DE656785C

DE656785C - Process for the production of adrenal cortical hormone preparations in purified form

Info

Publication number: DE656785C
Application number: DEN38021D
Authority: DE
Inventors: Tadeus Reichstein
Original assignee: Organon NV
Current assignee: Organon NV
Priority date: 1935-04-13
Filing date: 1935-04-13
Publication date: 1938-02-19

Description

Verfahren zur Gewinnung von Nebennierenrindenhormonpräparaten in gereinigter Form Die Reinigung von Präparaten - des Hormons der Nebennierenrinde verursacht große Schwierigkeiten und ist andererseits wichtig, um zu haltbaren Präparaten von möglichst gleichbleibender Wirksamkeit zu gelangen, die frei von unerwünschten Nebenwirkungen sind, die aktiven Anteile also in möglichst hoher Reinheit enthalten. Besonders hinderlich für eine wirksame Anreicherung ist außer der hohen Verdünnung, in der die physiologisch wirksamen Anteile meist gewonnen werden, besonders ihre großeWasserlöslichkeit und relative Hitzeempfindlichkeit. So ist es z. B. bisher auch nicht möglich gewesen, solche Hormonkonzentrate durch Vakuumdestillation zu reinigen, da bei sol- chen Versuchen die Aktivität zerstört wird.Process for obtaining adrenal cortex hormone preparations in purified form The purification of preparations - the hormone of the adrenal cortex causes great difficulties and, on the other hand, is important in order to obtain long-lasting preparations that are as effective as possible and that are free of undesirable side effects, i.e. the highest possible active content Contain purity. In addition to the high dilution in which the physiologically active components are usually obtained, particularly their high water solubility and relative heat sensitivity are particularly hindering for an effective enrichment. So it is z. For example, it has not previously been possible to purify such hormone concentrates by vacuum distillation, since such attempts destroy the activity.

Es wurde nun gefunden, daß eine wesentliche Reinigung der Hormonpräparate dadurch erzielt werden kann, daß man die Rohprodukte mit Ketonreagenzien, vorzugsweise Hydrazinderivaten, behandelt, die erhaltenen Kondensationsprodukte von den nicht in Reaktion getretenen Anteilen abtrennt und die ersteren hierauf ehier Spaltung in an sich bekannter Weise unterwirft, wobei die phy- siologisch wirksamen Anteile wieder in Freiheit gesetzt und in wesentlich reinerer Form gewonnen werden.It has now been found that the hormone preparations can be substantially purified by treating the crude products with ketone reagents, preferably hydrazine derivatives, separating the condensation products obtained from the unreacted fractions and then cleaving the former in a manner known per se subject, whereby the physiologically effective components are set free again and obtained in a much purer form.

Für die Kondensation können die verschiedensten Ketonreagenzien benutzt werden. Zweckmäßig wählt man solche, die sich möglichst leicht durch Säuren wieder spalten lassen und die eine möglichst große Änderung der Löslichkeitsverhältnisse zwischen freiem Hormon und Kondensationsprodukt hervorrufen, also das in Wasser erheblich, in Äther oder Benzol nur mäßig lösliche Hormon in ein Kondensationsprodukt überführen, das entweder in Wasser oder in organischen Lösungsmitteln möglichst unlöslich ist, wodurch eine Abtrennung der Ballaststoffe wesentlich erleichtert wird. Eine sehr bequeme Ausführungsform des Verfahrens besteht darin, daß man als Ketonreagenzien solche Körper verwendet, die neben der zur Verbindung mit Carbonylgruppen geeigneten Gruppe noch eine salzbildende Gruppe enthalten, wie z. B. die Phenylhydrazinsulfosäure.A wide variety of ketone reagents can be used for the condensation will. It is advisable to choose those which can easily be recovered by acids can split and the greatest possible change in the solubility ratios between free hormone and condensation product, i.e. that in water considerably, in ether or benzene only moderately soluble hormone in a condensation product convert this either in water or in organic solvents if possible is insoluble, which makes it much easier to separate the dietary fiber will. A very convenient embodiment of the method is that as Ketone reagents such bodies used, in addition to being used for connection with carbonyl groups suitable group still contain a salt-forming group, such as. B. the phenylhydrazine sulfonic acid.

Es ist zwar bereits ein Verfahren zur Reinigung des Corpus-luteum-Hormons beschrieben, bei welchem dieses mittels Carbonylreagenzien abgetrennt wird.While there is already a method of cleansing the corpus luteum hormone described in which this is separated by means of carbonyl reagents.

Bei dem vorliegenden Verfahren handelt es sich um die Gewinnung des Nebennierenrindenhormons, über dessen chemische Eigenschaften äußerst wenig, bekannt war. Im allgemeinen beschränkten sich die Reinigungen auf die Methode der Ausschüttelung von Extrakten mittels darin unlöslichen Lösungsmitteln bzw. auf die Verteilung zwischen den zwei Phasen miteinander nicht mischbarer Lösungsmittel. Es war deshalb ein erheblicher technischer Fortschritt, als gefunden wurde, daß dieses zum Leben notwendige Hormon mittels Ketonreagenzien gereinigt werden kann. Aus der Tatsache, daß das Corpus-luteum-Hormon mit den gleichen Reagenzien gereinigt werden kann, w keineswegs darauf zu schließen oder auch nur zu erwarten, daß es möglich sein konnte, das' Nebennierenrindenhormon ebenfalls mittels dieser Reagenzien zu reinigen, um so mehr als bisher nicht beschrieben worden war, daß das Hormon Ketoneigenschaften besitzt.In the present process is the recovery of adrenocortical hormone on its chemical properties very little was known. In general, the purifications are limited to the method of shaking out extracts using solvents which are insoluble therein or to distributing them between the two phases of immiscible solvents. It was therefore a considerable technical advance when it was found that this vital hormone can be purified using ketone reagents. From the fact that the corpus luteum hormone can be purified with the same reagents, it is by no means to be concluded or even expected that it might be possible to purify the adrenal cortex hormone also by means of these reagents, all the more so than It had not previously been described that the hormone possessed ketone properties.

Beispiel i 2o g eines in bekannter Weise hergestellten Hormonkonzentrates, das die wirksamen Teile aus iooo kg Rindernebennieren enthält (entsprechend einer Wirksamkeit von etwa 50 Hundeeinheiten pro mg), wird mit einer Lösung versetzt, die durch Verreiben von 12 g Semicarbazidchlorhydrat und 18 g kri'-stallisiertem Natriumacetat unter allmählichem Zusatz von i5o ccm Methylalkohol und nachträglicher Entfernung von Natriumchlorid durch Filtration hergestellt worden war. Nach 4stündigem, Stehen bei Zimmertemperatur wird im Vakuum zur Trockne gedampft und der Rückstand mit Wasser angerieben, dem so viel Soda zugesetzt wird, daß Lackmus gerade gebläut wird. Das so erhaltene gelbliche Pulver wird abfiltriert, mehrmals mit wenig Eiswasser, dann gründlich mit Äther und zuletzt mit etwas Essigester gewaschen.Example i 20 g of a hormone concentrate prepared in a known manner, which contains the active parts from 100 kg of bovine adrenal glands (corresponding to an effectiveness of about 50 dog units per mg), is mixed with a solution which, by rubbing in 12 g of semicarbazide chlorohydrate and 18 g of kri ' -stallized sodium acetate was produced with the gradual addition of 150 cc of methyl alcohol and subsequent removal of sodium chloride by filtration. After standing for 4 hours at room temperature, the mixture is evaporated to dryness in vacuo and the residue is rubbed with water, to which enough soda is added that litmus is just blued. The yellowish powder obtained in this way is filtered off, washed several times with a little ice water, then thoroughly with ether and finally with a little ethyl acetate.

Es wird hierauf zur Spaltung in ioo ceni normaler Salzsäure suspendiert und mit 5oo ccm Essigester längere Zeit durchgeschüttelt, bis alle festen Partikel verschwunden sind. Durch Erwärmen auf etwa 4 0' sowie durch mechanisches Zerkleinern fester -Klümpchen kann die 'Spaltung beschleunigt werden. Nach eingetretener Lösung wird abgetrennt und die wäßrige Schicht noch mehrmals mit Essikester ausg eschüttelt. Die mit möglichst wenig starker Sodalösung neutralisierten Essigesterauszüge werden getrocknet und hinterlassen nach dem Eindampfen im Vakuum etwa 2 g des gereinigten, fast farblosen Hormons, das nunmehr eine Wirksamkeit von etwa 5oo Hundeeinheiten pro mg aufweist. Beispiel 2 i5g Hormonpräparat mit einer Wirksamkeit ' von etwa 33Hundeeinheiten pro mg werden in ioo ccin wasserfreiem Alkohol gelöst, mit 2o g Benzoesäurehydrazid und 2 g Eisessig versetzt. Nach mehrstündigem Stehen bei Zimmertemperatur wird der Alkohol im Vakuum entfernt, der Rückstand mit Eiswasser versetzt und mit Äther ausgeschüttelt. Die ätherische Lösung wird mehrmals mit eisgekühlter, verdünnter Salzsäure, dann mit Sodalösung und schließlich gründlich mit Wasser gewaschen. Das ini A.ther verbliebene Kondensationsprodukt -'#yi#d nach Abdestillieren des Äthers durch .mehrstündiges Schütteln oder Verkneten mit .2ooccm halbnormaler Salzsäure bei 2o bis 50' gespalten und hierauf das Hormon mit Essigester ausgeschüttelt, der nach Neutralisation mit Pottasche im Vakuum abgedampft wird. Zur Reinigung wird der RÜckstand noch durch längeres Schütteln Mit 2 1 Clestilliertem, Mit Kohlendioxyd gesättigtem Wasser in Lösung gebracht, diese mit etwa 4ooccm reinem Äther ausgezogen und die abgetrennte Ätherschicht noch viermal mit je 2oo ccm Wasser ausgezogen. Die vereinigten wäßrigen Lösungen geben beim Eindampfen im Vakuum etwa 45 9 gereinigtes Hormon, das eine Wirksamkeit von etwa 5oo Hundeeinheiten pro mg aufweist. Beispiel 3 :2og Hormonpräpa:rat Mit einer Wirksamkeit von etwa 2,5 Hundeeinheiten pro mg werden mit der möglichst konzentrierten wäßrigen Lösung von 30 g reinem' phenylhydrazinparasulfosaurem Natrium unter Zusatz von 2 g Eisessig 8 Stunden lebhaft geschüttelt. Hierauf wird Soda bis zur eben alkalischen Reaktion zugesetzt, wodurch die beim Eisessigzusatz eingetretene Fällung in Lösung geht und die Mischung mehrmals mit Essigester ausgeschüttelt, bis dieser nichts mehr aufnimmt.It is then suspended in 100 ceni of normal hydrochloric acid for cleavage and shaken with 500 cc of ethyl acetate for a long time until all solid particles have disappeared. The cleavage can be accelerated by heating to about 40 ' and by mechanically crushing solid lumps. After the solution has occurred, it is separated off and the aqueous layer is shaken out several times with ethyl acetate. The ethyl acetate extracts neutralized with as little strong soda solution as possible are dried and, after evaporation in vacuo, leave about 2 g of the purified, almost colorless hormone, which now has an effectiveness of about 500 dog units per mg. Example 2 i5g hormone preparation with an efficiency 'of about 33Hundeeinheiten per mg are dissolved in ioo CCIN anhydrous alcohol, mixed with 2o g benzoic acid hydrazide and 2 g of glacial acetic acid. After standing for several hours at room temperature, the alcohol is removed in vacuo, the residue is mixed with ice water and extracted with ether. The ethereal solution is washed several times with ice-cold, dilute hydrochloric acid, then with soda solution and finally thoroughly with water. The ini A.ther remaining condensation product - shaken '# yi # d after distilling off the ether by .mehrstündiges shaking or kneading with .2ooccm semi-normal hydrochloric acid at 2o to 50' split and then the hormone with Essigester, the evaporated after neutralization with potash in vacuo will. To clean the residue is still by prolonged shaking with 2 1 Clestilliertem, saturated with carbon dioxide in water solution, it pulled with about 4ooccm pure ether and four times pulled the separated ether layer with each 2oo cc of water. The combined aqueous solutions give about 45 9 purified hormone on evaporation in vacuo, which has a potency of about 500 dog units per mg. Example 3 : 2og hormone preparation: rat With an effectiveness of about 2.5 dog units per mg, the concentrated aqueous solution of 30 g of pure sodium phenylhydrazine parasulfonate with the addition of 2 g of glacial acetic acid is shaken vigorously for 8 hours. Soda is then added until the reaction is just alkaline, as a result of which the precipitation that has occurred when glacial acetic acid is added dissolves and the mixture is shaken out several times with ethyl acetate until it no longer absorbs anything.

Die wäßrige Phase wird hierauf mit demselben Vülumen an 3fach normaler Salzsäure sowie 3oo ccm Essigester versetzt und % Stunde bei Zimmertemperatur geschüttelt. Hierauf wird abgetrennt und noch vierinal mit je 2o0 ccm Essigester je io Minuten ausgeschüttelt. Die Aufarbeitung der Essige esterlösung geschieht wie, in Beispiel i. Statt .Essigester können hier wie in den anderen Beispielen auch andere Lösungsmittel verwendet werden, für Äther oder Benzol sind dabei aber mindestens die 15fachen Mengen anzuwenden. Erhalten werden etwa i g Hormon mit einer Wirksamkeit von ebenfalls etwa 5oo Hundeeinheiten pro mg. Das Produkt stellt einen fast farblosen oder leicht gelblichen, sehr dicken Sirup dar, der beim Trocknen im Vakuum in eine schaumige Masse verwandelt wird. Durch Behandlung mit geeigneten Lösungsmitteln oder chemischen Reagenzien lassen sich daraus auch kristallisierte Präparate gewinnen. Auch aus den nicht mit den Ketonreagenzien in Reaktion getretenen Anteilen lassen sich kristallisierte Körper gewinnen, insbesondere ein Körper, der - aus Alkohol in farblosen Blättchen kristallisiert, die sich beim Erwärmen gegen 170' in Nadeln umwandeln und bei 222' korr. unzersetzt schmelzen, vor der Umwandlun-'- hvcrroskoi)isch sind und die Zusammensetzung C.,Har,05 besitzen (die lediglich einen Fall von Dirnorphismus darstellt).The aqueous phase is then mixed with the same Vülumen to 3 times normal hydrochloric acid and 3oo cc Essigester and shaken% hour at room temperature. It is then separated off and shaken out four times with 2o0 ccm of ethyl acetate each time for 10 minutes. The work-up of the ethyl acetate solution is done as in Example i. Instead of ethyl acetate, as in the other examples, other solvents can also be used, but at least 15 times the amount should be used for ether or benzene. About 1 g of hormone is obtained with an effectiveness of also about 500 dog units per mg. The product is an almost colorless or slightly yellowish, very thick syrup, which is transformed into a foamy mass when dried in a vacuum. Crystallized preparations can also be obtained from them by treatment with suitable solvents or chemical reagents. Crystallized bodies can also be obtained from the components that have not reacted with the ketone reagents, in particular a body which - crystallizes from alcohol in colorless flakes, which when heated to 170 'turn into needles and at 222' corr. melt undecomposed, before the transformation are hvcrroskoi) isch and have the composition C., Har, 05 (which is only one case of dirnorphism).

Claims

PATEIX CLAIMS: i. Procedure for purifying adrenal cortex hormone preparations, characterized in that the crude products are treated with ketone reagents which condensation products obtained from the unreacted fractions separates and then splits again. : 2. Method according to claim i, thereby characterized in that such substances are used as ketone reagents, which in addition to the a group which is suitable for connection with a carbonyl group is also a salt-forming group Group included.