DE68923741T2

DE68923741T2 - Fledermausspeichel-Plasminogenaktivatoren.

Info

Publication number: DE68923741T2
Application number: DE68923741T
Authority: DE
Inventors: Bruce L. South Orange New Jersey 07079 Daugherty; Richard A.F. Lansdale Pa 19446 Dixon; Le Thi Jenkintown Pa 19046 Duong; Paul A. Rosemont Pa 19010 Friedman; Stephen J. North Wales Pa 19454 Gardell; John W. Doylestown Pa 18901 Jacobs; George E. Princeton Junction New Jersey 08550 Mark
Original assignee: Schering AG
Current assignee: Bayer Pharma AG
Priority date: 1988-07-20
Filing date: 1989-07-20
Publication date: 1996-02-15
Anticipated expiration: 2009-07-21
Also published as: EP0352119A3; IL91059A0; DK176140B1; IE69054B1; AU3891589A; EP0352119A2; PT91236B; JP2713467B2; FI100403B; KR910003094A; GR3017587T3; NO314548B1; NO302954B1; EP0352119B1; CA1341090C; KR0138997B1; NO970603D0; IL91059A; NO970603L; DK357589D0

Description

Hintergrund der Erfindung

Als Nahrung sind Fledermäuse absolut angewiesen auf frisches Blut, was sie erhalten, indem sie ihrem Opfer eine Wunde beibringen. Aus diesen Wunden fließt, obgleich sie oberflächlich sind, noch mehrere Stunden lang Blut.
Bestandteile des Speichels der Desmodus rotundus Fledermaus wurden untersucht, und es zeigte sich, daß sie den hämostatischen Mechanismus von Säugerblut in drei unterschiedlichen Bereichen störten. Es zeigte sich, daß sie die Blutplättchenzusammenballung hemmten und Plasminogen aktivierten (Hawkey, C.M. Nature 211:434 (1966) und Hawkey, C.M. Br. J. Haematol. 13:1014 (1967)). Jede dieser Aktivitäten wurde mit einer unterschiedlichen Proteinfraktion in Zusammenhang gebracht. Die Fraktion, die Plasminogen aktivierte, wurde "Desmokinase" genannt (Hawkey, C.M., Nature). Cartwright, T., Blood, beschreibt die Reinigung von Desmokinase aus Desmodus- Speichel und schlägt vor, daß diese wirksamer ist als Urokinase (UK) und Streptokinase in der Lyse von vorgeformten Pfropfen.
Das Material bewirkt die schnelle Lyse sowohl von Blutpfropfen, die reich an Plasminogen sind, als auch von Fibrinplatten. Das Material ist inaktiv, wenn es auf Fibrinplatten ohne aktives Plasminogen aufgebracht wird.
Das Material ist fähig, die schnelle Lyse von ganzen Blutpfropfen zu bewirken. Der Autor nahm an, daß keine anderen proteolytischen Proteine anwesend sind. Der zweistufige Casein-Test ist für die Charakterisierung unbrauchbar. Es gibt Unterschiede zwischen der Weise, in der das Material reagiert, und dem Mechanismus, durch welchen die Urokinase Plasminogen aktivieren kann.
In der Veröffentlichung von T. CARTWRIGHT ist keine technische Lehre für die Isolierungsreinigung und Charakterisierung eines thrombolytischen Mittels angegeben. Die von T. CARTWRIGHT verwendete Technik umfaßt eine Gelfiltration, die unreines Material liefert. Die gefundenen Mittel sind durch eine negative Liste beschrieben, die zeigt, welche Funktionen das Material nicht hat, und welche Eigenschaften dem Material fehlen.
Die Verwendung des Plasminogenaktivators vom Gewebetyp (tPA) als thrombolytisches Mittel ist mit einer Reihe von Nachteilen behaftet, einschließlich ernsten Blutungskomplikationen, einem relativ häufigen Auftreten von erneutem Verschluß (Reocclusion), einer Unfähigkeit, gleichmäßig wirksam zu sein, und der Anfälligkeit für eine Inaktivierung durch Plasminogenaktivatorinhibitoren wie dem Plasminogenaktivatorinhibitor vom Typ 1 (PAI-1) (Loskutoff, Seminars in Thrombosis and Hemostasis, Band 14, Nr. 1 (1988)).
Es wird angenommen, daß Blutungskomplikationen, die sich aus der thrombolytischen Behandlung ergeben, durch die Aktivierung von zirkulierendem Plasminogen verursacht oder zumindest verschlimmert werden. Es wird angenommen, daß die Fähigkeit von tPA, sich an Fibrin zu binden, für seine ausgeprägte Substratpräferenz fibringebundenem Plasminogen gegenüber verantwortlich ist. Nichtsdestoweniger haben theoretische Überlegungen und die Ergebnisse klinischer Untersuchungen gezeigt, daß die erhöhten Spiegel von tPA, die für eine schnelle Pfropfenauflösung erforderlich sind, auch die Aktivierung von spürbaren Mengen von zirkulierendem Plasminogen bewirken.
Außerdem wird angenommen, daß die Wechselwirkungen von tPA mit Plasmainhibitoren, die funktionelle Aktivität von tPA während und nach der Infusion abschwächen, wodurch sie potentiell zu einem erneuten Verschluß beitragen.
Ein zusätzlicher Nachteil, der die Verwendung von tPA als thrombolytischem Mittel begleitet, ist, daß die erforderliche Dosis von tPA groß ist, zwischen 100 und 150 mg, was dieses therapeutische Einschreiten äußerst teuer macht.
Wir haben Plasminogenaktivatoren, die im Speichel und den Speicheldrüsen von Desmodus rotundus vorhanden sind, gefunden, die eine bemerkenswert größere Selektivität fibringebundenen Plasminogen gegenüber aufweisen und folglich bei Verwendung in der thrombolytischen Therapie mit verminderter Heftigkeit und Häufigkeit der Blutungsdiathese in Zusam menhang gebracht werden können. Außerdem werden die Aktivatoren nicht leicht durch Plasmainhibitoren wie PAI-1 inaktiviert und können folglich mit einer geringeren Häufigkeit des erneuten Verschlusses in Zusammenhang gebracht werden.
Es ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, fibrinolytische Mittel zu schaffen, die tPA sowohl mit Bezug auf Sicherheit als auch Wirksamkeit überlegen sind.
Es ist auch eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, die für erfindungsgemäße Proteine kodierenden DNA-Sequenzen zu identifizieren die Sequenzen aus von Gewebe abgeleiteter cDNA herzustellen und die Sequenzen funktionsfähig in Expressionsvektoren zu inserieren.
Es ist auch eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, erfindungsgemäße Proteine aus Wirtsmikroorganismen oder eukaryotischen Zellen herzustellen die zur Herstellung des Proteins durch Expressionsvektoren transformiert worden sind.
Es ist auch eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, Antikörper herzustellen die gegen die erfindungsgemäßen Proteine reaktiv sind.

Zusammenfassung der Erfindung

Die Erfindung umfaßt ein glycosyliertes oder unglycosyliertes, plasminogenaktivierendes Protein mit einer Homologie von mindestens 90% mit der folgenden Aminosäuresequenz:
worin das Protein einen Fibrincofaktor erfordert, um Plasminogen zu aktivieren. Diese Sequenz steht für Bat-PA(L).
Außerdem umfaßt die Erfindung ein glycosyliertes oder unglycosyliertes, plasminogenaktivierendes Protein mit einer Homologie von mindestens 90% mit der folgenden Aminosäuresequenz:
worin das Protein einen Fibrincofaktor erfordert, um Plasminogen zu aktivieren. Diese Sequenz steht für Bat-PA(H) plus der Signalsequenz.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist ein glycosyliertes oder unglycosyliertes, plasminogenaktivierendes Protein mit einer Homologie von mindestens 90% mit der folgenden Aminosäuresequenz:
worin das Protein einen Fibrincofaktor erfordert, um Plasminogen zu aktivieren. Diese Sequenz steht für Bat-PA(H).
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist ein glycosyliertes oder unglycosyliertes, plasminogenaktivierendes Protein mit einer Homologie von mindestens 90% mit der folgenden Aminosäuresequenz:
worin das Protein einen Fibrincofaktor erfordert, um Plasminogen zu aktivieren. Diese Sequenz steht für Bat-PA(I).
Die aus Fledermausspeichel und -speicheldrüsen isolierten Proteinplasminogenaktivatoren unterscheiden sich sowohl von tPA als auch Urokinase durch mehrere strukturelle und funktionelle Kriterien. Im Gegensatz zu tPA enthalten erfindungsgemäße Plasminogenaktivatoren nicht die Kringle-2-Domäne und den plasminempfindliche Aktivitätsstellung. Äquimolare Mengen dieser Aktivatoren und tPA sind in ähnlicher Weise wirksam, wenn sie bezüglich ihre Fähigkeiten, die Lyse von vorgeformten Plasmapfropfen zu katalysieren, überwacht werden. Ihre Aktivität gegenüber Plasminogen wird in Gegenwart eines Fibrincofaktors um mindestens das 27.000-fache stimuliert. Der entsprechende Wert für tPA beträgt nur das 205-fache. Drei unterschiedliche Arten entsprechend der Vollängen-, Fingerminus- und Finger-EGF-minus-Formen von tPA wurden aus dem Fledermausspeichel isoliert. Sie werden als Bat-PA(H), BAT-PA(I) bzw. Bat-PA(L) bezeichnet. Nachstehende Bezugnahmen auf "Bat-PA" entsprechen der unfraktionierten Zubereitung, die die drei molekularen Formen H, I und L enthält. Die Vollängen-Art bindet sich im Gegensatz zu den anderen beiden eng an Fibrin. Bat- PA(H), Bat-PA(I) und Bat-PA(L) weisen Mr-Werte von 49, 42 bzw. 40 kD auf, bestimmt durch SDS-PAGE in Gegenwart von Dithiothreitol (Fig. 1, Auftragungslinie 1) Die scheinbaren Mr-Werte der deglycosylierten Formen von Bat-PA(H), Bat-PA(I) und Bat-PA(L) (erhalten durch Entfernen der N- verketteten Kohlehydratketten mit Endoglycosidase F), wie durch SDS-PAGE bestimmt, betragen 44, 40 bzw. 38 kD) (Fig. 1, Auftragungslinie 2). Diese Proteine haben ein zwingendes Erfordernis für die Gegenwart eines Fibrincofaktors und eine bemerkenswerte Fähigkeit, die Lyse von Piasmapfropfen zu katalysieren. Der Mechanismus für die Selektivität dieser Proteine fibringebundenem Plasminogen gegenüber ist ein Ergebnis von verschiedenen Faktoren, einschließlich dem direkten Fibrin binden und der starken Hemmung durch NaCl, die durch die Gegenwart des Fibrinpfropfens vermindert wird. Außerdem sind die Fledermausplasminogenaktivatoren der Inaktivierung durch in dem Plasma vorhandenen Inhibitoren weniger empfänglich als tPA.
Bat-PA(H) enthält die Sequenz der Aminosäuren 1-441. Bat-PA(I) enthält die Sequenz der Aminosäuren 1-3 und 50-441 und Bat-PA(L) enthält die Sequenz der Aminosäuren 1-3 und 87-441. Außerdem ist die Aminosäure in der Position 88 von Threonin zu Prolin im Protein "L" geändert.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist ein Antikörper der mit dem erfindungsgemäßen Protein besonders reaktiv ist.
Weiterhin umfaßt die Erfindung ein glycosyliertes oder unglycosyliertes, plasminogenaktivierendes Fusionsprotein, einschließlich einer Aminosäuresequenz entsprechend den in Fig. 8a gezeigten Aminosäuren 190-441 und einer schweren Kettensequenz eines Plasminogenaktivator des Gewebetyps, wobei das Protein eine höhere plasminogenaktivierende Aktivität in Gegenwart des Plasminogenaktivatorinhibitors vom Typ 1 aufweist als der Gewebeplasminogenaktivator in Gegenwart des Plasminogenaktivatorinhibitors vom Typ 1.
Die erfindungsgemäßen Proteine können als Medikament verwendet werden. Deshalb umfaßt die Erfindung eine pharmazeutische Zusammensetzung zum Aktivieren von fibringebundenem Plasminogen, die eine wirksame Menge des erfindungsgemäßen Proteins enthält.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist eine DNA-Sequenz, die für ein erfindungsgemäßes Protein von Bat-PA(L), Bat-PA(H) plus Signalsequenz, Bat-PA(H) und Bat-PA(I) kodiert.
Unter die vorliegende Erfindung fällt auch ein replizierbares Klonierungsvehikel, das eine inserierte DNA-Sequenz enthält, die für ein erfindungsgemäßes Protein von Bat-PA(L), Bat-PA(H) plus Signalsequenz, Bat-PA(H) und Bat-PA(I) kodiert.
Eine Säugerzelle oder eine Bakterienzelle, die mit einem Klonierungsvehikel der Erfindung, das für Bat-PA(H) kodiert, transfiziert ist, ist Teil der Erfindung.
Weiterhin umfaßt die Erfindung ein Verfahren zum Reinigen eines plasminogenaktivierenden Proteins mit einem Molekulargewicht von weniger als 50.000 Dalton, umfassend die Schritte:
(a) Homogenisieren von submandibularen Drüsen der Desmodus rotundus Fledermäuse zur Bildung einer Mischung und Zentrifugieren der Mischung zur Bildung einer überstehenden Fraktion,
(b) Klären und dann Konzentrieren der überstehenden Fraktion,
(c) Zuführen des erhaltenen Konzentrats zu einer Phosphocellulose- Kationenaustauschsäule und Absorbieren des Plasminogenaktivators an der Säule,
(d) Eluieren der Säule, um plasminogenaktivierende Proteine enthaltende Fraktionen zu erhalten,
(e) Vereinen der Fraktionen und Zuführen des Pools zu einer Affinitätssäule mit immobilisiertem Erythrina-Trypsininhibitor,
(f) Fraktionieren der Plasminogenaktivatoren durch Hochdruckflüssigchromatographie, und
(g) Trennen der Plasminogenaktivatoren durch SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese.
Jede der plasminogenaktivierenden Arten wird durch Fibrin aktiviert. Die einzige wahrnehmbare Charakterisierung, die die Arten unterscheidet, ist die ausschließliche Fähigkeit von Bat-PA(H), sich eng an Fibrin zu binden, eine Eigenschaft, die mit der Gegenwart der Finger-Domäne in Wechselbeziehung gebracht wird. Die Spezifizität von Bat-PA(I) und Bat-PA(L) fibringebundenem Plasminogen gegenüber scheint unabhängig von einer Fähigkeit zu sein, sich eng an Fibrin zu binden.
Die strikte Fibrinabhängigkeit der Bat-PA-Aktivität ist eine Eigenschaft, die im Zusammenhang mit der fibrinolytischen Therapie wünschenswert ist. Blutungskomplikationen, die die Verwendung thrombolytischer Mittel begleiten, können durch die Aktivierung von zur Lieferung von Plasmin zirkulierendem Plasminogen verschlimmert werden. Die Ernsthaftigkeit und die Häufigkeit von Blutungskomplikationen kann durch die Verwendung eines erfindungsgemäßen Plasminogenaktivators verringert werden, dessen Wirkung auf die Stelle des Fibrinpfropfens lokalisiert ist.
293-Bat-PA-1 Säugerzellen (hinterlegte ATCC Nr CRL 10180), BPA-CN- pSZBB-1 04-20 Bakterienzellen (hinterlegte ATCC Nr. 68050), BPA-CK-pSZ89- 111-17 Bakterienzellen (hinterlegte ATCC Nr. 68052), BPA-FK-p89WO-1 Bakterienzellen (hinterlegte ATCC Nr. ), BPA-FN-p89WO-2C Bakterienzellen (hinterlegte ATCC Nr. 68053) und BPA-DK-p89WP-20A Bakterienzellen (hinterlegte ATCC Nr. 68049) wurden bei der American Type Culture Collection, Bethesda, MD, USA, gemäß den Erfordernissen des Budapester Vertrags hinterlegt. Sie sind bei Gewährung dieses Patents unwiderruflich verfügbar. Die Hinterlegung ist auch in Ländern, wie durch ausländische Patentgesetze gefordert, verfügbar, in denen Gegenstücke dieser Anmeldung oder ihre Weiterentwicklungen eingereicht sein können. Es ist jedoch selbstverständlich, daß die Verfügbarkeit dieser Hinterlegungen, keine Erlaubnis darstellt, den Gegenstand der Erfindung in Beeinträchtigung der Patentrechte, die durch Regierungshandlungen gewährt werden, durchzuführen.

Beschreibung der Figuren

Fig. 1 zeigt die SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese von gereinigten Fledermausplasminogenaktivatoren. Die Proben stammten von Fledermausspeicheldrüsen (Auftragungslinien 1 und 3) und Fledermausspeichel (Auftragungslinien 2 und 4). Jede Probe wurde vor dem SDS-PAGE mit Endogiycosidase F behandelt. Auftragungslinien 1 und 2: Western Blotting und Immunfärbung. Auftragungslinien 3 und 4: Fibrinautographie.
Fig. 2 zeigt die prozentuale Lyse von blutplättchenarmen Plasmapfropfen, die durch tPA und das 40 kd Fledermausplasminogenaktivatorprotein katalysiert wurden.
Fig. 3 zeigt die prozentuale Lyse von blutplättchenreichen Plasmapfropfen, die durch tPA und das 40 kd Fledermausplasminogenaktivatorprotein katalysiert wurden.
Fig. 4 zeigt die Inaktivierung von Plasminogenaktivatoren durch Plasmabestandteile.
Fig. 5 zeigt das Molekulargewicht bei SDS-PAGE von 40 kd und 45 kd Proteinen, identifiziert durch Silberfärbung und Fibrinautographie.
Fig. 6 zeigt die durch Bat-PA und tPA katalysierte Pfropfenlyse.
Fig. 7 zeigt das Binden von Plasminogenaktivatoren an Fibrin.
Fig. 8a zeigt die Nucleotidsequenz des Fledermausplasminogenaktivators cDNA und Aminosäuresequenzen der Plasminogenaktivatoren.
Fig. 8b zeigt eine schematische Darstellung der Aminosäuresequenz des Fledermausplasminogenaktivators und einen Vergleich mit menschlichem tPA:
Fig. 9 zeigt schematisch die Synthese des Plasmids pSZ88-100-20, das von dem bekannten Plasmid pSP73 abgeleitet ist und das die Bat-PA(H)- Gensequenz enthält, und schließlich die Synthese des Plasmids pSZ88-104- 20, das von dem bekannten Plasmid pD5 abgeleitet ist und das die Bat- PA(H)-Gensequenz enthält.
Fig. 10 zeigt schematisch die Synthese des Plasmids pSZ89-109, pSZ89-110, p89WO-10 und p89WO-8, die von dem bekannten Plasmid pSP73 abgeleitet sind und die die Bat-PA(H)-Gensequenz enthalten, und der Plasmide pSZ89- 111, pSZ89-112 und pSZ89-113, die von dem bekannten Plasmid pD5 abgeleitet sind und die die Bat-PA(H)-Gensequenz enthalten.
Fig. 11 zeigt schematisch die Synthese der Plasmide p89WO-14, p89WO-5,6, p89WO-9 und p89WO-12, die von dem bekannten Plasmid pSP73 abgeleitet sind und die die Bat-PA(I)-Gensequenz enthalten, und der Plasmide p89WO- 1, P89WO-2A,B,C, p89WO-3 und p89WO-4, die von dem bekannten Plasmid pds abgeleitet sind und die die Bat-PA(I)-Gensequenz enthalten.
Fig. 12 zeigt schematisch die Synthese der Plasmide p89WP-20A&B und p89WP-19A&B aus dem bekannten Plasmid pD5, p89WP-17 bzw. p89WP-18. p89WP-17 wurde erhalten aus p89WO-11 und p89WO-18 wurde erhalten aus p89WO-9.

Detaillierte Beschreibung der Erfindung

Die Erfindung betrifft einen natürlichen und rekombinationsabgeleiteten, gereinigten Plasminogenaktivator wie durch die Bat-PA(L), Bat-PA(H) plus Signalfrequenz, Bat-PA(H) und Bat-PA(I) betreffenden Sequenzen beschrieben.
Protein und Polypeptide werden hier austauschbar verwendet und betreffen ein lineares Polymer von Aminosäuren, die miteinander durch Amidbindungen verbunden sind. Die Sequenz der Aminosäuren in der Kette ist von kritischer Bedeutung bei dem biologischen Wirken des Proteins oder Polypeptids. Plasminogenaktivatoren, wie hier verwendet, beziehen sich auf Proteine, die die Bildung von Plasmin katalysieren, ein Enzym, das Peptide und Ester von Arginin und Lysin hydrolysiert und Fibrin in lösliche Produkte umwandelt.
Monoklonale und polyklonale Antikörper für die Proteine sind brauchbar für das Isolieren und Identifizieren von erfindungsgemäßen Proteinen. Sie können durch irgendeine der üblichen Techniken, die in der Technik bekannt sind, hergestellt werden. Polyklonale Antikörper können beispielsweise durch ein Tier wie ein Kaninchen synthetisiert werden, daß eine Injektion der Desmodus rotundus Plasminogenaktivatorproteine erhalten hat. Nach der Injektion steigt der Antikörperspiegel in dem Tier an. Antikörper enthaltendes Blut, Antiserum genannt, wird dann dem Tier entnommen. Plasminogenaktivatorspezifischer Antikörper wird dann von anderen Antikörpern in dem Antiserum mittels irgendeiner einer Reihe von Abtrennungstechniken, beispielsweise mittels Affinitätschromatographie, isoliert. Monoklonale Antikörper können unter Verwendung der Technik von Kohler und Milstein, Nature, 256, Seiten 495-497 (1975) hergestellt werden.
Natürliche Proteine, wie hier verwendet, beziehen sich auf Vollängen- Proteine, die durch die entsprechenden Gene erzeugt sind. Rekombinationsabgeleitet bezieht sich auf die Isolierung eines Gens oder cDNA für ein gewünschtes Protein und die Verwendung dieses gereinigten Gens oder cDNA zum Bau einer Zelle, die das gewünschte Protein vermehrt bildet.
Mikroheterogene Formen, wie hier verwendet, beziehen sich auf ein einzelnes Genprodukt, d.h. ein Protein, das aus einer einzigen Geneinheit der DNA erzeugt wird, die nach der Translation strukturell modifiziert ist. Diese strukturellen Modifikationen führen jedoch nicht zu irgendwelchen signifikanten Veränderungen der Aktivität des Proteins. Die Modifikationen können entweder in vivo oder während des Isolierungs- und Reinigungsverfahren stattfinden. Die in vivo Modifikation kann zu der Acetylierung an dem N-Endpunkt, der Proteolyse, der Glycosylierung oder der Phosphorylisierung führen, ist aber nicht darauf beschränkt. Die Proteolyse kann eine Exoproteolyse umfassen, bei der eine oder mehr endständige Aminosäuren aufeinanderfolgend zur Herstellung mikroheterogener Formen mit weniger Aminosäuren als dem ursprünglichen Genprodukt enzymatisch gespalten werden. Die Proteolyse kann auch die endoproteolytische Modifikation umfassen, die sich aus der Wirkung der Endoproteasen ergibt, die das Peptid an spezifischen Stellen innerhalb der Aminosäuresequenz spalten. Ähnliche Modifikationen können während des Reinigungsverfahrens auftreten, was zu der Herstellung von mikroheterogenen Formen führen kann. Die während der Reinigung üblichste Modifikation ist die Proteolyse.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist ein plasminogenaktivierendes Protein mit einer Polypeptidsequenz, die zu mindestens 95% homolog mit der Polypeptidsequenz der Aminosäuren 1-441 ist, die in Fig. Sa gezeigt ist, wobei das Protein eine plasminogenaktivierende Aktivität hat, die in Gegenwart eines Fibrincofaktors stimuliert wird und wobei das Protein fähig ist, sich eng an Fibrin zu binden.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist ein plasminogenaktivierendes Protein mit einer Polypeptidsequenz, die zu mindestens 90% homolog mit der Polypeptidsequenz der Aminosäuren 1-441 ist, die in Fig. 8a gezeigt ist, wobei das Protein eine plasminogenaktivierende Aktivität hat, die in Gegenwart eines Fibrincofaktors stimuliert wird und wobei das Protein fähig ist, sich eng an Fibrin zu binden.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist ein plasminogenaktivierendes Protein mit einer Polypeptidsequenz, die zu mindestens 95% homolog mit der Polypeptidsequenz der Aminosäuren 1-3 und 50-441 ist, die in Fig. Ba gezeigt ist, wobei das Protein eine plasminogenaktivierende Aktivität hat, die in Gegenwart eines Fibrincofaktors stimuliert wird.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist ein plasminogenaktivierendes Protein mit einer Polypeptidsequenz, die zu mindestens 90% homolog mit der Polypeptidsequenz der Aminosäuren 1-3 und 50-441 ist, die in Fig. 8a gezeigt ist, wobei das Protein eine plasminogenaktivierende Aktivität hat, die in Gegenwart eines Fibrincofaktors stimuliert wird.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist ein plasminogenaktivierendes Protein mit einer Polypeptidsequenz, die zu mindestens 95% homolog mit der Polypeptidsequenz der Aminosäuren 1-3 und 87-441 ist, die in Fig. 8a gezeigt ist, (wobei die Aminosäure an der Stellung 88 sich von Threonin zu Prolin verändert hat), wobei das Protein eine plasminogenaktivierende Aktivität hat, die in Gegenwart eines Fibrincofaktors stimuliert wird.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist ein plasminogenaktivierendes Protein mit einer Polypeptidsequenz, die zu mindestens 90% homolog mit der Polypeptidsequenz der Aminosäuren 1-3 und 87-441 ist, die in Fig. 8a gezeigt ist, (wobei die Aminosäure an der Stellung 88 sich von Threonin zu Prolin verändert hat), wobei das Protein eine plasminogenaktivierende Aktivität hat, die in Gegenwart eines Fibrincofaktors stimuliert wird.
Die Erfindung betrifft weiterhin die Isolierung und Reinigung der genetischen Information, die für einzelne Proteine verantwortlich ist, und Verfahren der Expression der entsprechenden Proteine.
Fig. 1 zeigt die SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE) des gereinigten Fledermausplasminogenaktivators. Proben wurden mit 25 mM Dithiothreitol vor der Elektrophorese auf einem 11 %-igen gestapelten SDS- Polyacrylamidgels (stacking SDS-polyacrylamide gel) vorbehandelt. Die Auftragungslinie 1 zeigt den Aktivator (3,6 ug), gereinigt aus Federmausspeicheldrüsen, die Auftragungslinie 2 zeigt den Aktivator (3,6 ug), behandelt mit Endoglycosidase F (Boehringer Mannheim) (0,1 Einheiten während 24 Stunden bei 37ºC) und die Auftragungslinie 3 zeigt 0,1 Einheiten Endoglycosidase F. Die Proteinmolekulargewichtsmarker sind wie angegeben. Fledermausplasminogenaktivator (100 ng) aus Drüsen (Auftragungslinie 1) und Speichel (Auftragungslinie 2) wurden mittels Western Blotting unter Verwendung von Kaninchenantifledermausplasminogenaktivatorantikörpern und mit alkalischer Phosphatase konjugiertem Ziegenantikaninchen-IgG ausgetestet. Die Fibrinautographie des Aktivators (15 IE) aus Drüsen (Auftragungslinie 3) und Speichel (Auftragungslinie 4) wurde wie in Laemmli, U.K., Nature 227, Seiten 680 bis 685 (1970) beschrieben, durchgeführt.
Um die in Fig. 1 angegebenen Daten zu erhalten, wurden gefrorene, submandibuläre Primär- und Nebendrüsen (6 g) von Desmodus rotundus Fledermäusen in 40 m 10 mM Tris-HCl, 0,5 M NaCl, pH-Wert 7,5, verbracht und sofort unter Verwendung eines Brinkmann-Homogenisators homogenisiert. Das Homogenat wurde bei 27.000 x g während 20 Minuten zentrifugiert. Die überstehende Fraktion wurde durch Zentrifugieren bei 100.000 x g während 30 Minuten geklärt, mit 20 mM Tris-HCl, pH-Wert 7,0, 0,01% Tween 80 auf 50 mM NaCl verdünnt und auf eine Phosphocellulose- Kationenaustauschsäule (Whatmann P11) aufgebracht, die in 20 mM Tris- HCl, ph-Wert 7,2, 50 mM NaCl und 0,01% Tween 80 äquilibriert war. Nach der Probenaufbringung wurde die Phosphocellulosesäule erschöpfend mit dem vorstehenden Äquilibrierungspuffer gewaschen. Der Fledermausplasminogenaktivator wurde aus der Phosphocellulosesäuie mit 20 mM Tris-HCl, pH- Wert 7,2, 0,5 M NaCl und 0,01 % Tween 80 eluiert und auf eine Affinitätssäule aufgebracht, die aus Erythrina-Trypsininhibitor (ETI) (American Diagnostica), gekoppelt mit CNBR-activierter Sepharose 413 (Pharmacia), bestand. Die Affinitätssäule wurde mit 20,mM NaH&sub2;PO&sub4;, 0,5 M NaCl, pH-Wert 7,0, 0,1% Tween 80 gewaschen, und dann wurde der Aktivator mit 50 mM Na-Acetat, 0,2 M NaCl, pH-Wert 4,0, und 0,1% Tween 80 eluiert. Die den Aktivator enthaltenden Fraktionen wurden vereint und eine 1 M Tris-Base wurde zugegeben, um eine endgültige Tris-Konzentration von 25 mM zu ergeben. Die gereinige Probe wurde bei -70ºC gelagert. Die Proteinkonzentration wurde mit der farbstoffbindenden Biorad Testansatz unter Verwendung von Rinderserumalbumin als Standard berechnet.
Fig. 6 zeigt die Pfropfenlyse, katalysiert durch Fledermausplasminogenaktivator und tPA. Die Plasmapfropfen wurden gebildet durch Zugabe von 0,2 IE menschlichem Thrombin (Sigma) und 7,5 mM CaCl&sub2; zu195 ul menschlichem Plasma, das [¹²&sup5;I] Fibrinogen (100.000 cpm/Pfropfen) enthielt. Das endgültige Volumen jeder Probe betrug 200 ul. Die Pfropfen wurden in Gegenwart von kleinen Holzstäbchen gebildet und hafteten an diese, wurden während 30 Minuten bei 37ºC gealtert, zusammengedrückt, um Flüssigkeit auszudrücken und in 250 ul Plasma überführt, dem 25 E/ml Hirudin (Sigma) zugegeben wurden. Fünfundzwanzig ul 0,1 M Tris-HCl, pH- Wert 8,0 und 0,01% Tween 80, die den Plasminogenaktivator enthielten, wurden der Lösung zugegeben, welche die Pfropfen benetzte, die Proben wurden bei 37ºC inkubiert und Teilmengen wurden entfernt und mit Bezug auf lösliche Fibrinzersetzungsprodukte gezählt. Für diese Untersuchung wurden Fiedermausplasminogenaktivator, gereinigt aus Speicheldrüsen, und zweikettiges tPA verwendet. , 3 nM; Bat-PA; , 3 nM t-PA; , 10 nM Bat-PA; , 10 nM t-PA. Fledermausplasminogenaktivator und t-PA wiesen ähnliche Wirksamkeiten auf, wenn sie bezüglich ihrer Fähigkeiten, die Freisetzung von radioaktiv markierten Fibrinzersetzungsprodukten aus vorgeformten Plasmapfropfen zu katalysieren, überwacht wurden.
Fig. 7 zeigt die Bindung von Plasminogenaktivatoren an Fibrin. Auftragungslinie 1, Bat-PA, 1,8 pMol; Auftragungslinien 2 und 3, 10% des Voiumens der Pellet- bzw. überstehenden Fraktionen aus dem Fledermausplasminogenaktivator, der die Fibri nprobe enthielt; Auftragungslinie 4, einkeftiges tPA, 1,8 pMol, Auftragungslinien 5 und 6, 10% des Volumens der Pellet- bzw. überstehenden Fraktionen aus der tPA enthaltenden Fibrinprobe; Auftragungslinie 7, Urokinase, 0,5 pMol; Auftragungslinien 8 und 9 10% des Volumens der Pellet- bzw. überstehenden Fraktionen aus den Urokinase enthaltenden Fibrinproben. Die drei Fledermausplasminogenaktivatorarten (Auftragungslinie 1) sind ungleichmäßig zwischen den überstehenden und Pellet-Fraktionen verteilt. Die Masse der Bat-PA(H) teilt sich innerhalb des Fibrinpellets (Auftragungslinie 2) auf, während Bat-PA(I) und Bat-PA(L) keine wahrnehmbare Affinität für Fibrin haben und hauptsächlich in der überstehenden Fraktion lokalisiert sind (Auftragungslinie 3). Teilmengen von tPA (Auftragungslinie 4) und Urokinase (Auftragungslinie 7) wurden auch bezüglich ihrer Fähigkeit, sich an Fibrin zu binden, überwacht. Wie erwartet bindet sich tPA eng an Fibrin und teilt sich innerhalb der Pelletfraktion auf (Auftragungslinie 5), aber Urokinase ist ausschließlich in der überstehenden Fraktion (Auftragungslinie 9) lokalisiert.
Fibrinpfropfen wurden durch die Zugabe von 0,2 lE Thrombin zu 200 ul 10 mM NaH&sub2;PO&sub4;, 140 mM NaCl, pH-Wert 7,4, 0,01% Tween 80, das menschliches Fibrinogen (1 mg/ml) enthält, EDTA (5 mM) und Fledermausplasminogenaktivator (18 pMol) oder einem einkettigen tPA (18 pMol) oder Urokinase (5,5 pMol) gebildet. Das einkettige tPA wurde aus einer Mischung aus einkettigem und zweikettigem tPA durch Chromatographie mit einer monoklonalen Antikörpersäule gereinigt, die vorzugsweise einkettiges tPA (PAM-1, American Diagnostica) bindet. Fibrinpfropfen wurden während 1 Stunde bei 37ºC gealtert und bei 100.000 x g während 10 Minuten zentrifugiert. Die Pelletfraktionen wurden mit 400 ul NaH&sub2;PO&sub4;, NaCl, Tween 80 Puffer gewaschen, erneut mit 150 ul 0,5%-igem SDS suspendiert und bei 37ºC während 1,5 Stunden unter ständigem Rühren inkubiert. Die Pellet- und überstehenden Fraktionen, die Fledermausplasminogenaktivator enthielten, wurden mit Endo F. behandelt. Proben wurden SDS-PAGE unterzogen und mittels FA-Analyse analysiert.

Plasminogenaktivator-Testansätze

Fibrinplattenmethode:

Fibrinplatten wurden durch Lösen von Rinder- oder menschlichem Fibrinogen (2 mg/ml) und menschlichem Glu-Plasminogen (6 ug/m) in 1%-iger Agaroselösung (bei 55ºC gehalten) gebildet. Menschliches Thrombin (1,5 Einheiten) wurden dann vor dem Gießen der gemischten Lösung in kalibrierte Immundiffusionsplatten zugegeben. Vertiefungen wurden aus einer harten Fibrinplatte ausgestanzt, und Säulenfraktionen wurden aufgebracht. Die Bereiche der Lyse wurden beobachtet an denen eine Aktivität vorhanden war. Der Bereich der Lyse (mm²), pro Inkubationszeit bei 37ºC, kann mit den Einheiten der Aktivität des Enzyms in Wechselbeziehung gebracht werden.

Fibrinautoaraphie:

Proben wurden der SDS-PAGE unter nichtreduzierenden Bedingungen unterzogen, und Acrylamidgel wurde extensiv in Triton X-100 (2,5%) gewaschen und dann auf ein plasminogenenthaltendes Fibrinagarosegel verbracht. Die Plasminogenaktivatoren renaturieren aufgrund der Triton-Behandlung und diffundieren in das Agarosegel, wo sie Plasminogen zur Lieferung von Plasmin aktivieren. Erzeugtes Plasmin zersetzt das Fibrin, was zu dem Auftreten einer Zone der Fibrinolyse führt, die gegen den Hintergrund des nichtzersetzten Fibrins leicht erkannt wird.

Gekoppelter amidolytischer Testansatz:

Die Aktivierung von Plasminogen zur Lieferung von Plasmin wurde in Gegenwart von Desafib untersucht, und die Erzeugung von Plasmin wurde mit einem kolorimetrischen Plasminsubstrat, Spectrozyme PL, überwacht. Die Fledermausplasminogenaktivatoren wurden mit menschlichem Glu-Plasminogen (20 ug/ml), Spectrozyme PL (0,4 mM) und Desafib (80 ug/ml) inkubiert. Die Mischung wurde während 60 Minuten bei 37ºC inkubiert. Die Reaktion wurde durch die Zugabe von 50 ul 10%-iger SDS beendet. Die Absorption des abgespaitenen Substrats wurde bei 405 nm überwacht. Ei ne Aktivitätsei nheit der Fledermausplasminogenaktivatoren entspricht der Menge Enzym, die den Umsatz von 1 uMol Spectrozyme PL in 1 Minute bei 37ºC katalysiert.

Wirkstellentitrierung (active site titration):

Fledermausplasminogenaktivatoren wurden mittels zweier verschiedener Techniken titriert, um die funktionelle Molarität zu bestimmen. Die erste Technik beruhte auf dem Prinzip der Rücktitrierung eines kalibrierten Trypsinstandards mit einer kalibrierten Standardlösung eines Chlormethylketoninhibitors von sowohl Trypsin- als auch Plasminogenaktivatoren. Eine Lösung von Trypsin (500 nm) wurde direkt unter Verwendung von 4-Methyl-umbellifery-p-guanidinbenzoat (MUGB) titriert. Das Chlormethylketon (Dansyl-glutamyl-glycyl-arginin-chlormethylketon, DNS-EGRCK) wurde gegen das MUGB-kalibrierte Trypsin titriert. Die Reaktion einer solchen kalibrierten Trypsinlösung mit einer kalibrierten Chlormethylketonlösung gestattet die Messung der Verringerung der Hemmung des Trypsinstandards, wenn der CK-Standard mit den Aktivatoren vorinkubiert ist. Die Gegenwart von Plasminogenaktivatoren führt zu einer Erhöhung der Aktivität mit Bezug auf die Trypsin-CK-Kontrolle, die proportional zu der Menge an Plasminogenaktivator ist.
Die zweite Technik umfaßte die Beobachtung der Brechkinetik nach der Zugabe von MUGBE zu dem Fledermausplasminogenaktivator, wenn die Reaktion bei einer niedrigen Temperatur (5ºC) durchgeführt wurde.

SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese:

Wir verwendeten ein modifiziertes Protokoll des Laemmli-Systems (Nature, 227, Seiten 680 bis 685 (1970)). Gestapelte und Trenngels (0,75 mm) enthielten 4% bzw. 10% Polyacrylamid. Die Gels wurden bei 75 Volt während 20 Stunden laufen gelassen. Protein wurde durch Silberfärbung nachgewiesen.

Reinigung der Fledermausplasminogenaktivatorproteine

Materialien:

Der Speichel und die Speicheldrüsen von Desmodus rotundus wurden von Antibody Associates, Bedford, TX, und von Dr. C. Rupprecht, Rabies Unit, Wistar Institute, Philadelphia, PA, erworben. Fibrinogen, Plasminogen, Thrombin und Substrate für den amidolytischen Testansatz stammten von American Diagnostica, New York, NY. Für die Elektrophorese verwendete Materialien wurden von Biorad, Inc. erworben und für die Säulenchromatographie verwendete Materialien stammten von Pharmacia. HPLC-Säulen waren die Produkte von Vydac. Immundiffusionsplatten stammten von ICN.

Verfahren:

Die Reinigung der Aktivatoren aus Fledermausspeichel umfaßt die Phosphocellulose-, Phenyl-Sepharose- und C4-Umkehrphasen-HPLC- Chromatographieschritte.
Der Speichel von der Desmodus rotundus Fledermaus wurde auf das 3-fache seines Volumens mit 10 mM Tris, pH-Wert 7,4, 50 mM NaCl, 0,01% Tween 20 Lösung verdünnt. Der verdünnte Speichel wurde während 5 Minuten mit 12000 UpM bei 4ºC in einer Eppendorf Zentrifuge zentrifugiert. Der Überstand wurde direkt auf eine Phosphocellulose-Säule (25 x 10 cm) beschickt und mit dem gleichen Puffer gewaschen, der für die Verdünnung des Speichels verwendet wurde. Die Säule wurde mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 6 ml/Std. betrieben. Die Aktivität wurde durch den Bereich der Lyse unter Verwendung der Fibrinplattenmethode bestimmt, und das Protein wurde bei O.D. (optische Dichte) 280 überwacht.
Fledermausplasminogenaktivatoren banden sich eng an die Phosphocellulose-Säule. Die Rückgewinnung der Aktivität nach der Eluierung unter Verwendung von 1 M NaCl betrug 94% (Tabelle 1).
Fraktionen aus der Phosphocellulosesäule, die Plasminogenaktivatoraktivität aufwiesen, wurden vereint und direkt auf eine Phenyl-Sepharose-Säule (1,5 x 5,0 cm) in Gegenwart von 2,5 M NaCl aufgebracht. Die Säule wurde mit einem Gradienten von 2 M NaCl zu O M NaCl und 10% Glycerin in 10 mM Tris- Puffer gewaschen. Das Waschen mit der 10%-gen Glycerinlösung wurde fortgesetzt, bis die gesamte Aktivität eluiert war.
Die Chromatographie unter Verwendung der Phenyl-Sepharose-Säuie führte zu einer 82%-igen Rückgewinnung der Aktivität (Tabelle 1). Die Aktivität war jedoch in zwei Spitzen, 1 und 2, zerlegt, die getrennt vereint wurden. Die zwei Spitzen hatten unterschiedliche Molekulargewichte, bestimmt durch Silberfärbung im Anschluß an SDS-PAGE und Fibrinautographie (Fig. 5). Die Spitze 1, von der wie annehmen, daß sie Bat-PA(L) darstellt, eluierte in Richtung auf das Ende des Salzgradienten (2 M - O M NaCl). Wir nehmen an daß die Spitze 2 Bat-PA(I) darstellt.
Nach der Phenyl-Sepharose erzielten wir eine etwa 660-fache Reinigung von Bat-PA(L). Die Gesamtaktivität von Bat-PA(I) Enzym wurde nicht optimal mittels amidolytischem Testansatz unter Verwendung eines Plasminogen/Spectrozyme-PL-Kopplungssystems bestimmt, da Desafib kein wirksamer Cofactor für diesen Fledermausplasminogenaktivator ist. TABELLE I Reinigungstabelle SCHRITT AKTIVITÄT EINHEIT AUSBEUTE PROTEIN FLEDERMAUSSPEICHEL PHOSPHOCELLULOSE PHENYLSEPHAROSE Spitze C4-UMREHRPHASEN-HPLC *DESAFIB IST KEIN GEEIGNETER COFACTOR FÜR DIESE ART VON BAT- PA. N.B. NICHT BESTIMMT:
Der letzte Reinigungsschritt für die Proteine war eine C4-Umkehrphasen- HPLC-Säule die mit 0,1% (V/V) Trifluoressigsäure (TFA) in Wasser äquilibriert wurde. Fraktionspools der Proteine wurden durch Lyophilisierung konzentriert und direkt auf die HPLC-Säule aufgebracht. Das Enzym wurde mittels eines Gradienten von 25% bis 55% Acetonitril in Gegenwart von 0,1% TFA eluiert. Die Proteinspitzen wurden bei O.D. 214 überwacht und getrennt gesammelt. Flüchtige Materialien wurden durch Vakuumzentrifugieren entfernt, gefolgt von Lyophilisierung. Die Proteine wurden erneut in 10 mM Essigsäure gelöst. Die Aktivität wurde unter Verwendung der Fibrinplattenmethode ausgetestet, nachdem die Essigsäure mittels des Tris Tween Puffers neutralisiert worden war.
Die Reinigung des Fledermausplasminogenaktivators aus den Fledermausspeicheldrüsen wurde wie folgt durchgeführt.
Die submandibulären Primär- und Nebendrüsen der Fledermäuse werden in einen Puffer verbracht, der 10 mM Tris-HCl, 0,5 M NaCl, 0,1% Tween 80, pH- Wert 7,5, enthielt, und sofort unter Verwendung eines Polytrons homogenisiert. Nach dem Zentrifugieren wurde die geklärte SN-Fraktion in 10 mM Tris-HCl, 50 mM NaCl, pH-Wert 7,2 durch die Verwendung einer Amicon Rührkammer (YM 10 Membran) sowohl konzentriert als auch äquilibriert. Das erhaltene Konzentrat wird direkt einer Phosphocellulosesäule (Whatmann) zugeführt, die mit 10 mM Tris-HCl, 50 mM NaCl, 0,01% Tween 80, pH-Wert 57,2, äquilibriert ist. Das Plasminogenaktivatorprotein wird quantitativ an der Phosphocellulosesäule absorbiert und mit 0,5 M mit NaCl ergänztem Anwendungspuffer stufenweise eluiert. Die Aktivitätsrückgewinnung beträgt typischerweise mehr als 80%.
Aktivatoraktivität enthaltende Fraktionen wurden vereint und auf eine Affinitätssäule aufgebracht, die aus Erythrina-Trypsin-Inhibitor (ETI) mit Sepharose 4B gekoppelt besteht. Die Masse der Aktivität wurde an dieser Säule absorbiert und wirksam durch Waschen der Säule mit 50 mM Na- Acetat, pH-Wert 4,0, 0,2 M NaCl und 0,1% Tween 80 eluiert. Die endgültige Rückgewinnung der Fledermausplasminogenaktivatoraktivität aus dem Drüsenextrakt unter Verwendung dieses Protokolls betrug 91%, was etwa 5,4 mg Fledermausplasminogenaktivator aus 6 g Drüsen ergab. Die Homogenität der Fledermausplasminogenaktivatorzubereitung wurde angegeben durch eine Übereinstimmung der geschätzten Proteinkonzentration und der berechneten funktionellen Molarität, wie durch Wirkstellentitrierung unter Verwendung von 4-Methyl-umbelliferyl-p-guanidinobenzoat bestimmt (Urano et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 150, 45-51(1988)).
Proteinfärbung im Anschluß an SDS-PAGE der vereinten aktiven Fraktionen zeigte eine komplexe Gruppierung von Banden, die einen Bereich von Mr- Werten aufweisen. Die Wanderung dieser Arten entspricht den Zonen der Aktivität wie durch FA-Analyse definiert. Diese Wechselbeziehung zusätzlich zu der Übereinstimmung zwischen Aminosäureanalyse, N-terminaler Analyse und Wirkstellentitrierungsdaten liefert einen Beweis, daß der Aktivator erfolgreich auf Homogenität gereinigt wurde.

Proteincharakterisierung und -aktivität:

Plasminogenaktivatoren der vorliegenden Erfindung weisen keine Aktivität mit plasminogenfreien Fibrinplatten auf. Die Inkubierung der Aktivatoren mit Plasminogen in Gegenwart von Fibrin I (Desafib) führt zu der Erzeugung von Plasmin wie durch Western Blotting und Immunfärbung mit einem Antiplasmin(ogen)-Antikörper beurteilt. Sie haben eine Aktivität menschlichem Plasminogen gegenüber, das an menschliches Fibrin gebunden ist, soie Rinderplasminogen gegenüber, das an Rinderfibrin gebunden ist.
Bei Sepharose-G-200-Gelfiltrierungschromatographie wurde die Fledermausplasminogenaktivitoraktivität, die in rohem Speichel vorhanden war, als breite Spitze mit einem ungefähren Molekulargewicht von 130K eluiert. Dieses Molekulargewicht war wahrscheinlich ein aggregiertes Molekulargewicht des Fledermausplasminogenaktivators. Es schien um den 32K Bereich an der FPLC Sepharosesäule in Gegenwart von 0,01% Tween 20 zu sein.
Während der Reinigungsuntersuchungen stand der Fledermausplasminogenaktivator nicht in Wechselwirkung mit Lysin-Sepharose, von der vorher gezeigt wurde, daß sie ein wirksamer Schritt zu Reinigung von Proteinen war, die sich an Fibrin über die Kringle-Domäne binden. So unterscheidet sich der Bindungsmechanismus der Aktivatoren an Fibrin von tPA.
Die Behandlung der Aktivatoren mit Endoglycosidase H und F bildet wirksame Proteine mit niedrigem Molekulargewicht, was angibt, daß die Aktivatoren Glycoproteine sind. Die Wechselwirkung dieser Proteine mit Weizenkeim- und Concavalin A-Agarose liefert eine weitere Unterstützung dieser Schlußfolgerung.
Die Fähigkeit von Bat-PA(H), Glu-Plasminogen zu aktivieren wurde mit einem gekoppelten Testansatz bewertet, welcher den Umsatz eines plasminspezifischen, amidolytischen Substrats überwachte (Tabelle II). Die spezifische Aktivität (IE/nMol) von Bat-PA(H) Glu-Plasminogen gegenüber betrug etwa 260 mal weniger als tPA, wenn bei Fehlen eines Fibrinmimetikums ausgetestet. Die spezifische Aktivität von Bat-PA(H) Glu- Plasminogen gegenüber in Gegenwart von Desafib betrug etwa 85% der von tPA aufgewiesenen. Folglich stimulierte Desafib die tPA- und Bat-PA(H)- Aktivität 205-fach bzw. 45.000-fach. Die von Bat-PA gezeigte spezifische Aktivität, wobei die Zubereitung die drei molekularen Formen enthielt, war Bat-PA(H) bei Fehlen von Desafib vergleichbar, aber betrug etwa 30% weniger als Bat-PA(H) in Gegenwart dieses Fibrincofaktors (Tabelle II). Wir folgern daraus, daß die Aktivitäten von Bat-PA(I) und BAT-PA(L) nicht auf die gleiche Weise wie Bat-PA(H) durch 80 ug/ml Desafib stimuliert werden. TABELLE II Aktivierung von Plasminogen durch Bat-PA(H). Bat-PA(I) und Bat-PA(L) Plasminogen-Aktivator Desafib-Konzentration -fache Stimulierung
Diese Daten melden spezifische Aktivitäten (IE/nMol) unter Verwendung des vorstehend beschriebenen gekoppelten, amidolytischen Testansatzes. Zweikettige tPA wurde für diese Testansätze verwendet. Die kataiytische Aktivität der einkettigen tPA wird nicht gemeldet, da die Ergebnisse durch die unvermeidbare Erzeugung von zweikettiger tPA während des Testansatzes unklar werden. Desafib wurde, wo angegeben, in den Testansatz aufgenommen. Die Angaben unter der Überschrift"-fache Stimulierung" sind die Verhältnisse der spezifischen Aktivitäten in Gegenwart von Desafib im Vergleich zu dem Fehlen von Desafib. Die Zahlen in Klammern sind die Stimulierung der Plasminogenaktivatoraktivität durch Desafib im Vergleich zu derjenigen, die tPA aufweist.
Die Fähigkeiten von tPA und Bat-PA(H), die Lyse von plasminogenenthaltenden Fibrinpfropfen zu katalysieren, wurde auch verglichen. Geringfügig höhere Konzentration von Bat-PA(H) sind erforderlich, um Pfropfenlyseraten zu erzielen, die mit denjenigen identisch sind, die sich aus Konzentrationen von tPA im Bereich von 0,25 bis 10 nM ergeben. Die Konzentrationen von tPA und Bat-PA(H) (abgeleitet von ihren Dosis-Effekt- Kurven), die zu ausgewählten Pfropfenlysegeschwindigkeiten führen, sind in Tabelle III angegeben. Die spezifische Aktivität von Bat-PA(H) mit Bezug auf tPA lag im Bereich von 59 bis 72% und stand in Wechselbeziehung zu der plasminogenaktivierten Konzentration. Die erhöhte spezifische Aktivität von Bat-PA(H) mit Bezug auf tPA bei höheren Konzentrationen kann Unterschiede zwischen diesen Plasminogenaktivatoren mit Bezug auf ihre Wechselwirkungsweise mit Fibrin und/oder Plasminogen widerspiegeln. TABELLE III Fibrinpfropfenlyse, vermittelt durch tPA and Bat-PA(H) Relative Wirksamkeit Geschwindigkeit
Pfropfenlyseexperim ente unter Verwendung des Turbidimetrietestansatzes wurden vierfach mit den folgenden Konzentrationen der 2-kettigen tPA oder Bat-PA(H) durchgeführt: 0,25, 0,50, 1,0, 2,5, 5,0, 7,5 und 10,0 nM. Eine Pfropfenlysegeschwindigkeit wurde als maximale Rate der abnehmenden Trübung
(-mOD/min) wie durch Analyse jedes Pfropfenlyseprofils mit der kinetischen Softmax Software bestimmt angezeigt. Vier und sechs unabhängige, lineare Dosis-Effekt-Kurven (Geschwindigkeit gegenüber log [Plasminogenaktivator]) wurden für tPA bzw. Bat-PA(H) erzeugt. In der Tabelle sind die Plasminogenaktivatorkonzentrationen angegeben, die zu den angegebenen Pfropfenlysegeschwindigkeiten führen. Diese Werte wurden von Gleichungen abgeleitet, die die am besten entsprechenden Linien, die aus der Analyse aller Dosis-Effekt-Kurven für tPA und Bat-PA(H) erstellt wurden, beschreiben. Die relativen Wirksamkeitswerte sind die Verhältnisse der tPA- mit Bezug auf die Bat-PA(H)-Konzentrationen, die sich bei der angegebenen Pfropfenlysegeschwindigkeit ergeben.
Die erfindungsgemäßen Fledermausplasminogenaktivatoren sind weniger anfällig für die Inaktivierung durch den schnell wirkenden Plasminogenaktivatorinhibitor vom Typ 1 (PAI-1) als tPA.
Es wird angenommen, daß die Konzentration von PAI-1 in dem Bereich eines verstopften Gefäßes viel höher ist als die aus Plasmauntersuchungen berechneten Konzentrationen. Das Vorhandensein von latentem PAI-1 in Plasma, und PAI-1 enthaltenden Blutplättchen, die durch Thrombin freigesetzt werden können, Adenosindiphosphat und anderen Blutplättchenagonisten, trägt zu den relativ hohen, örtlichen Konzentrationen in verstopften Bereichen bei. PAI-1 wirkt als Antiaktivator, der die Aktivität von tPA spezifisch blockiert.
Fig. 4 zeigt, daß tPA leichter durch Plasminogenaktivatorinhibitoren inaktiviert wird als Fledermausspeichelplasminogenaktivatoren. tPA und Fledermausspeichelplasminogenaktivatoren wurden jeweils in Plasma inkubiert und ihre jeweiligen Aktivitäten wurden zeitabhängig überwacht.
Die NaCl-vermittelte Hemmung der Plasminogenaktivierung durch sowohl tPA als auch dem 40 kd Protein wurde nicht beobachtet, als wir die Lyse der Fibrinpfropfen überwachten. In diesem Fall wurden die Pfropfen aus gereinigten Komponenten hergestellt, die Fibrinogen (sowohl markiert als auch unmarkiert), Plasminogen, α-2-Antiplasmin, Faktor XIIIa und Puffer mit oder ohne 0,1 M NaCl enthielten.

SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese von Bat-PA und Blotting von Proteinen auf Immobilon (PVDF Membrane)

Vereinte, aktive Fraktionen einer Trypsininhibitor-Affinitätssäule wurden erhalten und weiter unter Verwendung einer Vydac C4 HPLC-Säule fraktioniert, aus der das Plasminogenaktivatorprotein bei etwa 40% Acetonitril/0,1 % Trifluoressigsäure eluierte. Zwei Hauptaktivitätsspitzen (wie durch Fibrinplattenautolyse bestimmt) konnten nachgewiesen werden, die aus der HPLC-Säule eluierten. Die zwei Aktivitätsspitzen wurden getrennt vereint und als Bat-PA(I) und Bat-PA(II) bezeichnet.
Unter Verwendung von SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE), gefolgt von Fibrinautographie, zeigen sowohl Bat-PA (I) als auch (II) ein ähnliches Muster von lytischen Zonen, die im Bereich von Molekulargewichten von 42.000-46.000 Dalton lagen. Sowohl Bat-PA (I) als auch (II) konnten mit ³H-DFP (Diisopropyifluorphosphat), einem Wirkstellenmarkierungsreagens für Serinproteinasen markiert werden.
Die Polyacrylamidgelelektrophorese der mit I und II bezeichneten Fledermausplasminogenaktivatoren wurde unter Verwendung eines modifizierten Protokolls des Laemmli Systems (Nature, 227, Seiten 680 bis 685 (1970)) durchgeführt. Gestapelte und Abtrenngels (0,75 mM) enthalten 4% bzw. 10% Polyacrylamid. Die Gels werden während 20 Stunden bei 75 Volt laufen gelassen.
Durch SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese abgetrennte Proteine wurden auf Immobilon (PVDF Membrane), erworben vom Millipore, Katalog Nr. IPVH304FO, elektrogeblottet. Das Elektroblotting der Proteine wurde im wesentlichen wie von Matsudaira (J Bio. Chem. 261, Seiten 10035-10038, 1987) beschrieben durchgeführt. Kurz gesagt, werden Proteine aus dem SDS- Polyacrylamidgel bei 30 Volt während eines Zeitraums von 15 Stunden elektroeluiert. Der Immobilon-Blot wird dann mit Coomassie Blue gefärbt, um Bande von Protein auf dem Blot zu zeigen. Die Bande von Protein werden direkt aus dem Blot herausgeschnitten und in ein Gasphasenanalysator mit einem "Polybren"-Vorbehandlungsfilter unterhalb der gebiotteten Probe verbracht. Die Sequenzerprogramme und Reagenzien sind jene, die von dem Hersteller (Applied Biosystems) geliefert werden. Freigesetzte Aminosäurederivate werden durch ein Online-HPLC-System identifiziert.

N-terminale Aminosäuresequenzen von Plasminogenaktivatoren von Fledermausspeichel

Die N-terminale Sequenzierung von SDS-PAGE fraktioniertem Plasminogenaktivator wurde unter Verwendung einer Polyvinylidendifluoridmembran (Immobilon, Millipore) und einem Applied Biosystems Modell 470 Sequenator mit Online-PTH-Analyse (Matsudaira, P., J. Biol. Chem. 262, 10035-10038 (1987)) durchgeführt. V8-Fragmente des Plasminogenaktivators wurden durch die Reduktion/Alkylierung des Aktivators mit Dithiothreitol/lodacetamid, Inkubieren des modifizierten Proteins mit Staphylococcus aureus V8 Protease (Boehringer Mannheim) und Isolieren von proteolytischen Fragmenten unter Verwendung einer Vydac C-18 HPLC- Säule erzeugt. Das Wirkstellenpeptidfragment, T1, wurde wie folgt identifiziert: Plasminogenaktivator wurde mit [1,3-³H]- Diisopropylfluorphosphat (New England Nuclear) in Gegenwart von Desafib (American Diagnostica) inkubiert, mit Dithiothreitol und Iodacetamid behandelt, mit Trypsin digeriert, und das radioaktiv markierte Fragment wurde durch HPLC isoliert und einer Sequenzanalyse unterzogen.
Acht Proteinbanden, die Plasminogenaktivatoraktivität zeigten wurden auf dem Immobilon Blot identifiziert und der Sequenzanalyse unterzogen. Die erhaltenen Sequenzen sind nachstehend angegeben: A -( )- gibt an, daß keine Aminosäure in dieser bestimmten Stellung identifiziert werden konnte, am wahrscheinlichsten aufgrund der Instabilität und schlechten Rückgewinnung von bestimmten Aminosäuren aus dem Proteinanalysator.
Bande 1 - Ala-Tyr-Gly-Gky-Pro-Ser-Gku-( )-Arg-Tyr-Phe
Bande 2 - Ala-Tyr-Gly-Gly-Pro-Ser-Ala-( )-( )-Tyr-( )- Asp-Gln-Gly-Val
Bande 3 - Ala-Tyr-Gly-Val-Ala-Cys-Lys-Asp-Glu-Ile-Thr- Gln-Met-(Thr)-Tyr
Bande 4 - Ala-Tyr-Gly-Val-Ala-Cys-Glu-Asp-Glu-Ile-Thr- Gln-Met-(Thr)-Tyr-Lys
Bande 5 - Ala-Tyr-Gly-Gly-Pro-Ser-Glu-Leu-( )-Tyr-Phe- Ile-Gly-Gly
Bande 6 - Ala-Tyr-Gly-Asp-Pro-His-Ala-Thr-Ala-Tyr-Lys- Asp-Gln-Gly-Val
Bande 7 - Ala-Tyr-Gly-Asp-Pro-His-Ala-Thr-Cys-Tyr-Lys- Asp-Gln-Gly-Val-Thr-Tyr-Arg-Gly
Bande 8 - Ala-Tyr-Gly-Asp-Pro-His-Ala-Thr-Cys-Tyr-Lys- Asp-Gln-Gly-Val-Thr-Tyr-Arg-Gly-Thr

Molekülklonen des Fledermausplasminogenaktivators cDNA

Rekombinante DNA-Technologie wird hier definiert als Technologie, die es gestattet, daß Segmente genetischer Information, DNA, von unterschiedlichen Zellen, üblicherweise von unterschiedlichen Organismen außerhalb der Organismen, aus denen die DNA erhalten wurde, endseitig verbunden werden, und diese Hybrid-DNA in eine Zelle eingebaut wird, welche die Herstellung des Proteins gestattet, für welches die ursprüngliche DNA kodiert. Genetische Information, DNA oder mRNA wird isoliert und in einen geeigneten Klonierungsvektor eingebaut und in eine geeignete Wirtszelle transfiziert.
Klonierungsvektor, wie hier verwendet, wird definiert als eine DNA-Sequenz, die den Einbau spezifischer, experimenteller Fremd-DNA gestattet, wobei die kombinierte DNA in eine Wirtszelle eingebaut wird, die auf stabile Weise existieren kann und das durch die experimentelle DNA vorbestimmte Protein exprimieren kann. Die mit der Vektor-DNA kombinierte Fremd-DNA bildet ein rekombinantes DNA-Molekühl, das von der Rekombinationstechnologie abgeleitet ist. Klonierungsvektoren können Plasmide, Bakteriophage, Viren und Cosmide umfassen. Es ist ersichtlich, daß jeglicher Klonierungsvektor zum Klonen der neuen Desmodus-Protein-DNA-Sequenzen verwendet werden kann. Expressionsvektoren sind hier als DNA-Sequenzen definiert, die für die Transkription von geklonten Kopien von Genen und die Translation ihrer mRNA's in einen geeigneten Wirt erforderlich sind. Solche Vektoren können verwendet werden, um entweder prokaryotische oder eukaryotische Gene in einer Vielzahl von Zellen wie Bakterien-, Hefe-, Insekten- und Säugerzellen zu exprimieren. Die Proteine können auch in einer Reihe von Virussystemen exprimiert werden. Ein geeignet aufgebauter Expressionsvektor sollte enthalten: einen Ursprung einer Replikation für die autonome Replikation in Wirtszellen, selektive Marker, eine begrenzte Anzahl von brauchbaren Restriktionsenzymschnittstellen, eine hohe Kopienzahl, und starke Promotoren. Ein Promotor wird definiert als DNA-Sequenz, die die RNA-Polymerase zur Bindung an DNA und zur Initiierung der RNA-Synthese ermöglicht. Ein starker Promotor ist einer der bewirkt, das mRNA's mit großer Häufigkeit initiiert werden. Expressionsvektoren können umfassen, aber sind nicht beschränkt auf, Klonierungsvektoren, modifizierte Klonierungsvektoren entsprechend konstruierte Plasmide oder Viren.
Die erfindungsgemäßen Proteine können, ohne hierauf beschränkt zu sein existieren als die vollständigen Proteine, spezifiziert durch die definierten Gene in dem natürlichen Desmodus Protein oder als irgendein Fragment oder eine Untereinheit davon oder als Hybride des vollständigen Proteins oder seiner Fragmente oder Untereinheiten, vorausgesetzt die Proteine weisen die Eigenschaften eines Plasminogenaktivators, abgeieitet von Desmodus rotundus Speichel mit einem strikten Erfordernis nach der Gegenwart von Fibrin, auf. Die vollständigen Proteine, wie hier verwendet, beziehen sich auf das posttranskriptionell modifizierte Polypeptid voller Länge, das durch die geeigneten Desmodus Gene hergestellt ist. Die vollständigen Proteine können durch die Reinigung aus Desmodus rotundus Speichel oder durch die Expression in einem geeigneten Expressionsvektor des entsprechenden rekombinationsabgeleiteten Genprodukts erhalten werden. Proteinfragmente oder Untereinheiten beziehen sich auf irgendeinen Teil des Proteins, der weniger Aminosäuren als das vollständige Protein enthält und die Fähigkeit zur Aktivierung von Plasminogen unter den gleichen Bedingungen die das ursprüngliche Protein bei behält. Hybridproteine umfassen, aber sind nicht beschränkt auf, Fusionsproteine oder Proteine, die sich aus der Expression von multiplen Genen innerhalb des Expressionsvektors ergeben. Ein Fusionsprotein wird definiert als eines, bei dem eine begrenzte Anzahl von Aminosäuren, die für den Expressionsvektor kodiert sind, exprimiert sind, und die Expression führt zu ihrer Anhaftung an das spezifische Plasminogenaktivatorpolypeptid. Proteine, die sich aus multiplen Genen ergeben, können das spezifische Aktivatorpolypeptid, gebunden an ein zweites Polypeptid oder Peptide durch Peptidbindungen, umfassen, die die Plasmincgenaktivierung fördern.
Speicheldrüsen wurden von 10 frisch getöteten Fledermäusen erhalten und für die Isolierung von Poly-A+ RNA verwendet. Diese RNA wurde zum Aufbau einer λ gt 22 unidirektionalen cDNA Bank, die aus mehr als 2 x 10&sup6; rekombinantem Bakteriophag besteht, verwendet. Eine zusätzliche RNA Zubereitung, die für die Northern Blotting Analyse verwendet wurde, wurde aus Drüsen isoliert, die auf Trockeneis schockgefroren waren. Die Qualität dieser RNA war vergleichbar derjenigen, die aus frischem Gewebe isoliert war.
Die gesamte RNA wurde aus den submandibulären Primär- und Nebendrüsen von Fledermäusen (Desmodus rotundus) mittels des Tieftemperaturguanidiniumtriocyanatverfahrens isoliert (Han, J. et al. Biochem. 26, 1617-1625 (1987). Poly(A)+ RNA wurde mittels Oligo(dT)- Cellulosechromatographie isoliert. Doppelsträngige cDNA wurde durch eine Modifizierung des Verfahrens von Gubler und Hoffman (Gene 25, 263-269 (1983)) wie vorstehend beschrieben (Dixon, R.A.F. et al., Nature 321, 75-79 (1986)) hergestellt. Die cDNA wurde durch Agarosegelektrophorese in Pools von 1-2 kb und 2-7 kb Längen größenfraktioniert, die an die EcorRI-Stelle von Lambda-ZAP-Armen (Stratagene) ligasiert wurden. Die Bank wurde bezüglich E. coli Stämmen LE392 amplifiziert und durch Plaquehybridisierung wie beschrieben (Maniatis, T., et al., Molekular Cloning: A Laboratory Manuel, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY) durchgeforscht. Paare von partiell überlappenden komplementären Oligonucleotiden entsprechend den Peptiden N-1, N-3, V-2 und T-1 wurden reassoziieren gelassen, mit Klenow-Fragment und vier [32P]alpha-dNTP's markiert und verwendet, um Nitrocelluloseübertragungsfilter aus den Banken zu sondieren.
Hybridisierung und Waschbedingungen waren wie beschrieben (Maniatis et al., ibid). Positive Klone wurden plaquegereinigt und die cDNA Insertionen wurden durch Coinfizierung mit einem Helfer-Phage gemäß Lieferantenanweisungen isoliert. Einzel- und doppelsträngige DNA- Sequenzierung wurde mittels des Dideoxynucleotidverfahrens durchgeführt. Sanger, F. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., Band 74, Seiten 5463-5467 (1977).
Fig. 8a zeigt die Nucleotidsequenz des bzw. der Plasminogenaktivator(en) cDNA und die Aminosäuresequenz des bzw. der Aktivator(en). Die Nucleotidsequenz erstreckt sich von dem 5' Ende des längsten Klons und durch den offenen Leseraster. Ein zusätzliches 800 nt der 3' untranslatierten Sequenz, die in einem Poly(A) Schwanz endet, ist nicht gezeigt. Die Nucleotidsequenz ist an der linken Seite jeder Linie numeriert, wobei das vorgeschlagene Start-Codon die erste Base ist. Die vorhergesagte Aminosäuresequenz ist mit einem einzigen Buchstabenkode gezeigt und rechts von jeder Linie numeriert. Die für Bat-PA(H), Bat-PA(I) und Bat-PA(L) bestimmten Aminosäuresequenzen sind unterstrichen und als N-1, N-2 bzw. N-3 bezeichnet. Bat-PA(H) entspricht einer Form in voller Länge, bei der das Signalpeptid an einer Stellung analog der Signalspaltstelle in dem tPA gespalten ist. Bat-PA(I) beginnt mit den gleichen drei Aminosäuren wie Bat- PA(H), gefolgt von Sequenzen, die mit N-2 entsprechend der EGF-Domäne beginnen. Folglich entspricht Bat-PA(I) einer Fingerminus-Form von Bat- PA(H). Die nur einmal vorhandene Aminosäuresequenz von Bat-PA(L) beginnt mit den gleichen drei Aminosäuren, gefolgt von dem Teil des Polypeptids, das bei N-3 beginnt, mit der Ausnahme, daß die zweite Aminosäure von N-3 von Threonin zu Prolin nach der EGF-Domäne geändert ist und zu einer Fingerminus- und einer EGF-minus-Form des Proteins führt. Die Aminosäuresequenzen von zwei proteolytischen Staphylococcus-V8- Fragmenten (V-1, V-2), und ein tryptisches Fragment (T-1) sind auch unterstrichen. Ein gestricheltes Unterstreichen gibt Aminsäurereste an, die nicht bestimmt werden konnten oder die mit den aus der cDNA vorhergesagten Aminosäuren nicht übereinstimmten. Die Stellung des Wirkstellen-Ser, die mit [³H] DIFP markiert war, ist mit (*) angegeben. Die vorhergesagten N-gekoppelten Glycosylierungsstellen sind durch die mit Kästchen versehenen Aminosäuren angegeben.
Oligonucfeotidprimer wurden synthetisiert auf der Grundlage von drei Phagenklons, die BATPA cDNA enthielten. Die BATPA cDNA Klone wurden einer mit Polymerasekettenreaktion (PCR) bewirkten Amplifizierung (siehe US Patent 4 800 159, Spalte 2, Zeilen 36 bis 68, Spalten 3 bis 4 und Spalte 5, Zeilen 1 bis 20, die hier ausdrücklich durch Bezugnahme aufgenommen ist) unterzogen. Die cDNA-Stränge wurden erhitzt, bis sie sich auftrennten, zu welchem Zeitpunkt die Primer, die sich an jeden Strang binden, zugegeben wurden. Die Primer wiesen die DNA-Polymerase an, die ihre Replizierungsfunktion durchführt, einen bestimmten Bereich des Strangs zu kopieren. Das Verfahren wurde mit einer Reihe von Erhitzungs- und Abküh- lungszyklen, Erhitzen zum Trennen der Stränge und Abkühlen, während der Erzeugung der Kopien fortgesetzt. Die Zyklen wurden wiederholt, um mehr und mehr Kopien der besonderen Stränge zu erzeugen. Durch die Amplifizierung wurde die kodierende Domäne, an der die terminalen Restriktionsstellen angehängt sind, erhalten.
Expressionsvektoren für die drei Fledermausplasminogenaktivatorformen Bat- PA(H), Bat-PA(I) und Bat-PA(L) wurden wie nachstehend beschrieben hergestellt und dann in Zellen gemäß einem temporären Transfizierungsprotokoll (das verwendet wurde, um qualitativ zu bestimmen ob eine erfolgreiche Expression erzielt wird) oder einem stabilen Protokoll (vorzugsweise zur Feststellung lebensfähiger Klone) in Zellen transfiziert.
In diesem temporären Transfizierungsprotokoll werden 2,5 x 10&sup6; Zellen/100 mm Schale in 10 m Medium 24 Stunden vor der Transfizierung ausgestrichen. Zwei bis vier Stunden vor der Transfizierung, ist das Medium verändert. Ein DNA/CaPO&sub4; Niederschlag wird hergestellt, indem mittels eines Filters sterilisierte, rekombinante BatPA-pD5 Plasmid-DNA in einer Konzentration von 5 ug/250 ul ddH&sub2;O für jede 100 mm Schale hergestellt wird. Dies wird mit 500 ul 0,5 M CaCl&sub2; und ddH&sub2; auf ein endgültiges Volumen von 1 ml gemischt. Ein m 2 x HBS wird tropfenweise unter leichtem Rühren zugegeben. Die Zubereitung wird bei Raumtemperatur während 10 bis 30 Minuten stehen gelassen, und der Niederschlag wird mit leichtem Wirbeln gleichmäßig auf die Platte getropft. Nach diesem Schritt unterscheidet sich das Protokoll leicht in Abhängigkeit von den zu transfizierenden Zellen. CV1-Zellen werden vier Stunden bei 37ºC und 10% CO&sub2; inkubiert, während COS7 und 293 Zellen vier Stunden bei 37ºC und 6% CO&sub2; inkubiert werden. Vier Stunden nach der Transfizierung wird das Medium für 293 Zellen entfernt. Vier Stunden nach der Infizierung werden CV1- und COS7-Zellen einer Glycerinschock während 2 Minuten (15% Glycerin im Medium) unterzogen und 2 mal mit PBS gespült. Dann wird frisches Medium zugegeben. Die Zellen werden bei 37ºC inkubiert und 24, 48 und 72 Stunden nach der Transfizierung ausgetestet.
Bei dem stabilen Transfizierungsprotokoll, wird das temporäre Transfizierungsprotokoll mit dem folgenden Modifikationen befolgt. 5 x 10&sup5; Zellen pro 100 mm Schale werden statt 2,5 x 10&sup6; pro 100 mm Schale ausgestrichen. 0,5 ug Neoexpressionsplasmid ist in dem DNA/CAPO&sub4; Niederschlag für die G418 Selektion enthalten. Die Zellen werden während 48 stunden in Selektion gehalten, wobei das Medium in Abständen von 2 bis 3 Tagen geändert wurde, bis sich G418-beständige Kolonien entwickelten.
Transport- und Expressionsvektoren wurden auf die folgende Weise für die verschiedenen Fledermausplasminogenaktivatorformen hergestellt.

I. Bat-PA(H)

1. 5' natürliches NTL:

Bat-PA(H) cDNA's wurden aus der cDNA Bank durch PCR-Amplifizierung der cDNA unter Verwendung der Oligodeoxynucleotidpaare 141 & 142 und 27 & 19, die nachstehend als Primer gezeigt sind, abgeleitet:
PCR wurde in einem 100 ul Reaktionsvolumen durchgeführt, das aus 10 mM Tris-Cl, pH-Wert 8,3, 50 mM KCl, 1,5 mM MgCl&sub2;, 200 uM in jedem dNTP, 100 pmol jedes PCR Primers, 10-100 ng cDNA oder Bank-DNA und 2,5 Einheiten Taq Polymerase bestand. Die Reaktion wurde in einem DNA- Temperaturwechsler während 30 Zyklen programmiert. Jeder Zyklus umfaßte eine 2-minütige Denaturierung bei 94ºC, zwei Minuten Wiederverbinden bei 60ºC und zwei Minuten Polymerisation bei 72ºC. Amplifizierte cDNA's wurden gelgereinigt und dann durch BgIII restriktiv gespalten und in die pSP73 Bg1II Stelle ligasiert. Nach Sequenzverifizierung wurden die offenen Bat-PA(H) Leseraster in den eukaryotischen Expressionsvektor pD5 subkloniert, der den Adenovirus-Hauptverzögerungspromotor enthält, um pSZ88-104-20 zu erzeugen (siehe Fig. 9). 293 Zellen wurden mit pSZ88-104-20 transfiziert, um 293-Bat-PA-1 Säugerzellen (ATCC Nr. CRL 10180) zu erzeugen. E. coli Zellen wurden mit pSZ88-104-20 transfiziert, um BPA-CN-pSZ88-104-20 Bakterienzellen (ATCC Nr. 68050) zu erzeugen.

2. 5' Kozak NTL:

Bat-PA(H) cDNA's wurden wie vorstehend beschrieben unter Verwendung von Oligodeoxynucleotidpaaren 18 & 19 als Primer PCR-amplifiziert:
Amplifizierte cDNA's wurden gelgereinigt und dann durch Xbal und Hind III gespalten, gefolgt durch Ligasierung in den Transportvektor pSP73 zwischen seinen Xbal und Hind III Stellen zur Erzeugung von pSZ89-109, pSZ89-110, p89WO-10 und p89WO-8. Die offenen Bat-PA(H) Leseraster wurden zusätzlich in die Sac l/Spe l Stelle des pD5-mcs Vektors subkloniert, der eine Muitiklonierungsstelle statt der ursprünglichen BamHI Klonierungstelle zur Erzeugung von pSZ89-111-17, pSZ89-112 und pSZ89-113 (siehe Fig. 10) enthält. E. coli Zellen wurden mit pSZ89-111-17 zur Erzeugung von BPA-CK- pSZ89-111-17 Bakterienzellen (ATCC Nr. 68052) transfiziert.

II. Bat-PA(I)

Die offenen Bat-PA(I) Leseraster wurden aus der cDNA Bank durch das vorstehend beschriebene, gleiche PCR-Verfahren abgeleitet und durch ihre geringere Größe mit bezug auf die vollständige Isoform erkannt. Bat-PA(I), das das natürliche NTL enthielt, wurde von dem Oligodeoxynucleotidpaar 27 & 19 abgeleitet, während die Bat-PA(I), das Kozak NTL enthielt, von dem Oligodeoxynucleotidpaar 18 & 19 abgeleitet wurde. Offene, amplifizierte Bat- PA(I) Leseraster wurden durch Hind III und Xbal zum Klonen in pSP73 zur Erzeugung von p89WO-14, p89WO-5,6, p89WO-9 und p89FWO-12 gespalten oder durch Spe l und Sac l zum Klonen in den pD5-mcs Vektor zur Erzeugung von p89WO-1, p89WO-2,A,B,C, p89WO-3 und p89WO-4 gespalten (siehe Fig. 11). E. coli Zellen wurden mit p89WO-1 transfiziert, um BPA-FK-p89WO-1 Bakterienzellen (ATCC Nr. 68051) zu erzeugen. E. coli Zellen wurden mit p89-WO-2C transfiziert, um BPA-FN-p89WO-2C Bakterienzellen (ATCC Nr. 68053) zu erzeugen.

III. Bat-PA(L)

Offene Bat-PA(L) Leseraster wurden aus der cDNA Bank durch die gleiche PCR Amplifizierung der Bank-DNA mit dem Oligodeoxynucleotidpaar 18 & 11.4 als Primer abgeleitet.
11.4 5 > CCT TTC TCC TGA TGA CCT TC > 3'
Amplifizierte DNA wurde gelgereinigt und dann mit Ncol geschnitten und das kleinste der drei Ncol Fragmente, das für den 5' Teil von Bat-PA(L) kodiert, wurde erneut gelgereinigt und mit Ncol gespaltenem p89WO-11 ligasiert (einem offenen Bat-PA(H) Leseraster in pSP73), um p89WP-17 bzw. p89WP- 518 zu erhalten. Die offenen Bat-PA(L) Leseraster wurden dann von den Transportvektoren durch Spalten mit Sac l und Spe l frei gesetzt und in den pds-mcs Vektor subkloniert, was zu p89W-20A&B und p89WP-19A&B führt (siehe Fig. 12). E. coli Zellen wurden mit p89WP-20A transfiziert, um BPA-DK- p89WP-20A Bakterienzellen (ATCC Nr. 68049) zu erzeugen.
Fibrinagarplattentestansätze mit konditioniertem Medium, das 48 Stunden nach der Transfizierung von COS-7 entfernt wurde, ergaben 50 ng/mL BatPA.
Es wurde gefunden, daß der Klon pSZ88-104-20 der beste Expressor war. Dieser Klon wurde in 293 Zellen festgestellt und exprimierte mehr als 0,5 Mikrogramm pro Milliliter pro Tag BatPA Aktivität/konfluente Einzelzellschicht. Eine chronische Aussetzung an Butyrat und Mediumoptimierung verstärkte die Expressionsstärke auf mehr als 10 Mikrogramm pro Milliliter pro Tag. Andere brauchbare Expressionsvektoren sind pSZ89-111-17 (ein Derivat von pSZ88- 104-20 mit einem Kozak statt einem natürlichen 5'-NTL), EBV/EBNA/DSBATPA-C und CMVIE-AKl-BatPA-C, und HIV LTR/BatPA-C.

Vergleich mit Humangewebeplasminogenaktivator

Nachstehend ist ein Vergleich der primären Aminosäuresequenzstruktur von Humangewebeplasminogenaktivator und dem erfindungsgemäßen Bat-PA(H) angegeben. Human-t-PA Bat-PA(H) Human-t-PA Bat-PA(H) Human-t-PA Human-t-PA Human-t-PA Bat-PA(H) Human-t-PA Bat-PA(H) Human-t-PA Bat-PA(H) Human-t-PA Bat-PA(H)
Die Fibronectinfingerdomäne des menschlichen tPA (Sequenz 9-46) besitzt eine 78%-ige Homologie mit der Bat-PA(H)-Sequenz 6-43. Die Epidermis- Wachstumsfaktordomäne des menschlichen tPA (Sequenz 46-95) besitzt eine 75%%-ige Homologie mit der Bat-PA(H)-Sequenz 43-92. Die erste Kringle- Domäne des menschlichen tPA (Sequenz 95-177) besitzt eine 67%-ige Homologie mit der Bat-PA(HA) Sequenz 92-174.
Die zweite Kringle-Domäne des menschlichen tPA (Sequenz 178-265) besitzt kein Gegenstück in Bat-PA(H). Bat-PA(H)-Aminosäuren 175 und 176 sind Lysin und Alanin. Die Aminosäuren 190-441 des Bat-PA(H), die "leichte Kette", besitzen eine 74%-ige Homologie mit der menschlichen Leichtketten- tPA-Sequenz 280-531.
Fig. 8b ist eine schematische Darstellung der Aminsäuresequenz von Bat- PA(H) und dem Vergleich mit menschlichem t-PA (Pennica et al., Nature, Band 301, 214-221 (1983)). Die einzelnen Aminosäuren der Bat-PA sind als Einzelbuchstabenkode angegeben. Die ausgefüllten Kreise zeigen die 40 Aminosäureidentität zwischen Bat-PA(H) und menschlichem t-PA. Nicht ausgefüllte Kreise stellen divergierende Reste dar. Das vorgeschlagene Disulfidmuster enspricht analog t-PA. Die postulierten N-gekoppelten Glycosylierungsstellen sind durch eine beigefügte Klammer angegeben.
Zusätzlich zu den natürlichen Derivaten Bat-PA(I) und Bat-PA(L) dieses Plasminogenaktivators sind andere Derivate innerhalb der vorliegenden Erfindung Plasminogenaktivatoren mit Ausnahme von entweder dem Fingerdomänebereich (Aminosäuren (-3)-43) oder dem Epidermis- Wachstumsfaktorbereich (Aminosäuren 43-84). Ein weiteres Derivat ist Pat- PA(H) mit einem mutierten Kohlehydrat, das Aminosäurereste hält. Jedes weist wünschenswerte plasminogenaktivierende Eigenschaften, einschließlich einer längeren Halbwertzeit, auf.
Fusionsproteine der Ieichtkettigen Bat-PA's (Sequenz 190-441) und des schwerkettigen, menschlichen tPA (Sequenz 1-278) und Derivate davon mit plasminogenaktivierenden Eigenschaften fallen auch unter den Umfang dieser Erfindung. Da die proteolytischen Domäne der Bat-PA's nicht signifikant durch den Plasminogenaktivatorinhibitor vom Typ 1 inaktiviert werden, nehmen wir an, daß die Fusionsproteine verbesserte pharmakologische Eigenschaften im Vergleich zu Humangewebeplasminogenaktivator haben.
Wie vorstehend erwähnt wird die Aktivität von Fledermausplasminogenaktivatoren in Gegenwart eines Fibrincofaktors drastisch stimuliert. Sie scheint mindestens 90-fach selektiver als tPA gegenüber fibringebundenem Plasminogen zu sein. Die zweite Kringle-Domäne von tPA beherbergt eine Lysinbindungsstelle, von der angenommen wird, daß sie bei der Vermittlung der fibrininduzierten Stimulierung der Aktivität eine entscheidende Rolle spielt. Im Gegensatz dazu zeigt die Aminosäuresequenz des erfindungsgemäßen Aktivators, daß ihre ausgeprägte Fibrinselektivität nicht auf das Vorhandensein eines Bereichs ähnlich der zweiten Kringle- Domäne des tPA zurückzuführen ist. Außerdem zeigt die Unfähigkeit von Fledermausplasminogenaktivatoren, sich an Lys-Sepharose zu binden, daß das Vorhandensein einer Lysinbindungsstelle nicht für die fibrinspezifische Aktivierung des Plasminogens verantwortlich ist.
Die Kringle-Domäne der erfindungsgemäßen Aktivatoren vermittelt die fibrininduzierte Stimulierung der Aktivität trotz ihres Unterschiede mit Bezug auf den zweiten Kringle-Bereich des tPA.
Die Aktivatoren unterscheiden sich auch strukturell von tPA durch das Fehlen einer plasminempfindiichen Aktivitätsstelie in dem Fledermausenzym.
Die vorstehend beschriebenen Bat-PA-Proteine wurden mittels bestimmter DNA-Gen- und deduktiver Aminosäuresequenzierung definiert. Es ist ersichtlich, daß es natürliche, allele Variationen gibt. Diese Variationen können durch einen Aminosäureunterschied bzw. Aminosäureunterschiede in der Gesamtsequenz oder durch Deletionen, Substitutionen, Insertionen, Inversionen oder Additionen einer Aminosäure bzw. von Aminosäuren in der Sequenz gezeigt werden. Außerdem hängt die Stelle und der Grad der Glycosylierung von der Art der Wirtszellenumgebung ab.
Es gibt bei der Verwendung der rekombinanten DNA-Technologie das Potential für die Herstellung von verschiedenen Fledermausplasminogenaktivatorderivaten, unterschiedlich modifiziert durch sich ergebende Einzel - oder Mehrfachaminosäuresubstitutionen, -deletionen, - additionen oder -austausch beispielsweise von seitenkettengerichteter (site directed) Mutagenese der zugrundeliegenden DNA. Alle solchen allelen Variationen und Modifikationen, die zu Derivaten des Fledermausplasminogenaktivators führen, fallen unter den Umfang dieser Erfindung so Iange die wesentliche, charakteristische Fledermausplasminogenaktivatoraktivität unbeeinflußt in ihrer Art bleibt. Der Fledermausplasminogenaktivator wird hergestellt (1) wobei Methionin seine erste Aminosäure (vorhanden aufgrund des ATG Startsignalkodoninsertion vor dem Strukturgen) ist oder (2) wo das Methionin intra- oder extrazellulär gespalten wird, welches normalerweise die erste Aminosäure ist oder (3) zusammen mit entweder seinem Signalpolypeptid oder einem konjugierten Protein außer dem herkömmlichen Signalpolypeptid, wobei das Signalpolypeptid oder Konjugat spezifisch in einer intra- oder extrazellulären Umgebung spaltbar ist (siehe britische Patentanmeldungsveröffentlichung 2 007 676A) oder (4) durch direkte Expression in reifer Form ohne die Notwendigkeit der Abspaltung irgendwelchen fremden, überflüssigen Polypeptids. Das letztere ist besonders wichtig, wo ein gegebener Wirt ein Signalpeptid nicht oder nicht wirksam entfernen kann, wo das Expressionsvehikel bestimmt ist, den Plasminogenaktivator zusammen mit seinem Signalpeptid zu exprimieren. Auf jeden Fall wird der so hergestellte Fledermausplasminogenaktivator in seinen verschiedenen Formen in einem Grad gewonnen und gereinigt, der für die Verwendung bei der Behandlung von verschiedenen Gefäßleiden oder -erkrankungen geeignet ist.

Therapeutische Behandlung

Diese Proteine können durch irgendein geeignetes Mittel verabreicht werden, das zu ihrer Zuführung in den Blutstrom in wesentlicher Menge führt. Gegenwärtig wird die intravenöse Verabreichung als bevorzugter Verabreichungsweg in Betracht gezogen. Sie sind in Wasser löslich und können deshalb wirksam in Lösung verabreicht werden.
Bei einer beispielhaften Anwendung wird eine geeignete Menge der erfindungsgemäßen Proteine dem Opfer eines Herzanfalls intravenös verabreicht. Geeignete Dosen zur Erzielung der Thrombolyse betragen bis zu 200 mg, vorzugsweise zwischen 25 mg und 150 mg und weiter bevorzugt zwischen etwa 25 mg und 50 mg.
Die Proteine können mit den vorstehend angegebenen Dosen durch aufeinanderfolgende Bolus-Injektionen während eines Zeitraums von mehreren Stunden verabreicht werden.
Die Proteine können zusammen mit Blutplättchenanhäufungsinhibitoren zur Erzeugung der kombinierten Wirkung von Thrombolyse und Blutplättchenanhäufungshemm ung verabreicht werden. Die gemeinsame Verabreichung umfaßt die intravenöse Verabreichung der Blutplättchenanhäufungsinhibitoren in einer Menge, um die Blutplättchenanhäufung zu hemmen, beispielsweise in einer Menge, die eine Plasmakonzentration mit einem Fließgleichgewicht von 0,052 um erreicht.

Claims

1. Glycosyliertes oder unglycosyliertes, plasminogenaktivierendes Protein mft einer Homologie von mindestens 90% mit der folgenden Aminosäuresequenz:

worin das Protein einen Fibrincofaktor erfordert, um Plasminogen zu aktivieren.

2. Glycosyliertes oder unglycosyliertes, plasminogenaktivierendes Protein mit einer Homologie von mindestens 90% mit der folgenden Aminosäuresequenz:

worin das Protein einen Fibrincofaktor erfordert, um Plasminogen zu aktivieren.

3. Glycosyliertes oder unglycosyliertes, plasminogenaktivierendes Protein mit einer Homologie von mindestens 90% mit der folgenden Aminosäuresequenz:

worin das Protein einen Fibrincofaktor erfordert, um Plasminogen zu aktivieren.

4. Glycosyliertes oder unglycosyliertes, plasminogenaktivierendes Protein mit einer Homologie von mindestens 90% mit der folgenden Aminosäuresequenz:

worin das Protein einen Fibrincofaktor erfordert, um Plasminogen zu aktivieren.

5. Mit dem Protein von Anspruch 1 bis 4 spezifisch reaktiver Antikörper.

6. Glycosyliertes oder unglycosyliertes, plasminogenaktivierendes Fusionsprotein, einschließlich einer Sequenz von Aminosäuren, die den Aminosäuren 190 - 441 wie in Fig. 8a gezeigt entsprechen, und einer schweren Kettensequenz des Plasminogenaktivators des Gewebetyps, wobei das Protein eine höhere plasminogenaktivierende Aktivität in Gegenwart des Plasminogenaktivatorinhibitors vom Typ 1 aufweist als der Gewebeplasminogenaktivator in Gegenwart des Plasminogenaktivatorinhibitors vom Typ 1.

7. Pharmazeutische Zusammensetzung zum Aktivieren von fibringebundenem Plasminogen, welches eine wirksame Menge des Proteins der Ansprüche 1 bis 4 umfaßt.

8. Für ein Protein des Anspruchs 1 codierende DNA-Sequenz.

9. Für ein Protein des Anspruchs 2 codierende DNA-Sequenz.

10. Für ein Protein des Anspruchs 3 codierende DNA-Sequenz.

11. Für ein Protein des Anspruchs 4 codierende DNA-Sequenz.

12. Replizierbares Klonierungsvehikel, welches eine inserierte DNA-Sequenz des Anspruchs 8 aufweist.

13. Replizierbares Klonierungsvehikel, welches eine inserierte DNA-Sequenz des Anspruchs 9 aufweist.

14. Replizierbares Klonierungsvehikel, welches eine inserierte DNA-Sequenz des Anspruchs 10 aufweist.

15. Mit einem Klonierungsvehikel des Anspruchs 14 transfizierte Säugerzelle.

16. Mit einem Klonierungsvehikel des Anspruchs 14 transfizierte Bakterienzelle.

17. Replizierbares Klonierungsvehikel, das eine inserierte DNA-Sequenz des Anspruchs 11 aufweist.

18. Verfahren zum Reinigen eines Plasminogenaktivierungsproteins mit einem Molekulargewicht von weniger als 50.000 Dalton, umfassend die Schritte:

(a) Homogenisieren von submandibularen Drüsen der Desmodus rotundus Fledermäuse zur Bildung einer Mischung und Zentrifugieren der Mischung zur Bildung einer überstehenden Fraktion,

(b) Klären und dann Konzentrieren der überstehenden Fraktion,

(c) Zuführen des erhaltenen Konzentrats zu einer Phosphocellulose- Kationenaustauschsäule und Absorbieren des Plasminogenaktivators an der Säule,

(d) Eluieren der Säule, um plasminogenaktivierende Proteine enthaltende Fraktionen zu erhalten,

(e) Vereinen der Fraktionen und Zuführen des Pools zu einer Affinitätssäule mit immobiiisiertem Erythrina-Trypsininhibitor,

(f) Fraktionieren der Plasminogenaktivataren durch Hochdruckflüssigchromatographie, und

(g) Trennen der Plasminogenaktivatoren durch SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese.