DE68926712T2

DE68926712T2 - Gen zum kodieren eines antigens gegen menschlichen malaria impfstoff

Info

Publication number: DE68926712T2
Application number: DE68926712T
Authority: DE
Inventors: David C. Kensington Md 20895-4235 Kaslow; Louis H. Chevy Chase Md 20815 Miller
Original assignee: US Department of Health and Human Services; US Department of Commerce
Current assignee: US Department of Health and Human Services; US Department of Commerce
Priority date: 1988-05-02
Filing date: 1989-04-20
Publication date: 1997-04-17
Anticipated expiration: 2009-04-21
Also published as: CA1340963C; IL90134A0; JPH03503122A; AU3763789A; ATE139537T1; WO1989010936A1; EP0418310B1; AU619312B2; DE68926712D1; EP0418310A1; EP0418310A4; IL90134A; JP2812759B2

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

1. Gebiet der Erfindung

Die Erfindung bezieht sich auf Gene zum Kodieren von Malaria-Impfstoff-Antigenen. Genauer gesagt, bezieht sich die Erfindung auf ein Gen zum Kodieren des Plasmodium falciparum 2SKDA-Ookinete-Oberflächen-Antigens.

2. Beschreibung der Hintergrundtechnik

Malaria hört nicht auf, einen schweren Zoll von der Menschheit zu fordern. Ungefähr 25 Prozent aller Todesfälle von Kindern im ländlichen Afrika mit dem Alter zwischen ein und vier Jahren werden durch Malaria verursacht. Diese Todesrate hört trotz der Empfindlichkeit von örtlichen Parasiten gegen doroquine nicht auf. Eine Moskito-Kontrolle ist bei dieser Situation schwierig. Gegenwärtig ist die größte Hoffnung auf Verminderung der Sterblichkeitsrate ein schützender Impfstoff, der das Auftreten des Leidens und Todes durch Unterdrückung der Reproduktion des Parasiten vermindert. Der häufigste Grund für Malaria bei Menschen ist der Parasit Plasmodium falciparum.
Der Wert von verschiedenen Impfstoffen zur Bekämpfting von Malaria wird durch Verstehen des Lebenszyklus des Parasiten erkannt. Die menschliche Infektion beginnt, wenn junge Malaria-Parasiten oder "Sporozoiten" durch den Moskito in den Blutstrom eines Menschen eingespritzt werden. Nach dem Einspritzen läßt sich der Parasit in Leberzellen nieder. Nach ungefähr einer Woche werden die Parasiten oder "Merozoiten" in den Blutstrom entlassen. Mit dem Eintritt der Parasiten in den Blutstrom beginnt die "erythrocytische" Phase. Jeder Parasit drängt in eine rote Blutzelle, um zu wachsen und sich zu entwickeln. Wenn der Merozoit in der roten Blutzelle gereift ist, ist er als Trophozoit und Schizont bekannt. Ein Schizont ist das Stadium, in dem die Kernteilung erfolgt, um einzelne Merozoiten zu bilden, die entlassen werden, um in andere rote Zellen einzudringen. Nach verschiedenen schizogonen Zyklen entwickeln sich einige Parasiten, statt durch asexuelle Reproduktion zu Schizonten zu werden, zu großen, kernmäßig Vereinten Parasiten. Diese Parasiten unterliegen einer sexuellen Entwicklung.
Die sexuelle Entwicklung der Malaria-Parasiten umfaßt die weiblichen Parasiten oder "Macrogametocyten" und die männlichen Parasiten oder "Microgametocyten". Diese Gametocyten unterliegen im Menschen keiner weiteren Entwicklung. Nach Einnahme der Gametocyten in den Moskito beginnt der komplizierte sexuelle Kreislauf in dem Mitteldarm des Moskitos. Die roten Blutzellen lösen sich in dem Mitteldarm des Moskitos nach 10 bis 20 Minuten auf. Die Microgametocyte fährt fort, sich durch Austreiben von Schößlingen zu entwickeln und gibt 8 hochentwickelte Microgameten frei. Die Befruchtung findet mit der Verschmelzung der Microgameten in eine Macrogamete statt. Der befruchtete Parasit ist als eine Zygote bekannt, die sich in einen "Ookineten" entwickelt. Der Ookinet durchdringt die Mitteldarmwand des Moskitos und wandelt sich um in die Oocyste, in der sich viele kleine Sporozoiten bilden. Wenn die Oocyste zerbricht, wandern die Sporozoiten entlang dem Haemolymph zu der Speicheldrüse des Moskitos. Wenn er erst in dem Speichel des Moskitos ist, kann der Parasit in einen Wirt injiziert werden.
Malariaimpfstoffe sind gegen verschiedene Stadien in des Parasiten Lebenszyklus entwickelt worden, der das Sporozoit-, Asexual-Erythrocyt- und Sexual-Stadium umfaßt. Jede Entwicklung steigert die Möglichkeit, Malaria in den vielen verschiedenen Situationen zu beeinflussen, in denen das Leiden auftritt. Sporozoit-Impfstoffe würden vom Moskito veranlaßte Infektionen verhindern. Impfstoffe einer ersten Generation dieser Art sind an Menschen erprobt worden. Impfstoffe bzgl. des asexual-erythrocytischen Stadiums würden bei einer Verminderung der Schwere des Leidens nützlich sein. Vielfältige Bewerber- Antigene sind geklont worden und in Tieren sowie in Menschen erprobt worden.
Auf das Sexualstadium abgestellte Impfstoffe bringen Antikörper ein, die, wenn sie in einer Sexualstadium-Moskitos enthaltenden Blutmalilzeit eingenommen sind, eine Infektion von Moskitos verhindern würden. Obwohl das nicht unmittelbar gegen Infektion und Leiden schützt, würde der Sexualstadium-Impfstoff kombiniert mit einem schützenden Impfstoff, wie z.B. ein Sporozoit- oder Asexual-Stadium-Impfstoff, die Chancen einer Übertragung von impfstoff-induzierten Mutanten, die gegen schützende Bestandteile resistent sind, vermindern. Auf diese Weise würde die brauchbare Lebenszeit des schützenden Bestandteils verlängert. In einigen geographischen Bereichen könnte der Sexualstadium-Impfstoff die Übertragung unter die kritische Schwelle vermindern, die erforderlich ist, um die infizierte Population aufrecht zu erhalten. Diese verminderte Übertragung wäre bei einer Unterstützung der Kontrolle oder Ausrottung von Malaria nützlich.
Die US-PS 46 32 909 von Carter und Miller, die durch Bezugnahme in der Offenbarung der vorliegenden Beschreibung eingeschlossen ist, offenbart monoklonale Antikörper, die sich mit einem oder mehreren Proteinen binden, die sich auf der Oberfläche von Gameten oder Zygoten von Malariaparasiten befinden und Ziele für Sexualstadium4mpfstoffe sind. Die Antikörper sind spezifisch für Antigene gegen Moskito-Mitteldarm-Stadien von Malariaparasiten und sterilisieren die Parasiten in den Moskitos, die ansonsten zur Übertragung des Leidens fähig sind. Die monoklonalen Antikörper sind spezifisch für die 255, 59 und 53 K- Oberflächenproteine auf Plasmodium falciparum und für das 25 K-Oberflächenprotein auf Zygoten und Ookineten von Plasmodium gallinaceum. Die Erfindung schließt ein Verfahren zum Sperren von Übertragungen von Malariaparasiten ein. Das Verfahren umfaßt das Füttern von Moskitos, welche die monoklonalen Malariaparasit-Antikörper tragen, die spezifisch für ein Glycoprotein an der Oberfläche des Malariaparasiten Zygote sind. Das Glycoprotein hat ein Molekulargewicht von 24-30 K. Das Verfahren ist an einer Zygote bis zu 3 Stunden nach der Befruchtung wirksam. Diese Erfindung umfaßt weder ein geklontes Gen, um übertragungssperrende Resistenz gegen Malaria einzuführen, noch ein abgeleitetes Peptid von dem Gen zur Anwendung in einem Malariaimpfstoff.
Eine Studie zur Identifizierung von Antigenen, die zur Entwicklung einer Resistenz durch Malariaübertragungssperrung geeignet sind, ist in dem Artikel von Carter u.a., "Zielantigene für Resistenz durch Malariaübertragungssperrung", Phil. Trans. R. Soc. Land. B 307: 201-213 (1984) offenbart; der Artikel ist durch Bezugnahme in der Offenbarung der vorliegenden Beschreibung eingeschlossen. Dieser Artikel beschreibt die Entwicklungsphasen von Malariaparasiten, wobei eine übertragungssperrende Resistenz auftritt. Es werden in dem Artikel Zielantigene auf Garneten und neu befruchteten Zygoten und Zielantigene einer nach der Befruchtung auftretenden übertragungssperrenden Resistenz indentifiziert. Der Artikel offenbart kein geklontes Gen, um eine übertragungssperrende Resistenz gegen Malaria zu bewirken, und auch kein abgeleitetes Peptid von dem Gen, um es in einem Malariaimpfstoff zu verwenden.
Ein Artikel von Grotendorst u.a., "Ein Oberflächenprotein, das während der Übertragung von Zygoten von Plasmodium gallinaceum ausgedrückt ist, ist ein Ziel von übertragungssperrenden Antikörpern", Infektion und Resistenz, Vol 45, No. 3, S. 775-777 (1984), ist durch Bezugnahme in der Offenbarung der vorliegenden Beschreibung eingeschlossen und offenbart ein besonderes Protein, das zur Verwendung als ein Antigen geeignet ist. Der Artikel benennt Materialien und Verfahren, die beim Isolieren und Identifizieren eines Antigens geeignet sind, das ein Oberflächenprotein von Mr 26,00 ist, das von Zygoten von P. gallinaceum hergestellt ist. Monoklonale Antikörper mit Eigenschaften eines Antiookinet-Serums wurden in bestimmten Beispielen geftinden, um die Übertragbarkeit von befruchteten Parasiten auf Moskitos zu unterdrücken. Ein analoges 2SKDA-Oberflächenprotein, das von Zygoten und Ookineten von Plasmodium falciparum hergestellt ist, wird von Vermeulen u.a. beschrieben in "Regelmäßig aufeinanderfolgendes Ausdrücken von Antigenen bei Sexualstadien von Plasmodium falciparum, die für übertragungssperrende Antikörper im Moskito zugänglich sind", J. Exp. Med., 162: 1460-1476 (1985); dieser Artikel ist durch Bezugnahme in der Offenbarung der vorliegenden Beschreibung eingeschlossen. Diese Artikel offenbaren kein geklontes Gen von P. falciparum, um eine übertragungssperrende Resistenz gegen Malaria zu bewirken, und auch kein abgeleitetes Peptid von dem Gen zur Verwendung in einem Malariaimpfstoff.
Der Industrie fehlt ein Gen, das einen Impfstoff erzeugen kann, der dazu bestimmt ist, eine übertragungssperrende Resistenz bei 25kDA-Oberflächenprotein von Plasmodium falciparum, nachfolgend Pfs25 genannt, und anderen Sexualstadium-Antigenen zu bewirken. Der Industrie fehlt auch ein synthetisches Peptid, das von dem vorhergenannten Gen ausgedrückt werden kann und in einem pharmazeutischen Präparat zur Erzeugung eines Malariaimpfstoffs verwendet werden kann. Impfstoffe, die von solchen Genen stammen, würden die Nutzbarkeit von anderen schützenden Malariaimpfstoffen verlängern und auch die Verbreitung von Malaria in Gebieten niedriger Übertragung vermindern.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Die Erfindung ist ein Gen zum Ausdrücken bzw. Darstellen von Antigenen zur Erzeugung eines menschlichen Malariaimpfstoffs. Das Gen umfaßt eine geklonte nucleotide Folge bzw. einen geklonten nucleotiden Abschnitt zum Kodieren des 25kDA-Oberflächenprote ins von Zygoten und Ookineten von Plasmodium falciparum. Der das Protein kodierende Abschnitt des Gens ist
Die Erfindung umfaßt ein synthetisches Protein, das zur Bereitung eines Malariaimpfstoffs brauchbar ist. Das synthetische Protein des geklonten Gens ist
Die Erfindung umfaßt ein pharmazeutisches Präparat mit dem synthetischen Protein und das Verfahren zum Herstellen eines Antimalariaimpfstoffs mit dem synthetischen Protein.

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

Figur 1 verdeutlicht die nucleotide und vorhergesagte Aminosäurefolge von Pfs25.
Figur 2 verdeutlicht eine Northern-Blot-Analyse von Asexual- und Sexualstadium-RNA.
Figur 3 verdeutlicht eine Proteinstruktur von Pfs25, die angeordnet ist, um die Verwandtschaft der EGF-ähnlichen Bereiche zu betonen.

DETAILIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Die Erfindung ist das isolierte und geklonte Gen zum Kodieren des 25kDA-Oberflächenproteins (Pfs25) von Zygoten und Ookineten von Plasmodium falciparum. Die abgeleitete Aminosäurefolge dieses Gens besteht aus einer Signalfolge, einem hydrophoben C-Terminus und vier hintereinander angeordneten epidermalen Wachstumsfaktor(EGF)-ähnlichen Bereichen. Das geklonte Gen der Erfindung stellt daher ein brauchbares Präparat dar, das ein Antigen ausdrücken kann, das bei der Bereitung eines Malariaimpfstoffs brauchbar ist. Das Antigen ist auch ein brauchbares Erzeugnis der Erfindung. Das Antigen ist ein Polypeptid, das in therapeutischen Mengen gebraucht werden kann, um pharmazeutische Präparate zu schaffen, die als Malariaimpfstoffe geeignet sind.
Die Gene zum Kodieren der drei sexualstadium-spezifischen Antigene von P. falciparum sind bis jetzt nicht geklont worden. Dies beruht zum Teil auf der Tatsache, daß von monoklonalen Antikörpern bestimmte Epitope von Disulfidbindungen abhängig sind und große Mengen von Parasiten und gereinigtem Protein, wie es für Peptidfolgen nötig ist, schwierig zu erhalten sind. Das Gen der Erfindung wird durch Reinigen des Pfs25 von Zygoten des P. falciparum erhalten. Bei der bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird der 3D7-Klon von NF54-P. falciparum benutzt. Das Pfs25 wird durch Verwendung einer Immunoaffinitäts-Chromatographie und SDS-PAGE gereinigt. Die Mikrosequenz des Proteins wird dann gebildet, um oligonudeotide Prüflinge zu machen, um genomische DNA-Bibliotheken zu sieben. Das gereinigte Pfs25 wird mit Trypsin versetzt, weil der Amino-Terminus gesperrt war. Die sich ergebenden Peptide werden durch HPLC fraktioniert. Aus diesem Verfahren werden fünf Peptidfolgen erhalten. Diese Peptidfolgen sind in Figur 1 ihrer Art nach festgestellt.
Ein hochdegenerierter oligonudeotider Prüfling wird aus einer tryptischen Peptidfolge gebaut. Dieses Oligonucleotid wird benutzt, um ein 600 bp Dra 1-Fragment (pSKR 2) einer genomischen DNA zu klonen. Das Dra I-Fragment enthält einen langen offenen Leserahmen, aber keinen Terminationscodon. Daher ist ein 3,5 kb Hind III-Fragment (pNF4.13) geklont. Beide geklonten Fragmente können dazu verwendet werden, die nucleotide Folge von Pfs25 zu bestimmen.
Figur 1 verdeutlicht die Aminosäurefolge für Pfs25, wie sie durch das vorher geschilderte Verfahren abgeleitet wird. Die Aminosäurefolge ist oberhalb der Nucleotidfolge gezeigt. Das Gen hat ein einziges Exon, das für ein Polypeptid von 217 Aminosäuren kodiert. Der vorherbestimmte Kodifizierungsbereich der Nucleotidfolge wird zu Kapital gemacht und besteht aus 654 Basispaaren. Der N-Terminus ist gesperrt; daher ist der Beginn des voll entwickelten Proteins nicht bestimmt worden. Feste Linien stellen tryptische Peptidfolgen dar, die durch Mikrofolgen bestimmt sind. Sternchen stellen die Folge dar, die durch Mikrofolgen von strahlengekennzeichneten Peptiden bestimmt ist. Die gepunktete Linie stellt die unbestimmten Aminosäurereste des mikrogefolgten Peptids dar. Die doppelte feste Linie stellt die tryptische Peptidfolge dar, die verwendet ist, um oligonudeotiden Prüflinge zu bilden. Die offenen Kreise stellen die Lagen einer möglichen asparagingekoppelten Glycozylation dar. Die gebrochenen Linien stellen die hydrophoben Bereiche dar. Die erste und wichtigste Beweismaßnahme dafür, daß das Gen für das 25kDa-Ookinet- Oberflächengen geklont ist, ist, daß fünf von den mikrogefolgten tryptischen Peptiden von Pfs25 in den abgeleiteten Aminosäurefolgen von Pfs25 gefünden werden, wie es in Figur 1 gezeigt ist. Eine Zubereitung von (³&sup5;S)-gekennzeichnetem Pfs25 kann von Zygoten immunitätsgereinigt sein, die mit ³&sup5;S-Methionin und ³&sup5;S-Zystein metabolisch gekennzeichnet sind. Die sich ergebenden tryptischen Peptide von Pfs25 werden durch HPLC getrennten und die die meiste Radioaktivität enthaltende Fraktion wird mikrogefolgt. Die radioaktiven Spitzen für Zystein und Methionin in dem tryptischen Peptid von Pfs25 treffen genau die Stellung dieser Überreste in der abgeleiteten Aminsäurefolge des Pfs25- Gens von Figur 1, das durch Sternchen markiert ist.
Ein Malariaimpfstoff kann von dem Gen der Figur 1 oder einem Teil davon erzeugt werden. Das Gen kann unter Anwendung bekannter Techniken zum Weglassen der Signalfrequenz, des hydrophoben Ankers und/oder anderer Teile des Gens abgeändert werden. Die Änderungen an dem Gen setzen das Erzeugen eines geeigneten Antigens zur Anwendung in dem Impfstoff fort.
Der Fachmann versteht, daß bestimmte Codons, die in der Folge von Figur 1 dargestellt sind, durch andere Codons ersetzt werden können und einen gleichwirkenden Bereich erzeugen können. Das durch den gleichwirkenden Bereich erzeugte Polypeptid hat in seiner Aminosäurefolge eine entsprechende Änderung, hat aber eine gleichwirkende Funktion für das bevorzugte Polypeptid. Z.B. ändert ein Ersatz von Glutaminsäure für Glycin bei Aminosäure 131 nicht die Wirkungsweise des Polypeptids.
Zweitens ist das Gen der Erfindung vorzugsweise in den Sexualstadien von P. falciparum ausgedrückt. Das ist das Stadium, in dem Pfs25 synthetisiert wird. Das mRNA von (nicht gezeigten) Gametozyten und fünf Stunden alten Zygoten, wie in Figur 2, Spur 5 dargestellt, von P. falciparum unter Verwendung des 3D7-Klons von NF 54 haben einen Überschuß von ungefähr 1,4 kb Arten, die zu pSKR 2 hybridisieren. Im Gegensatz dazu gibt das mRNA von Asexualstadium-Parasiten von 3D7, wie sie in Figur 2, Spur A dargestellt sind, nur ein schwaches Signal. Das schwache Signal von den Asexualstadium-Parasiten ist höchstwahrscheinlich wegen des Vorhandenseins einiger Gametozyten in der Aufbereitung von Parasiten vorhanden. Z.B. hybridisiert pSKR 2 nicht mit dem mRNA, wie es in Figur 2, Spur L dargestellt ist, von einem P. falciparum-Parasiten, der keine Gametozyten erzeugt so wie das LF4-Klon eines liberianischen Isolats von P. falciparum.
Zum Dritten: Wenn Gameten, Zygoten oder Ookineten von P. falciparum metabolisch etikettiert bzw. gekennzeichnet sind, enthalten multiple Sexualstadium-Proteine ³&sup5;S- Methionin und ist Pfs25 kein größeres strahlengekennzeichnetes Produkt. Im Unterschied dazu ist Pfs25 das vorherrschende Produkt, das ³&sup5;S-Zystein beinhaltet, wie durch Versuche bekannt ist, die üblicher Standard sind. Die abgeleitete Aminosäurefolge enthält 11 Prozent Zystein, was mit diesen Ergebnissen übereinstimmt.
Zum Vierten: Die Struktur des Proteins der abgeleiteten Aminosäurefolge stimmt überein mit früheren, weiter oben angegebenen Berichten von der Biochemie des 25kDa-Oberflächen-Glycoproteins. Die abgeleitete Folge enthält ein mutmaßliches Signalpeptid am Terminus und einen kurzen hydrophoben Anker am C-Terminus. Sie hat vier mögliche Polypeptid-Lagen für N-gekoppelte Zucker und kodiert für ein Polypeptid von ungefähr 24kDa. Die abgeleitete Folge hat auch einen kurzen hydrophoben Anker von 15 Aminosäuren und das Fehlen eines möglichen cytoplasmischen hydrophilen Bereichs am C- Terminus.
Die Organisation der Zysteine zwischen der Signalfolge und dem hydrophoben C- Terminus ist ähnlich den Bereichen in EGF 1, wie es in Figur 3B dargestellt ist. Basierend auf der Stellung der Zysteine in den Exons von menschlichen EGF-Vorläufern und menschlichen LDL-Rezeptoren gehen drei Zystein-Reste der Konsensus-Folge Y/F-x-C x-C x-x-G-Y/F voraus und folgt eine dieser Folge, wie es in Figur 3B dargestellt ist. Der EGF- ähnliche Bereich wird auch in Wirbellosen gefünden, so als Einschnitt in Drosophilia melanogaster und lin-12 in Caenorhabditis elegans. Die Erfindung stellt den ersten Bericht über die Gegenwart von EGF-ähnlichen Bereichen in Proteinen von unicellularen Organismen dar. Von der Gegenwart von EGF-ähnlichen Bereichen im Protein der Erfindung kann erwartet werden, daß sie eine Wachstumsfaktorwirkung auf höhere Organismen, einschließlich den Moskito hat.

BEISPIEL

Das folgende Beispiel sieht das Verfahren zum Erhalten des Gens der Erfindung vor. Das Beispiel stellt die bevorzugte Ausführungsform der Erfindung dar.
Ein 3D7-Klon eines NF 54-Isolats von P. falciparum wurde in vitro gezüchtet und Zygoten wurden wir oben beschrieben vorbereitet. Pfs25 von Triton-X-100-Auszügen von fünf Stunden alten Zygoten (10&sup9;) wurden bzgl. Immunoaffinität gereinigt, wobei ein monoklonaler Antikörper 1C7 verwendet wird, der an Sepharose-4B-Perlen (CnBr-aktiviert) kovalent gekoppelt ist. Das Pfs25 ist metabolisch mit Trans S35 gekennzeichnet worden, das 70 % ³&sup5;S-Methionin, 20 % ³&sup5;S-Zystein und 10 % andere ³&sup5;S-Verbindungen hat und im Handel von ICN Radiochemicals Inc. erhältlich ist. Die Perlen bzw. Kügelchen enthielten Pfs25 und werden in einem SDS-PAGE Beispiel-Puffer wieder verteilt, der 5 % SDS, 62,5 mM Tris bei pH-Wert 6,8, 0,002 % Bromophenol blau und 8 M Urea hat. Das wird für fünf Minuten bei 680ºC erhitzt. Das ausgewaschene Protein in dem Beispielpuffer wird unter nichtreduzierenden Bedingungen auf ein 12 % SDS-Polyacrylamid-Gel geladen. Das Pfs25 war das einzige strahlungsgekennzeichnete Protein, das auf dem Gel identifiziert wurde, und wurde von dem Gel durch passive Diffusion wiedergewonnen. Das lyophilisierte Beispiel wird wiedergelöst in 0,5 M Tris-HCI pH-Wert 8,5, 6 M Guanidin-Hydrochlond, 0,3 mM EDTA-Puffer mit 64 mM Dithiothreitol, und für 2 Stunden bei 37ºC in einer N&sub2;- Atmosphäre ausgebrütet. Iodoacetarnid wurde bis zu einer Endkonzentration von 174 mM hinzugegeben und für 1 Stunde bei 25ºC im Dunkeln reagieren gelassen. Ein Überschuß von 2-Mercaptoethanol wird hinzugefügt, gefolgt von 10 Volumen von absolutem Ethanol. Das reduzierte und alkylierte Protein läßt man sich bei -20ºC für 4 Stunden niederschlagen. Das verbleibende Pellet wird in 50 mM NH&sub4; HCO&sub3;, pH-Wert 7,9, wieder verteilt und mit zwei 0,5 ug-Dosen von TPCK-behandeltem Trypsin (Sigma) aufgeschlossen, wobei jede Dosis von einer sechsstündigen Inkubation bei 37ºC gefolgt ist. Die Aufschließung wird durch Erhitzen des Beispiels während 10 Minuten bei 65ºC begrenzt. Die tryptischen Peptide werden fraktioniert auf entgegengesetztphasigem HPLC (RP-300, Applied Biosystems, Inc.) unter Verwendung eines 50 %igen Acetonitrilgradienten mit 0,1 % trifluoracetischer Säure. Eine Peptid-Mikrofolgenbildung wurde auf einem Gasphasenfolgebildner Modell 470A von Applied Biosystems, Inc. ausgeführt, 40 % des Erzeugnisses jeden Durchgangs wurde auf einem beigefügten Analysiergerät Modell 120A PTH unter Verwendung des Herstellerprogramms C3RPTH analysiert. Bei einem Peptid wurde die Radioaktivität der verbleibenden 60 % des Erzeugnisses jeden Durchgangs bestimmt. Radioaktive Spitzen (***) wurden in den Durchgangsnummern 1, 7, 12 und 17 gefunden.
Die Peptidfolge, die durch durchgehende Doppellinien gekennzeichnet ist, wurde benutzt, um hoch degenerierte oligonudeotide Prüflinge zu bauen. Eine Gruppe von Oligonucleotiden der 512-Degeneration hybridisierte zu einem 1,4 kb-Band von Zygot-RNA. Durch Änderung des Codons für Prolin wurde der Prüfling in vier Gruppen jeweils einer 128- Degeneration geteilt und eine dieser Gruppen hybridisierte zu einem 1,4 kb-Band von RNA sowie einem 600 bp Dra I-Fragment eines genomischen DNA. 20.000 Plaquen, von einer größenausgewählten Dra I-Bereichsbibliothek in Lambda gt 10, wurden mit diesem Oligionucleotid-Prüfling bearbeitet. Ein Klon wird gekennzeichnet und zu Blue Script SK (pSKR 2) gesubklont. Das pSKR 2 wurde verwendet, um ein 3,5 kb Hind III-Fragment in einer größenausgewählten Bibliothek im Vektor PSP64 zu kennzeichnen. Beide Stränge jedes Klons werden durch das Dideoxynucleotid-Terminator-Verfahren folgegebildet.
In Figur 2 ist die Northern-Blot-Analyse von Asexual- und Sexual-Stadium-RNA gezeigt. Totalcellulares RNA (20 ug/Spur) wurde aus asexualen Parasiten (L) von LF 4 aufbereitet, asexuale Parasiten (A) von 3D7 oder 5 Stunden alte Zygoten (5) von 3D7 wurden durch ein 1 %iges Agarose/Formaldehyd-Gel elektrophoresiert und auf eine Nylonmembran übertragen. Der Filter wurde bei 55ºC über Nacht mit einer wahllos vorbereiteten pSKR 2- Einlage (spezifische Aktivität 10&sup9; c.p.m. ug&supmin;¹) hybridisiert und wie beschrieben gewaschen. Größenkennzeichen sind 0,24-9,5 kb RNA Leiter (BRL).
Figur 3 verdeutlicht in Teil A eine Struktur von Pfs 25 in einer Anordnung, welche die Verwandtschaft der EGF-ähnlichen Bereiche betont. Die Kästen stellen Zystein-Überreste und andere identische oder verwandte Aminosäuren dar. Das Teil B verdeutlicht eine EGF- ähnliche Wiederholungskonsensus-Folge von Pfs25, lin-12, notch, EGF und menschlichem LDL-Rezeptor. Die Kästen stellen Zystein-Überreste dar. Die Doppelkästen stellen einen Kern einer Konsensusfolge dar. Die Buchstaben bestimmen die folgenden Aminosäuren: C, Cys; D, Asp; E, Glu; F, Phe; G, Gly; 1, Ile; K; Lys; L, Leu; N, Asn; T, Thr; Y, Tyr; x, irgendeine Aminosäure; und eine unspezifizierte Anzahl von Aminosäuren.

Claims

1. Rekombinantes DNA-Molekül, das ein 25kDa-Oberflächen-Protein oder ein antigenes Teil davon von Zygoten und Ookineten von Plasmodium falciparum kodiert, mit einer Signalfrequenz, einem hydrophoben C-Terminus und vier hintereinander liegenden, epidermalen wachstumsfaktorähnlichen Bereichen.

2. Rekombinantes DNA-Molekül, das ein 25kDa-Oberflächen-Protein oder ein antigenes Teil davon in Zygoten und Ookineten von Plasmodium falciparum kodiert, mit einer Signalfrequenz, einem hydrophoben C-Terminus und vier epidermalen wachstumsfaktorähnlichen Bereichen zum Ausdrücken eines Antigens zur Erzeugung eines menschlichen Malariaimpfstoffs.

3. Rekombinantes DNA-Molekül, das folgende Aminosäure-Sequenz verschlüsselt: oder ein Antigen-Teil davon.

4. Rekombinantes DNA-Molekül, das die folgende DNA-Sequenz umfaßt: