DE68912477T3

DE68912477T3 - Verfahren zum messen der biologischen wirkung von antithrombin iii und reagenzkit zu dessen messung

Info

Publication number: DE68912477T3
Application number: DE68912477T
Authority: DE
Inventors: Masayasu Enomoto
Original assignee: Nippon Shoji Co Ltd
Current assignee: Nippon Shoji Co Ltd
Priority date: 1988-03-03
Filing date: 1989-02-22
Publication date: 1999-12-23
Anticipated expiration: 2009-02-23
Also published as: FI895215A0; EP0360871B1; US5093237A; EP0360871A1; EP0360871B2; DE68912477D1; EP0360871A4; DE68912477T2; WO1989008150A1

Description

Gebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung der biologischen Aktivität von Antithrombin III (nachstehend abgekürzt als AT III) im Plasma und ein Reagenzsatz dafür.

Hintergrund der Erfindung

AT III ist ein Serinprotease-Inhibitor, der im Blut in großen Mengen (20 bis 30 mg/dl) vorhanden ist und der als Gerinnungsinhibitor bekannt ist. Wie nachstehend beschrieben wird, umfaßt die Blutgerinnungsreaktion einen intravaskulären Gerinnungsreaktionsweg und einen extravaskulären Gerinnungsreaktionsweg. Verschiedene Gerinnungsfaktoren sind an den entsprechenden Reaktionswegen beteiligt, und AT III inhibiert die meisten der aktivierten Gerinnungsfaktoren. Insbesondere werden als Wirkung von AT III die Inhibition von Thrombin (wobei es sich um aktivierten Faktor II (IIa) handelt) und aktiviertem Faktor X (Xa) als wichtig angesehen. Da die Reaktion der Gerinnungsfaktoren wirksamer auf einer frühen Stufe des Blutgerinnungssystems inhibiert wird, nimmt man an, daß AT III eine besonders wichtige Rolle bei der Inhibition von Faktor Xa spielt, der an einer früheren Stufe als Faktor IIa beteiligt ist.
Klinisch richtet sich die Aufmerksamkeit auf AT III in einem Zustand, in dem die Bildung von AT III eingeschränkt ist, wie Hepatocirrhose und Unterernährung, auf Zustände, bei denen AT III verbraucht wird, wie ausgebreitete intravaskuläre Gerinnung (DIC) und andere progressive Gerinnungszustände, auf Zustände, bei denen AT III in den Urin abgegeben wird, wie in Nephrosesyndrom, angeborene AT III-Mangelerkrankungen und dergl. Zur Diagnose dieser Zustände ist es daher erforderlich, ein genaues, rasches und einfaches Verfahren zur Bestimmung der biologischen Aktivität von AT III einzuführen.
Bisher sind als Verfahren zur Bestimmung der biologischen Aktivität von AT III ein Verfahren, bei dem ein synthetisches Substrat verwendet wird, und ein Verfahren, das die Gerinnungsaktivität ausnutzt, bekannt. Von diesen Verfahren wird das Verfahren unter Verwendung des synthetischen Substrats durchgeführt, indem ein synthetisches Substrat und eine überschüssige Menge an Faktor IIa zu einer Plasmaprobe gegeben werden und die anti-IIa-Aktivität von AT III in der Probe gemessen wird. Dieses Verfahren ist hervorragend, da die Bestimmung innerhalb einer kurzen Zeitspanne durchgeführt werden kann. Bei dem Verfahren bestehen jedoch viele Probleme. Z. B. weist das Verfahren unterschiedliche Spezifitäten in Abhängigkeit von der Art der synthetischen Substrate auf, und ein synthetisches Substrat ist sehr teuer. Ferner ist der zu verwendende Faktor IIa weniger stabil, und, da Faktor IIa leicht an Glas adsorbiert wird, sollte eine Kunststoffzelle für die Messung verwendet werden. Da das Verfahren ferner die Verwendung von Meßinstrumenten, wie einem Spektrophotometer und einem Fluorophotometer erfordert, ist es sehr kostspielig.
Bei der Gerinnungsmethode andererseits wird die Konzentration von AT III bestimmt, indem eine Plasmaprobe einer Wärmebehandlung unterworfen wird, um Fibrinogen zu entfernen, eine überschüssige Menge an Faktor IIa zugegeben wird und die Gerinnungszeit aufgrund der Umwandlung von Fibrinogen in Fibrin gemessen wird, um die anti-IIa-Aktivität von AT III in der Probe zu erhalten. Die Durchführung dieses Verfahrens ist jedoch kompliziert, und die Bestimmung dauert eine lange Zeit, z. B. nicht weniger als 1 Stunde.

Aufgaben der Erfindung

Unter diesen Umständen hat der Erfinder der vorliegenden Anmeldung intensive Untersuchungen durchgeführt, um ein genaues, rasches und einfaches Verfahren zur Bestimmung von AT III ohne die vorstehend genannten Probleme einzuführen. Als Ergebnis hat der Erfinder der vorliegenden Anmeldung festgestellt, daß diese Aufgabe durch ein neuartiges Verfahren zur Bestimmung von AT III gelöst werden kann, bei dem ein Gerinnungsverfahren angewandt wird, indem der extravaskuläre Gerinnungsreaktionsweg der Blutgerinnungsreaktion herangezogen wird und an AT III armes Plasma, aus dem AT III entfernt worden ist, verwendet wird.
Die Messung der Gerinnungsfaktoraktivität unter Verwendung eines an dem Faktor armen Plasmas, aus dem der gewünschte Faktor entfernt worden ist, wird bei der Bestimmung verschiedener Blutgerinnungsfaktoren herangezogen [vgl. z. B. Kensa to Gijutsu, Bd. 13/7 (Juli 1985), S. 611-616]. Außerdem wird die Verwendung von an Protein 5 armem Plasma zur Bestimmung der biologischen Aktivität von Protein S. bei dem es sich um einen der Blutgerinnungsinhibitoren handelt, vorgeschlagen worden (JP-A-62-159048).
Ein Blutgerinnungsfaktor weist jedoch die umgekehrte Aktivität in bezug auf einen Gerinnungsinhibitor, wie AT III, auf, und die Messung davon ist wesentlich verschieden von der Messung eines Gerinnungsinhibitors. Außerdem ist zu beachten, daß Protein S. obwohl es ein Gerinnungsinhibitor ist, als Cofaktor des aktivierten Proteins C wirkt und daher seine Wirkung wesentlich verschieden von der Wirkung von AT III ist. Ferner wird bei dem vorstehend vorgeschlagenen Verfahren der intravaskuläre Gerinnungsreaktionsweg der Blutgerinnungsreaktion herangezogen. Im Hinblick darauf ist das vorstehend vorgeschlagene Verfahren auch wesentlich verschieden von dem erfindungsgemäßen Verfahren. Ferner ist AT III im Plasma in einer großen Menge vorhanden und die spezifische Entfernung davon ist schwierig.

Kurze Erläuterung der Zeichnung

Fig. 1 ist ein schematisches Diagramm, das das Blutgerinnungsreaktionssystem und die Wirkung von AT III verdeutlicht. Fig. 2 ist ein Graph, der ein Beispiel einer Eichkurve für die Bestimmung der biologischen Aktivität von AT III zeigt. Fig. 3 ist ein Graph, der die Korrelation zwischen dem erfindungsgemäßen Verfahren und einem bekannten Verfahren unter Verwendung eines synthetischen Substrats zeigt.

Zusammenfassende Darstellung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Bestimmung der biologischen Aktivität von AT III bereit, das die Schritte, wie sie in Anspruch 1 genannt sind, enthält. Die vorliegende Erfindung stellt auch einen Reagenzsatz zur Bestimmung der biologischen Aktivität von AT III in einer Probe gemäß Anspruch 2 zur Verfügung.

Ausführliche Beschreibung der Erfindung

Wie in der beigefügten Fig. 1 gezeigt ist, gibt es bei der Blutgerinnungsreaktion den intravaskulären Gerinnungsreaktionsweg, bei dem die Gerinnung durch Kontakt mit der Oberfläche eines Fremdstoffs ausgelöst wird, und den extravaskulären Gerinnungsreaktionsweg, bei dem die Reaktion durch Gewebethromboplastin ausgelöst wird. Man nimmt an, daß der intravaskuläre Gerinnungsreaktionsweg dafür anfällig ist, viele Fehler zu erzeugen, da viele Reaktionen beteiligt sind. Daher wird bei der vorliegenden Erfindung die extravaskuläre Gerinnungsreaktion herangezogen. Das heißt, die vorliegende Erfindung nutzt eine Reaktion, bei der die Gerinnungsreaktion durch Gewebethromboplastin ausgelöst wird und die Fällung von Fibrin durch die Wirkung von Faktor VII, aktiviertem Faktor VII (VIIa), Faktor X, aktiviertem Faktor X (Xa), Faktor V, Faktor II, aktiviertem Faktor II (IIa) und Fibrinogen verursacht wird. Bei diesem Weg inhibiert AT III die Faktoren IIa und Xa in Gegenwart von Heparin. Erfindungsgemäß wird die biologische Aktivität von AT III in einer Probe als Verzögerung der Blutgerinnungszeit unter Verwendung einer einfachen, herkömmlichen Vorrichtung zur Messung der Blutgerinnungszeit erhalten, und eine genauere Messung der biologischen Aktivität von AT III kann durchgeführt werden.
Die Probe, auf die das erfindungsgemäße Verfahren anwendbar ist, ist üblicherweise Plasma. Nach einem herkömmlichen Verfahren wird einem zu untersuchenden Patienten Blut entnommen, und das Plasma wird davon abgetrennt:
Das von AT III freie, extravaskuläre Gerinnungsfaktoren enthaltende Plasma, das verwendet werden soll, bedeutet ein Plasma, aus dem AT III spezifisch entfernt worden ist und das die extravaskulären Gerinnungsfaktoren, Faktor VII, Faktor X, Faktor V, Faktor II und Fibrinogen enthält. Wenn die Prothrombin-Zeiten des Plasmas in Gegenwart von 5 bis 20 U/ml Heparin und in Abwesenheit von Heparin gemessen werden, dann sollte die Differenz dazwischen innerhalb von 10 Sekunden, vorzugsweise 5 Sekunden, liegen. Douglas M. Tollefsen et al., Journal of Biological Chemistry, Bd. 257/5 (März 1982), S. 2162-2169, beschreiben z. B. die Behandlung von Plasma durch Heparin-Affinitätschromatographie als eine Stufe der Abtrennung und Reinigung von Heparin-Cofaktor II. Der Proteingehalt des auf diese Weise behandelten Produkts beträgt jedoch nur etwa 1/300 des Proteingehalts des ursprünglichen Plasmas, und das Produkt kann kaum als Plasma bezeichnet werden. Im Gegensatz dazu ist festgestellt worden, daß AT III spezifisch absorbiert werden kann, und zwar ohne wesentliche Absorption von extravaskulären Gerinnungsfaktoren, indem Salz zum Plasma gegeben wird, so daß der Salzgehalt einen bestimmten Wert annimmt, und indem das Plasma einer Heparin-Affinitätschromatographie unterworfen wird, die mit der gleichen Konzentration an Salz äquilibriert worden ist, wobei man ein von AT III freies, extravaskuläre Gerinnungsfaktoren enthaltendes Plasma erhält. Obwohl nämlich die Gerinnung (Prothrombin-Zeit) nicht stattfindet, wenn Heparin in einer Konzentration von 12 U/ml zu Plasma vor der Durchführung der Chromatographie gegeben wurde, zeigte die Fraktion, die nicht durch Heparin-Affinitätschromatographie adsorbiert wurde, fast die gleiche Gerinnungszeit wie das ursprüngliche Plasma, zu dem kein Heparin gegeben wurde. Daraus wurde geschlossen, daß ein von AT III freies, extravaskuläre Gerinnungsfaktoren enthaltendes Plasma durch Heparin-Affinitätschromatographie erhalten werden kann. Es ist günstig, die Heparin- Affinitätschromatographie unter Verwendung einer Lösung mit einem Gehalt an einem Salz, wie Natriumchlorid oder Kaliumchlorid, in einem Bereich von 0,05 bis 0,7 m und vorzugsweise von 0,1 bis 0,3 m, in einem Puffer, z. B. Michaelis-Puffer, Phosphatpuffer, Tris-HCl-Puffer oder dergl., vorzugsweise in einer Konzentration von 10 bis 50 millimolar und bei einem pH-Wert von 7,0 bis 7,5, durchzuführen und als Träger Heparin-Agarose, Heparin- Sepharose oder dergl, zu verwenden. Das Salz wird in der gleichen Konzentration auch zu dem Plasmagegeben, das der Chromatographie unterworfen werden soll. Auf diese Weise kann von AT III freies, extravaskuläre Gerinnungsfaktoren enthaltendes Plasma erhalten werden. Das Plasma kann auch durch eine Antigen-Antikörper-Reaktion erhalten werden. Das heißt, das gewünschte Plasma kann durch Immunopräzipitation oder Immunoaffinitätschromatographie unter Verwendung eines anti-AT III-Antikörpers, der durch Immunisierung einer Ziege, eines Kaninchens, einer Maus oder dergl., mit AT III als Antigen erhalten wurde, oder eines monoclonalen anti-AT III-Antikörpers, der durch herkömmliche Zellfusionstechniken oder dergl. erhalten wurden, um spezifisch AT III aus dem Plasma zu entfernen, erhalten werden.
Das Prothrombin-Zeitmeß-Reagenz umfaßt Gewebethromboplastin, das aus inneren Organen, wie Hirn, Lunge, Plazenta und dergl., von Mensch, Kaninchen und dergl., stammt, und Calcium.
Im allgemeinen kann die erfindungsgemäße Bestimmung der biologischen Aktivität von AT III durch Mischen einer vorher festgelegten Menge einer Plasmaprobe oder einer verdünnten Lösung davon und des von AT III freien, extravaskuläre Gerinnungsfaktoren enthaltenden Plasmas, Inkubieren des Gemisches bei 25 bis 45ºC und üblicherweise bei 37ºC für 1 bis 10 Minuten und vorzugsweise für 2 bis 5 Minuten, durch Zugabe einer Prothrombin-Zeitmeß-Reagenzes, das Heparin enthält, und die anschließende Messung der Gerinnungszeit bei der gleichen Temperatur durchgeführt werden. Getrennt davon wird Plasma eines gesunden Menschen in verschiedenen Konzentrationen verdünnt, und die Gerinnungszeiten werden auf die gleiche Weise gemessen. Die Gerinnungszeiten werden, bezogen auf den Verdünnungsgrad aufgetragen, um eine Eichkurve zu erhalten. Aus der auf diese Weise erhaltenen Eichkurve erhält man das Verhältnis der AT III-Aktivität der Probe zu der eines gesunden Menschen, und das Ergebnis wird durch dieses Verhältnis ausgedrückt.
Üblicherweise wird eine Plasmaprobe mit einem Puffer bei einem pH-Wert von 6,0 bis 8,5, z. B. Michaelis-Puffer, Tris- HCl-Puffer, Phosphatpuffer, Veronalpuffer, Imidazolpuffer oder Good-Puffer, wie HEPES, TES oder MOPS verdünnt, und vorzugsweise werden 5 bis 100 ul Plasma oder einer verdünnten Lösung davon mit 100 ul von AT III freiem, extravaskuläre Gerinnungsfaktoren enthaltendem Plasma gemischt.
Obwohl die Konzentrationen der entsprechenden Reagenzien geeignet gewählt werden können, ist es günstig, wenn die Konzentration von Heparin 0,1 bis 50 000 U/ml und vorzugsweise 1 bis 50 U/ml beträgt (die Einheit an Heparin wurde gemäß "Authentische Heparin-Natrium-Probe und Verfahren zur Bestimmung davon" nach der Japanischen Pharmacopoeia bestimmt), die Konzentration von Thromboplastin in einem Prothrombin-Zeitmeß-Reagenz 0,001 bis 15 mg/ml und vorzugsweise 0,01 bis 0,1 mg/ml beträgt und die Konzentration an Calcium 2 bis 500 millimolar und vorzugsweise 5 bis 50 millimolar beträgt. Im allgemeinen wird ein Prothrombin- Zeitmeß-Reagenz in einem Anteil von 50 bis 300 ul pro 100 ul des von AT III freien, extravaskuläre Gerinnungsfaktoren enthaltenden Plasmas verwendet.
Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren kann die biologische Aktivität von AT III genau, rasch und einfach bestimmt werden, und es ist festgestellt worden, daß die Daten eine hohe Korrelation mit denen zeigen, die nach einem · herkömmlichen Verfahren unter Verwendung eines synthetischen Substrats erhalten wurden.
Der erfindungsgemäße Reagenzsatz zur Bestimmung der biologischen Aktivität von AT III umfaßt das vorstehende, von AT III freie, extravaskuläre Gerinnungsfaktoren enthaltende Plasma und die entsprechenden vorstehend genannten Reagenzien. Üblicherweise wird das von AT III freie, extravaskuläre Gerinnungsfaktoren enthaltende Plasma in einer lyophilisierten Form nach herkömmlichen Verfahren hergestellt und mit gereinigtem Wasser oder einem Puffer vor der Verwendung rekonstituiert. Ferner können die entsprechenden Reagenzien in Form einer Lösung vorliegen, die gemäß dem herkömmlichen Verfahren erhalten wird, wobei alle Reagenzien, gegebenenfalls zusammen mit einem Träger, in gereinigtem Wasser oder einem Puffer gelöst werden, so daß vorher festgelegte Konzentrationen der entsprechenden Reagenzien in einem Reaktionssystem erhalten werden können und dabei die Lösung direkt bei der Bestimmung verwendet werden kann. Sie können auch in Form konzentrierter Lösungen vorliegen, die in geeigneter Weise auf die gewünschte Konzentration verdünnt werden können, oder in einer lyophilisierten Form. Ferner können die entsprechenden Reagenzien in Form einer Lösung, eines lyophilisierten Produkts oder dergl. hergestellt werden. Der erfindungsgemäße Reagenzsatz zur Bestimmung wird als sogenannter Reagenzsatz durch Kombination dieser Reagenzien verwendet.
Die nachstehenden Beispiele dienen der weiteren ausführlichen Erläuterung der Erfindung.

Beispiel 1

Herstellung eines von AT III freien, extravaskuläre Gerinnungsfaktoren enthaltenden Plasmas:

Etwa 20 ml Heparin-Agarose (Typ II) (hergestellt von Sigma Company, USA) wurden in einen Zylinder eines Kunststoffinjektors gepackt und mit 20 millimolar Tris-Puffer (pH-Wert: 7,3) mit einem Gehalt an 0,1 m Natriumchlorid und 0,35% Natriumcitrat äquilibriert.
Getrennt davon wurde menschliches Plasma (negativ in Bezug auf HBsAg und HIV-Antikörper, erhalten von Plasma Biological Service Incorporated, USA) bei 2500 U/min für 10 Minuten zentrifugiert, der Niederschlag wurde entfernt, und 1,8 ml 2 m Natriumchlorid wurden zu 36 ml Plasma gegeben. Das Plasma, dem das Natriumchlorid zugesetzt worden war, wurde durch eine Säule geleitet, und die Fraktion, die nicht adsorbiert wurde, wurde in Kunststoffgefäßen in Portionen von 2 ml aufgefangen.
Die Säule wurde bei Raumtemperatur betrieben, und das Plasma und die entsprechenden Fraktionen wurden in Eis gelagert.
Die Prothrombin-Zeit des gewonnenen Plasmas wurde in Gegenwart von 12 U/ml Heparin oder in Abwesenheit von Heparin unter Verwendung von Thrombomat (Thromboplastin aus Kaninchenhirngewebe, hergestellt von Bio Merieux S. A., Frankreich) gemessen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 gezeigt. Tabelle 1
- : nicht gemessen
Wie aus Tabelle 1 ersichtlich ist, trat bei Plasma vor dem Auftragen auf die Säule die Gerinnung in 15,2 Sekunden in Abwesenheit von Heparin auf, und es trat keine Gerinnung innerhalb von 250 Sekunden in Gegenwart von Heparin auf. Im Gegensatz dazu trat die Gerinnung im Fall von Fraktionen, die nicht adsorbiert wurden, z. B. bei Fraktion Nr. 11, in 14,0 Sekunden in Abwesenheit von Heparin und in 14,7 Sekunden in Gegenwart von Heparin auf. Aus diesen Ergebnissen wurde geschlossen, daß aus den Fraktionen Nr. 4 bis 15 AT III fast vollständig entfernt wurde, während die extravaskulären Gerinnungsfaktoren, d. h. Faktor VII, Faktor X, Faktor V, Faktor II und Fibrinogen, enthalten waren.
Die Fraktionen Nr. 4 bis 15 wurden vereinigt, wobei man von AT III freies, extravaskuläre Gerinnungsfaktoren enthaltendes Plasma erhielt, das bei -30ºC gelagert wurde.
In diesem Beispiel wurden etwa 26 ml von AT III freies, extravaskuläre Gerinnungsfaktoren enthaltendes Plasma (nachstehend lediglich als AT III freies Plasma bezeichnet) aus 36 ml Plasma erhalten.

Beispiel 2

(1) Aufstellung einer Eichkurve

5 Plasmaproben von gesunden Menschen wurden gemischt und 5- fach mit Michaelis-Puffer (pH-Wert: 7,35) verdünnt. Es wurde in 5 Stufen verdünnt, um 5 Proben zu erhalten. 50 ul jeder Probe wurden mit 100 ul von AT III freiem Plasma, das in Beispiel 1 erhalten wurde, gemischt und 2 Minuten auf 37ºC erwärmt. Dazu wurden 200 ul einer wäßrigen Lösung von 0,04 mg/ml Thromboplastin aus Kaninchenhirngewebe (eine Lösung, die durch Lösen eines Fläschchens Thrombomat für 10 ml, das in Beispiel 1 verwendet wurde, in 100 ml einer Lösung mit einem Gehalt von 5 U/ml Heparin und 25 millimolar Calciumchlorid hergestellt wurde) gegeben und es wurde auf 37ºC erwärmt und die Gerinnungszeit wurde gemessen.
Wenn die Daten auf halblogarithmischem Papier aufgetragen wurden, indem der Verdünnungsgrad der Plasmaprobe auf der x- Achse und der Gerinnungszeit auf der y-Achse aufgetragen wurde, um eine lineare Beziehung, wie sie in der beigefügten Fig. 2 gezeigt ist, zu erhalten, dann wurde festgestellt, daß die Verzögerung der Koagulationszeit von der Konzentration an AT III im Plasma abhängig war.
Wie aus Fig. 2 ersichtlich ist, wird eine gute lineare Beziehung zwischen etwa 42 bis 92 Sekunden erhalten, wenn Thromboplastin aus Kaninchenhirngewebe verwendet wird. Auf diese Weise kann es als Eichkurve verwendet werden.
Zum Vergleich wurde die gleiche Probe einer Bestimmung unter Verwendung eines Reagenzsatzes zur Messung von AT III mit einem synthetischen Substrat (AT III-Test "BMY", verkauft von Boehringer Mannheim Yamanouchi K. K.) unterworfen, und die Ergebnisse wurden mit denen der vorliegenden Erfindung unter Verwendung von Thromboplastin aus Kaninchenhirngewebe verglichen, um die Korrelation zu untersuchen. Die Ergebnisse sind in Fig. 3 gezeigt. In Fig. 3 entspricht die Ordinate den Daten, die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhalten wurden, und die Abszisse entspricht den Daten, die unter Verwendung von BMY erhalten wurden. Die Ergebnisse werden ausgedrückt, indem der Prozentsatz an AT III-Aktivität von nicht verdünntem Plasma, der durch Mischen von 5 Proben erhalten wurde, als 100% genommen wird.
Wie aus Fig. 3 ersichtlich ist, nimmt der Korrelationskoeffizient zwischen beiden Verfahren den hohen Wert von 0,940 an, was die Brauchbarkeit des erfindungsgemäßen Verfahrens zeigt.

(2) Bestimmung

5 Plasmaproben von gesunden Menschen wurden 10-fach mit Michaelis-Puffer (pH-Wert: 7,35) verdünnt. In der gleichen Weise wie in Beispiel 2 (1) wurden Gerinnungszeiten unter Verwendung von Thromboplastin aus Kaninchenhirngewebe gemessen, und die prozentualen AT III-Aktivitäten (die AT III-Aktivität von nicht verdünntem Plasma, erhalten durch Mischen von 5 Proben, wurde als 100% genommen) jeder Probe unter Verwendung der Eichkurve in Beispiel 2 (1) erhalten. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 gezeigt. Tabelle 2
Wie in Tabelle 2 gezeigt ist, betrugen die prozentualen AT III-Aktivitäten dieser Plasmaproben von gesunden Menschen 96 bis 109%, und sie lagen innerhalb des normalen Bereiches für AT III (81 bis 118%, Minoru UKITA, Rinsho Byori, besondere Ausgabe Nr. 70 (1987), S. 173 bis 180).

Beispiel 3

Reagenz für die Bestimmung der biologischen Aktivität von AT III:

1 ml jeder der in Beispiel 1 erhaltenen, von AT III freien Plasmaproben wurde in Fläschchen gegossen und gemäß einem herkömmlichen Verfahren lyophilisiert.
Getrennt davon wurden jeweils 1 ml einer Lösung mit einem Gehalt an 0,4 mg/ml Thromboplastin aus Kaninchenhirngewebe (Thrombomat), 50 U/ml (193,4 U/mg) Heparin-Natrium und 10 mg/ml Sorbit in gereinigtem Wasser in Fläschchen gegossen und gemäß dem herkömmlichen Verfahren lyophilisiert. Beide Fläschchen wurden kombiniert, um einen Reagenzsatz zu erhalten. Bei der Verwendung wird das von AT III freie Plasma durch Zugabe von 1 ml gereinigtem Wasser gelöst. Das Thromboplastinreagenz wird in 10 ml einer 25 millimolar Calciumchloridlösung gelöst.
Erfindungsgemäß kann die biologische Aktivität von AT III im Plasma einfach, rasch und genau mit einer herkömmlichen Vorrichtung zur Messung der Blutgerinnungszeit bestimmt werden. Daher kann die vorliegende Erfindung einen wesentlichen Betrag zur klinischen Diagnostik leisten.

Claims

1. Verfahren zur Bestimmung der biologischen Aktivität von Antithrombin III (AT III) in einer Probe umfassend die Schritte:

(i) das Mischen einer Probe von einem von AT III freien, extravaskuläre Gerinnungsfaktoren enthaltenden Plasma, von Heparin und von einem Prothrombin-Zeitmeß-Reagenz und

(ii) Messen der Prothrombin-Zeit, wobei das extravaskuläre Gerinnungsfaktoren enthaltende Plasma ein Plasma ist, bei dem das AT III spezifisch entfernt worden ist.

2. Reagenzsatz zur Bestimmung der biologischen Aktivität von AT III in einer Probe umfassend:

(i) von AT III freies, extravaskuläre Gerinnungsfaktoren enthaltendes Plasma,

(ii) Heparin und

(iii) ein Prothrombin-Zeitmeß-Reagenz, wobei das extravaskuläre Gerinnungsfaktoren enthaltende Plasma ein Plasma ist, bei dem AT III spezifisch entfernt worden ist.