DE68927283T2

DE68927283T2 - HCG-Peptide zur Verwendung in Antikörper-Reinigungsverfahren

Info

Publication number: DE68927283T2
Application number: DE68927283T
Authority: DE
Inventors: John B Bodner; Virender K Sarin
Original assignee: Abbott Laboratories
Current assignee: Abbott Laboratories
Priority date: 1988-07-20
Filing date: 1989-07-19
Publication date: 1997-04-24
Anticipated expiration: 2009-07-20
Also published as: US5451527A; EP0351804B1; KR910003092A; CA1341014C; JP3055063B2; DE68927283D1; AU634479B2; AU3825389A; ATE143669T1; ES2094725T3; JPH02111792A; JP2000159800A; JP3174041B2; EP0351804A3; EP0351804A2

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

1. Gebiet der Erfindung

Diese Erfindung bezieht sich auf Techniken zur Reinigung von Antikörpern. Insbesondere bezieht sich die Erfindung auf synthetische humane chorionische Gonadotropin (hCG) -Peptide zur Reinigung von polyklonalen anti- hCG-Antikörpern.

2. Beschreibung des Standes der Technik.

Zahlreiche analytische Verfahen und Geräte werden üblicherweise in Assays verwendet, um das Vorhandensein und/oder die Konzentration von Substanzen zu messen, die interessant sind, oder eine klinische Bedeutung haben, und welche in biologischen Flüssigkeiten oder anderen Materialien enthalten sein können. Diese Substanzen werden im allgemeinen "Analyte" genannt, und können Antikörper, Antigene, Medikamente, Hormone, usw. einschließen. Der Nachweis bestimmter Analyte in biologischen Flüssigkeiten wie Serum, Plasma, Urin, Rückenmarksflüssigkeit und ähnlichem ist in den letzten Jahren von kritischer Bedeutung geworden, sowohl in wissenschaftlichem wie auch in klinischem Rahmen. Der Nachweis bestimmter interssierender Analyte kann oft zu verschiedenen Stadien einer Krankheit zugeordnet werden und ist demzufolge besonders nützlich bei der Diagnose einer Krankheit und in der Überwachung der Effektivität einer Therapie. Wenn die Analyte, Antigene oder Antikörper sind, hängen die Assays üblicherweise von der immunologischen Reaktivität, die diese Substanzen charakterisiert, ab. Allgemein werden solche Assays zusammengenommen als Immunoassays bezeichnet.
Immunoassaytechniken verwenden die Mechanismen des Immunsystems höherer Organismen, wobei Antikörper als Antwort auf die Anwesenheit von Antigenen hergestellt werden, welche pathogen oder dem Organismus fremd sind. Einer oder mehrere Antikörper werden als Antwort auf ein bestimmtes Antigen hergestellt und sind in der Lage, mit einem bestimmten Antigen zu reagieren, wodurch ein hochspezifischer Reaktionsmechanismus geschaffen wird, welcher in vitro verwendet werden kann, um die Anwesenheit oder Konzentration dieses Antigens in einer biologischen Probe festzustellen. Beispielsweise beschreibt GB-A-2 091 740 die Verwendung zahlreicher synthetischer Peptide als Immunogene, um Antikörper gegen hCG zu züchten. Insbesondere wird die Verwendung der natürlichen Sequenzen 118-145, 110-145, 105-145 und 100-145 und verwandter längerer Sequenzen, um Antikörper zu züchten, offenbart.
Das Ergebnis eines Immunoassays, jedoch, kann abhängig von dem verwendeten Typ von Antikörper und der Spezifität des Antikörpers für das besondere Antigen variieren. In einem quantitativen Assay für hCG, kann der besondere anti- hCG-Antikörper, der verwendet wird, mit einem zweiten Glycoproteinantigen kreuzreagieren, wie beispielsweise mit humanem luteinisierendem Hormon (hLH), mit Follikel stimulierendem Hormon (FSH) oder mit thyreostimulierendem Hormon (TSH = thyroid stimulating hormone), wodurch die Genauigkeit des Assays abnimmt. Beispielsweise wird ein Antikörper der hCG erkennt und bindet, ebenfalls im allgemeinen an LH, FSH und TSH binden, anstatt spezifisch nur an hCG zu binden. Verfahren zur Reinigung von Antikörpern wurden entwickelt, um die Kreuzreaktivität zu minimieren. Für eine solche herkömmliche Methodik ist ein Verfahren typisch, welches eine zwei- Säulentechnik verwendet, das eine erste Affinitätssäule einschließt, die ein ganzes hCG-Molekül enthält, um eine spezifische Gruppe von IgG-Molekülen zu konzentrieren und eine zweite Affinitätssäule, die LH oder FSH enthält, mit der Zielsetzung, Antikörper zu entfernen, die mit hCG kreuzreagieren. Die polyklonalen hCG-Antikörper, die mit diesem konventionellen Verfahren erhalten werden, haben weiterhin eine signifikante Kreuzreaktivität Zusätzlich ist die zwei-Säulentechnik ein zeitraubendes und kostenintensives Verfahren.
Die chemische Analyse von Analyten, wie zum Beispiel hCG und hLH, hat gezeigt, daß die Kreuzreaktivität dieser Hormone, in deren α-Untereinheiten begründet ist, welche strukturell ähnlich sind. Daher wurden Versuche unternommen, die β-Untereinheit von hCG (β-hCG) abzutrennen und zu aufzureinigen, welche in ihrer Struktur im Vergleich zu hLH verhältnismäßig verschieden ist. Die Abtrennungstechniken jedoch, können immer noch zum Auftreten von Unsauberkeiten führen und zum Einschluß von Aminosäuresequenzen, die sowohl hCG als auch hLH gemeinsam sind.
Der Peptidabschnitt, der sich an den COOH-Ende von β-hCG befindet, besteht aus etwa 45 Aminosäuren. Es wurde nachgewiesen, das dieser Abschnitt eine deutliche Identifikation von hCG gegenüber hLH erlaubt (Matsuura et al, Endocrinology 104: 396, 1979). Iwasa und andere beschreiben die Herstellung einer synthetischen Peptidsequenz, welche einen spezifischen Abschnitt des COOH-terminalen Peptids (CTP) von β-hCG reproduziert, zum Einsatz bei der Herstellung eines anti- hCG Antikörpers (U.S. Patent 4 517 290). Die Aminosäuresequenz des CTP von β-hCG besteht aus 45 Aminosäuren, wie folgt:
Gly-Gly-Pro-Lys-Asp¹&sup0;&sup5;- His-Pro-Leu-Thr-Cys¹¹&sup0;-Asp-Asp-Pro-Arg-Phe¹¹&sup5;- Gln-AspP-Ser-Ser-Ser¹²&sup0;-Ser-Lys-Ala-Pro-Pro¹²&sup5;-Pro-Ser-Leu-Pro-Ser¹³&sup0;- Pro-Ser-Arg-Leu-Pro¹³&sup5;-Gly-Pro-Ser-Asp-Thr¹&sup4;&sup0;-Pro-Ile-Leu-Pro-Gln¹&sup4;&sup5;
wie dies von Morgan und anderen in Mol. Cell. Biochem. 2(1), 97- 99 (1973) beschrieben wird. Die synthetische Peptidsequenz, die von Iwasa beschrieben wurde, zur Reinigung polyklonaler Antikörper, enthält CTP-Fragmente oder -Untersequenzen, von 10 bis 23 Aminosäureresten, wie etwa:
Gly-Pro-Ser-Asp-Thr¹&sup4;&sup0;-Pro-Ile-leu-Pro-Gln¹&sup4;&sup5;
mit erhöhter Sequenzlänge, bis hin zu
Ala-Pro-Pro¹²&sup5;-Pro-Ser-Leu-Pro-Ser¹³&sup0;-Pro-Ser-Arg-Leu-Pro¹³&sup5;- Gly-Pro-Ser-Asp-Thr¹&sup4;&sup0;-Pro-Ile-Leu-Pro-Gln¹&sup4;&sup5;.
Nirgends im Stand der Technik, wie er oben beschrieben ist, wird der Einsatz von CTP-Sequenzen, die länger als 23 Aminosäurereste sind, beschrieben oder vorgeschlagen, um die Kreuzreaktivitätseigenschaften von Antikörpern zu vermindern.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Es wurde nun entdeckt, und die vorliegende Erfindung basiert auf dieser Entdeckung, daß bestimmte synthetische Aminosäuresequenzen vorteilhaft verwendet werden können, um hochspezifische anti-hCG-Antikörper zu erzeugen. Dementsprechend bezieht sich die vorliegende Erfindung auf ein Verfahren zur Reinigung eines anti-hCG-Antikörpers unter Verwendung von hCG-Analytenanaloga und auf die Herstellung der hCG-Analytenanaloga. Das Reinigungsverfahren schließt eine Affinitätsäule ein, die ein hCG-Analytenanalogon enthält, welches auf einem Träger oder Gerüst unlöslich gemacht wird, wobei das hCG-Analytenanalogon die folgende Peptidsequenz aufweist:
Asp¹¹²-Pro-Arg-Phe¹¹&sup5;-Gln-Asp-Ser-Ser-Ser¹²&sup0;-Ser-Lys-Ala-Pro-Pro¹²&sup5;- Pro-Ser-Leu-Pro-Ser¹³&sup0;-Pro-Ser-Arg-Leu-Pro¹³&sup5;-Gly-Pro-Ser-Asp-Thr¹&sup4;&sup0;- Pro-Ile-Leu-Pro-Gln¹&sup4;&sup5;.
Diejenigen anti-hCG-Antikörper, die ein Epitop mit der Peptidsequenz gemeinsam haben, werden spezifisch aus einer Flüssigkeit absorbiert, die anti-hCG-Antikörper enthält.
Andere geeignete hCG-analytanaloge Peptidsequenzen der vorliegenden Erfindung schließen Varianten des Peptids am C-Terminus ein, wie etwa:
Asx¹¹²-Pro-Arg-Phe¹¹&sup5;-Glx-Asx-Ser-Ser-Ser¹²&sup0;-Lys-Ala-Pro-Pro-Pro¹²&sup5;- Ser-Leu-Pro-Ser-Pro¹³&sup0;-Ser-Arg-Leu-Pro-Gly¹³&sup5;-Pro-Pro-Asx-Thr-Pro¹&sup4;&sup0;- Ile-Leu-Pro-Glx-Ser¹&sup4;&sup5;-Leu-Pro.
wobei Asx gleich Asp oder Asn sein kann, und wobei Glx gleich Gln oder Glu sein kann. Weitere geeignete Peptidsequenzen der vorliegenden Erfindung können ebenfalls einen oder mehrere terminale Lys-Reste umfassen, um die Immobilisation des Peptids auf dem Träger zu vereinfachen, zum Einsatz in der Affinitätssäule. Beispielsweise kann die hCG-analytenanaloge Peptidsequenz folgendes umfassen:
Asx¹¹²-Pro-Arg-Phe¹¹&sup5;-Glx-Asx-Ser-Ser-Ser¹²&sup0;-Lys-Ala-Pro-Pro-Pro¹²&sup5;- Ser-Leu-Pro-Ser-Pro¹³&sup0;-Ser-Arg-Leu-Pro-Gly¹³&sup5;-Pro-Pro-Asx-Thr-Pro¹&sup4;&sup0;- Ile-Leu-Pro-Glx-Ser¹&sup4;&sup5;-Leu-Pro
wobei Asx gleich Asp ist und Glx gleich Gln ist, und wobei die Peptidsequenz mindestens einen terminalen Lys-Rest umfaßt.
Die anti-hCG-Antikörper, die gemäß der vorliegenden Erfindung hergestellt sind, können vorteilhaft in Assays verwendet werden, wie dies folgend genauer beschrieben ist.

DETAILLIERE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung liefert ein Verfahren zur Reinigung von anti-hCG-Antikörpern unter Verwendung von hCG-Analytenanaloga. Das beanspruchte Verfahren ermöglicht die Herstellung eines gereinigten polyklonalen anti- hCG-Antikörpers, der eine Spezifität besitzt, die vergleichbar ist mit der eines monoklonalen anti-hCG-Antikörpers. Das Verfahren der Erfindung ist sehr vorteilhaft in Bezug auf Zeitersparnisse und niedrigere Produktionskosten, im Vergleich zu dem konventionellen Verfahren, das oben beschrieben wurde.
Die folgenden Ausdrücke, die hierin verwendet werden, haben die folgende Bedeutung:
Der Ausdruck "Determinanten" bezieht sich auf jene Regionen des Analyten oder anderer spezifisch bindender Glieder, der/die eingehend in die spezifischen Bindungsreaktionen mit einbezogen ist/sind, die für die immunoreaktive Bindung von Antigenen und Antikörpern typisch sind. Im wesentlichen sind es die Determinaten, in denen sich die Antigene unterscheiden, und daher, auf der Basis der immunologischen Spezifität, auch die Antikörper voneinander.
Der Ausdruck "Analytenanalogon" bezieht sich auf ein Molekül, das im wesentlichen die gleiche räumliche und polare Anordnung besitzt, wie eine oder mehrere Determinanten des Analyts, der gerade interessiert. Diese Duplikation der Determinanten erlaubt dem Analytenanalogon die spezifischen Bindungscharakteristika des Analyts nachzuahmen. Daher kann das Analytenanalogon an ein analytspezifisches bindendes Glied binden. Zusätzlich kann das Analytenanalogon verändert werden, so daß es -obwohl es nicht mit dem Analyten identisch ist- die notwendige(n) Determinante(n) enthalt, um an das analytspezifische bindende Glied zu binden.
Der Ausdruck "spezifisch bindendes Glied" bezieht sich auf ein Glied eines spezifischen Bindungspaares, zum Beispiel auf zwei unterschiedliche Moleküle, wobei eines der Moleküle durch chemische oder physische Mittel spezifisch an das zweite Molekül anbindet. Immunoreaktive spezifisch bindende Glieder schließen Antigene, Haptene, Antikörper und Komplexe daraus ein, einschließlich jener, die durch rekombinante DNA- Verfahren oder Peptidsynthese gebildet werden. Ein Antikörper kann ein monoklonaler oder polyklonaler Antikörper sein, ein rekombinantes Protein oder eine Mischüng(en) oder Fragment(e) daraus, oder auch eine Mischung eines Antikörpers und anderer spezifisch bindender Glieder. Die Details der Herstellung solcher Antikörper und deren Eignung zum Einsatz als spezifisch bindende Glieder sind jenen, die sich im Fachgebiet auskennen, wohlbekannt.
Der Ausdruck "Marker" bezieht sich auf jede Substanz, die an ein spezifisch bindendes Glied angebunden ist, und welche in der Lage ist, ein Signal zu erzeugen, das mit visuellen oder instrumentellen Mitteln meßbar ist. Verschiedene geeignete Marker zum Einsatz in der vorliegenden Erfindung können folgendes einschließen: Chromogene; Katalysatoren; fluoreszente Verbindungen; chemilumineszehte Verbindungen; radioaktive Marker; direkte visuelle Marker, einschließlich kolloidaler metallischer und nicht-metallischer Partikel, Farbstoffpartikel, Enzyme oder Substrate, oder organische Polymerlatexpartikel; Liposome oder andere Vesikel, die signalerzeugende Substanzen enthalten, und ähnliches.
Eine große Zahl von Enzymen, die geeignet sind zur Verwendung als Marker, sind in dem U. S. Patent Nr. 4 275 149, Spalten 19-23, beschrieben, das hiermit durch Bezugnahme in die Anmeldung aufgenommen wird. Ein weiteres Beispiel eines Enzym/Substrat-signalerzeugenden Systems, das nützlich ist in der vorliegenden Erfindung, ist das Enzym alkalische Phosphatase und das Substrat Nitroblautetrazolium-5brom-4-chlor-3-indolylphosphat oder ein Derivativ oder Analogon davon.
In einem anderen signalerzeugenden System kann der Marker eine fluoreszente Verbindung sein, wo keine enzymatische Veränderung des Markers benötigt wird, um ein meßbares Signal zu liefern. Fluoreszente Moleküle wie Fluorescein, Phycobiliprotein, Rhodamin und deren Derivate und Analoga sind geeignet zur Verwendung als Marker in dieser Reaktion.
Auch eine visuell wahmembare gefärbte Partikel kann verwendet werden als Markerkomponente der Indikatorreagenzes, und dadurch wird ein direkte Farbablesung der Anwesenheit oder Konzentration des Analyten in der Probe ermöglicht, ohne Bedarf an weiteren signalerzeugenden Reagenzien. Materialien zum Einsatz als gefärbte Partikel sind kolloidale Metalle, wie etwa Gold und Farbstoffpartikel, wie in den U.S. Patenten Nr. 4 313 734 und 4 373 932 beschrieben. Die Herstellung und der Einsatz von nicht-metallischen Kolloiden, so ie kolloidalen Selenpartikeln, ist inder U. S. Patentanmeldung mit der Seriennummer 072 084, angemeldet am 9. Juli, 1987, beschrieben, welche hiermit durch Bezugnahme in die Anmeldung aufgenommen wird. Der Einsatz kolloidaler Partikelmarker in der Immunochromatographie, ist in der U.S. Patentanmeldung mit der Seriennummer 072 459 beschreiben, die am 13. Juli 1987 angemeldet wurde, und organische Polymerlatexpartikel zum Einsatz als Marker sind in der U.S. Patentanmeldung mit der Seriennummer 248 858 beschrieben, die am 23. September 1988 angemeldet wurde, und die beide hiermit durch Bezugnahme in die Anmeldung aufgenommen werden.
Der Ausdruck "Indikatorreagenz" bezieht sich auf einen Marker, der an ein spezifisch bindendes Glied angebunden ist. Das Indikatorreagenz erzeugt ein meßbares Signal, bei einem pegel, der zu der Menge des Analyten in der Testprobe in Beziehung steht. Im allgemeinen wird das Indikatorreagenz nachgewiesen oder gemessen, sobald es auf einem Festphasenmaterial eingefangen ist, aber ungebundenes Indikatorreagenz kann ebenfalls gemessen werden, um das Ergebnis eines Assays festzulegen.
Das spezifisch bindende Glied des Indikatorreagenzes ist in der Lage, entweder an den Analyten zu binden, wie in einem Sandwichassay, oder an das Fangreagenz, wie in einem kompetitiven Assay, oder an ein spezifisch bindendes Hilfsglied, wie in einem indirekten Assay. Der Marker, wie oben beschrieben, erlaubt, daß das Indikatorreagenz ein meßbares Signal erzeugt, das zu der Menge an Analyt in der Testprobe in Beziehung steht. Die spezifisch-bindendes-Glied-Komponente des Indikatorreagenzes ermöglicht die indirekte Bindung des Markers an den Analyten, an ein spezifisch bindendes Hilfsglied, oder an das Fangreagenz. Die Wahl eines bestimmten Markers ist nicht kritisch, aber der Marker muß in der Lage sein, ein meßbares Signal zu liefern, entweder von selbst, etwa als visuell meßbares Signal, das durch gefärbte organische Polymerlatexpartikel erzeugt wird, oder in Verbindung mit einem oder mehreren zusätzlichen signalerzeugenden Komponenten, so wie ein Enzym/Substrat-signalerzeugendes System. Eine Vielzahl von unterschiedlichen Indikatorreagenzien kann gebildet werden, indem entweder der Marker oder das spezifisch bindende Glied variiert werden; für den Fachmann ist hier bei offensichtlich, daß die Auswahl die Betrachtung des nachzuweisenden Analyten und des gewunschten Nachweismittels umfaßt.
Der Ausdruck "Fangreagenz" bezieht sich auf ein nicht-markiertes spezifisch bindendes Glied, das üblicherweise, aber nicht in jedem Fall, an eine feste Phase gebunden ist. Die Anbindung der Komponenten ist im wesentlichen nicht reversibel und kann kovalente Mechanismen einschließen. Das Fangreagenz wird verwendet, um die Beobachtung des meßbaren Signals zu erleichtern, indem der Analyt und/oder das Indikatorreagenz von den anderen Reagenzien des Assays und der übrigen Testprobe abgetrennt werden. Das spezifisch bindende Glied des Fangreagenzes kann entweder für den Analyten -wie in einem Sandwichassay-, für das Indikatorreagenz oder den Analyten -wie bei einem kompetitiven Assay-, oder für ein spezifisch bindendes Hilfsglied, das seinerseits für den Analyten spezifisch ist,-wie in einem indirekten Assay- spezifisch sein.
Der Ausdruck "spezifisch bindendes Hilfsglied" bezeichnet jedwedes Glied eines spezifischen Bindungspaares, welches in dem Assay zusätzlich zu den spezifisch bindenden Gliedern des Fangreagenzes und des Indikatorreagenzes verwendet wird. Beispielsweise kann in einem indirekten Assay ein spezifisch bindendes Glied den Analyten wie auch ein zweites spezifisch bindendes Hilfsglied binden, an das der Analyt selber nicht zu binden vermag, oder in einem Inhibitionsassay kann das spezifisch bindende Hilfsglied ein Bezugsbindungsglied sein, wie unten beschrieben. Eines oder mehrere spezifisch bindende Glieder können in einem Assay verwendet werden.
Der Ausdruck "feste Phase" bezieht sich auf jedes Material, welches unlöslich ist, oder welches durch eine nachfolgende Reaktion unlöslich gemacht werden kann. Eine Assayvorrichtung der vorliegenden Erfindung kann mehrere Konfiguratiqnen besitzen, wobei einige davon abhängen, welches Material als feste Phase gewählt wird. Beispielsweise kann die feste Phase jedes geeignete poröse Material umfassen. Mit "porös" ist gemeint, daß das Material eines ist, durch welches Flüssigkeiten fließen und leicht hindurchtreten können. Bei der vorliegenden Erfindung kann die feste Phase ein Fiberglas-, Zellulose- oder Nylonkissen zum Einsatz in einer Gieß- und Durchflußassayvorrichtung sein, die eine oder mehrere Schichten besitzt, die eines oder mehrere der Assayreagenzien enthalten; ein Eintauchstreifen für einen Eintauch- und Ableseassay; ein Teststreifen, der sich vollsaugt, (z.B. Papier) oder oder für dünnschichtchromographische (z.B. Nitrozellulose Techniken; oder ein anderes poröses Material, das dem Fachmann bekannt ist. Die feste Phase ist jedoch nicht auf poröse Materialien beschränkt. Die feste Phase kann ebenfalls polymere oder Glaskügelchen, Mikropartikel, Reagenzgläser, Blätter, Platten, Objektträger, Reaktionsvertiefungen, Bänder, Teströhrchen oder ähnliches oder jedes andere Material umfassen, das eine intrinsische Ladung hat, oder welches eine geladene Substanz zurückhalten kann.
Die folgenden Abkürzungen werden in der Beschreibung der Erfindung verwendet:

Allgemeine Verfahren und Materialien

Synthetische Pedtide

Die vorliegende Erfindung schließt chemisch synthetisierte CTP-Fragemente ein, z.B. Analyten- Analoga zur Reinigung von anti-hCG-Abtikörpern. In einer bevorzugten Ausführung schließt ein solches Fragment die folgende Aminosäuresequenz ein: Asp¹¹²-Pro-Arg-Phe¹¹&sup5;-Gln-Asp-Ser-Ser-Ser¹²&sup0;-Ser-Lys-Ala-Pro-Pro¹²&sup5;- Pro-Ser-Leu-Pro-Ser¹³&sup0;-Pro-Ser-Arg-Leu-Pro¹³&sup5;-Gly-Pro-Ser-Asp-Thr¹&sup4;&sup0;- Pro-Ile-Leu-Pro-Gln¹&sup4;&sup5;.
Solch eine Sequenz wird beschrieben von Morgan et al. in Mol. Cell. Biochem. 2(1), 97-99 (1973), wobei diese Offenbarung hiermit durch Bezugnahme in die Anmeldung aufgenommen wird. Der Einschluß der 112-122er Peptidregion in einem synthetisiertem Fragment der vorliegenden Erfindung liefert, wie herausgefunden wurde, zumindest eine, und möglicherweise drei zusätzliche Determinanten, welche zusätzlich und vorteilhafterweise dieses hCG-Analytenanalogon von anderen Glycoproteinen oder anderen CTP-Peptidsequenzen unterscheiden. Desweiteren kann in einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ein Analytenanalogon der vorliegenden Erfindung einen oder mehrere Lys-Reste an beiden Enden der Sequenz umfassen. Es wurde herausgefunden, daß der Zusatz der Lys-Reste das Unlöslichmachen des Peptids für die Durchführung der Säulenchromatographie vereinfacht. Beispielsweise wurde gemäß der Erfindung eine Peptidsequenz, die das CTP-112-145-Analytenanalogon enthält, mit fünf zusätzlichen Lysinresten synthetisiert und an einen Harzträger gebunden, um eine Affinitätssäule zur Reinigung von anti-hCG-Antikörpern auszubilden. Es wurde herausgefunden, daß der Zusatz der Polylysineinheit am COOH-Terminus des CTP-Analytenanalogons die Kupplung des Analytenanalogons an den Träger (z.B., Affigel-10) in einer Affinitätssäule erleichtert, ohne die Leistung des Antikörpers nachteilig zu beeinflussen (72-78% Kupplungsausbeute).
In einer weiteren Ausführungsform umfaßt ein Analytenanalogon der vorliegenden Erfindung, eine Variante der CTP-Sequenz, die wie folgt abgeändert ist:
Asx¹¹²-Pro-Arg-Phe¹¹&sup5;-Glx-Asx-Ser-Ser-Ser¹²&sup0;-Lys-Ala-Pro-Pro-Pro¹²&sup5;- Ser-Leu-Pro-Ser-Pro¹³&sup0;-Ser-Arg-Leu-Pro-Gly¹³&sup5;-Pro-Pro-Asx-Thr-Pro¹&sup4;&sup0;- Ile-Leu-Pro-Glx-Ser¹&sup4;&sup5;-Leu-Pro.
Eine solche Sequenz wurde von Bahl et al. in Biochemical and Biophysical Research Communications, 48(2), 416-422 (1972) beschrieben, wobei diese Offenbarung hiermit durch Bezugnahme in die Anmeldung aufgenommen wird. Diese CTP-Variante unterscheidet sich von der oben beschriebenen ersten Ausführungsform insofern als daß ein Ser-Aminosäurerest in der Position 120 gelöscht ist, als daß ein Pro ein Ser in der 138iger-Position ersetzt, und als daß eine -Ser-Leu-Pro-Gruppe der Sequenz hinzugefügt wird. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist Asx gleich Asp, Glx ist gleich Gln, und das Analytenanalogon schließt den Zusatz von einem oder mehreren Lys-Resten an jedem Ende der Sequenz ein.
Die Synthese von Peptidsequenzdeterminanten durch Peptidaufbau oder andere chemische Prozesse sind nicht die einzige Art und Weise, in der die vorliegende Erfindung durchgeführt werden kann. Alternative Verfahren können für den einzelnen Durchführenden vorteilhafter sein, basierend auf seiner oder ihrer Erfahrung, den verfügbaren Materialien und der Art der Determinante, die kopiert werden soll. Beispielsweise können rekombinante DNA-Techniken verwendet werden, um die für die Bindung notwendige Determinante zu rekonstruieren.
Alternativ können die notwendigen Analytenanalogon-Determinanten hergestellt werden, indem der Analyt in kleinere Stücke oder Fragmente "zerteilt" oder "aufgeschlossen" wird. Diese Fragmente können beispielsweise hergestellt werden, unter zu Hilfenahme mechanischer Mitteln wie wie der Beschallung, mit chemischen Mitteln oder durch enzymatische Mittel. Das resultierende fragmentierte Analytenmaterial kann durch eine Affinitätschromatographiesäule geleitet werden, an welcher ein geeigneter Antikörper immobilisiert ist, an dem die anigenischen Determinanten andocken können. Danach können die Analytenanaloga von der Säule mit geeigneten Lösungsmitteln eluiert werden.

Antikörperreinigung

Die Antikörper wurden hergestellt, indem in Ziegen eine Antwort auf ein Immunogen induziert wurde. Die Imunogene wurden den Tieren in einer Reihe von Inokulationen auf dem Fachmann gut bekannte Weise verabreicht, und es ist offensichtlich, daß obwohl Ziegen die immunologischen Empfänger waren, die bei den hier beschriebenen Experimenten verwendet wurden, jeder in vivo oder in vitro Empfänger verwendet werden kann, der in der Lage ist, Antikörper auf die Immunogene zu erzeugen. Die anti-hCG-Antikörper können gezüchtet werden, indem ganze hCG-Moleküle als Immunogen verwendet werden, oder durch Verwendung eines hCG-Analytenanalogons, wie etwa einer synthetischen β-Untereinheit oder einer C-Terminuspeptidsequenz der vorliegenden Erfindung als Immunogen.
Die Antikörper, die gegen die β-Untereinheit des hCG-Moleküls erzeugt worden waren, wurden dann durch eine Affinitätssäule geleitet, in welcher entweder ein CTP-Peptid oder eine CTP-Variante der vorliegenden Erfindung immobilisiert war. Nach dem Waschen der Säule, wurden die Antikörper, die spezifisch für die CTP-Determinante waren, von der Säule eluiert. Diese polyklonalen Antikörper, die gemäß der Erfindung erzeugt worden waren, hatten, wie herausgefunden wurde, eine vernachlässigbare Kreuzreaktivität mit hLH und können vorteilhafterweise in Immunoassays verwendet werden, wie in heterogenen Sandwichimmunoassays zur Messung von ganzen hCG- Molekülen, im Vergleich mit konventionell hergestellten Antikörpern. Bei der Verwendung können die resultierenden gereinigten Antikörper an eine geeignete funktionelle Gruppe gekoppelt werden, beispielsweise an einen Marker oder eine feste Phase, um ein Indikatorreagenz oder ein Fangreagenz zum Einsatz in dem Immunoassay herzustellen. Die genauen Bedingungen des Gebrauchs werden durch den routinierten Anwender festgelegt, basierend auf dem Typ des besonderen Assays und seinen einzigartigen Erfordernissen.
Es wurde herausgefunden, daß der Einsatz der bevorzugten CTP-Variante der Erfindung die Erzeugung eines sehr reproduzierbaren Einschritt-Affinitätssäulenchromatographieverfahrens ermöglicht, zur Reinigung von hochspezifischen polyklonalen Antikörpern, die die β-Untereinheit des hCG-Analyten erkennen, die aber nicht mit hLH reagieren, wodurch die Spezifität eines Assays erhöht wird, wenn solche Antikörper darin verwendet werden. Zusätzlich wurde herausgefunden, daß die polyklonalen Antikörper, die mit Hilfe der CTP-Variante gemäß der Erfindung gereinigt wurden, die Sensitivität des Assays bei Einsatz des CTP-Peptids vergleichsweise erhöhen.
Andere Vorteile der vorliegenden Erfindung schließen die Leichtigkeit ein, mit der eine Peptidaffinitätssäule unter Verwendung des Analytenanalogons hergestellt werden kann, und die Leichtigkeit, mit der spezifische Antikörper erzeugt werden können, unter Einsatz einer solchen Säule im Vergleich mit konventionellen Verfahren. So kann gemäß der vorliegenden Erfindung eine Affinitätssäule hergestellt werden, die den Bedarf an der zweifachen Vollmolekül-hCG- und hLH-Affinitätssäule nach dem Stand der Technik eliminiert, und eine solche Säule erzeugt, wie herausgefunden wurde, eine Antikörpergesamtheit, die praktisch keine Kreuzreaktivität mit hLH zeigt. Weiterhin ist das Verfahren schnell, zuverlässig, reproduzierbar, und kosteneffektiv. Zusätzlich wurde herausgefunden, daß polyklonale Antikörper, die gemäß der vorliegenden Erfindung gereinigt wurden, eine Spezifität besitzen, die sich der derkonventionell verwendeten monoklonalen anti-hCG-Antikörpern annähert. Dieses überraschende Resultat kann der limitierten Anzahl von Epitopen, die auf dem CTP vorhanden sind, zugeschrieben werden (Bidart et al., J. Immuno. 134:457, 1985, dessen Offenbarung durch Bezugnahme hiermit in die Anmeldung aufgenommen wird).
Die Analytenanaloga, die von der vorliegenden Erfindung geliefert werden, können auch verwendet werden, um Immunogene zum Züchten von für die analytenanalogen Determinanten spezifische Antikörper zu erzeugen. Solche Immunogene wurden hergestellt, indem das Analytenanalogon an ein Trägerprotein gebunden wurde, wie etwa Hemocyanin oder Rinderserumalbumin (BSA). Beispielsweise kann ein solches Immunogen ein Trägerprotein umfassen, das an die β-Untereinheit von hCG gekoppelt ist oder ein Trägerprotein, das an die CTP- Sequenz oder einen Teil oder eine Variante davon gekoppelt ist. Das Peptide und der Träger können durch eine Reihe von Linkergruppen verknüpft sein, einschließlich Carbamat-, Amido-, Amino-, Thioether- oder Ethergruppen.
Die folgenden Beispiele beschreiben im Detail bevorzugte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung und sollen als illustrativ verstanden werden und nicht als einschränkend.
Beispiel 1 bezieht sich nicht auf die Synthese eines Peptides gemäß der vorliegenden Erfindung sondern zeigt stattdessen Vorschriften, die bei den folgenden Beispielen verwendet werden, um Peptide gemäß der vorliegenden Erfindung herzustellen.

Beispiel 1

Ein Herpes-Peptidanalytenanalogon, welches nicht ein Peptid gemäß der Erfindung ist, wurde hergestellt, um Vorschriften zu veranschaulichen, die in den folgenden Beispielen verwendet werden.
Ein Herpes-Peptidanalytenanalogon wurde hergestellt, das den Aminosäuren 290-300 des Herpes Simplex Virus Typ I Glycoprotein D (HSIGD) entspricht, das in der Region zwischen den Basenpaaren 1108-1140 (Watson, R. J. et al., Science. 218: 381-384 (1982), wie folgt codiert ist. Die Peptidsequenz für das Analytenanalogon ist unten gezeigt:
Gln-Pro-Glu-Leu-Ala-Pro-Glu-Asp-Pro-Glu-Asp-Gly
Die Aminosäure Glycin wurde an den C-Terminus des Peptids angebunden, um als Linker zwischen dem Peptid und dem Harzträger zu fungieren.
Boc-Gly-OCH&sub2;-Pam-Harz wurde synthetisiert gemäß dem folgenden Verfahren, beschrieben durch Mitchell, A. R. et al., J. Org. Chem., 43: 2845-3852 (1978) und Mitchell, A. R. et al., J. Am. Chem. Soc., 98: 7357-7362 (1976). Aminomethyl- Harz (2,36g, 0,25 mmol/g) wurde in ein Reaktionsgefäß eingebracht und es wurde in Methylenchlorid (CH&sub2;Cl&sub2;) 30 Minuten gequollen. Es wurde dann an Boc-Gly-OCH&sub2; C&sub6;H&sub4;CH&sub2;CO&sub2;H (0,89mmol) in Methylenchlorid durch den Zusastz von Dicyclohexylcarbodiimid (DCC, 0,89mmol) gekopplet.
Geschützte Aminosäuren wurden an den Harzträger schrittweise im Sinne der Chemie vorgeformter symmetrische Anhydride gekopplet, außer in den Fällen von Asparaginsäure und Glutamin. Alle Amino-terminalen Reste wurden durch t-Butyloxycarbonyl (t-BOC) geschützt und die Seitenketten der verschiedenen Aminosäurereste wurden durch die folgenden Gruppen geschützt: Asp durch Cyclohexyl (OChxl) und Glu durch Benzyl (Obzl). Die folgende Kupplungsvorschrift wurde für die Aminosäuren Glu, Pro, Leu, Ala verwendet.
1) CH&sub2;Cl&sub2; wurde hinzugefügt, eine Minute lang geschüttelt und gefiltert (der Prozess wurde sechs Mal wiederholt, zum Beispiel sechs Mal eine Minute);
2) 50%ige Trifluoressigsäure (TFA)/CH&sub2;Cl&sub2;, 1 × 1 Minute;
3) 50% TFA/CH&sub2;Cl&sub2;, 1 × 20 Minuten;
4) CH&sub2;Cl&sub2;, 6 × 1 Minute;
5) 5% Diethylamin (DIEA)/CH&sub2;Cl&sub2;, 2 × 2 Minuten;
6) CH&sub2;Cl&sub2;, 3 × 1 Minute; und
7) geschützte Aminosäure, acht Äquivalente wurden in Methylenchlorid gelöst, und auf 0º C gekühlt. Zu dieser Lösung wurde N-N-Dicyclohexylcarbodiimid (DCC) hinzugefügt (vier Äquivalente in Methylenchlorid). Nach zehnminütigem Umrühren bei 0º C wurde die Lösung gefiltert. Eine abschließende Aufkonzentration dieses symetrischen Anhydrids ( 0,05M bis 0,1M) wurde dem Reaktionsgefäß, das das Harz enthielt, hinzugefügt. Das Gefäß wurde zwei Stunden lang bei Raumtemperatur geschüttelt und gefiltert.
8) CH&sub2;Cl&sub2;, 3 × 1 Minute;
9) 5% DIEA/CH&sub2;Cl&sub2;, 1 × 2 Minuten; und
10) CH&sub2;Cl&sub2;, 3 × 1 Minute; und dann
11) wurde entweder Schritt 7 wiederholt oder 1-Hydroxybenzotriazol (HOBT vier Äquivalente) in Dimethylformamid (DMF) gelöst und auf 0º C gekühlt. Zu dieser Lösung wurde DCC (vier Äquivalente) in CH&sub2;Cl&sub2; hinzugefügt, gefolgt von dem Zusatz von geschützter Aminosäure (vier Äquivalente) in DMF: CH&sub2;Cl&sub2; (1:1). Dieses Reaktionsgemisch wurde zehn Minuten lang bei 0º C gerührt. Dann wurde das Reaktionsgemisch in das Reaktionsgefäß, das Harz enthielt, überführt, und zwei Stunden lang bei Raumtemperatur geschüttelt.
12) CH&sub2;Cl&sub2;:DMF (1:1), 3 × 1 Minute; und
13) CH&sub2;Cl&sub2;, 3 × 1 Minute.
Die Vollständigkeit der Reaktion wurde durch einen quanititativen Ninhydrintest wie von Sann, V.K. et al., Analytical Biochemistry, 117: 147-157 (1981) beschrieben, überwacht.
Für die geschützte Aminosäure Asp, waren die Schritte 1 bis 6 die selben, wie oben beschrieben, und danach folgte folgendes:
7) geschützte Aminosäure (vier Äquivalente) in Methylenchlorid wurde dem Reaktionsgefäß mit DCC (vier Äquivalente) in Methylenchlorid hinzugefügt und bei Raumtemperatur 24-72 Stunden geschüttelt; und
8) CH&sub2;Cl&sub2;, 6 × 1 Minute.
Die Vollständigkeit der Reaktion wurde durch eine quantitative Ninhydrinanalyse überwacht.
Für Glutamin wurde eine DCC/HOBT Kupplungsvorschrift verwendet, wie beschrieben von Konig und Geiger, Chem. Ber. 103: 788-798 (1970).
Das vollkommen geschützte Peptid-Harz (1g) ließ man fünf Minuten lang in Methylenchlorid quellen, und die N-alpha-BOC-Schutzgruppe wurde entfernt, gemäß der folgenden Vorschrift:
1) CH&sub2;Cl&sub2;, 6 × 1 Minute;
2) 50% TFA/CH&sub2;Cl&sub2;, 1 × 1 Minute;
3) 50% TFA/CH&sub2;Cl&sub2;, 1 × 20 Minuten;
4) CH&sub2;Cl&sub2;, 6 × 1 Minute,
5) 5% DIEA/CH&sub2;Cl&sub2;, 1 × 3 Minuten;
6) CH&sub2;Cl&sub2;, 4 × 1 Minute; und
7) das Harz wurde dann getrocknet.
Das Peptid-Harz wurde auf zwei separate Reaktionsgefäße aufgeteilt und 60 Minuten lang bei 0º C mit wasserfreier Fluorwasserstoffsäure (13,5ml), zu welcher p-Cresol (1,5ml) hinzugefügt worden war, behandelt. Die Fluorwasserstoffsäure wurde in Vakuo bei 0º C abdestilliert. Das gespaltene freie Peptid und das Harz wurden vier Mal mit Diethylether (10ml Anteile) gewaschen, und das Peptid wurde extrahiert, bei drei Extraktionen mit jeweils 10%iger und 20%iger wässeriger Essigsäure. Die wässerigen Extrakte wurden vereinigt und drei Mal jeweils mit 10 Milliliter Anteilen von Diethylether und Ethylacetat gewaschen. Die wässerige Schicht wurde dann gefriergetrocknet, um ein weißes flockiges Peptid zu liefern. Das Polypeptid wurde durch Umgekehphasen- Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) gemäß den Standardvorschriften, wie beschrieben Rivier, et al., Journal of Chromatography, 288: 303-328 (1984) gereinigt, wobei diese Offenbarung durch Bezugnahme hiermit in die Anmeldung aufgenommen wird. Die Zusammensetzung des gereinigten Peptids wurde durch Hydrolyse in 6 N Chlorwasserstoffsäure (HCl), im Vakuum bei 110º C, 24 Stunden lang, bestätigt und wurde danach mit einem Aminosäureanalysator analysiert.

Beispiel 2

Synthese von β-hCG C-Terminuspeptiden

Ein hCG-Analytenanalogon, entsprechend dem CTP 112-145 von β-hCG wurde gemäß der vorliegenden Erfindung wie folgt hergestellt. Die Peptidsequenz ist unten dargestellt: Asp¹¹²-Pro-Arg-Phe¹¹&sup5;-Gln-Asp-Ser-Ser.Ser¹²&sup0;-Ser-Lys-Ala-Pro-Pro¹²&sup5;- Pro-Ser-Leu-Pro-Ser¹³&sup0;-Pro-Ser-Arg-Leu-Pro¹³&sup5;-Gly-Pro-Ser-Asp.Thr¹&sup4;&sup0;- Pro-Ile-Leu-Pro-Gln¹&sup4;&sup5;
Das Analytenanalogon wurde auf einem Harzträger durch schrittweise Festphasensynthese, beginnend mit dem Carboxy-terminalen Rest, hergestellt. Im wesentlichen wurde das Verfahren, das von Barany und Merrifield, in The Pedtides, 2: 1984, Gross, E. und Meinehofer, J. eds, Academic Press, New York, N.Y. (1980) beschrieben ist, für diese Synthese verwendet. Ein BOC-L-Gln-OCH&sub2;-Harz wurde in das Reaktionsgefäß eines Beckman Synthezisers, Model 900 eingebracht. Geschützte Aminosäuren wurden in einer schrittweise an den Harzträger angebunden, im wesentlichen gemäß der in Beispiel 1 beschriebenen Chemie. Die Aminosäure Leu in den Positionen 128 und 134 wurde doppelt gekuppelt um die Vollständigkeit der Kupplungsreaktion sicherzustellen. Nach dem Einbau von Pro an der Position 126 wurden alle folgenden Aminosäuren doppelt gekoppelt.
Das vollständige Peptid wurde von dem vollständig geschützten Peptid-Harz mit wasserfreier Fluorwasserstoffsäure gemäß der Vorschrift nach Beispiel 1 abgespalten. Das rohe Peptid wurde unter Einsatz von Umgekehrphasen-HPLC an einer C&sub4;-Säule (10mm × 25cm) mit einer Flußrate von drei ml/Min. und unter dem Einsatz von Gradienten von 0,1%iger TFA/H&sub2;O (A) und 100% Acetonitril (B) als Lösungssysteme gereinigt. Der verwendete Gradient war 10% B bis 35% B über eine Periode von dreißig Minuten.
Die Polypeptideluierung von der HPLC- Säule wurde bei 225nm und 280nm überprüft. Die Zusammensetzung des gereinigten Peptids wurde wie in Beispiel 1 beschrieben bestätigt.

Beispiel 3

Synthese von β-hCG-Polylysin-C-Terminuspeptiden

Ein Polylysin-Analytenanalogon, das fünf zusätzliche Lysinreste, welche am C-Terminus angebunden sind, umfaßt, das als Polylysin-CTP bezeichnet wird, wurde hergestellt gemäß der Erfindung unter Einsatz des folgenden Verfahrens. Die zusätzlichen Lysine erleichterten die Herstellung eines Peptidimmunosorbens zum Einsatz in einer Affinitatssäule, um anti-hCG-Antikörper zu reinigen. Die zusätzliche(n) Aminosäure(n) können zu jedem Ende der Pepidsequenz hinzugefügt werden, zum Beispiel:
Asp¹¹²-Pro-Arg-Phe¹¹&sup5;-Gln-Asp-Ser-Ser-Ser¹²&sup0;-Ser-Lys-Ala-Pro-Pro¹²&sup5;- Pro-Ser-Leu-Pro-Ser¹³&sup0;-Pro-Ser-Arg-Leu-Pro¹³&sup5;-Gly-Pro-Ser-Asp-Thr¹&sup4;&sup0;- Pro-Ile-Leu-Pro-Gln¹&sup4;&sup5;-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys
Das Peptid wurde aufgebaut, abgetrennt und gereinigt, wie zuvor beschrieben, außer daß es auf einem Applied Biosystems Synthesizer, Model 430A synthetisiert wurde. Ein Boc-L-Lys (2 Cl-Z)-OCH&sub2;-Pam-Harz wurde in ein Reaktionsgefäß überführt, und geschütze Aminosäuren wurden schrittweise an den Harzträger gekoppelt, im Sinne der Chemie vorgeformter symmetrische Anhydride (außer in dem Fall der Arginin- und Glutaminzugabe, bei denen eine DCC/HOBT-Kupplungsvorschrift verwendet wurde). Das voll geschützte Peptid-Harz wurde mit wasserfreier Fluorwasserstoffsäure behandelt, gefolgt von einer Extraktion und Reinigung der Peptide, wie zuvor beschrieben.

Beispiel 4

Synthese einer Polylysin-CTP-Variante

Ein Polylysin-CTP-Varianten- Analytenanalogon, gemäß der Erfindung wurde hergestellt, welches die folgende Sequenz aufweist:
Asx¹¹²-Pro-Arg-Phe¹¹&sup5;-Glx-Asx-/Ser-Ser-Ser¹²&sup0;-Lys-Ala-Pro-Pro-Pro¹²&sup5;- Ser-Leu-Pro-Ser-Pro¹³&sup0;-Ser-Arg-Leu-Pro-Gly¹³&sup5;-Pro-Pro-Asx-Thr-Pro¹&sup4;&sup0;- Ile-Leu-Pro-Glx-Ser¹&sup4;&sup5;-Leu-Pro
wobei Asx gleich Asp ist, Glx gleich Gln ist, und wobei fünf zusätzliche Lys-Reste am Ende der Sequenz hinzugefügt sind. Das Peptid wurde aufgebaut, abgespalten und gereinigt, im wesentlichen gemäß dem Verfahren beschrieben in Beispiel 3, außer daß die funktionellen Gruppen in den Seitenketten der Aminosäure durch Kupplungsreaktionen wie folgt geschützt wurden: Lys und 2-Cl-Z; Ser und Bzl; Asp und Obzl; Arg und Tosyl (TOS); und Thr und Bzl. Die Aminosäuren in den Positionen 112, 123, 124, 127, 133, 135, 136, 141, 142, und 146 wurden unter Einsatz symmetrischer Anhydridchemie in Methylenchlorid im wesentlichen gemäß dem Verfahren in Beispiel 1 angekuppelt.
Das vollständig geschützte Peptid-Harz wurde mit wasserfreier Fluorwasserstoffsäure behandelt, gefolgt von der Extraktion des Peptids, im wesentlichen gemäß dem Verfahen beschrieben in Beispiel 1, außer daß zwei zusätzliche 40%ige wässerige Essigsäureextraktionen durchgeführt wurden. Das rohe Peptid wurde dann mittels Umkehrphasen-HPLC an einer C&sub4;-Säule (Vydac 22 × 250mm; The Separation Group, Hesperia, CA) gereinigt, im wesentlichen gemäß dem Verfahren, beschrieben in Beispiel 1, unter Verwendung einer Flußrate von 12 ml/Min. und unter Einsatz eines Gradienten von 0,1% TFA/H&sub2;O (A) und 100% Acetonitril (B) als Lösungssysteme. Der Gradient wurde gestartet mit 19% B, wo er drei Minuten lang gehalten wurde und dann auf 40% B erhöht über einen Zeitraum von 20 Minuten, unter Einsatz der Kurve Nummer sieben von Water's automatischer Gradientsteuerung (Water's Millipore Corporation, Bedford, MA). Der Gradient wurde bei 40% B eine Minute lang gehalten und dann zurückgeführt auf 19% B über einen Zeitraum von einer Minute. Die Polypeptideluierung von der HPLC-Säule wurde bei 225nm und 254nm gleichzeitig überwacht. Die Zusammensetzung des -gereinigten Peptids wurde mit einer Aminosäurenanalyse bestätigt, wie in Beispiel 1 beschrieben.

Beispiel 5

CTP: Hemocyaninimmunogen

Das CTP, das im wesentlichen gemäß dem Verfahren, das in Beispiel 2 beschrieben ist, hergestellt worden war, wurde an Hemocyanin gebunden (von Limulus Polyphemus Hemolymph Typ VIII; Sigma, St. Louis, MO), und zwar mittels eines 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid-(EDC) -Verfahrens. Ein Milligramm CTP wurde in einer Phosphatgepufferten Salzlösung (1,0ml) gelöst. Hemocyanin (2,0mg) wurde gewogen und der CTP-Lösung hinzugefügt. Zwanzig Milligramm von EDC wurde abgemessen und in Wasser (200µl) aufgelöst. Die EDC- Lösung wurde dann langsam der CTP-Hemocyanin-Lösung unter Rühren hinzugefügt. Die Mischung reagierte eine Stunde lang und wurde dann gegen Wasser in einer Zellulosedialyseröhre (Spectra/por , Spectrum Medical Industries, Inc., Los Angeles, CA; MG 12,000- 14,000) dialysiert. Die Dialyse wurde 24 Stunden lang bei dreimaligem Austausch der Volumina durchgeführt. Nach der Dialyse wurde die Lösung durch Zentrifugation geklärt. Das resultierende Konjugat wurde mit einem Biuret Assay auf seinen Proteingehalt getestet.

Beispiel 6

Anti-hCG-Antikörperreinigung

Eine Affinitätssäule zur Reinigung von Antikörpern wurde hergestellt unter Einsatz eines Analytenanalogons der vorliegenden Erfindung gemäß dem folgenden Verfahren: Das HPLC-gereinigte Polylysin-CTP-Varianten-Peptid (im wesentlichen gemäß des Verfahrens hergestellt, das in Beispiel 4 beschrieben ist) wurde in 0,1M 3-(N-Morpholino)- propansulfonsäure-(MOPS)-Puffer gelöst, bei einem pH von 7,5. Die sich ergebende Lösung wurde dann mit einer Aufschlämmung von Affigel-10-Harz (Bio-Rad, Richmond, CA) kombiniert, das zuvor gewaschen worden war und in 0,1M MOPS, pH 7,5) aktiviert. Das Verhältnis von Peptid (mg) zu Affigel-10 (ml) war ungefähr 7:1. Nach dem Binden über Nacht bei 2-8º C, wurde das Peptidgekoppelte Harz drei mal mit 0,1M MOPS, pH 7,5, gewaschen und wurde dann mit einem Tris-Salzlösungspuffer ins Gleichgewicht gesetzt, der 0,1M Tris-(Hydroxy-methyl)-aminomethan (pH 7,5), 0,5M NaCl und 0,1%iges NaN&sub3; enthielt, und eine initiale Extinktion bei der Wellenlänge von 280 Nanometern (A&sub2;&sub8;&sub0;) wurde gemessen.
Antiserum, das in Ziegen gegen die β-Untereinheit von hCG erzeugt worden war, wurde mit Ammoniumsulfat bei 2-8º C gefällt. Der gefällte Antikörper wurde durch Zentrifugation abgetrennt, und das Pellet wurde wiederum in Tris-Salzlösungspuffer aufgelöst. Der resuspendierte Antikörper wurde eingehend gegen den Tris-Salzlösungspuffer bei 2-8º C dialysiert und dann bei -15º C gelagert.
Die Reinigung des Antikörpers mittels Säulenchromatographie wurde bei Raumtemperatur durchgeführt. Der gefrorene Antikörper wurde aufgetaut und es wurde ihm gestattet, sich an die Raumtemperatur anzugleichen. Der Antikörper wurde über die Affinitätssäule bei einer Flußrate von 1,5 ml/Min. geleitet. Ungebundendes Material wurde entfernt, indem die Säule mit dem Tris-Salzlösungspuffer gewaschen wurde, bis die initiale A&sub2;&sub8;&sub0; Grundlinie wieder hergestellt worden war. Der gebundene Antikörper wurde in einem 0,1 M Glycin-HCl-(pH 2,5)-Puffer eluiert, bei einer Flußrate von 1,5 ml/Min.. Die Antikörper enthaltenden Fraktionen wurden vereinigt und sofort mit 0,5 M Tris neutralisiert. Die neutralisierte Antikörperlösung wurde ausführlichst gegen 0,02 M Natriumphosphat, pH 7,2, 0,15 M NaCl bei 2-8º C dialysiert. Die dialysierte Antikörperlösung wurde dann auf etwa 10 Milligramm/Milliliter konzentriert und bei -15º C gelagert.

Vergleich der gereinigten Antikörper

Äquivalente Proteinmassen von CTP-Peptid- gereinigtem Antikörper und von mit CTP-Varianten gereinigtem Antikörper, die im wesentlichen gemäß dem Verfahren, beschrieben in Beispiel 6 hergestellt wurden, wurden verwendet, um die Leistung der Antikörper, die gemäß den Prinzipien der vorliegenden Erfindung hergestellt worden waren, zu demonstrieren. Um obiges zu erreichen, wurden der CTP-Peptid- Antikörper und der CTP-Varianten-Antikörper an alkalische Phosphatase konjugiert, wie unten beschrieben, um zwei unterschiedliche Antikörper/Enzym-Indikatorreagenzien zu bilden, zum Einsatz in einem heterogenen Sandwichimmunoassay.
Die Oxidation der alkalischen Phosphatase wurde in 25mM Natriumperiodat, 0,2mM Natriumacetat und 0,2M Natriumphosphat, pH 4,5, durchgeführt, und zwar während drei Stunden bei Raumtemperatur in der Dunkelheit. Die Oxidation wurde durch den Zusatz von Glyzer in beeendet, und das sich ergebende Material wurde über Nacht gegen 10mM Natriumacetat, pH 4,5, 100mM NaCl, 1mM MgCl&sub2; und 1mM ZnCl&sub2; dialysiert. Die dialysierte alkalische Phosphatase wurde mit dem jeweiligen gereinigten Antikörper in einem 1:1 Verhältnis bei einer Antikörperendkonzentration zwischen 1,5 und 2,0 Milligramm/Milliliter zusammengegeben. Der pH der Lösung wurde durch den Zusatz von Natriumbicarbonat auf einen pH von 9,5 erhöht, und die Lösung wurde fünf Stunden lang im Dunkeln bei Raumtemperatur inkubiert. Die jeweiligen Indikatorreagenzien wurden auf 2-8º C überführt und durch den Zusatz von Natrium Natriumborhydrid drei Stunden lang reduziert. Die reduzierten Indikatorreagenzien wurden dann über Nacht bei 2-8º C gegen 50 mM Tris-Hcl, pH 7,5, 0,1mM MgCl&sub2;, 0,1mM ZnCl&sub2; und 0,1% (w/v) NaN&sub3; dialysiert.
Die sich ergebenden Indikatorreagenzien wurden titriert, damit sie bei der Verwendung in einem hCG- Sandwichimmunoassay, welcher auf einem Abbott IMx automatischen Mikropartikel-Enzym-Immunoassaysystem (Abbott Laboratories, Abbott Park, IL) durchgeführt wurde, die gleichen Siganle ergaben. Das Fangreagenz war ein monoklonaler anti-β-hCG- Antikörper der auf Mikropartikel aufgezogen war (in 50mM tris- HCl, pH 7,5, 0,5mM NaCl, 0,1% NaN&sub3; und 13,6% Rohrzucker). Die Probe (50µl) wurde mit dem Fangreagenz (50µl) und einem der Indikatorreagenzien (50µl; in 50mM Tris-HCl, pH 7,4, 0,5M NaCl, 2,25% [w/v] Fischgelatine, 1% [w/v] Brij-35, 1,0mM MgC12, 0,1mM ZnCl&sub2; und 0,1% [w/v] NaN&sub3; und 10µl [75/25 v/v] normal-human- Serum/normal-Ziegenserum) und einem Verdünner (10µl; 0,05M Tris- HCl, bei pH 7,5, enthaltend 0,3M NaCl und 0,1% Natriumazid) vermischt. Das Reaktionsgemisch wurde in eine Reaktionsvertiefung gegeben und fünf Minuten lang inkubiert. Ein aliquoter Teil des Reaktionsgemisches (110µl) wurde auf eine Glasfasermatrix übertragen, an der die Mikropartikel binden, und die Matrix wurde mit Verdünner gewaschen. Ein fluoreszentes Substrat, 4-Methylumbelliferylphosphat (65µl) wurde der Matrix hinzugefügt und die Probe wurde mit einem Fluorometer abgelesen. Das Ausmaß der von der Oberfläche der Matrix ausgesendeten Fluoreszenz war direkt proportional zu der Konzentration des Analyten in der Probe.
Eichlösungen, die bekannte Mengen von hCG (in einer normalen Kalbsserummatrix) enthielten wurden gemessen und verwendet, um eine Standardkurve für jedes der Indikatorreagenzien zu berechnen. Die Ergebnisse der Eichung sind in Tabelle 1 dargestellt. Ein Indikatorreagenztiter von 1/2000 wurde für die Reagenzien verwendet, die den CTP- Varianten-Antikörper als das spezifisch bindende Glied enthielten, und ein Indikatorreagenztiter von 1/1000 wurde verwendet für die Reagenzien, die den CTP-Peptid-Antikörper als spezifisch bindendes Glied enthielten. Wie in Tabelle 1 dargestellt, lieferten die Indikatorreagenzien, die mit dem CTP- Varianten-Antikörper hergestellt worden waren, eine höheres Signal/Rausch-(S/N, "signal/noise")-Verhältnis, indem weniger Hintergrund bei Null mIU/ml von hCG erzeugt wird. Die rate oder die Zählungen/Sekunde/Sekunde (c/s/s) sind eine Messung der Intensität der Fluoreszenzemission, die von der Enzym/Substrat- Reaktion erzeugt wird (beschrieben durch Fiore et al., Clinical Chemistry, 34 (9): 1726-1732, 1988, dessen Offenbarung hiermit durch Bezugnahme in die Anmeldung aufgenommen wird.). Das S/N ist definiert als die gemessene Rate für jede Probe, dividiert durch die gemessene Rate für die Null-Eichlösung. Tabelle 1 Vergleich der Leistungen der Indikatorreagenzien Ein Satz Kontrollsubstanzen wurde ebenfalls getestet, und die Ergebnisse sind in Tabelle 2 dargestellt, wie aus den Standardkurven, die mit den Kalibratoren (Eichlösungen) hergestellt worden waren, gemessen. Die Kontrollen enthielten ungefähr 25, 150 oder 750 mIU/ml von hCG. Die Ergebnisse zeigen, daß die beiden unterschiedlichen Indikatorreagenzien, die beide aus Antikörpern hergsetllt sind, die gemäß der vorliegenden Erfindung gereinigt sind, gleiche Signale lieferten, aber daß eine wesentlich geringere Konzentration des Indikatorreagenzes, das den CTP-Varianten- Antikörper enthält, (eine zwei Mal niedrigere Konzentration) benötigt wurde, um das Signal zu liefern. Tabelle 2 Messung der Kontrollen mit der Standardkurve
Die Ergebnissse des Assays zeigen ebenfalls, daß das Indikatorreagenz, das aus eineitt bevorzugten Antikörper hergestellt ist, der gemäß der vorliegenden Erfindung hergestellt wird, der unter Verwendung der CTP-Variante gereinigt wurde, eine Erhöhung in der Sensitivität des Assays lieferte, wie dies bei einer 95%igen Vertrauensgrenze bei Null mIU/Milliliter hCG definiert ist.
Zusätzlich wurde die Kreuzreaktivität von hLH gemessen, indem der gleiche Assay durchgeführt wurde, bei Verwendung von bekannten hLH-Testproben und indem die sich ergebenden hCG-Werte gemessen wurden. Es wurde herausgefunden, daß die hLH-Kreuzreaktivität 3 bis 8 Mal niedriger ist, wenn der CTP-Varianten-Antikörper in dem Indikatorreagenz verwendet wird, wie durch die Ergebnisse gezeigt wird, die in Tabelle 3 dargestellt sind. Tabelle 3 Kreuzreaktivität

Claims

1. Verfahren zur Reinigung von polyklonalem anti-hCG-Antikörper, das folgende Schritte umfaßt:

a. In-Kontakt-Bringen einer Körperflüssigkeit, die polyklonalen anti-hCG-Antikörper enthält, mit einem hCG- Analytenanalogon, das an einem Träger unlöslich gemacht ist, wobei das hCG-Analytenanalogon eine Peptidsequenz ist, die folgendes umfaßt:

Asx¹¹²-Pro-Arg-Phe¹¹&sup5;-Glx-Asx-Ser-Ser-Ser¹²&sup0;- Lys-Ala-Pro-Pro-Pro¹²&sup5;-Ser-Leu-Pro-Ser-Pro¹³&sup0;- Ser-Arg-Leu-Pro-Gly¹³&sup5;-Pro-Pro-Asx-Thr-Pro¹&sup4;&sup0;- Ile-Leu-Pro-Glx-Ser¹&sup4;&sup5;-Leu-Pro

wobei der polyklonale anti-hCG-Antikörper, der für die Peptidsequenz spezifisch ist, absorbiert wird; und

b. Eluieren des polyklonalen anti-hCG--Antikörpers, der auf diese Weise spezifisch absorbiert worden ist.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei Asx gleich Asp ist und Glx gleich Gln.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Peptidsequenz desweiteren mindestens einen terminalen Lys-Rest umfaßt.

4. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Peptidsequenz folgendes umfaßt:

Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Asx¹¹²-Pro-Arg-Phe¹¹&sup5;--

Glx-Asx-Ser-Ser-Ser¹²&sup0;-Lys-Ala-Pro-Pro-Pro¹²&sup5;- Ser-Leu-Pro-Ser-Pro¹³&sup0;-Ser-Arg-Leu-Pro-Gly¹³&sup5;- Pro-Pro-Asx-Thr-Pro¹&sup4;&sup0;-Ile-Leu-Pro-Glx-Ser¹&sup4;&sup5;-Leu-Pro.

5. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Peptidsequenz folgendes umfaßt:

Asx¹¹²-Pro-Arg-Phe¹¹&sup5;-Glx-Asx-Ser-Ser-Ser¹²&sup0;-- Lys-Ala-Pro-Pro-Pro¹²&sup5;-Ser-Leu-Pro-Ser-Pro¹³&sup0;- Ser-Arg-Leu-Pro-Gly¹³&sup5;-Pro-Pro-Asx-Thr-Pro¹&sup4;&sup0;- Ile-Leu-Pro-Glx-Ser¹&sup4;&sup5;-Leu-Pro-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys.

6. hCG-analytenanaloges Peptid, das die Sequenz aufweist, die folgendes umfaßt:

Asx¹¹²-Pro-Arg-Phe¹¹&sup5;-Glx-Asx-Ser-Ser-Ser¹²&sup0;- Lys-Ala-Pro-Pro-Pro¹²&sup5;-Ser-Leu-Pro-Ser-Pro¹³&sup0;- Ser-Arg-Leu-Pro-Gly¹³&sup5;-Pro-Pro-Asx-Thr-Pro¹&sup4;&sup0;- Ile-Leu-Pro-Glx-Ser¹&sup4;&sup5;-Leu-Pro.

7. Peptid nach Ansprucn 6, worin Asx gleich Asp ist und Glx gleich Gln.

8. Peptid nach Anspruch 6 oder 7, worin die Peptidsequenz deswelteren mindestens einen terminalen Lys-Rest umfaßt.

9. Peptid nach Anspruch 6, das die Sequenz aufweist, die folgendes umfaßt:

Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Asx¹¹²-Pro-Arg-Phe¹¹&sup5;- Glx-Asx-Ser-Ser-Ser¹²&sup0;-Lys-Ala-Pro-Pro-Pr0¹²&sup5;- Ser-Leu-Pro-Ser-Pro¹³&sup0;-Ser-Arg-Leu-Pro-Gly¹³&sup5;- Pro-Pro-Asx-Thr-Pro¹&sup4;&sup0;-Ile-Leu-Pro-Glx-Ser¹&sup4;&sup5;-Leu-Pro.

10. Peptid nach Anspruch 6, das die Sequenz aufweist, die folgendes umfaßt:

Asx¹¹²-Pro-Arg-Phe¹¹&sup5;-Glx-Asx-Ser-Ser-Ser¹²&sup0;- Lys-Ala-Pro-Pro-Pro¹²&sup5;-Ser-Leu-Pro-Ser-Pro¹³&sup0;- Ser-Arg-Leu-Pro-Gly¹³&sup5;-Pro-Pro-Asx-Thr-Pro¹&sup4;&sup0;- Ile-Leu-Pro-Glx-Ser-¹&sup4;&sup5;-Leu-Pro--Lys-Lys-Lys-Lys-Lys.

11. Polyklonaler Antikörper, der gemäß einem Verfahren zur Reinigung von polyklonalem anti-hCG-Antikörper hergestellt worden ist, das folgende Schritte umfaßt:

a. In-Kontakt-Bringen einer Körpertlüssigkeit, die polyklonalen anti-hCG-Antikörper enthält, mit einem hCG- Analytenanalogon, das an einem Träger unlöslich gemacht ist, wobei das hCG-Analytenanalogon eine Peptidsequenz ist, die folgendes umfaßt:

Asx¹¹²-Pro-Arg-Phe¹¹&sup5;-Glx-Asx-Ser-Ser-Ser¹²&sup0;- Lys-Ala-Pro-Pro-Pro¹²&sup5;-Ser-Leu-Pro-Ser-Pro¹³&sup0;- Ser-Arg-Leu-Pro-Gly¹³&sup5;-Pro-Pro-Asx-Thr-Pro¹&sup4;&sup0;-- Ile-Leu-Pro-Glx-Ser¹&sup4;&sup5;-Leu-Pro

b. Eluieren des polyklonalen anti-hCG-Antikörpers, der auf diese Weise spezifisch absorbiert worden ist.

12. Antikörper nacn Anspruch 11, wobei Asx gleich Asp ist und Glx gleich Gln.

13. Antiköper nach Anspruch 11, wobei die Peptidsequenz desweiteren wenigstens einen terminalen Lys-Rest umfaßt, um die Sequenz an dem Träger zu verankern.

14. Affinitätssäule zur Reinigung von polykonalen anti-hCG- Antikörpern, die folgendes umfaßt:

a. ein hCG-analytenanaloges Peptid, das die Sequenz aufweist, die folgendes umfaßt:

wobei das Peptid auf

b. einem Träger immobilisiert ist.

15. Affinitätssäule nach Anspruch 14, worin Asx gleich Asp ist und Glx gleich Gln.

16. Affinitätssäule nach Anspruch 14 oder 15, worin die Peptidsequenz desweiteren mindestens einen terminalen Lys-Rest umfaßt, um die Sequenz an dem Träger zu verankern.

17. Verfahren zur Reinigung von polyklonalem anti-hCG-Antikörper, das folgende Schritte umfaßt:

a. In-Kontakt-Bringen einer Körperflüssigkelt, die polyklonalen anti-hCG-Antikörper enthält, mit einem hCG- Analytenanalogon, das an einem Träger unlöslich gemacht ist, wobei das hCG-Analytenanalogon eine Peptidsequenz ist, die aus folgendem besteht:

(Lys)m-Asp¹¹²-Pro-Arg-Phe¹¹&sup5;-Gln-Asp-Ser-Ser-Ser¹²&sup0;- Ser-Lys-Ala-Pro-Pro¹²&sup5;-Pro-Ser-Leu-Pro-Ser¹³&sup0;-- Pro-Ser-Arg-Leu-Pro¹³&sup5;-Gly-Pro-Ser-Asp-Thr¹&sup4;&sup0;-- Pro-Ile-Leu-Pro-Gln¹&sup4;&sup5;-(Lys)n

worin m und n unabhängig voneinander beliebige ganze Zahlen sind, die größer oder gleich Null sind, wodurch der polyklonale anti-hCG-Antikörper, der für die Peptidsequenz spezifisch ist, absorbiert wird; und

b. Eluleren des polyklonalen anti-hCG-Antlkörpers, der auf diese Weise spezifisch absorbiert worden ist.

18. Verfahren nach Anspruch 17, wobei mindestens eine der Zahlen m und n einen Wert von mindestens 1 aufweist.

19. Verfahren nach Anspruch 17, worin die Peptidsequenz aus folgendem besteht:

Asp¹¹²-Pro-Arg-Phe¹¹&sup5;-Gln-Asp-Ser-Ser-Ser¹²&sup0;- Ser-Lys-Ala-Pro-Pro¹²&sup5;-Pro-Ser-Leu-Pro-Ser¹³&sup0;- Pro-Ser-Arg-Leu-Pro¹³&sup5;-Gly-Pro-Ser-Asp-Thr¹&sup4;&sup0;- Pro-Ile-Leu-Pro-Gln¹&sup4;&sup5;-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys.

20. hCG-analytenanaloges Peptid, das die Sequenz aufweist, die aus folgendem besteht:

worin m und n unabhängig voneinander beliebige ganze Zahlen sind, die größer oder gleich Null sind, vorausgesetzt, daß wenigstens eine der Zahlen m und n einen Wert von mindestens 1 aufweist.

21. Peptid nach Anspruch 20, das die Sequenz aufweist, die aus folgendem besteht:

22. Polyklonaler Antikörper, der gemäß einem Verfahren zur Reinigung von polyklonalem antl-hCG-Antikörper hergestellt worden ist, das folgende Schritte umfaßt:

a. In-Kontakt-Bringen einer Körperflüssigkeit, die polyklonalen anti-hCG-Antikörper enthält, mit einem hCG- Analytenanalogon, das an einem Träger unlöslich gemacht ist, wobei das hCG-Analytenanalogon eine Peptidsequenz ist, die aus folgendem besteht:

worin m und n unabhängig von einander beliebige ganze Zahlen sind, die größer oder gleich Null sind,

b. Eluleren des polyklonalen anti-hCG-Antikörpers, der auf diese Weise spezifisch absorbiert worden ist.

23. Antikörper nach Anspruch 22, worin wenigstens eine Zahl aus m und n einen Wert von wenigstens 1 aufweist.

24. Affinitätssäule zur Reinigung von polyklonalen anti-hCG- Antikörpern, die folgendes umfaßt:

a. ein hCG-analytenanaloges Peptid, das die Sequenz aufweist, die aus folgendem besteht:

worin m und n unabhängig voneinander beliebige ganze Zahlen sind, die größer oder gleich Null sind,

worin das Peptid

b. auf einem Träger immobillsiert ist.

25. Affinitätssäule nach Anspruch 24, worin wenigstens eine der Zahlen aus m und n einen Wert von wenigstens 1 aufweist.