DE68922844T2

DE68922844T2 - Agglutinationsverfahren zur Bestimmung von mehreren Liganden.

Info

Publication number: DE68922844T2
Application number: DE68922844T
Authority: DE
Inventors: Hoegaerden Michel Van
Original assignee: Chemunex SA
Current assignee: Chemunex SA
Priority date: 1988-11-04
Filing date: 1989-11-03
Publication date: 1995-12-21
Anticipated expiration: 2009-11-04
Also published as: EP0397828B1; JPH03502246A; FR2638848B1; DE68922844D1; WO1990005307A1; ATE123150T1; FR2638848A1; EP0397828A1; AU4518689A; US5405784A; US5219763A

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis und/oder zur empfindlichen und spezifischen Bestimmung von mehreren zu analysierenden Liganden mit Hilfe einer geeigneten Agglutinationsreaktion in einer flüssigen, halbflüssigen oder pastösen Probe.
Es ist bekannt, lösliche Substanzen und insbesondere Peptide oder Proteine durch eine Agglutinationsreaktion oder eine Reaktion zur Hemmung der Agglutination nachzuweisen und zu bestimmen.
Die Agglutinationsreaktion ist die direkte Folge der Bindung eines agglutinierenden Antikörpers an eine Zelle beispielsweise, und führt so zu Antigen-Antikörper oder Hormon-Rezeptor-Komplexen, die Agglutinationseigenschaften besitzen.
Trotzdem ist darauf hinzuweisen, daß, obwohl diese Reaktionen leicht zu realisieren sind, ihre Interpretation mit dem unbewaffneten Auge meistens zeitaufwendig ist und das Vorhandensein einer großen Menge an zu bestimmender Substanz in der Probe, für die die Interpretation leicht sein soll, benötigt.
Eine Agglutinationsreaktion kann in verschiedenen biologischen Umgebungen in Betracht gezogen werden; insbesondere ist auf dem Gebiet der Immunologie die Agglutination die Sichtbarmachung der Bildung eines Komplexes.
Es gibt sog. direkte Methoden (Antigen-Antikörper-Komplex), sog. indirekte Methoden oder Methoden der kompetitiven Hemmung; man kennt ebenso Bestimmungsmethoden vom sog. "Sandwich"- oder doppelseitigen Typ; bei diesen Methoden vom "Sandwich"-Typ werden zwei Antikörper verwendet, einer zum Einfangen des Antigens, der andere zum Nachweis seines Vorhandenseins, wenn dieses Antigen effektiv vorhanden ist und durch den ersten Antikörper eingefangen wurde. Im allgemeinen wird der erste Antikörper auf einen festen Träger (Platte, Kugel ...) gebunden, und der zweite Antikörper wird an einen Reaktionsmarker, wie ein Fluorochrom, Radioisotop, Enzym, gebunden.
In einer Agglutinationsreaktion dienen die von einem Antigen bedeckten Erythrocyten zum Nachweis entsprechender spezifischer Antikörper (Hemagglutination). Eine Erweiterung der Agglutinationsverfahren besteht darin, daß man Plastikkügelchen verwendet; im falle einer positiven Reaktion beobachtet man das Auftreten einer makroskopischen "Granulation" (passive Agglutination). Ein umgekehrtes Verfahren wurde ebenfalls beschrieben: die Antikörper sind auf den Kügelchen gebunden und dienen zum Nachweis der entsprechenden Antigene. Die Empfindlichkeit eines derartigen Verfahrens ist erhöht, aber, wie bereits vorstehend erwähnt, ist die Interpretation des Ergebnisses nicht objektiv und variiert als Funktion des Beobachters, wobei das Ausmaß der Agglutination eine Funktion der vorhandenen Antigenmenge für ein bestimmtes Kontingent an Konzentrationen dieses Antigens ist.
Um diesen Nachteil der Agglutinationsverfahren zu überwinden und um diese quantitativ zu machen, haben eine ganze Anzahl von Autoren die Zählung der nicht-agglutinierten Teilchen mit Hilfe eines geeigneten Teilchenzählers, insbesondere eines Blutzellzählers vorgeschlagen.
Masson et al. (Particle Counting Immunoassay, Meth. Enzymol., 1981, 74, 106-139) schlagen ein Verfahren zur Bestimmung verschiedener Antigene (Proteine, Peptide ...) von Antikörpern, Haptenen und Immunkomplexen mit Hilfe einer Agglutinationsreaktion zwischen Latexteilchen mit einem Durchmesser von 0,8 µm, die von geeigneten Antikörpern oder Antigenen bedeckt sind, und den Antigenen oder Antikörpern oder Haptenen oder Immunkomplexen und die Zählung der nicht-agglutinierten Teilchen mit Hilfe eines Teilchenzählers, insbesondere eines Erythrocytenzählers vor, der ein Detektor mit in kleinen Winkeln gebrochenem Licht ist. Die Zählung der nicht-agglutinierten Teilchen erlaubt die Bewertung des Ausmaßes der Agglutinationsreaktion und folglich der Menge des zu bestimmenden Produkts.
Der Detektor ist so kalibriert, daß elektronisch die Teilchen ignoriert werden, deren Durchmesser kleiner als 0,6 µm ist, und die Teilchen, deren Durchmesser größer als 1,2 µm ist (agglutinierte Teilchen).
Masson beschrieb die verschiedenen Elemente dieses Verfahrens in einer bestimmten Anzahl von Patenten:
- Das US-Patent 4 062 935 (1977) beansprucht ein Nachweisverfahren für Antigen-Antikörper-Komplexe, bei dem man die Probe mit einer Lösung des Rheumafaktors (RF) und einer Substanz, die bei Kontakt mit RF agglutiniert, versetzt, anschließend das Ausmaß der Agglutination der Substanz, verglichen mit einem Standardgemisch der Substanz und des RFs vergleicht, wobei die Substanz aus inerten mit Immunglobulinen bedeckten Teilchen besteht, wobei die Teilchen insbesondere aus Polystyrol bestehen. Dieses Patent beschreibt auch ein Verfahren zum Nachweis des Vorhandenseins oder Fehlens von Antikörper-Antigen-Komplexen in einer Probe einer biologischen Flüssigkeit, bei dem man die Probe mit einer bekannten Menge an RF und einer bekannten Menge an mit IgG bedeckten Latexteilchen versetzt, das dadurch gekennzeichnet ist, daß der RF an irgendeinen vorhandenen Antigen-Antikörper-Komplex bindet, wobei der Rest des RFs die Agglutination der Latexteilchen herbeiführt, dann die Menge des Rests an RF durch Zählen der agglutinierten Latexteilchen und Vergleich des Ergebnisses mit einer Standardkurve bestimmt.
- Das US-Patent 4 138 213 (1979) beschreibt ein automatisiertes Verfahren zur Bestimmung einer Menge eines Antikörpers oder eines Antigens in einer Probe einer biologischen Flüssigkeit, umfassend mehrere Stufen und insbesondere eine Stufe, bei der die Anzahl der nicht-agglutinierten Teilchen gezählt wird.
- Das US-Patent 4 162 895 (1979) beschreibt ein Verfahren zum Nachweis von Antigenen, Antikörpern oder Antigen-Antikörper-Komplexen, bei dem ein Reagens auf der Grundlage von Mäuseserum eingesetzt wird. Dieses Reagens verbindet sich nur mit den Antigen-Antikörper-Komplexen und wird bei Agglutinationsreaktionen verwendet, beispielsweise ein Verfahren zum Nachweis von Antikörpern, bei dem man der Probe eine bekannte Menge von mit den Antikörpern entsprechenden Antigenen bedeckten Teilchen zusetzt, anschließend die Anzahl der nicht-agglutinierten Teilchen zählt und die Menge der in der Probe vorhandenen Antikörper berechnet.
- Das US-Patent 4 184 849 (1980) beschreibt ein Verfahren zum Nachweis von Antigenen und Antikörpern in einer Flüssigprobe, bei dem eine geeignete Agglutinationsreaktion und der Nachweis des Ausmaßes der Agglutination verwendet werden, was die Bestimmung der Menge der in der Probe vorhandenen Antikörper oder Antigene erlaubt. In die Flüssigkeit werden zwei Reagentien in Form von Teilchen eingebracht, die miteinander agglutinieren, aber deren Agglutination durch die ggf. vorhandenen Antikörper oder Antigene gehemmt wird.
- Das US-Patent 4 397 960 (1983) beschreibt ein Verfahren zur Bestimmung eines Antigens durch Agglutinationsreaktion. Die Bestimmung besteht aus der Bestimmung des Ausmaßes der Agglutination der Latexteilchen in Lösung und erlaubt so die Bestimmung der Antigenmenge in der Probe. Die Abschätzung der Agglutination wird durch selektive Zählung der agglutinierten und nicht-agglutinierten Latexteilchen durchgeführt.
- Die in Patent Abstracts of Japan, Band 10, Nr. 322 (P-511) (2378), 31. Oktober 1986, erschienene Zusammenfassung entsprechend der Anmeldung JP-A-61 128 169 beschreibt ein immunologisches Analyseverfahren auf einen Liganden, das die Messung des Aggregationsgrads, der von einem geeigneten Antigen oder Antikörper bedeckten fluoreszierenden Teilchen, bezogen auf die Erhöhung der Fluoreszenzintensität, erlaubt.
Diese verschiedenen Methoden besitzen trotzdem eine bestimmte Reihe von Nachteilen:
- Es ist notwendig, die Probe so zu behandeln, daß jedes Teilchen beseitigt wird, das ein falsch positives Ergebnis ergeben könnte. Dafür ist es notwendig, die Probe einer bestimmten Anzahl physikalischer oder chemischer Operationen zu unterwerfen, wie der Verwendung von speziellen Puffern, Filtration, Zentrifugation;
- die Zählung der agglutinierten Teilchen ist nur in klaren Medien möglich;
- außerdem erlaubt die Zählung durch Brechung mit kleinen Winkeln keine gute Sensibilität, wenn man die Zählung von agglutinierten Teilchen versucht (nicht getrennte und somit schwierig zu interpretierende Peaks);
- außerdem erlauben sie nicht die gleichzeitige Detektion von mehreren Liganden.
Die Anmelderin hat sich folglich zur Aufgabe gestellt, ein Verfahren bereitzustellen, daß nicht die Nachteile der im Stand der Technik beschriebenen Agglutinationsverfahren besitzt.
Unter Antiligand versteht man eine molekulare Struktur, die spezifisch die zu bestimmenden organischen, biologischen oder medikamentösen Substanzen, die nachstehend als Liganden bezeichnet werden, erkennen und daran binden kann.
Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zum Nachweis und/oder zur Bestimmung von mehreren zu analysierenden Liganden in einer flüssigen, halbflüssigen oder pastösen Probe durch ein direktes, indirektes Agglutinationsverfahren oder ein kompetitives Agglutinationshemmverfahren, bei dem fluoreszierende Strukturen, die nachstehend als Kügelchen bezeichnet werden, mit der Eignung, an einen geeigneten Antiliganden zu binden, verwendet werden, dadurch gekennzeichnet, daß man zur spezifischen und gleichzeitigen Bestimmung von mindestens zwei Liganden:
- die zu analysierende Probe mit mindestens zwei verschiedenen Populationen von fluoreszierenden Kügelchen in Kontakt bringt, wobei die jede Population bildenden Kügelchen identische Eigenschaften besitzen, was ihre Emissionswellenlänge, ihren Durchmesser, ihre Fluorochromdichte und die Anzahl ihrer auf ihrer Oberfläche gebundenen Antiliganden betrifft, und
- die diese Kügelchen enthaltende Probe mit Hilfe der Messung eines einzigartigen Fluoreszenzmeßparameters durch den Liganden analysiert, um gleichzeitig die Anzahl der nicht-agglutinierten Kügelchen, die Anzahl der agglutinierten Kügelchen, die Anzahl der Kügelchenaggregate und für jedes Aggregat die Anzahl der Kügelchen, die es umfaßt, nachzuweisen und/oder zu zählen.
Unter homogener Population von fluoreszierenden Kügelchen versteht man eine Gesamtheit von identischen Kügelchen, d.h. deren Emissionswellenlänge, Durchmesser und/oder Fluorochromdichte identisch sind, sowie den/die auf ihrer Oberfläche fixierten Antiligand(en).
Gemäß einer vorteilhaften Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens umfassen die Kügelchen mindestens zwei auf ihrer Oberfläche fixierte Antiliganden.
Gemäß einer anderen vorteilhaften Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens besitzen diese Kügelchen einen Durchmesser zwischen 0,05 µm und 10 µm.
Die dem Detektionssystem entsprechenden fluoreszierenden Kügelchen können insbesondere Latexkügelchen, Polyacrylamidkügelchen, Cellulosekügelchen, Polystyrolkügelchen, Agarosekügelchen, PVC-Kügelchen, Glaskügelchen sein.
Gemäß einer noch anderen vorteilhaften Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird/werden der/die Ligand/Liganden aus der Gruppe, umfassend Antigene, Antikörper, Rezeptoren, Lectine, Proteine zur Fixierung an Immunglobulinen vom Typ A oder G und Avidine, die für die Substanz(en) oder Liganden, die zu bestimmen sind, spezifisch sind, ausgewählt.
Gemäß einer vorteilhaften Durchführungsform dieser Ausführungsform sind die Antikörper monoclonale Antikörper.
Gemäß einer anderen vorteilhaften Durchführungsform dieser Ausführungsform sind die Antikörper polyclonale Antikörper.
Die Gesamtmenge des Fluoreszenzlichts variiert als Funktion der Anzahl der in jedem Aggregat oder Agglutinat agglutinierten Kügelchen und erlaubt so mit Hilfe eines Fluoreszenzdetektors die Unterscheidung der Anzahl der in jedem Agglutinat vorhandenen fluoreszierenden Kügelchen und ihrer Größe.
Eine derartige Unterscheidung erlaubt, das Erfahren der Anzahl der gebildeten Dupletts, Tripletts, Quadrupletts, etc. ... und verleiht deshalb diesem Bestimmungsverfahren eine deutlich erhöhte Empfindlichkeit und Präzision beim Messen.
Die zu analysierenden Substanzen, die insbesondere durch das erfindungsgemäße Verfahren nachgewiesen werden können, umfassen mindestens zwei Liganden, die einen Antiliganden binden können, beispielsweise organische, biologische oder medikamentöse Substanzen und insbesondere Antigene, Antikörper, Haptene und Immunkomplexe, Hormone, Membranrezeptoren, Lectine, Proteine zur Bindung von Immunglobulinen vom Typ A oder G oder Avidine.
Gemäß einer weiteren vorteilhaften Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird das Mittel zur Messung der Fluoreszenz aus der Gruppe, umfassend Durchflußcytometrie, Bildanalyse und Laserstrahlsystem ausgewählt.
Das erfindungsgemäße Verfahren zum Nachweis und zur Zählung besitzt eine Reihe von Vorteilen sowohl ökonomische (weniger Arbeitsschritte, sehr rasche Zählzeiten) als auch technische:
- es erlaubt insbesondere die Zählung von agglutinierten und nicht- agglutinierten Kügelchen in einem trüben oder viskosen Medium;
- es erlaubt die Zählung von agglutinierten und nicht-agglutinierten Kügelchen in sehr engen Einheiten;
- es ist deswegen sehr empfindlich, was die Bestimmung von sehr kleinen Mengen einer gewünschten Substanz betrifft;
- die verwendeten fluoreszierenden Kügelchen vermeiden Interferenzen mit anderen ggf. vorhandenen Teilchen und benötigen weder eine physikalische Trennung der in der zu bestimmenden Probe ggf. vorhandenen Teilchen, noch Waschstufen, was eine homogene Bestimmung darstellt; in der Tat erlaubt die Verwendung des erfindungsgemäßen Detektionssystems das arbeiten in einem komplexen Medium, enthaltend eine Vielzahl anderer Teilchen, wobei die Anzahl der eigenfluoreszierenden Elemente sehr gering ist und durch das Detektionsmittel, insbesondere durch die geschickte Wahl optischer Filter ignoriert werden kann;
- es erlaubt die Unterscheidung von nicht-agglutinierten Teilchen, Dupletts, Tripletts, etc. ..., da es die Durchführung einer absoluten Messung der Intensität und der Fluoreszenzwellenlänge jedes Teilchens oder jedes Teilchenaggregats für sich erlaubt.
Man kann insbesondere und zwar ohne Beschränkung das in der französichen Patentanmeldung Nr. 88 02937 (FR-A-2 628 531) beschriebene Durchflußcytometer verwenden: es erlaubt die Passage von Proben mit großen Volumina, besitzt ein automatisches Waschsystem zwischen jeder Probe und ist für den Routinebetrieb konzipiert; es kann außerdem jedes agglutinierte oder nicht-agglutinierte Kügelchen nachweisen und sie einzeln bis zu einer Häufigkeit von 3.000 pro Sekunde zählen.
Die Form der Durchflußzelle ist so gewählt, daß sie die hydrodynamischen Anhaftkräfte auf ein Minimum reduziert.
Die Erfindung betrifft weiterhin ein gebrauchsfertiges Kit oder eine Zusammenstellung zur Durchführung des erfindungsgemäßen Detektions- oder Bestimmungsverfahrens, das dadurch gekennzeichnet ist, daß es mindestens zwei Populationen von Kügelchen umfaßt, auf denen mindestens ein geeigneter Antiligand, der ggf. mit geeigneten Puffern assoziiert ist, fixiert ist.
Die Erfindung betrifft auch ein gebrauchsfertiges Kit oder Zusammenstellung zur Durchführung des erfindungsgemäßen Detektions- und/oder Bestimmungsverfahrens, das dadurch gekennzeichnet ist, daß es mindestens zwei Populationen von Kügelchen umfaßt, auf denen mindestens zwei verschiedene geeignete Antiliganden fixiert sind.
Das erfindungsgemäße Verfahren ist bei Anwendung auf die Analyse von komplexen Kohlenhydraten dadurch gekennzeichnet, daß man die zu analysierende Probe mit mindestens zwei Populationen von fluoreszierenden Kügelchen in Kontakt bringt, auf denen Lectine unterschiedlicher Spezifität fixiert sind.
Ebenso ist das erfindungsgemäße Verfahren bei Anwendung auf die Analyse von Nucleinsäurematerial zum Absuchen nach spezifischen Sequenzen dadurch gekennzeichnet, daß man die zu analysierende Probe mit mindestens zwei fluoreszierenden Kügelchen-Populationen in Kontakt bringt, auf denen Nucleinsäuresonden hybridisiert sind, die mit den komplementären Sequenzen auf einem gleichen Gen hybridisieren.
Außer den vorstehend beschriebenen Ausführungsformen umfaßt die Erfindung noch andere Ausführungsformen, die aus der folgenden Beschreibung hervorgehen, die sich auf Ausführungsbeispiele des erfindungsgemäßen Verfahrens beziehen.
Es ist jedoch zu verstehen, daß diese Beispiele nur der Erläuterung des Gegenstands der Erfindung dienen und in keiner Weise eine Beschränkung davon darstellen sollen.
Das erfindungsgemäße Verfahren umfaßt die Bildung von Komplexen durch Inkontaktbringen der Probe mit fluoreszierenden Kügelchen, auf denen mindestens ein geeigneter Antiligand fixiert ist, unter Bedingungen, die für das Auftreten einer Agglutination oder die Hemmung einer Agglutination geeignet sind, anschließend Detektion der agglutinierten und nicht-agglutinierten Kügelchen.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens sind die Populationen von fluoreszierenden Kügelchen, die dem zu bestimmenden Liganden komplementäre Antiliganden tragen, in gleicher Anzahl etwa 50.000 pro ml gemischt. Die zu testende Lösung oder Suspension wird in einem Volumen, das von 3 bis 1.000 ul oder mehr variieren kann, zugesetzt. Eine Inkubation bei 37ºC beschleunigt die Bildung der Ligand-Antiligand-Bindung; die Dauer dieser Inkubation hängt im wesentlichen von der Affinitätskonstante der verwendeten Antiliganden ab; die abschließende Empfindlichkeit des Tests hängt davon ebenfalls ab.
Das erfindungsgemäße Verfahren erlaubt die Detektion eines einzelnen fluoreszierenden Kügelchens. Wenn man zwei zählt, kann man gleichzeitig bestimmen, ob sie getrennt oder agglutiniert sind und im Falle, in dem sie agglutiniert sind, ob sie die gleichen Charakteristika besitzen oder nicht. Die Empfindlichkeit dieses Verfahrens erlaubt so theoretisch die Messung des Vorhandenseins eines einzelnen Ligandenmoleküls, wenn es mit zwei fluoreszierenden Kügelchen, die die gleichen spektralen Eigenschaften besitzen oder nicht, zur Agglutination kommt.

Beispiel 1: Herstellung und Verwendung der fluoreszierenden Kügelchen:

1) Herstellung von mit einem Antiliganden bedeckten fluoreszierenden Kügelchen (Detektionssystem)

Zuerst wird ein Detektionssystem durch Koppeln von fluoreszierenden Teilchen mit dem geeigneten Reagens gemäß bekannten Methoden hergestellt.
- Kovalente Kopplung der carboxylierten fluoreszierenden Teilchen mit polyclonalen Kaninchen-Anti-Enterotoxin A-Antikörpern:

a - Herstellung von Kügelchen (Fluoresbrit - Polysciences):

. 0,5 g Kügelchen in einer 2,5%igen Suspension in 4 ml Boratpuffer (10&supmin;² M Borsäure + 0,15 M NaCl, pH 8,1);
. Herstellen einer Lösung, die 80 µmol Hexamethylendiamin in 1 ml Boratpuffer enthält;
. Zugabe der 4 ml Kügelchen dazu;
. Zugabe von 0,05 M Carbodiimid;
. Inkubation eine Nacht bei 4ºC;
. Waschen mit Boratpuffer.

b - Herstellung der Antikörper:

. Dialyse der Antikörper gegen 0,1 M Phosphatpuffer, pH 6;
. Bereitstellen von 2/3 Antikörpern auf 1/3 Kügelchen;
. Zugabe von 200 µm 0,15 M NaIO&sub4;;
3stündige Inkubation bei 4ºC im Dunkeln;
. Zugabe von Glycerin in einer Endkonzentration von 0,015 M;
30minütige Inkubation bei Umgebungstemperatur;
. Dialyse gegen Phosphatpuffer, ph 6;

c - Eigentliche Kopplung:

. Zugabe der Kügelchen und der Antikörper in Gegenwart von 5 ml Boratpuffer;
. 16stündige Inkubation bei 4ºC unter Rühren;
. Einstellen des pH-Werts auf 8,8;
. Stabilisierung mit NaBH&sub4; (5 mg im Versuch);
5stündige Inkubation bei 4ºC;
. Waschen mit 0,5 % PBS-BSA - 0,1 % Tween.
- Nicht-kovalente Kopplung der fluoreszierenden carboxylierten Teilchen mit polyclonalen Kaninchen-Anti-Enterotoxin A-Antikörper:
a - In einem Reagensglas:
. 100 ul einer 2,5 mg/ml Antikörperlösung;
. 100 ul Glycinpuffer (Meth. Enzymol. 74, 111);
. 5 ul 1/10 verdünnte Kügelchen;
b - 30minütiges Rühren bei Umgebungstemperatur;
c - Spülung: 3mal in 0,5 % PBS-BSA - 0,1 % Tween-Puffer;
d - Aufnahme in 100 ul PBS.

2) Detektion der gewünschten Substanz:

a) Es wird ein Detektionssystem, wie unter 1) hergestellt, verwendet;
b) das Detektionssystem wird mit einer Antigenmenge vermischt; es wird 2 h lang bei 37ºC inkubiert, und die agglutinierten und nicht-agglutinierten Kügelchen werden detektiert; die Ergebnisse sind in der Tabelle I und in der Fig. 1 gezeigt.
Die nachstehende Tabelle I zeigt einen Vergleichstest zwischen einer negativen Kontrolle (mit Antikörpern bedeckte Kügelchen, aber Fehlen von Enterotoxin), wofür man 10,5 % der agglutinierten Kügelchen erhält (Fig. 1) und Spalte A der Tabelle I) und
- eine Detektion von Enterotoxin A durch das erfindungsgemäße Verfahren (Fig. 2 und Spalte B der Tabelle I), für das man 85 % der agglutinierten Kügelchen in Gegenwart einer Probe, die 10 ng Enterotoxin A enthält, erhält; die Agglutination ist der Konzentration an Enterotoxin A in den gegebenen Konzentrationsrahmen proportional.
In den Fig. 1, 2 und 3 ist auf der Abszisse die relative Fluoreszenzmessung (Kanal), die Anzahl des Kanals und auf der Ordinate die Anzahl der Teilchen oder der Teilchenaggregate pro Kanal aufgetragen.
Die Fig. 1 zeigt das mit mit Antikörpern gekoppelten Latexteilchen erhaltene Ergebnis (negative Kontrolle) und entspricht den in der Ta-belle I, Spalte A erwähnten Ergebnissen.
Fig. 2 zeigt in Histogrammform die in der Tabelle I, Spalte B, erwähnten Ergebnisse.
Die Fig. 3 zeigt das mit nicht an Antikörper gekoppelten fluoreszierenden Latexkügelchen erhaltene Ergebnis (andere negative Kontrolle), aber in Gegenwart von Antigen. Es wird eine Agglutination unter 2 % beobachtet. Tabelle I 1,1 um Kügelchen carboxyliert, gekoppelt mit einem polyclonalen Kaninchen-Anti-Enterotoxin A- Antikörper 1,1 um Kügelchen + Antikörper A 1,1 um Kügelchen + Antikörper + 10 ng Enterotoxin A Anzahl der Kügelchen pro Haufen Kanal Ereignis/Histo Kügelchen/Histo Summe
Die nachstehende Tabelle II zeigt die mit einer negativen Kontrolle (von Antikörpern bedeckte Kügelchen, aber Fehlen des entsprechenden Antigens) aber unter leicht veränderten Arbeitsbedingungen (sanftes Rühren während nur 30 min) erhaltenen Ergebnisse. In diesem Fall werden 1,6 % agglutinierte Kügelchen erhalten (Untergrund und sehr geringe Interferenzen). Tabelle II 1,1 µm Kügelchen + Antikörper 30 min Anzahl der Kügelchen pro Haufen Kanal Ereignis/Histo Kügelchen/Histo Summe

Beispiel 2: Untersuchung der Stabilität von mit geeigneten Antikörpern bedeckten Kügelchen.

Von mit polyclonalen Kaninchen-Anti-Enterotoxin A-Antikörpern bedeckten Kügelchen, wie in Beispiel 1 beschrieben, werden eine Woche nach ihrer Herstellung verwendet. Man erhält die in der Tabelle III dargestellten Ergebnisse:
- In Spalte A sind die Ergebnisse bezüglich einer negativen Kontrolle von Kügelchen, die mit Antikörpern bedeckt sind, erhaltenen Ergebnisse dargestellt;
- in Spalte B sind die Ergebnisse bezüglich eines Tests zum Nachweis von Enterotoxin A dargestellt, deren Menge 10 ng beträgt; die Ablesung des Ergebnisses wird nach 20 min unter sanftem Rühren durchgeführt;
- in Spalte C sind die Ergebnisse bezüglich eines Tests zum Nachweis von Enterotoxin A dargestellt, deren Menge 50 ng beträgt; die Ablesung des Ergebnisses wird nach 20 min unter sanftem Rühren durchgeführt;
- man beobachtet eine Hemmung der Agglutination der Kügelchen im Falle eines Überschusses an Antigen (50 ng gegen 10 ng); 51,3 % der nicht-agglutinierten Kügelchen gegen 42,7 % nicht-agglutinierter Kügelchen; die Zusammenfügung spezifischer freier Antikörper stellt die Agglutination der von Antikörpern bedeckten Kügelchen, die an Antigen gesättigt sind, wieder her. Tabelle III 1,1 um Kügelchen, carboxyliert, gekoppelt mit einem polyclonalen Kaninchen-Anti-Enterotoxin A- Antikörper 1,1 um Kügelchen + Antikörper A 1,1 um Kügelchen + Antikörper + 10 ng Enterotoxin A, 20 min Anzahl d. Kügelchen pro Haufen Kanal Ereignis/Histo Kügelchen/Histo Summe
In der Folge der Beispiele versteht man unter grün fluoreszierenden Kügelchen mit Coumarin markierte Kügelchen und unter rot fluoreszierenden Kügelchen mit Phycoerythrin R markierte Kügelchen.

Beispiel 3: Analyse des immunologischen Schutzes der schwangeren Frau gegen Toxoplasmose.

Es werden fluoreszierende von Toxoplasmen-Antigenen bedeckte Kügelchen sowie fluoreszierende, von Anti-IgG-Antikörpern bedeckte Kügelchen und von Anti-IgM-Antikörpern bedeckte Kügelchen wie in Beispiel 1 (1a) hergestellt.
Die Aufgabe besteht darin, gleichzeitig das Vorhandensein von Antitoxoplasmen-Antikörpern vom Isotyp IgG und IgM zu finden. Grüne fluoreszierende Kügelchen werden mit Toxoplasmen-Antigen bedeckt und werden anschließend mit der Blutprobe in Gegenwart von grünen, mit Anti-IgG-Antikörpern bedeckten Kügelchen und roten, mit Anti-IgM-Antikörpern bedeckten Kügelchen inkubiert. Das Verhältnis der Dupletts grün (grün einerseits und grün/rot andererseits) erlaubt das Auffinden und die gleichzeitige Bestimmung von IgG- und IgM-Antikörpern. Die Aggregate mit drei Kügelchen oder mehr werden auf ihre roten und grünen Bestandteile analysiert. Außerdem wird eine Referenzkurve aufgestellt.

Beispiel 4: Rasche Bestimmung von denaturierten Isomeren oder Epitopen.

Es werden fluoreszierende, mit einem geeigneten Antiliganden bedeckte Kügelchen wie in Beispiel 1 hergestellt.
Ein allen Isomeren gemeinsamer oder alle nativen und denaturierten Formen eines Proteins erkennender monoclonaler Antikörper bedeckt die grünen Kügelchen. Ein für jede modifizierte Form spezifischer monoclonaler Antikörper wird an entweder grüne oder rote Kügelchen gekoppelt. Die Suche nach Aggregaten grün/grün und grün/rot ergibt gleichzeitig die Gesamtmenge an Antigen und das Verhältnis der beiden (oder auch, wenn man mehrere Kügelchenfarben wählt) die Form des Moleküls.

Beispiel 5: Suche Analyse und Bestimmung von komplexen Kohlenhydraten.

Die Fixierung von Lectinen mit unterschiedlicher Spezifität (beispielsweise Concanavalin A für α-D-Glucosyl und Weizenkeimaglutinin für (ß-N-Acetylglucosaminyl)n oder Sialinsäuren) auf Kügelchen unterschiedlicher Farben gemäß dem Protokoll von Beispiel 1, erlaubt die Bestimmung, ob die von diesen Lectinen erkannten Zucker auf dem gleichen Molekül vorhanden sind (Agglutination) oder auf verschiedenen Molekülen vorhanden sind (keine Agglutination), was ebenso ein Mittel zur Bestimmung von Strukturen darstellt; man kennt in der Tat mehrere Zehnergruppen von verschiedenen Lectinen bis zu diesem Tag.

Beispiel 6: Untersuchunci spezifischer Nucleinsäuresequenzen.

- Zwei (oder mehr) Nucleinsäuresonden, die mit komplementären Sequenzen auf einem gleichen Gen hybridisieren, werden an Kügelchen unterschiedlicher Farben gemäß dem Protokoll von Beispiel 1 gekoppelt.
- Das Nucleinsäurematerial, das von Zellen befreit wurde, wird in die Anwesenheit der verschiedenen fluoreszierenden Kügelchenpopulationen unter Hybridisierungsbedingungen gebracht.
- Die Untersuchung der Aggregate wird durchflußcytometrisch durch Bildanalyse oder Laserstrahlen durchgeführt. Das Vorhandensein von Aggregaten aus Kügelchen der gleichen Farbe zeigt das Vorhandensein von repetitiven Sequenzen auf dem gleichen Gen oder dem gleichen Chromosom an, während Aggregate aus Kügelchen unterschiedlicher Farben das komplementäre Vorkommen der zwei (oder mehr) spezifischen gesuchten Sequenzen anzeigt.

Claims

1. Verfahren zum Nachweis und/oder zur Bestimmung von mehreren zu analysierenden Liganden in einer flüssigen, halbflüssigen oder pastösen Probe, durch ein direktes oder indirektes Agglutinationsverfahren oder ein kompetitives Agglutinationshemmverfahren, durch Einsetzen von fluoreszierenden Strukturen, nachstehend als Kügelchen bezeichnet, mit der Eignung, einen geeigneten Antiliganden zu fixieren, dadurch gekennzeichnet, daß zur spezifischen und gleichzeitigen Bestimmung von mindestens zwei Liganden

- man die zu analysierende Probe mit mindestens zwei verschiedenen Populationen von fluoreszierenden Kügelchen in Kontakt bringt, wobei die Kügelchen, die jede Population bilden, identische Eigenschaften was ihre Emissionswellenlänge, ihren Durchmesser, ihre Fluorochromdichte und ihre Anzahl der auf ihrer Oberfläche fixierten Antiliganden betrifft, besitzen und

- man die Probe, die die Kügelchen enthält, mit Hilfe einer Meßvorrichtung für einen einzigen Fluoreszenzmeßparameter pro Ligand analysiert, um gleichzeitig die Anzahl der nicht agglutinierten Kügelchen, die Anzahl der agglutinierten Kügelchen, die Anzahl der Aggregate von Kügelchen, und für jedes Aggregat, die Anzahl der Kügelchen, die es umfaßt, nachzuweisen und/oder zu zählen.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Kügelchen mindestens zwei auf ihrer Oberfläche fixierte Antiliganden umfassen.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Kügelchen einen Durchmesser zwischen 0,05 µm und 10 µm besitzen.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß der Antiligand aus der Gruppe, umfassend Antigene, Antikörper, Rezeptoren, Lektine, Proteine zur Fixierung an Immunglobuline vom Typ A oder G, Avidine, welche für den zu bestimmenden Liganden spezifisch sind, ausgewählt wird.

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Antikörper monoclonale Antikörper sind.

6. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Antikörper polyclonale Antikörper sind.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß das Mittel zur Messung der Fluoreszenz aus der Gruppe, umfassend ein Durchflußzytometer, einen Bildanalysator und ein System zur Laserabtastung, ausgewählt wird.

8. Gebrauchsfertiges Kit oder Reagenszusammenstellung zur Durchführung des Nachweis- und/oder Bestimmungsverfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß es mindestens zwei Populationen von Kügelchen, auf denen mindestens ein geeigneter Antiligand fixiert ist, gegebenenfalls zusammen mit geeigneten Puffern, umfaßt.

9. Gebrauchsfertiges Kit oder Reagenszusammenstellung zur Durchführung des Verfahrens zum Nachweis und/oder zur Bestimmung nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß es mindestens zwei Populationen an Kügelchen umfaßt, auf denen mindestens zwei verschiedene geeignete Antiliganden fixiert sind.

10. Verwendung des Verfahrens nach Anspruch 1 zur Analyse eines komplexen Kohlenhydrats, dadurch gekennzeichnet, daß man die zu analysierende Probe mit mindestens zwei Populationen an fluoreszierenden Kügelchen in Kontakt bringt, auf denen Lektine mit verschiedenen Spezifitäten fixiert sind.

11. Verwendung des Verfahrens nach Anspruch 1 zur Analyse eines Nucleinsäurematerials zum Absuchen auf das Vorhandensein spezifischer Sequenzen, dadurch gekennzeichnet, daß man die zu analysierende Probe mit mindestens zwei Populationen an fluoreszierenden Kügelchen in Kontakt bringt, auf denen Nucleinsäuresonden fixiert sind, die mit den komplementären Sequenzen auf einem gleichen Gen hybridisieren.