt.
So wurde nun das elektrochemische Assayverfahren unter Verwendung des MEDIA Verfahrens und einer neuen p-Phenylendiamin-Verbindung gemäß der vorliegenden Erfindung im Detail im Hinblick auf verschiedene Beispiele beschrieben, die natürlich nicht begrenzend sein sollen und die innerhalb des Umfangs der Erfindung modifiziert oder verbessert werden können.

BEISPIELE

Die folgenden Beispiele werden bereitgestellt um die vorliegende Erfindung weiter darzustellen. Es sollte klargestellt werden, dass diese Beispiele nur dem Zwecke der Darstellung dienen und nicht als Definition der Grenzen der Erfindung ausgelegt werden sollten.

Synthese-Beispiel 1 (Stand der Technik)

Synthese von N,N,N',N'-Tetraethyl-p-phenylendiamindihydrochlorid (TEPD · 2HCl)

p-Phenylendiamin (1g), Ethyliodid (10,7 g) und Natriumcarbonat (4,4 g) wurden in Methanol (10 ml) gelöst und über Nacht im Rückfluss gehalten. Nach einem Abkühlen der Reaktionsmischung auf Raumtemperatur wurde das Lösungsmittel bei reduziertem Druck entfernt und der resultierende Rest wurde mit Aceton gemischt um unlösliche Materialien durch Filtration zu entfernen. Das Lösungsmittel wurde aus dem so erhaltenen Filtrat bei reduziertem Druck entfernt und der erhaltene Rest wurde aus einer Ethylacetat-Ether-Mischungslösung umkristallisiert um 6,8 g eines quaternären Ammoniumsalzes zu erhalten.
Daraufhin wurden 6,8 g des so erhaltenen quaternären Ammoniumsalzes und 12,5 g Natriumthiosulfatpentahydrat in 50 ml Dimethylformamid gelöst und über Nacht im Rückfluss gehalten. Nach einem Abkühlen auf Raumtemperatur wurde die Reaktionsmischung mit destilliertem Wasser verdünnt und mit Toluol extrahiert, die extrahierte Schicht wurde mit Wasser gewaschen und auf wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet, woraufhin das Lösungsmittel bei reduziertem Druck entfernt wurde um 1,0 g TEPD zu erhalten. Zu dem so erhaltenen TEPD wurden 10 ml Ethanol, gefolgt von einer tröpfchenweisen Zugabe von 5 ml 4 N Salzsäure/Ethylacetat hinzugefügt, während in einem Eisbad gekühlt und darauffolgend 1 h bei 5ºC gerührt wurde. Das so gebildete Präzipitat wurde durch Filtration gesammelt und mit Ethanol und Ether gewaschen um 1,3 g TEPD 2 HCl zu erhalten.
Die Ergebnisse der folgenden ¹H NMR, IR (lnfrarotabsorptions-Spektrum) und MS (Massenspektrum) -analysen bestätigten, dass die so erhaltene Verbindung das TEPD 2 HCl von Interesse ist.
¹H NMR: 5 1.2 (12H, t, J = 7 Hz), 3.7 (8 H, c, J = 7 Hz), 7.9 (4H, S)
IR (cm&supmin;¹): 715, 840, 1020, 1276, 1516, 2420
MS: M&spplus;-2HCl+1 221

Synthesebeispiel 2 (vorliegende Erfindung)

Synthese von N,N,N',N'-Tetrakiscarboxymethyl-p-phenylendiamin (TCPD) p-Phenylendiamin (1g), Chloressigsäure (3,5 g), Natriumhydroxid (3,1 g) und Kaliumiodid (460 mg) wurden in destilliertem Wasser (46 ml) gelöst und eine Stunde im Rückfluss gekocht. Nach einem Abkühlen der Reaktionsmischung auf Raumtemperatur wurden 3,7 ml konzentrierter Salzsäure tröpfchenweise zugefügt, während in einem Eisbad abgekühlt wurde. Danach wurde das so gebildete Präzipitat durch Filtration gesammelt und aus einer Methanol-Ethanol-Mischungslösung umkristallisiert um 700 mg TCPD zu erhalten.
Die Ergebnisse der folgenden ¹H NMR, IR und MS Analysen bestätigten, dass die so erhaltene Verbindung das TCPD von Interesse ist.
¹H NMR: δ 3.9 (8H, s), 6.3 (4H, S), 11.2 (4H, S) IR (cm&supmin;¹): 700, 820, 1030, 1514, 1720, 2700, 3300
MS: M&spplus;+1. 341

Synthesebeispiel 3 (vorliegende Erfindung)

Synthese von N,N,N',N'-Tetrakis-(2'-hydroxyethyl)-p- phenylendiamindihydrochlorid (THEPD · 2 HCl)
p-Phenylendiamin (1g), 2-Chlorethanol (3.0 g) und Natriumhydroxid (1,5 g) wurden in destilliertem Wasser (6 ml) gelöst und 2 Stunden im Rückfluss gekocht. Nach einem Abkühlen der Reaktionsmischung auf Raumtemperatur wurde das Lösungsmittel bei reduziertem Druck entfernt und der resultierende Rest wurde mit Ethanol gemischt um unlösliche Materialien durch Filtration zu entfernen. Das Lösungsmittel wurde aus dem so erhaltenen Filtrat bei reduziertem Druck entfernt und der erhaltene Rest wurde durch eine Silica-Gelchromatographie unter Verwendung einer Chloroform-Methanol-Mischung als Elutionslösung gereinigt, wodurch 1,5 g THEPD erhalten wurden.
Daraufhin wurden 1,5 g des so erhaltenen THEPD in 10 ml Ethanol gelöst zu dem darauffolgend 5 ml 4 N Salzsäure/Ethylacetat tröpfchenweise zugefügt wurden, während in einem Eisbad gekühlt wurde, gefolgt von einem Rühren bei 5ºC für 1 h. Das so gebildete Präzipitat wurde durch Filtration gesammelt und mit Ethanol gewaschen um 1,1 g THEPD 2 HCl zu erhalten.
Die Ergebnisse der folgenden ¹H NMR, IR und MS Analysen bestätigten, dass die so erhaltene Verbindung das THEPD · 2 HCl von Interesse ist.
¹H NMR: δ 3.5 (16H, s), 7.0 (4H, m), 7.1 (4H, S)
IR (cm&supmin;¹): 720, 890, 1020, 1210, 1390, 1500, 2700, 3300
Ms: M&spplus;-2hCl+1 285

Synthese Beispiel 4 (vorliegende Erfindung>

Synthese von N,N,N',N'-Tetrakis-(2',3'- dihydroxypropyl)- phenylendiamindihydrochlorid (TDHPD · 2 HCl)
p-Phenylendiamin (1g), 3-Chlor-1,2-Propandiol (4,6 g) und Natriumhydroxid (1,64 g) wurden in destilliertem Wasser (30 ml) gelöst und 2 h im Rückfluss gekocht. Nach einem Abkühlen der Reaktionsmischung auf Raumtemperatur wurde das Lösungsmittel bei reduziertem Druck entfernt und der erhaltene Rest wurde mit Ethanol gemischt um unlösliche Materialien durch Filtration zu entfernen. Das Lösungsmittel wurde aus dem so erhaltenen Filtrat bei reduziertem Druck entfernt und der erhaltene Rest wurde durch eine Silica-Gelchromatographie unter Verwendung einer Chloroform-Methanol-Mischung als Elutionslösung gereinigt, wodurch 1,1 g TDHPD erhalten wurden.
Daraufhin wurden 1,1 g des so erhaltenen TDHPDs in 10 ml Ethanol gelöst, zu dem darauffolgend 5 ml 4 N Salzsäure/Ethylacetat hinzufügt wurden, während in einem Eisbad gekühlt wurde, gefolgt von 1 h Rühren bei 5ºC. Das so gebildete Präzipität wurde durch Filtration gesammelt und mit Ethanol gewaschen um 820 mg TDHPD · 2 HCl zu erhalten.
Die Ergebnisse der folgenden ¹H NMR, IR und MS Analysen bestätigten, dass die so erhaltene Verbindung das TDHPD · 2 HCl von Interesse ist.
¹H NMR: δ 3.7 (20H, m), 1.1 (4H, S)
IR (cm&supmin;¹): 720, 870, 1040, 1260, 1370, 1520, 3300
MS: M&spplus;-2HCl+1 405

Synthesebeispiel 5 (vorliegende Erfindung)

Synthese von N-2'-Hydroxyethyl-N,N',N'-triethyl-p- phenylendiamindihydrochlorid (HTEPD · 2 HCl)
Ein 12.8 g schwerer Teil Kaliumcarbonat wurde zu 100 ml einer Methanollösung, die 5 g p-Phenylendiamin enthielt, hinzugegeben und 14,4 g Ethyliodid wurden der erhaltenen Lösung tröpfchenweise hinzugefügt, wobei man 10 min. bei Raumtemperatur verbrachte. Die Reaktionslösung wurde bei 50ºC gerührt, bis das Verschwinden des Ausgangsmaterials durch eine Dünnschichtchromatographie (Chloroform : Methanol = 10 : 1) bestätigt wurde und es wurde bei reduziertem Druck konzentriert.
Der so konzentrierte Rest wurde in einer n-Hexan : Ethylacetat (1 : 1) Mischung gelöst, die präzipitierten Kristalle wurden abgefiltert und das resultierende Filtrat wurde bei reduziertem Druck konzentriert. Der resultierende Rest wurde durch eine Silica- Gelchromatographie (n-Hexan : Ethylacetat = 1 : 1) gereinigt, um 1,5 g N,N',N'-Triethyl -p-phenylendiamin zu erhalten.
Daraufhin wurden 1,5 g des so erhaltenen N,N',N'-Triethyl-p-phenylendiamins in 20 ml n-Butanol gelöst, zu dem darauffolgend 2,2 g Natriumhydroxid hinzugefügt wurden. Zu der erhaltenen Lösung wurden tröpfchenweise 4,4 g 2-Chlorethanol bei Raumtemperatur hinzugegeben, wobei man 5 min. verbrachte, gefolgt von einer Stunde Kochen im Rückfluss. Nach der Bestätigung des Verschwindens des Ausgangsmaterials durch eine Dünnschichtchromatographie (n-Hexan : Ethylacetat = 1 : 1) wurde die Reaktionslösung auf Raumtemperatur abgekühlt und die präzipitierten Kristalle wurden abgefiltert. Der resultierende Rest wurde durch eine Silica-Gelchromatographie (n- Hexan : Ethylacetat = 1 : 1) gereinigt um HTEPD zu erhalten.
Danach wurde das so erhaltene HTEPD in 15 ml Ethanol gelöst und 2,4 ml 4 N Salzsäure/Ethylacetat wurden der erhaltenen Lösung tröpfchenweise zugefügt, die in einem Eisbad abgekühlt wurde und dann wurden die so gebildeten Kristalle mit Ethanol gewaschen um 1,0 g HTEPD 2 HCl zu erhalten.
Spektrale Daten von HTEPD · 2 HCl
¹H NMR: δ 1.1 (9H, t, J = 7 Hz), 3.5 (10H, m), 7.4 (4H, m)
MS (cm&supmin;¹): 700, 830, 1060, 1370, 1450, 1500, 2350, 2900, 3350
MS (M&spplus;-2HCl+1): 237

Synthesebeispiel 6 (vorliegende Erfindung)

Synthese von N,N-bis(2'-Hydroxyethyl)-N',N'-diethyl-p- phenylendiamindihydrochlorid (N, N- BHDPD · 2 HCl)
Ein 3,7 g schwerer Teil Natriumhydroxid wurde zu 30 ml einer n-Butanollösung, die 5 g N,N-Diethyl-p-phenylendiamin enthielt, hinzugefügt und 7,3 g 2-Chlorethanol wurden der erhaltenen Lösung tröpfchenweise zugefügt, wobei man 10 min. bei Raumtemperatur verbrachte. Die Reaktionslösung wurde 4 h im Rückfluss gekocht. Nach einer Bestätigung des Verschwindens des Ausgangsmaterials durch eine Dünnschichtchromatographie (Chloroform : Methanol = 10 : 1)wurde die Reaktionslösung auf Raumtemperatur abgekühlt. Die so präzipitierten Kristalle wurden abgefiltert, das erhaltene Filtrat wurde bei reduziertem Druck konzentriert und der erhaltene Rest wurde durch eine Silica-Gelchromatographie (Chloroform : Methanol = 10 : 1) gereinigt, um N,N-BHDPD zu erhalten.
Danach wurde das so erhaltene BHDPD in 20 ml Ethanol gelöst, 2,74 ml 4 N Salzsäure/Ethylacetat wurden der erhaltenen Lösung tröpfchenweise hinzugefügt, die in einem Eisbad gekühlt wurde und daraufhin wurden die so gebildeten Kristalle mit Ethanol gewaschen um 1,22 g BHDPD · 2 HCl zu erhalten.
Spektrale Daten von BHDPD · 2 HCl
¹H NMR: δ 1.0 (6H, t, J = 7 Hz), 3.5 (12H, m), 6.7 (2H, d, J = 9 Hz), 7.5 (2H, d, J = 9 Hz)
IR (cm&supmin;¹) 700, 830, 1050, 1380, 1450, 1500, 2480, 2900, 3300
MS (M&spplus;-2HCl+1): 253

Synthesebeispiel 7 (vorliegende Erfindung)

Synthese von N,N'-bis-(2'-Hydroxyethyl)-p-phenylendiamin (N,N'-BHPD)
Ein 4,4 g schwerer Teil von Natriumhydroxid wurde zu 100 ml einer Ethanollösung hinzugefügt, die 5 g p-Phenylendiamin enthielt und wurde auf 55ºC erhitzt. Danach wurden 8,9 g 2-Chlorethanofder erhaltenen Lösung tröpfchenweise hinzugefügt, wobei 10 min. verbracht wurden. Die Reaktionslösung wurde über Nacht im Rückfluss gekocht. Nach der Bestätigung des Verschwindens des Ausgangsmaterials durch eine Dünnschichtchromatographie (Chloroform : Methanol = 10 : 1) wurde die Reaktionslösung auf Raumtemperatur abgekühlt.
Die so präzipitierten Kristalle wurden abgefiltert und das erhaltene Filtrat wurde bei reduziertem Druck konzentriert. Der erhaltene Rest wurde durch eine Silica- Gelchromatographie (Chloroform : Methanol = 10 : 1) gereinigt, um 5.0 g N,N'-BHPD zu erhalten.

Synthesebeispiel 8 (vorliegende Erfindung)

Synthese von N,N'-bis-(2'-Hydroxyethyl)-N,N'-diethyl-p- phenylendiamindihydrochlorid (N,N'-BHDPD)
Ein 8,9 g schwerer Teil Kaliumcarbonat wurde zu 100 ml einer Ethanollösung hinzugefügt, die 4,5 g BHPD enthielt und 9,5 g Ethyliodid wurden der resultierenden Lösung hinzugefügt. Die Reaktionslösung wurde über Nacht im Rückfluss gekocht. Nach einer Bestätigung des Verschwindens des Ausgangsmaterials durch eine Dünnschichtchromatographie (Chloroform : Methanol = 5 : 1) wurde die Reaktionslösung auf Raumtemperatur abgekühlt.
Die präzipitierten Kristalle wurden abgefiltert und das resultierende Filtrat wurde bei reduziertem Druck konzentriert. Der erhaltene Rest wurde durch eine Silica- Gelchromatographie (Ethylacetat 100%) gereinigt um 233 mg N,N'-BHDPD zu erhalten. Als nächstes wurde das so erhaltene N,N'-BHDPD in 5 ml Ethanol gelöst, zu dem darauffolgend tröpfchenweise 10% Wasserstoffchlorid/Methanol zugefügt wurde, während auf Eis gekühlt wurde um die Kristalle auszufällen. Die Kristalle wurden durch Filtration abgetrennt um 266 mg N,N'-BHDPD · 2 HCl zu erhalten.
Spektrale Daten von N,N'-BHDPD · 2 HCl
¹H NMR: δ 1.2. (6H, t, J = 7 Hz), 3.5 (12H, m), 7.4 (4H, s)
IR (cm&supmin;¹): 670, 830, 1070, 1500, 2500, 2900, 3350
MS (M&spplus;-2HCl+1): 253

Synthesebeispiel 9 (vorliegende Erfindung)

Synthese von p-Phenylendiaminderivaten mit einer substituierten Aminogruppe durch Umsetzen von p-Phenylendiamin mit Propylenoxid
Ein 1,3 g schwerer Anteil von Natriumhydroxid wurde weiter zu 100 ml einer Methanollösung hinzugefügt, die 5 g p-Phenylendiamin enthielt und 1,1 g Propylenoxid wurden zu der erhaltenen Lösung tröpfchenweise hinzugefügt. Die Reaktionslösung wurde über Nacht gerührt und zwar bei 30ºC und dann bei reduziertem Druck konzentriert. Dem Konzentrat wurde Chloroform hinzugefügt um 7 g eines Chloroformextrahierten Produkts zu erhalten.
Eine HPLC-Trennung des Chloroformextrahierten Produkts wurde durch Verwendung eines Elutionsmittels (Acetonitril : 50 mM Ammoniumacetat = 15,6 : 84,4) und einer ODS Säule (YMC-Pack ODS, 20 mm Durchmesser · 250 mm; Produkt von YMC Co.) durchgeführt, wobei die Flussrate auf 15 ml/min. und die Nachweis-Wellenlänge auf 254 nm eingestellt waren.
Im Ergebnis wurden p-Phenylendiaminderivate mit (einer) mono-, di- und trisubstituierten Aminogruppe(n) erhalten. Jede Substitution wurde durch ¹H-NMR und MS-Analysen bestätigt.
Mono-substituierte ¹H NMR: δ 1.1 (3H, d, J = 6 Hz), 2.8 (2H, m), 3.8 (1H, m), 4.9 (3H, brS), 6.4 (4H, m) [MS 167 (M+1)]
di-substituierte [MS 225 (M+1]
tri-substituierte [MS 283 (M+1)]
Es wurde durch die obigen Daten bestätigt, dass ein p-Phenylendiaminderivat mit einer monosubstituierten Aminogruppe ein N-2'-hydroxypropylphenylendiamin (HPPD) ist.

Testbeispiel 1

Messung des Dampfdrucks von p-Phenylendiamins (PPD), N,N,N',N'-Tetramethyl-p - phenylendiamin (TMPD), TEPD, TCPD, THEPD und TDHPD
Das PPD (hergestellt von Wakoh Junyaku K. K.), TMPD (hergestellt von Tokyo Kasei K. K.) und weiterhin TEPD, TCPD, THEPD und TDHPD, die durch die Verfahren gemäß den Synthesebeispielen 1 bis 4 erhalten wurden, wurden im Hinblick auf ihren Dampfdruck untersucht.
Die Dampfdichten (Menge der Evaporation/Volumen) der festen Proben (PPD, TMPD, TEPD, TCPD, THEPD und TDHPD) wurden gemessen, indem jede auf eine bestimmte Temperatur erwärmte Probe mit einem Strom eines Trägergases (Stickstoff) in Kontakt gebracht wurde und indem die Probe mit Dampf gesättigt wurde und der Dampfdruck von TEPD und THEPD wurde aus den Daten berechnet, basierend auf der Annahme, dass der Dampf dem Gesetz des idealen Gases (Gasflussverfahren) folgt. Die Dampfdicht wurde berechnet, indem die Evaporationsrate (Verlustrate) jeder Probe unter Verwendung einer elektrischen Balance gemessen wurde und wobei die Trägergasflussrate unter Verwendung einer Fluss-Messvorrichtung gemessen wurde.
Der Dampfdruck wurde aus der Dampfdichte berechnet, basierend auf der folgenden Formel:
P = (k/v)Vπ/M
In der obigen Formel bedeutet P der Dampfdruck (Pa; mm Hg), k bedeutet die Evaporationsrate (mg/min), v bedeutet die Trägergastlussrate (mlimin), k/v bedeutet die Dampfdichte (mg/ml), M bedeutet das Molekulargewicht jeder Probe, π bedeutet der Druck des Systems (Pa; mm Hg) und V bedeutet das molare Volumen des Trägergases (l/mol).
Die Dampfdruckprofile von TEPD und THEPD bei jeder Temperatur sind in Fig. 5 dargestellt.
Die Dampfdruckkurven der Verbindungen bei 25ºC sind in Fig. 24 dargestellt. Wie sich aus den Fig. 5 und 24 ergibt ist der Dampfdruck von TEPD, TCPD, THEPD und TDHPD bei 25ºC 5,6 · 10&supmin;² Pa (4,2 · 10&supmin;&sup4; mm Hg), 1,2 · 10&supmin;&sup6; Pa (8,7 · 10&supmin;&sup9; mm Hg), 1,7 · 10&supmin;&sup4; Pa (1,3 · 10&supmin;&sup6; mm Hg) bzw. 1,3 · 10&supmin;&sup7; Pa (1.0 · 10&supmin;&sup9; mm Hg), was zeigt, dass der Dampfdruck von TCPD, THEPD und TDHPD ungefähr 50.000 mal, ungefähr 300 Mal bzw. ungefähr 420.000 mal niedriger ist als der von TEPD. Diese Ergebnisse zeigen, dass die Eigenschaften beim Trocknen (Gefriertrocknen, Vacuumtrocknen, Trocknen an Luft oder ähnlichem) und die Stabilität der getrockneten Zustände von TCPD, THEPD und TDHPD denjenigen von PPD, TMPD und TEPD überlegen sind.

Testbeispiel 2

Die Messung der zyklischen Voltamperemetrie (CV) von TEPD · 2 HCl, TCPD, THEPD · 2 HCl, TDHPD · 2 HCl, HTEPD · 2 HCl, N,N-BHDPD · 2 HCl, N,N'-BHDPD · 2 HCl und p-Phenylendiaminderivaten, die eine substituierte Aminogruppe durch Umsetzung von p-Phenylendiamin mit Propylenoxid aufweisen ("2 HCl" wird im folgenden weggelassen).
Jede der Verbindungen TEPD, TCPD, THEPD, TDHPD, HTEPD, N,N-BHDPD, N,N' -BHDPD und die p-Phenylendiaminderivate, die eine substituierte Aminogruppe durch Umsetzung von p-Phenylendiamin mit Propylenoxid aufweisen, erhalten in den Synthese Beispielen 1-9, wurden in 0,1 M Phosphatpuffer (pH 6,0), der 0,1 M NaCl enthielt, gelöst und die CV der so hergestellten 5,0 · 10&supmin;&sup4; M Lösungen wurden gemessen. Die Glas-Kohlenstoffelektrode (MF 2012, hergestellt von BIOANALYTICAL SYSTEMS) wurde als Arbeitselektrode verwendet, eine Ag/AgCl Elektrode (MF 2020, hergestellt von BIOANALYTICAL SYSTEMS) wurde als Referenzelektrode verwendet und ein Platin-Draht (hergestellt von BIOANALYTICAL SYSTEMS) wurde als Gegenelektrode verwendet. Diese wurden mit einem Potentiostat HA - 150 (hergestellt von Hokuto Denko) verbunden, mit dem weiter ein Funktionsgenerator HB - 104 (hergestellt von Hokuto Denko) verbunden war, zur Verwendung beim Festsetzen des Elektrodenpotentials sowie ein Rekorder. Der Rekorder war über eine GPIB Leitung mit einem Computer verbunden um die Messungsaufzeichnung und die Datenverarbeitung durchzuführen. Die Messung der CV wurde durchgeführt, indem das anfängliche Potential auf - 500 mV (vs Ag/AgCl, dasselbe soll hiernach gelten) und das Umkehrpotential auf + 800 mV eingestellt wurde oder indem das anfängliche Potential auf - 200 mV und das Umkehrpotential auf + 300 mV eingestellt wurde und wobei die Potential-Durchlaufgeschwindigkeit auf eine Rate von 50 mV/sec. eingestellt wurde.
Die Ergebnisse von - 500 mV bis + 800 mV und von - 200 mV bis + 300 mv von TEPD sind in den Fig. 6 bzw. 7 dargestellt. In derselben Weise sind die Ergebnisse von TCPD in den Fig. 8 und 9, diejenigen von THEPD in den Fig. 10 und 11 und diejenigen von TDHPD in den Fig. 12 und 13 dargestellt. Die Ergebnisse von HTEPD sind in den Fig. 25 und 26 und diejenigen von N,N-BHDPD sind in den Fig. 27 und 28 und diejenigen von N,N'-BHDPD sind in den Fig. 29 und 30 dargestellt, während diejenigen der p- Phenylendiaminderivate mit einer monosubstituierten Aminogruppe durch Umsetzung von p-Phenylendiamin mit Propylenoxid (HPPD) erhalten, in den Fig. 31 und 32 dargestellt sind. Weiterhin sind die Ergebnisse der p-Phenylendiaminderivate mit einer di-substituierten Aminogruppe oder Gruppen durch Umsetzung von p-Phenylendiamin mit Propylenoxid in den Fig. 33 und 34 dargestellt und diejenigen der p- Phenylendiaminderivate mit trisubstituierten Aminogruppen durch Umsetzen von p- Phenylendiamin mit Propylenoxid sind in den Fig. 35 und 36 dargestellt.
Wie sich aus den CV Daten, die in den Fig. 8 bis 13 und in den Fig. 25 bis 36 dargestellt sind, deutlich ergibt ist jede der Verbindungen, ähnlich wie im Fall des vorher erwähnten TEPD (Fig. 6 und 7), TCPD, THEPD, TDHPD, HTEPD, N,N-BHDPD, N,N'-BHDPD und die p-Phenylendiaminderivate mit einer substituierten Aminogruppe durch Umsetzen von p-Phenylendiamin mit Propylenoxid ebenfalls eine Verbindung, die in der Lage ist, eine Oxidations-Reduktionsreaktion an einer Elektrode zu durchgelaufen und sie kann in geeigneter Weise als ein Elektronenvermittler bei elektrochemischen Messungen verwendet werden. Zusätzlich, wie dargestellt in den Fig. 9, 11, 13, 26, 28, 30, 32, 34 und 36, kann durch diese Verbindungen in einem Potentialbereich von - 200 mV bis + 300 mV eine reversible Oxidations-Reduktionsreaktion bewirkt werden.

Testbeispiel 3

Messung der Elektronentransferaktivitäten von TEPD, TCPD, THEPD, TDHPD, HTEPD, N, N' - BHPD, N, N - BHDPD, N,N'-BHDPD und p-Phenylendiaminderivaten mit einer substituierten Aminogruppe durch Umsetzung von p-Phenylendiamin mit Propylenoxid - -1.
Glucoseoxidase (GOD, hergestellt von Boehringer Mannheim) wurde in 0,1 M Phosphatpuffer (pH 6,0), der 0,1 M NaCl enthielt, gelöst um 0 M und 4,0 · 10&supmin;&sup4; M GOD Lösungen herzustellen. Ausserdem wurde Glucose (hergestellt von Junsei Kagaku) in demselben Puffer gelöst um ein 1,5 M Lösung herzustellen. In derselben Weise wurde jede der Verbindungen TEPD, TCPD, THEPD, TDHPD, HTEPD, N,N'-BHPD, N,N'- BHDPD und N,N-BHDPD und die p-Phenylendiaminderivate, die eine substituierte Aminogruppe aufwiesen, indem p-Phenylendiamin mit Propylenoxid umgesetzt wurde, wie erhalten in den Synthesebeispielen 1-9, in demselben Puffer gelöst um eine 5,0- 10&supmin;³ M Lösung herzustellen.
Jede dieser Lösungen wurde direkt bevor gemessen wurde in dem folgenden Mischverhältnis in 0,1 M Phosphatpuffer (pH 6,0), der 0,1 M NaCl enthielt, gemischt, um Lösungen der folgenden Zusammensetzungen A und B herzustellen, woraufhin die Stromstärke kontinuierlich in Gegenwart (Zusammensetzung A) oder Abwesenheit (Zusammensetzung B) von GOD gemessen wurde. Zusammensetzung A
*: 0,1 M Phosphatpuffer (pH 6,0), der 0,1 M NaCl enthielt Zusammensetzung B
*: 0,1 M Phosphatpuffer (pH 6,0), der 0,1 M NaCl enthielt
Unter Verwendung derselben Vorrichtung wie in Testbeispiel 2 wurde die elektrische Stromstärke in Gegenwart (Zusammensetzung A) oder Abwesenheit (Zusammensetzung B) von GOD für 10 min. unter Anlegen eines Potentials von + 300 mv (vs Ag/AgCl) an die Arbeitselektrode gemessen.
Die Ergebnisse der Messung von TEPD (GOD - Glucose - TEPD) sind in Fig. 14 dargestellt und diejenigen von TCPD (GOD - Glucose - TGPD) in Fig. 15, die von THEPD (GOD - Glucose - THEPD) in Fig. 16 und die von TDHPD (GOD - Glucose - TDHPD) in Fig. 17.
Die Ergebnisse der Messung von HTEPD (GOD - Glucose - HTEPD) sind in Fig. 37 dargestellt, und diejenigen von N,N-BHDPD (GOD - Glucose - N,N-BHDPD) in Fig. 38, die von N,N'-BHDPD (GOD - Glucose - N,N'-BHDPD) in Fig. 39.
Die Ergebnisse der Messung von p-Phenylendiaminderivaten mit einer monosubstituierten Aminogruppe durch Umsetzen von p-Phenylendiamin mit Propylenoxid (HPPD) sind in Fig. 40 dargestellt und diejenigen der p-Phenylendiaminderivate mit einer di-substituierten Aminogruppe oder Gruppen durch Umsetzen von p- Phenylendiamin mit Propylenoxid in Fig. 41 und diejenigen von p- Phenylendiaminderivaten mit tri-substituierten Aminogruppen durch Umsetzen von p- Phenylendiamin mit Propylenoxid in Fig. 42.
Wie dargestellt in den Fig. 14 bis 17 und den Fig. 37 bis 42 steigt die Oxidationsstromstärke durch die Messung von irgendeiner der Verbindungen an, wenn GOD in dem System vorhanden ist (Zusammensetzung A) im Vergleich mit der Situation, wenn es nicht vorhanden ist (Zusammensetzung B). Demzufolge ist es offensichtlich, ähnlich wie im Fall von TEPD aus dem Stand der Technik, dass jede der Verbindungen TCPD, THEPD, TDHPD, HTEPD, N,N-BHDPD, N,N'-BHDPD und die p-Phenylendiaminderivate mit einer substituierten Aminogruppe durch Umsetzen von p-Phenylendiamin mit Propylenoxid gemäß der vorliegenden Erfindung als ein reversibler Elektronenvermittler zwischen GOD und der Elektrode wirken kann. Und ähnlich wie im Fall dieser Verbindungen besitzt N,N'-BHPD gemäß der vorliegenden Erfindung eine Funktion als reversibler Elektronenvermittler zwischen GOD und der Elektrode.

Testbeispiel 4

Messung der Elektronentransferaktivitäten von TCPD, THEPD, TDHPD, HTEPD, N,N- BHDPD, N,N'-BHPD, N,N'-BHDPD und p-Phenylendiaminderivaten mit einer substituierten Aminogruppe durch Umsetzen von p-Phenylendiamin mit Propylenoxid - 2
Meerettich-Peroxidase (HRPO, hergestellt von TOYOBO) wurde in 0,1 M Phosphatpuffer (pH 6,0) gelöst, der 0,1 M NaCl enthielt um 0 M und 5,0 · 10&supmin;&sup7; M HRPO Lösungen herzustellen. Ausserdem wurde Wasserstoffperoxid (hergestellt von Wako Pure Chemical Industries) in demselben Puffer gelöst um eine 1,0 · 10&supmin;¹ M Lösung herzustellen. In derselben Weise wurde jede der Verbindungen TCPD, THEPD, TDHPD, HTEPD, N,N- BHDPD, N,N'-BHPD, N,N'-BHDPD und die p- Phenylendiaminderivate mit einer substituierten Aminogruppe durch Umsetzen von p- Phenylendiamin mit Propylenoxid, wie erhalten in den Synthesebeispielen 1 bis 9 in demselben Puffer gelöst um eine 5,0 · 10&supmin;³ M Lösung herzustellen.
Jede dieser Lösungen wurde direkt bevor gemessen wurde in dem folgenden Mischverhältnis in 0,1 M Phosphatpuffer (pH 6,0), der 0,1 M NaCl enthielt, gemischt und zwar, um Lösungen der folgenden Zusammensetzungen A und B herzustellen, woraufhin die Stromstärke kontinuierlich in Gegenwart (Zusammensetzung A) oder Abwesenheit (Zusammensetzung B) von HRPO gemessen wurde. Zusammensetzung A
*: 0,1 M Phosphatpuffer (pH 6,0), der 0,1 M NaCl enthielt Zusammensetzung B
*: 0,1 M Phosphatpuffer (pH 6,0), der 0,1 M NaCl enthielt
Unter Verwendung derselben Vorrichtung wie in Testbeispiel 2 wurde die elektrische Stromstärke in Gegenwart (Zusammensetzung A) oder Abwesenheit (Zusammensetzung B) von HRPO für 5 oder 10 min. unter Anlegen eines Potentials von -80 mV (vs Ag/AgCl, dasselbe soll hiernach gelten) im Fall von TEPD, THEPD und TDHPD oder-150 mv im Fall von TCPD, HTEPD, N,N-BHDPD, N,N'-BHPD, N,N' -BHDPD und den p-Phenylendiaminderivaten mit einer substituierten Aminogruppe durch Umsetzen von p-Phenylendiamin mit Propylenoxid gemessen.
Die Ergebnisse der Messung von TEPD (HRPO-Wasserstoffperoxid - TEPD) sind in Fig. 18 dargestellt und diejenigen von TCPD (HRPO-Wasserstoffperoxid-TCPD) in Fig. 19, die von THEPD (HRPO-Wasserstoffperoxid- THEPD) in Fig. 20 und die von TDHPD (HRPO-Wasserstoffperoxid- TDHPD) in Fig. 21.
Die Ergebnisse der Messung von HTEPD (HRPO - Wasserstoffperoxid - HTEPD) sind in Fig. 43 dargestellt, und diejenigen von N,N-BHDPD (HRPO - Wasserstoffperoxid- N,N-BHDPD) in Fig. 44, die von N,N'-BHDPD (HRPO -Wasserstoffperoxid - N,N'- BHDPD) in Fig. 45.
Die Ergebnisse der Messung von p-Phenylendiaminderivaten mit einer monosubstituierten Aminogruppe durch Umsetzen von p-Phenylendiamin mit Propylenoxid (HPPD) sind in Fig. 46 dargestellt und diejenigen der p-Phenylendiaminderivate mit einer di-substituierten Aminogruppe oder Gruppen durch Umsetzen von p- Phenylendiamin mit Propylenoxid in Fig. 47 und diejenigen von p- Phenylendiaminderivaten mit tri-substituierten Aminogruppen durch Umsetzen von p- Phenylendiamin mit Propylenoxid in Fig. 48.
Wie dargestellt in den Fig. 18 bis 21 und den Fig. 43 bis 48 steigt die Reduktionsstromstärke durch die Messung von irgendeiner der Verbindungen an, wenn HRPO in dem System vorhanden ist (Zusammensetzung A) im Vergleich mit der Situation, wenn es nicht vorhanden ist (Zusammensetzung B). Demzufolge ist es offensichtlich, ähnlich wie im Fall von TEPD aus dem Stand der Technik, dass jede der Verbindungen TCPD, THEPD, TDHPD, HTEPD, N,N-BHDPD, N,N'-BHDPD und die p-Phenylendiaminderivate mit einer substituierten Aminogruppe durch Umsetzen von p-Phenylendiamin mit Propylenoxid gemäß der vorliegenden Erfindung als ein reversibler Elektronenvermittler zwischen HRPO und der Elektrode wirken kann. Und ähnlich wie im Fall dieser Verbindungen besitzt N, N' - BHPD gemäß der vorliegenden Erfindung eine Funktion als reversibler Elektronenvermittler zwischen HRPO und der Elektrode.

Beispiel gemäß der Erfindung

Die Vorrichtung für einen spezifischen Bindungsassay, wie dargestellt in den Fig. 2 und 3, wurde hergestellt und die Konzentration von hCG in den Proben wurde unter Verwendung dieser Vorrichtung gemessen.
Zunächst wurden die folgenden Glieder zur Verwendung bei der Konstruktion der Vorrichtung für einen spezifischen Bindungsassay hergestellt.

(1) Präparation eines Konjugats eines anti-hCG Antikörpers und Meerettich Peroxidase (markierter Antikörper)

Ein monoklonaler anti-hCG Antikörper MB81 aus Maus (hergestellt von Mochida Pharmaceutical) wurde in einer 100 mM Natriumchlorid/l mM EDTA/60 mM Triethanolamin-Pufferlösung (pH 8,0, TEA Puffer) zu einer endgültigen Konzentration von 8,3 mg/ml gelöst und die erhaltene Lösung wurde gründlich gegen TEA Puffer, der mit Stickstoffgas gereinigt worden war, dialysiert. Ein 61 ul Teil der 50 mM 2 - Iminothiolan-hydrochlorid-Lösung (hergestellt von Pierce Chemical Company) wurde zu 1,1 ml der so hergestellten Antikörperlösung hinzugefügt und die Mischung wurde gerührt und dann ließ man sie 1,5 h bei 4ºC in einer Atmosphäre von Stickstoffgas still stehen. Danach wurde die erhaltene Lösung gründlich gegen eine 100 mM Phosphatpufferlösung (pH 7), die 100 mM Natriumchlorid und 1 mM EDTA (EDTA-PB) enthielt, und die mit Stickstoff gereinigt worden war, dialysiert. Auf diese Weise wurde ein anti-hCG Antikörper HM 81 erhalten, in den eine SH Gruppe eingeführt worden war.
Andererseits wurde Meerettich-Peroxidase (HRPO, hergestellt von TOYOBO) in 100 mM Phosphatpuffer (pH 7) zu einer endgültigen Konzentration von 20 mg/ml gelöst. Unter Rühren bei 30ºC wurden 500 ul der so hergestellten Enzymlösung mit 500 ul 50 mM Sulfo-SMCC (hergestellt von Pierce Chemical Co.) vermischt. Nach 20 Minuten einer Reaktion bei 30ºC wurde die resultierende Reaktionsmischung durch eine Säule (2,6 Durchmesser · 15 cm), gepackt mit Sephadex G-25® (hergestellt von Pharmacia) geführt, die vorher mit Stickstoff gereinigtem EDTA-PB äquilibriert worden war, wobei Sulfo-SMCC, das nicht umgesetzt worden war, entfernt wurde, woraufhin die entstehende Lösung unter Verwendung eines Konzentrators (CENTRIPREP-10®, hergestellt von Amicon Corp) konzentriert wurde, um maleimidierte (maleimidated) HRPO zu erhalten. Die Konzentration der maleimidierten HRPO wurde basierend auf der Absorption bei 403 nm bestimmt.
Eine Lösung der maleimidierten HRPO (1,25 · 10&supmin;&sup8; Mol oder 1,56 · 10&supmin;&sup8; Mol) wurde mit einer Lösung des anti-hCG Antikörpers HM 81 mit eingeführten SH-Gruppen vermischt (3 mal oder 1/3 mal im molaren Verhältnis) und die Mischung wurde 12 h bei 4ºC unter einer Stickstoff-Atmosphäre inkubiert. Nach der Reaktion wurden 50 ul einer 50 mM Cysteamin-Lösung zu jeder der Reaktionsmischungen hinzugefügt und die Reaktion wurde bei 4ºC für 60 min. unter einer Stickstoffatmosphäre fortgesetzt. Danach wurde die erhaltene Reaktionsmischung einer Gel-Filtrationschromatographie unter Verwendung einer ULTROGEL AcA34® Säule (hergestellt von IBF Biotechniques) unterzogen, die vorher mit Stickstoff gereinigtem EDTA-PB äquilibriert worden war.
Jede der eluierten Fraktionen wurde auf ihre Absorption bei 280 nm und 403 nm hin untersucht um die Fraktionen zu sammeln und zu konzentrieren, die das HM 81/HRPO konjugierte Produkt enthielten jedoch keine freien Enzymmoleküle. Nach einer Bestätigung des Molekulargewichts des so konzentrierten Konjugats (auf das hiernach als "HRPO - HM 81" Bezug genommen werden wird), und zwar durch eine Phast System ® Elektrophorese (Pharmacia), wurden die Mengen des Antikörpers und des Enzyms, die in dem Konjugat enthalten waren, basierend auf der Absorption und der enzymatischen Aktivität bestimmt. Das so hergestellte HRPO - HM 81 wurde als ein mit einem Oxidations-Reduktionsenzym markierter Antikörper in den Messexperimenten verwendet.

(2) Präparation eines gefriergetrockneten Glieds, das mit dem Meerettich Peroxidasemarkierten anti-hCG Antikörper (HRPO - HM 81) imprägniert ist.

Das in dem obigen Schritt (1) erhaltene HRPO - HM 81 wurde mit einem Phosphatpuffer (pH 6), der 5% normales Kaninchenserum (NRS) enthielt, sowie 10% Saccharose und 0,1 M NaCl zur Herstellung einer Lösung verdünnt, die eine Peroxidase-Aktivität von 0,63 U/ml aufwies. Als nächstes wurden 140 ul der Lösung auf ein rundes Filterpapierstück mit einem Durchmesser von 12 mm getüpfelt, das aus einem Glasfaserfilterpapier (GA 100, hergestellt von Advantech Toyo) ausgestanzt worden war und es wurde dann gefriergetrocknet um ein gefriergetrocknetes HRPO - HM 81 Glied zu erhalten, das als das mit dem markierten Antikörper imprägnierte Glied 14 verwendet werden kann.

(3) Herstellung eines gefriergetrockneten Glieds, das mit THEPD imprägniert ist (ein erfindungsgemäßes Beispiel)

Das in dem Synthesebeispiel 3 erhaltene THEPD wurde in einem Phosphatpuffer (pH 6), der 0,1 M NaCl enthielt, gelöst um eine 5 mM Lösung herzustellen. Als nächstes wurden 140 ul der Lösung auf ein kreisförmiges Filterpapierstück mit einem Durchmesser von 12 mm getüpfelt, das aus einem Glasfaserfilterpapier (GA 100, hergestellt von Advantech Toyo) ausgestanzt worden war und dieses wurde dann gefriergetrocknet um ein gefriergetrocknetes THEPD-Glied zu erhalten, dass als das mit dem Elektronenvermittler imprägnierte Glied 16 der vorliegenden Erfindung verwendet werden kann.

(4) Herstellung eines gefriergetrockneten Glieds, das mit TEPD imprägniert ist (ein Vergleichsbeispiel)

Das in dem Synthesebeispiel 1 erhaltene TEPD wurde in einem Phosphatpuffer (pH 6), der 1 M NaCl enthielt, gelöst um eine 5.0 mM Lösung herzustellen. Als nächstes wurden 140 ul der Lösung auf ein kreisförmiges Filterpapierstück mit einem Durchmesser von 12 mm getüpfelt, das aus einem Glasfaserfilterpapier (GA 100, hergestellt von Advantech Toyo) ausgestanzt worden war und dann wurde dieses gefriergetrocknet um ein gefriergetrocknetes TEPD Glied zu erhalten, das als ein mit einem vergleichenden Elektronenvermittler imprägniertes Glied 16 verwendet werden konnte.

(5) Herstellung eines gefriergetrockneten Glieds, das mit Wasserstoffperoxid imprägniert ist

Wasserstoffperoxid (Wako Pure Chemical Industries) und Harnstoff (Wako Pure Chemical Industries) wurden in destilliertem Wasser gelöst um eine Lösung herzustellen, die 0,5 M Wasserstoffperoxid und 0,5 M Harnstoff enthielt. Als nächstes wurden 120 ul der Lösung auf ein kreisförmiges Filterpapierstück mit einem Durchmesser von 12 mm getüpfelt, das aus einem Chromatographie-Filterpapier (17 Chr, hergestellt von Whatman) ausgestanzt worden war, und daraufhin wurde das Stück gefriergetrocknet um ein gefriergetrocknetes Wasserstoffperoxid - Harnstoff-Glied zu erhalten, das als das Absorptionsmittel 24 verwendet werden kann.

(6) Herstellung einer porösen, anti-hCG Antikörper-immobilisierten Cellulose-Ester-Folie

Eine Gesamtzahl von 200 kreisförmigen Stücken (13 mm im Durchmesser) einer porösen Membran aus einem Celluloseacetat / Cellulosenitratmischungsester mit einer Porengröße von 8,0 um (Kat. Nr. SCWP 01300, hergestellt von Nippon Millipore Kogyo) wurden in ein Glasgefäß gegeben, das mit 200 ml einer PBS Lösung gefüllt war, die 1,0 % (w/v) Rinder-γ-Globulin (Kat. Nr. G 7516, hergestellt von Sigma Chemical) enthielt und wurden auf 60ºC für 2 h unter leichtem Rühren erhitzt.
Nach Entfernen des Überstandes und weiterem Entfernen der verbliebenen Flüssigkeit durch Absaugen wurden die so behandelten kreisförmigen Stücke durch Rühren in einem ausreichenden Volumen einer 0,076 M Phosphatgepufferten Kochsalzlösung (pH 6,4, hiernach als "PBS" bezeichnet) gewaschen, woraufhin die verwendete PBS entfernt wurde. Der Waschschritt mit PBS wurde zweimal wiederholt und dann wurden die gewaschenen Stücke wiederum 7mal mit destilliertem Wasser gewaschen. Nach Abschluss der Waschschritte wurden die kreisförmigen Stücke in 200 ml einer 1,0%igen wässrigen Glutaraldehyd-Lösung gegeben und bei 25ºC 3 h inkubiert, wobei leicht gerührt wurde. Nach der Reaktion wurden die so behandelten kreisförmigen Stücke aus porösen Membranen 10mal mit destilliertem Wasser gewaschen und dann eines nach dem anderen auf einer Glasplatte angeordnet um zu trocknen.
Andererseits wurde monoklonaler anti-hCG Antikörper HM 21 (hergestellt von Mochida Pharmaceutical) aus der Maus in einer Lösung gelöst, die aus 0,05 M Natriumbicarbonat und 0,05 M Natriumchlorid bestand, zu einer endgültigen Konzentration von 1,0 mg/ml. Jedes Stück (13 mm im Durchmesser) der auf einer Glasplatte getrockneten porösen Membran wurde mit 25 ul der gerade hergestellten Antikörperlösung von dem zentralen Stück des kreisförmigen Stücks imprägniert. Nach 1 h Reaktionszeit bei Raumtemperatur wurden die kreisförmigen Stücke der porösen Membran in 200 ml einer 0,2%igen Rinderserumalbumin (BSA) / PBS Lösung gegeben und bei 4ºC 2 Tage geschüttelt um ein Blockieren zu bewirken. Danach wurden die so behandelten Stücke dreimal mit einer 0,1%igen Tween 20/PBS Lösung und 7mal mit PBS gewaschen und daraufhin wurden sie getrocknet um anti-hCG Antikörper (HM 21), immobilisiert auf einer porösen Cellulose-Mischungsestermembran zu erhalten, die als Matrix 22 verwendet werden kann.

(7) Herstellung eines Nachweismittels (Elektrode) 20

Ein Muster, wie dargestellt in Fig. 4, wurde durch ein Siebdruckverfahren auf jede Vorderseite und jede Rückseite einer transparenten PET Folie (50 mm Länge, 20 mm Breite und 0,25 mm Dicke) unter Verwendung von leitender Kohlenstofftinte (400 - CT, hergestellt von Asahi Kaken) gedruckt. Ausserdem wurde die Referenzelektrode 32 durch Siebdruck auf den kreisförmigen Bereich des zentralen Bereichs der Vorderseite unter Verwendung einer leitenden Silbertinte (LS 411 N, hergestellt von Asahi Kaken) gedruckt. Zusätzlich wurde die isolierende Schicht 36 auf die Vorderseite und die Rückseite der Elektrode durch ein Siebdruckverfahren gedruckt, wobei eine isolierende Tinte (XB - 101 G, hergestellt von Fujikura Kasei) verwendet wurde. Danach wurde eine Öffnung mit einem Durchmesser von 3 mm in der Mitte des kreisförmigen Bereichs ausgebildet wobei eine Stanzwerkzeug verwendet wurde, und zwar um sie als die durchgehende Öffnung 30 zu verwenden, in einer Weise, dass ringförmige Elektroden sowohl auf der Vorderseite als auch auf der Rückseite der durchgehenden Öffnung 30 verblieben. Nach dem Stanzen wurde bestätigt, dass die Elektroden auf der Vorderseite bzw. auf der Rückseite elektrisch unabhängig voneinander waren.
Danach wurde der mit der leitenden Silbertinte überlagerte Teil einer 10minütigen Elektrolyse in 0,1 M wässriger Natriumchloridlösung (+ 1,0 V vs Ag/AgCl) unterzogen um eine Silberchloridschicht auf der Oberfläche zu bilden. Von den exponierten Ringzonen wurde die mit einer Silber/Silberchlorid-Schicht laminierte Seite als die Referenzelektrode 32 (und Gegenelektrode) venrwendet und die andere Seite mit nur der leitenden Kohlenstofftinte wurde als die Arbeitselektrode 34 zu Nachweiszwecken verwendet.

(Herstellung einer Assayvorrichtung für die erfindungsgemäße beispielhafte Verwendung)

Unter Verwendung von jedem der so hergestellten Glieder wurde die in den Fig. 2 und 3 des MEDIA Verfahrens dargestellte Assayvorrichtung zur Verwendung bei der Durchführung des Assayverfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung in der folgenden Weise konstruiert.
Zunächst wurde das Absorptionsmittel 24, hergestellt im obigen Schritt (5), auf dem unteren Träger 26 angeordnet, der aus einem Acrylharz bestand. Auf den zentralen Bereich der Oberfläche des Absorptionsmittels wurde ein Siegel mit einem Durchmesser von 6 mm angeordnet, das durch Ausstanzen eines Reparaturbandes (hergestellt von Sumitomo 3M) hergestellt worden war, um als Versiegelungsmittel 24a zu dienen. Auf die obere Fläche desselben wurde die Matrix 22 aufgebracht, die in dem obigen Schritt (6) hergestellt worden war. Dies geschah, indem ihr Mittelpunkt mit demjenigen des Versiegelungsmittels 24a des Absorptionsmittels 24 in Übereinstimmung gebracht wurde. Als nächstes wurde der Elektrodenteil 20, hergestellt in dem obigen Schrift (7), wobei die Referenzelektrode 32 die obere Seite bildete, auf die Matrix 22 aufgebracht. Dies geschah in einer Weise, dass der Mittelpunkt der durchgehenden Öffnung 30 mit demjenigen der Matrix 22 in Übereinstimmung gebracht wurde. Ein kreisförmiges Stück mit einem Durchmesser von 3 mm wurde aus einem Glasfasefilterpapier (GA 55, hergestellt von Advantech Toyo) ausgestanzt und wurde in die durchgehende Öffnung 30 eingebracht um die Kommunikationsvorrichtung 18 zu bilden. Auf den Elektrodenteil 20 wurde weiterhin das gefriergetrocknete, mit dem Elektronenvermittler (THEPD) imprägnierte Glied 16, hergestellt in dem obigen Schritt (3) aufgebracht und zwar in einer Weise, dass sein Mittelpunkt mit demjenigen der durchgehenden Öffnung 30 des Elektrodenteils 20 in Übereinstimmung gebracht wurde. Auf den oberen zentralen Teil des mit dem Elektronenvermittler imprägnierten Glieds 16 wurde ein Siegel mit einem Durchmesser von 6 mm aufgebracht, das hergestellt worden war, indem ein Reparaturband ausgestanzt wurde und dieses wurde als Versiegelungsmittel 16a verwendet. Auf dieses wurde das mit dem markierten Antikörper imprägnierte Glied 14, hergestellt in dem obigen Schritt (2), angeordnet, auf das wiederum ein kreisförmiges Stück mit einem Durchmesser von 12 mm angeordnet wurde, das als Filter 12 verwendet werden sollte, und das durch Ausstanzen eines Tween-20-behandelten ERUTAS (Kat. Nr. A 05070, hergestellt von Asahi Chemical Ind.) hergestellt worden war. Darauf wurde schließlich die obere Abdeckung 10, hergestellt aus einer Acryl-Platte mit einer Dicke von 5 mm, aufgebracht, die eine Öffnung zur Eingabe von Proben 10a (Durchmesser 6 mm) enthielt, und zwar in einer Weise, dass der Mittelpunkt der Probeneingabeöffnung 10a mit demjenigen des Filters 12 übereinstimmte. Auf diese Weise wurde eine spezifische Bindungsassayvorrichtung zur Verwendung bei der Messung der hCG Konzentration konstruiert. In diesem Fall wurde die Entfernung zwischen der unteren Oberfläche der oberen Platte und der oberen Oberfläche des unteren Trägers auf 3400 um eingestellt.
(Herstellung der Assayvorrichtung für die Vergleichs-Beispiel-Verwendung) Eine spezifische Bindungsassayvorrichung zur Verwendung bei der Messung der hCG Konzentration wurde in derselben Weise wie im Fall der obigen erfindungsgemäßen Assayvorrichtung konstruiert, ausser das das mit dem Elektronenvermittier imprägnierte Glied 16, hergestellt durch Imprägnieren und Gefriertrocknen von THEPD im obigen Schritt (3), durch ein anderes, mit einem Elektronenvermittler imprägniertes Glied 16 ersetzt wurde, das durch Imprägnieren und Gefriertrocknen von TEPD in dem obigen Schritt (4) hergestellt wurde.

(Messung von hCG in Vollblut)

Jede der so konstruierten erfinderischen und vergleichenden spezifischen Bindungsassayvorrichtungen zur Verwendung für die hCG Konzentrationsmessung wurde mit der notwendigen Messausrüstung, wie z. B. einem Potentiostat und ähnlichem, wie beschrieben in Testbeispiel 2, verbunden. Andererseits wurde hCG zu mit Heparin behandelten Vollblutproben von gesunden, männlichen Freiwilligen hinzugefügt um Lösungen (A) (hCG 0 IU/l Vollblut) und (B) (1000 IU/l Vollblut) herzustellen. Ein 260 ul Teil von jeder der Lösungen (A) und (B) wurde in die Probeneingabevorrichtung 38 durch die Probeneingabeöffnung 10a auf die obere Abdeckung 10 von jeder der erfindungsgemäßen und vergleichenden spezifischen Bindungsassayvorrichtungen eingeführt (aufgetüpfelt). Nach 30 Sekunden des Auftüpfelns von Proben wurde ein Potential von - 150 mV an die Arbeitselektrode angelegt, basierend auf der Gegen/Referenzelektrode um die elektrische Stromstärke aufzunehmen. Die Ergebnisse der Messung der erfindungsgemäßen und vergleichenden Assayvorrichtungen sind in den Fig. 22 bzw. 23 dargestellt.
Wie dargestellt in Fig. 22 wurde die Reduktionsstromstärke in Reaktion auf die Konzentration von hCG im Fall der erfinderischen spezifischen Bindungsassayvorrichtung hoch, wobei das gefriergetrocknete THEPD Glied als das mit dem Elektronenvermittler imprägnierte Glied 16 verwendet worden war. Demgegenüber, wie dargestellt in Fig. 23, stieg die elektrische Stromstärke in Reaktion auf die Konzentration von hCG nicht an, wenn die vergleichende spezifische Bindungsassayvorrichtung verwendet wurde, bei der das gefriergetrocknete TEPD Glied als das mit dem Elektronenvermittler imprägnierte Glied 16 verwendet wurde. Diese Ergebnisse, wie auch die Ergebnisse des Testbeispiels 1, zeigen an, dass TEPD nicht als ein geeigneter Elektronenvermittler zum Zeitpunkt der Messung in einem solchen Assayverfahren dienen kann, da es eine schlechte Trocknungseigenschaft und Stabilität im getrockneten Zustand aufweist und da es Einflüssen von störenden Substanzen in den Proben unterworfen ist und da es ausserdem eine schlechte Stabilität in den Proben zeigt.
Auf der Basis dieser Ergebnisse wurde bestätigt, dass die quantitative Bestimmung der Konzentration von hCG in der Testprobe einfach und schnell durch Verwendung der Assayvorrichtung durchgeführt werden kann, bei der der Elektronenvermittler der vorliegenden Erfindung verwendet wird.
Es wurde so also oben im Detail beschrieben, dass gemäß dem elektrochemischen Assayverfahren und mit der neuen p-Phenylendiaminverbindung der vorliegenden Erfindung die Messung von zu untersuchenden Substanzen durch ein Enzym- Elektrodenverfahren, spezifische Bindungsassayverfahren, wie das MEDIA-Verfahren und ähnliche immer stabil mit hoher Nachweis-Sensibilität (Reaktivität) und guter Reproduzierbarkeit durchgeführt werden kann, selbst im Fall von Blut, Urin und ähnlichen Proben, die störende Substanzen enthalten und dass das Assayverfahren auch in geeigneter Weise für die Wegwerf-Verwendung geeignet ist.

Claims

1. Elektrochemisches Assay-Verfahren, umfassend das Messen einer zu untersuchenden Substanz in Flüssigkeitsproben, wobei man sich mindestens eines Oxidations-Reduktions-Enzyms bedient, wobei ein Oxidations-Reduktions-Enzym, ein Elektronen-Vermittler und eine Elektrode, die in der Lage ist, mit dem Elektronen- Vermittler einen Elektronentransfer durchzuführen, in dem Assay angeordnet sind und eine durch die folgende Formel [1] dargestellte Verbindung oder ein Salz davon als Elektronen-Vermittler verwendet wird:

wobei R¹, R², R³ und R&sup4; dieselben oder unterschiedlich voneinander sein können und jeweils eine lineare oder verzweigte Alkylgruppe mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen bedeuten, die eine Substituentengruppe aufweisen kann, mit der Maßgabe, dass mindestens einer der Reste R¹, R², R³ und R&sup4; mindestens eine Gruppe aufweist, ausgewählt aus der Klasse, bestehend aus Hydroxyl, Mercapto, Carboxyl, Phosphonooxy und Sulfo.

2. Das elektrochemische Assayverfahren nach Anspruch 1 wobei der mindestens eine, aus der Gruppe von R¹, R², R³ und R&sup4; ausgewählte Rest, eine Hydroxylgruppe oder eine Carboxylgruppe aufweist.

3. Das elektrochemische Assayverfahren nach Anspruch 1, wobei die durch die Formel [I] dargestellte Verbindung mindestens eine Verbindung ist, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus

4. Das elektrochemische Assayverfahren nach Anspruch 1, wobei die zu untersuchende Substanz ein Substrat, ein Inhibitor, ein Cofaktor oder ein Aktivator des Oxidations- Reduktions-Enzyms ist und eine Modulation einer Enzymreaktion, die in Reaktion auf die Menge des Substrats, des lnhibitors, des Cofaktors oder des Aktivators des Oxidations-Reduktionsenzyms erzeugt wird, als eine Modulation des elektrochemischen Signals an der Elektrode nachgewiesen wird.

5. Das elektrochemische Assayverfahren nach Anspruch 1, wobei die zu untersuchende Substanz durch eine spezifische Bindungsreaktion gemessen wird, wobei man sich mindestens einer spezifischen Bindungssubstanz bedient, die für die zu untersuchende Substanz spezifisch ist und wobei das Oxidations-Reduktionsenzym als Markierung verwendet wird.

6. Das elektrochemische Assayverfahren nach Anspruch 5, wobei eine Vorrichtung, umfassend eine Matrix als einen Bereich, in dem eine Flüssigkeitsprobe, die vermutlich die zu untersuchende Substanz enthält, entwickelt wird, eine Vorrichtung zur Eingabe der Probe, durch die die Probe in die Matrix eingeführt wird und eine Elektrode, benachbart zu der Matrix, als eine Assayvorrichtung verwendet wird und wobei eine Probe in die Proben-Eingabe-Vorrichtung eingeführt wird um der zu untersuchenden Substanz in der Probe zu ermöglichen, in der Matrix mit einer ersten spezifischen Erfindungssubstanz und einer zweiten spezifischen Bindungssubstanz zu reagieren, die mit einem Oxidations-Reduktions-Enzym markiert ist, das eine Elektronen-Transferart erzeugen kann, die ein Signal an dem Elektrodenteil erzeugt, oder wobei die Probe in die Matrix eingeführt wird, nachdem man der zu untersuchenden Substanz in der Probe ermöglicht hat, in einem äusseren Bereich der Matrix mit einer ersten spezifischen Bindungssubstanz und einer zweiten spezifischen Bindungssubstanz zu reagieren, die mit einem Oxidations-Reduktions-Enzym markiert ist, das in der Lage ist, eine Elektronen-Transferart zu bilden, die ein Signal an dem Elektrodenteil erzeugt,

wodurch Veränderungen in der Verteilung von mindestens einer molekularen Spezies in einem Komplex der mit dem Oxidations-Reduktions-Enzym markierten zweiten spezifischen Bindungssubstanz und der zu untersuchenden Substanz bewirkt werden, einem Komplex der mit dem Oxidations-Reduktions-Enzym markierten zweiten spezifischen Bindungssubstanz, der zu untersuchenden Substanz und der ersten spezifischen Bindungssubstanz und einer freien Form der mit dem Oxidations- Reduktions-Enzym markierten zweiten spezifischen Bindungssubstanz und wobei die Verteilungsveränderungen, die in Reaktion auf die Menge der zu untersuchenden Substanz in der Probe als Signalmodulation an der Elektrode auftreten, nachgewiesen werden, die durch den Massentransfer der durch das Oxidations- Reduktions-Enzym erzeugten Elektronentransferart begrenzt ist.

7. Das elektrochemische Assayverfahren nach Anspruch 5, wobei eine Vorrichtung, umfassend eine Matrix als einen Bereich, in dem eine Flüssigkeitsprobe, die vermutlich die zu untersuchende Substanz enthält, entwickelt wird, eine Vorrichtung zur Probeneingabe, von der die Probe in die Matrix eingeführt wird und eine Elektrode, benachbart zu der Matrix, als eine Assayvorrichtung verwendet wird, wobei entweder eine spezifische Bindungssubstanz, die für die zu untersuchende Substanz spezifisch ist oder eine Substanz, die mit der zu untersuchenden Substanz um die spezifische Bindungssubstanz kompetitiert, mit einem Oxidations-Reduktions -Enzym markiert ist, das in der Lage ist, eine Elektronentransferart zu bilden, die ein Signal an der Elektrode erzeugt und

wobei eine Probe in die Vorrichtung für die Probeneingabe eingeführt wird, um der zu untersuchenden Substanz in der Probe zu ermöglichen in kompetitiver Weise in der Matrix mit einer spezifischen Bindungssubstanz oder einer Substanz, die mit der zu untersuchenden Substanz um die spezifische Bindungsubstanz kompetitiert, zu reagieren oder die Probe in die Matrix eingeführt wird, nachdem man der zu untersuchenden Substanz in der Probe ermöglicht hat, in einem äusseren Bereich der Matrix in einer kompetitiven Weise mit einer spezifischen Bindungssubstanz oder einer Substanz, die mit der zu untersuchenden Substanz um die spezifische Bindungssubstanz kompetitiert, zu reagieren,

wodurch Veränderungen in der Verteilung von mindestens einer mit dem Oxidations- Reduktions-Enzym markierten molekularen Spezies in einem Komplex der spezifischen Bindungssubstanz und der zu untersuchenden Substanz, einem Komplex der spezifischen Bindungssubstanz und der Substanz, die mit der zu untersuchenden Substanz um die spezifische Bindungssubstanz kompetitiert, einer freien Form der spezifischen Bindungssubstanz und einer freien Form der Substanz, die mit der zu untersuchenden Substanz um die spezifische Bindungssubstanz kompetitiert, bewirkt werden,

und wobei die in Reaktion auf die Menge der zu untersuchenden Substanz in der Probe · auftretenden Verteilungsveränderungen als eine Signalmodulation an der Elektrode nachgewiesen werden, die durch den Massentransfer der Elektronentransferart, die durch das Oxidations-Reduktionsenzym erzeugt wird, begrenzt ist.

8. Verbindung, dargestellt durch die folgende chemische Struktur oder ein Salz davon:

9. Verbindung, dargestellt durch die folgende chemische Struktur oder ein Salz davon:

10. Elektrochemisches Assayverfahren, das das Messen einer zu untersuchenden Substanz in Flüssigkeitsproben umfasst, wobei man sich mindestens eines Oxidations- Reduktions-Enzyms bedient, wobei ein Oxidations-Reduktions-Enzym, ein Elektronenvermittler und eine Elektrode, die in der Lage ist, einen Elektronentransfer mit dem Elektronenvermittler durchzuführen, in dem Assaysystem angeordnet sind und wobei eine Verbindung, die durch die folgende Formel [II] dargestellt ist oder ein Salz davon als Elektronenvermittler verwendet wird:

wobei R&sup5;, R&sup6;, R&sup7; und R&sup8; dieselben oder unterschiedlich voneinander sein können und jeweils ein Wasserstoffatom oder eine lineare oder verzweigte Alkylgruppe mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen bedeuten, die eine Substituentengruppe aufweisen kann, mit der Maßgabe, dass mindestens einer der Reste R&sup5;, R&sup6;, R&sup7; und R&sup8; eine Alkylgruppe ist, die mindestens eine Gruppe aufweist, ausgewählt aus der Klasse, bestehend aus Hydroxyl, Mercapto, Carboxyl, Phosphonooxy und Sulfo und wobei mindestens einer der Reste R&sup5;, R&sup6;, R&sup7; und R&sup8; Wasserstoff ist.

11. Das elektrochemische Assayverfahren nach Anspruch 10, wobei der mindestens eine der Reste, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus R&sup5;, R&sup6;, R&sup7; und R&sup8;, eine Hydroxylgruppe aufweist.

12. Das elektrochemische Assayverfahren nach Anspruch 10, wobei die zu untersuchende Substanz ein Substrat, ein Inhibitor, ein Cofaktor oder ein Aktivator des Oxidations-Reduktions-Enzyms ist und eine Modulation einer Enzymreaktion, die in Reaktion auf die Menge des Substrats, des lnhibitors, des Cofaktors oder des Aktivators des Oxidations-Reduktionsenzyms erzeugt wird, als eine Modulation des elektrochemischen Signals an der Elektrode nachgewiesen wird.

13. Das elektrochemische Assayverfahren nach Anspruch 10, wobei die zu untersuchende Substanz durch eine spezifische Bindungsreaktion gemessen wird, wobei man sich mindestens einer spezifischen Bindungssubstanz bedient, die für die zu untersuchende Substanz spezifisch ist und wobei das Oxidations-Reduktionsenzym als Markierung verwendet wird.

14. Das elektrochemische Assayverfahren nach Anspruch 13, wobei eine Vorrichtung, umfassend eine Matrix als einen Bereich, in dem eine Flüssigkeitsprobe, die vermutlich die zu untersuchende Substanz enthält, entwickelt wird, eine Vorrichtung zur Eingabe der Probe, durch die die Probe in die Matrix eingeführt wird und eine Elektrode, benachbart zu der Matrix, als eine Assayvorrichtung verwendet wird und wobei eine Probe in die Proben-Eingabe-Vorrichtung eingeführt wird um der zu untersuchenden Substanz in der Probe zu ermöglichen, in der Matrix mit einer ersten spezifischen Bindungssubstanz und einer zweiten spezifischen Bindungssubstanz zu reagieren, die mit einem Oxidations-Reduktions-Enzym markiert ist, das eine Elektronen-Transferart erzeugen kann, die ein Signal an dem Elektrodenteil erzeugt, oder

wobei die Probe in die Matrix eingeführt wird, nachdem man der zu untersuchenden Substanz in der Probe ermöglicht hat, in einem äusseren Bereich der Matrix mit einer ersten spezifischen Bindungssubstanz und einer zweiten spezifischen Bindungssubstanz zu reagieren, die mit einem Oxidations-Reduktions-Enzym markiert ist, das in der Lage ist, eine Elektronen-Transferart zu bilden, die ein Signal an dem Elektrodenteil erzeugt,

wodurch Veränderungen in der Verteilung von mindestens einer molekularen Spezies in einem Komplex der mit dem Oxidations-Reduktions-Enzym markierten zweiten spezifischen Bindungssubstanz und der zu untersuchenden Substanz bewirkt werden, einem Komplex der mit dem Oxidations-Reduktions-Enzym markierten zweiten spezifischen Bindungssubstanz, der zu untersuchenden Substanz und der ersten spezifischen Bindungssubstanz und einer freien Form der mit dem Oxidations- Reduktions-Enzym markierten zweiten spezifischen Bindungssubstanz und wobei diese Verteilungsveränderungen, die in Reaktion auf die Menge der zu untersuchenden Substanz in der Probe als Signalmodulation an der Elektrode auftreten, nachgewiesen werden, die durch den Massentransfer des durch das Oxidations-Reduktions-Enzym erzeugten Elektronenvermittlers begrenzt ist.

15. Das elektrochemische Assayverfahren nach Anspruch 13, wobei eine Vorrichtung, umfassend eine Matrix als einen Bereich, in dem eine Flüssigkeitsprobe, die vermutlich die zu untersuchende Substanz enthält, entwickelt wird, eine Vorrichtung zur Probeneingabe, von der die Probe in die Matrix eingeführt wird und eine Elektrode, benachbart zu der Matrix, als eine Assayvorrichtung verwendet wird, wobei entweder eine spezifische Bindungssubstanz, die für die zu untersuchende Substanz spezifisch ist oder eine Substanz, die mit der zu untersuchenden Substanz um die spezifische Bindungssubstanz kompetitiert, mit einem Oxidations-Reduktions-Enzym markiert ist, das in der Lage ist, eine Elektronentransferart zu bilden, die ein Signal an der Elektrode erzeugt und

wobei eine Probe in die Vorrichtung für die Probeneingabe eingeführt wird, um der zu untersuchenden Substanz in der Probe zu ermöglichen, in kompetitiver Weise in der Matrix mit einer spezifischen Bindungssubstanz oder einer Substanz, die mit der zu untersuchenden Substanz um die spezifische Bindungsubstanz kompetitiert, zu reagieren,

oder wobei eine Probe in die Matrix eingeführt wird, nachdem man der zu untersuchenden Substanz in der Probe ermöglicht hat, in einem äusseren Bereich der Matrix in einer kompetitiven Weise mit einer spezifischen Bindungssubstanz oder einer Substanz, die mit der zu untersuchenden Substanz um die spezifische Bindungssubstanz kompetitiert, zu reagieren,

wodurch Verteilungsveränderungen von mindestens einer, mit dem Oxidations- Reduktions-Enzym markierten molekularen Spezies in einem Komplex der spezifischen Bindungssubstanz und der zu untersuchenden Substanz, einem Komplex der spezifischen Bindungssubstanz und der Substanz, die mit der zu untersuchenden Substanz um die spezifische Bindungssubstanz kompetitiert, einer freien Form der spezifischen Bindungssubstanz und einer freien Form der Substanz, die mit der zu untersuchenden Substanz um die spezifische Bindungssubstanz kompetitiert, bewirkt werden,

und wobei die in Reaktion auf die Menge der zu untersuchenden Substanz in der Probe auftretenden Verteilungsveränderungen als eine Signalmodulation an der Elektrode nachgewiesen werden, die durch den Massentransfer des Elektronenvermittlers, der durch das Oxidations-Reduktionsenzym erzeugt wird, begrenzt ist.