DE60226125T2

DE60226125T2 - Verfahren zur quantifizierung von glykiertem protein

Info

Publication number: DE60226125T2
Application number: DE60226125T
Authority: DE
Inventors: Cameron E. Nine Mile Falls MELTON; Ralph P. Mccroskey
Original assignee: Scripps Laboratories Inc
Current assignee: Scripps Laboratories Inc
Priority date: 2001-01-31
Filing date: 2002-01-31
Publication date: 2009-05-07
Anticipated expiration: 2022-02-01
Also published as: IL157047A; JP2004532388A; BR0206904A; EP1360505B1; DE60226125D1; EP1360505A1; CA2435741C; BRPI0206904B8; WO2002061436A1; IL157047A0; CA2435741A1; JP4392164B2; ATE392621T1; CN1489693A; WO2002061436A8; BRPI0206904B1; CN1489693B; MXPA03006838A

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Diese Erfindung betrifft ein Verfahren zur Quantifizierung des Prozentsatzes an glykiertem Protein in einer biologischen Probe, die zur Verwendung in einem Reflexionsmessgerät geeignet ist, wie es von Diabetikern für die Selbstüberwachung der Glucosekonzentration im Blut verwendet wird.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Es ist gezeigt worden, dass die Kontrolle der Glucosekonzentrationen im Blut bei Diabetikern die Häufigkeit und den Schweregrad von mikrovaskulären und neurologischen Langzeitkomplikationen der Krankheit verringert. Die Messung von glykiertem Hämoglobin und Protein im Blut wird eingesetzt, um zu bestimmen, wie gut die Glucosekonzentration im Blut über einen längeren Zeitraum geregelt worden ist.
Die Geschwindigkeit der Bildung von glykiertem Hämoglobin steht in direktem Zusammenhang mit der Glucosekonzentration im Blut.
Die durchschnittliche Lebensdauer von roten Blutkörperchen ist 120 Tage, so dass eine Quantifizierung des Prozentsatzes der Glykierung von Hämoglobin mit einem Maß der durchschnittlichen Glucosekonzentration über die vorangegangenen 2 bis 3 Monate korreliert worden ist, was ein Maßstab für die Kontrolle der Glykämie über diesen Zeitraum ist (siehe „Diabetes Control and Complications Trial Research Group, The effect of intensive treatment of diabetes an the development of progression of long-term complications in insulin-dependent diabetes mellitus", New England Journal of Medicine 329: 977–986 (1993), und „American Diabetes Association, Tests of Glycemia in Diabetes", Diabetes Care 20 (Ergänzungsband 1), S18–S20 (1977)).
Glucose heftet sich auch an Nicht-Hämoglobin-Proteine im Blut, zum Beispiel an Albumin. Da Albumin das am häufigsten vorkommende Serumprotein ist und seine Halbwertszeit etwa 20 Tage beträgt, ist die Konzentration an glykiertem Protein ein Maß der durchschnittlichen Glucosekonzentration über die vorangegangenen 2 bis 3 Wochen. Die Messung von Glucose ergibt direkt die Glucosekonzentration zum Zeitpunkt der Messung.
Es ist berichtet worden, dass eine immobilisierte Dihydroxyborylverbindung nützlich ist, um an die 1,2-cis-Diole des Kohlenhydrats von glykierten Proteinen zu binden, um diese von nicht-glykierten Proteinen zu trennen. Die Verwendung dieser Technologie in einem Säulenchromatographieverfahren, um den Prozentsatz der Glykierung zu bestimmen, ist berichtet worden (siehe US-Patent Nr. 4,269,605 , erteilt am 26. Mai 1981 an Dean und US-Patent Nr. 5,284,777 , erteilt am 8. Februar 1994 an Rosenthal). Diese Verfahren verwenden angeblich das Boronatderivat, das an Agarosekügelchen in einer Säule immobilisiert ist, um in der Probe glykierte von nicht-glykierten Proteinen zu trennen. Diese Verfahren erfordern spezielle Verdünnungen und Pipettierungen der Probe, um die Kapazität des an die Agarosekügelchen gebundenen Affinitätsbindemittels nicht zu überlasten. Die Verwendung eines Boronatderviats, das an Agarosekügelchen immobilisiert ist, scheint sich nicht für eine Streifenanwendung zu eignen.
Das US-Patent Nr. 5,110,745 , das am 5. Mai 1992 an Kricka et al. erteilt wurde, beschreibt angeblich Verfahren zum Nachweis von glykiertem Protein in einer Probe, wobei die Probe mit einem definierten Überschuss einer Boronatverbindung in Lösung in Kontakt gebracht wird. Das so erhaltene ungebundene Boronat wird angeblich gemessen, indem man es an ein immobilisiertes glykiertes Molekül auf einer Trägermatrix bindet und die Menge an glykiertem Molekül misst, die keinen Komplex gebildet hat. Dieses Verfahren scheint eine Anzahl von Schritten zu erfordern, wozu eine separate Reaktion in Lösung vor der Aufbringung auf einen festen Träger, Verdünnung der Probe, um zu gewährleisten, dass die Menge an Bindemittel, die zu der biologischen Probe hinzugefügt wird, im Überschuss vorliegt, Durchführung eines separaten Assays, um den Prozentsatz der Proteinglykierung zu bestimmen, sowie mehrere Bindungs- und Waschschritte gehören.
Ein Messstab („dipstick")-Verfahren für die Messung von glykiertem Hämoglobin ist angeblich im US-Patent Nr. 4,861,728 beschrieben worden, das am 29. August 1989 an Wagner erteilt wurde. Dieses Verfahren soll Inkontaktbringen eines an einen festen Träger gebundenen, Hämoglobin bindenden Agens mit einer lysierten Blutprobe umfassen, die mit einer Dihydroxyborylverbindung vermischt ist, die mit einem fluoreszierenden Marker gekoppelt ist. Der Träger soll nicht-glykiertes Hämoglobin und fluoreszierend markiertes glykiertes Hämoglobin binden. Der Fluoreszenzmarker soll über die Dihydroxyborylverbindung an das glykierte Hämoglobin binden. Die Festphase wird aus der Probe entfernt und das Gesamt-Hämoglobin wird mittels Reflexionsphotometrie gemessen, während glykiertes Hämoglobin mit Hilfe der Fluoreszenz gemessen wird. Dieses Verfahren soll die Zugabe einer Menge an fluoreszenz-markiertem Dihydroxyboryl-Reagenz zur Probe erfordern sowie einen Spülschritt, nachdem es aus der Probe entfernt worden ist. Des Weiteren erfordert es zwei verschiedene Messverfahren für die Quantifizierung.
In anderen Assays (siehe z. B. das Japanische Patent Nr. 6,058,936 , das Europäische Patent Nr. 455225 und die veröffentlichte PCT-Anmeldung WO 96/03657 ) wird angeblich ein Boronat verwendet, das an einen detektierbaren Marker gekoppelt ist (wie z. B. eine fluoreszierende Verbindung, eine chemilumineszierende Verbindung, ein Isotop, Enzym oder einen anderen Marker). Sowohl die glykierten als auch die nicht glykierten Proteine werden an einen festen Träger gebunden, wobei ein allgemeines Affinitätsbindemittel wie z. B. ein Antikörper eingesetzt wird. Der Boronat-Marker-Komplex wird hinzugefügt und die Menge an Marker, die an dem festen Träger gebunden bleibt, wird gemessen. Jede dieser Methodenarten erfordert den zusätzlichen Schritt, das glykierte Protein zu markieren. Darüber hinaus werden in diesen Assays verschiedene Messverfahren verwendet, um Gesamt- und glykierte Proteine zu quantifizieren.
Die veröffentlichte PCT-Anmeldung WO 9840750 (die am 17. September 1998 veröffentlicht wurde) soll ein Verfahren zur Bestimmung des Prozentsatzes an glykiertem Hämoglobin beschreiben, bei dem immobilisiertes Boronat glykiertes Hämoglobin in der Probe bindet. Die Menge an gebundenem glykiertem Hämoglobin ist angeblich proportional zu dem Anteil an glykiertem Hämoglobin in der Probe. Dies soll die Notwendigkeit ungehen, nicht glykiertes Hämoglobin zu messen, um den Prozentsatz der Glykierung zu bestimmen. Die Ergebnisse des Verfahrens scheinen jedoch je nach Inkubationszeit des glykierten Proteins mit dem boronierten Träger zu variieren.
Demzufolge gibt es einen Bedarf für ein einfaches, schnelles und effizientes Verfahren zur Quantifizierung der Menge an glykiertem Protein in einer biologischen Probe, welches keine Verdünnung der Probe erfordert, das eine minimale Anzahl an Prozessschritten benötigt, das in Verbindung mit einem einfachen Nachweisgerät wie z. B. einem Handreflexionsmessgerät benutzt werden kann und das an einen Standard-Streifenassay angepasst werden kann.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung ist auf Verfahren zur Quantifizierung von glykierten Proteinen in biologischen Proben gerichtet. Des Weiteren sind hierin Vorrichtungen beschrieben, die diese Verfahren verwenden, sowie Kits, welche diese Vorrichtungen umfassen.
Die Ergebnisse aus der Messung von Glucose, glykiertem Protein und glykiertem Hämoglobin können ein umfassenderes Bild der Glykämiekontrolle bereitstellen. Die Messung der direkten Glucosekonzentration kann zur Einstellung von medikamentösen Behandlungen, einer Diät oder von Training eingesetzt werden. Zur Messung der mittelfristigen Glykämiekontrolle kann es die Messung der Konzentration an glykiertem Albumin ermöglichen, die Auswirkungen kürzlicher Veränderungen in der Lebensweise zu verfolgen. Zur Messung der langfristigen Glykämiekontrolle kann es die Messung der Konzentration an glykiertem Hämoglobin ermöglichen, die Gesamtwirkungen von Veränderungen zu überwachen. Es wäre praktisch, einen Test für alle drei in einem Format zu haben, das im Labor einer Arztpraxis verwendet werden könnte, damit die Ergebnisse während des Besuchs mit dem Patienten erörtert werden können, oder das alternativ von dem Patienten zuhause verwendet werden könnte. Derzeit wird Blutglucose routinemäßig mit Handmessgeräten und leicht zu benutzenden Streifen überwacht. Leider stehen ähnliche Tests für glykierte Proteine und glykiertes Hämoglobin nicht zur Verfügung.
Die Verfahren der vorliegenden Erfindung stellen Verfahren zur Quantifizierung von glykiertem Protein in einer biologischen Probe bereit. Die biologische Probe wird mit einer festen Trägermatrix in Kontakt gebracht, unter Bedingungen, unter denen sowohl glykiertes Protein als auch nicht glykiertes Protein an die feste Trägermatrix gebunden werden. Es wird ein Aliquot eines ersten Puffers hinzugegeben, das ausreicht, um ungebundenes Protein abzuspülen. Man führt eine erste Messung des gebundenen Proteins durch, um die Gesamtmenge (glykiert und nicht glykiert) des gebundenen Proteins zu bestimmen. Man gibt einen zweiten Puffer zu der festen Trägermatrix hinzu, der die Bedingungen verändert, so dass glykiertes Protein gebunden wird und nicht glykiertes Protein nicht wesentlich gebunden wird, und der in einer Menge hinzugefügt wird, die ausreicht, um ungebundenes (nicht glykiertes) Protein abzuspülen. Man führt dann eine zweite Messung des gebundenen Proteins durch. Glykiertes Protein wird quantifiziert, indem man die erste und die zweite Messung des gebundenen Proteins verwendet.
Gemäß einer Ausführungsform ist die vorliegende Erfindung auf ein Verfahren zur Quantifizierung von glykiertem Protein in einer Probe gerichtet, das umfasst: (a) Inkontaktbringen einer festen Trägermatrix, die eine negativ geladene Gruppe und eine Hydroxyborylverbindung umfasst und die einen Messbereich aufweist, mit einem Aliquot einer biologischen Probe, das ausreicht, um den Messbereich zu bedecken; (b) Inkontaktbringen dieser festen Trägermatrix mit einem Aliquot eines ersten Puffers, das ausreicht, um ungebundenes Protein abzuspülen, wobei der erste Puffer einen pH-Wert hat, der so ausgewählt ist, dass sowohl glykiertes als auch nicht glykiertes Protein an die feste Trägermatrix binden kann; (c) Quantifizieren des an den Messbereich gebundenen Proteins, wobei die Messung einer ausgewählten Eigenschaft dieses Proteins verwendet wird, um eine erste Messung von gebundenem Protein zu erhalten; (d) Inkontaktbringen der festen Trägermatrix mit einem Aliquot eines zweiten Puffers, das ausreicht, um ungebundenes Protein abzuspülen, wobei der zweite Puffer einen pH-Wert hat, der so ausgewählt ist, dass glykiertes Protein an die feste Trägermatrix binden kann, bei dem aber nicht glykiertes Protein nicht wesentlich an die feste Trägermatrix gebunden wird; (e) Quantifizieren des an den Messbereich gebundenen Proteins, wobei eine Messung der Eigenschaft verwendet wird, die in Schritt (c) gemessen worden ist, um eine zweite Messung von gebundenem Protein zu erhalten; und (f) Berechnen des Prozentsatzes an glykiertem Protein unter Verwendung der ersten und der zweiten Messung von gebundenem Protein.
Gemäß einer anderen Ausführungsform ist die vorliegende Erfindung auf ein Verfahren zur Quantifizierung einer Menge eines glykierten Proteins in einer biologischen Probe gerichtet, das umfasst: (a) Inkontaktbringen einer festen Trägermatrix, die eine negativ geladene Gruppe und eine Hydroxyborylverbindung umfasst und die einen Messbereich aufweist, mit einem Aliquot einer biologischen Probe, das ausreicht, um den Messbereich zu bedecken; (b) Inkontaktbringen dieser festen Trägermatrix mit einem Aliquot eines ersten Puffers, das ausreicht, um ungebundenes Protein abzuspülen, wobei der erste Puffer einen pH-Wert von etwa 5,0 bis etwa 7,0 hat; (c) Quantifizieren des an den Messbereich gebundenen Proteins, um eine erste Messung von gebundenem Protein zu erhalten; (d) Inkontaktbringen der festen Trägermatrix mit einem Aliquot eines zweiten Puffers, das ausreicht, um ungebundenes Protein abzuspülen, wobei der Puffer einen pH-Wert von etwa 8,0 bis etwa 10,0 hat; (e) Quantifizieren des an den Messbereich gebundenen Proteins, um eine zweite Messung von gebundenem Protein zu erhalten; und (f) Berechnen des Prozentsatzes an glykiertem Protein in der Probe unter Verwendung der ersten und der zweiten Messung von gebundenem Protein.
Bevorzugt und der Einfachheit halber messen die erste und die zweite Messung von gebundenem Protein dieselbe Eigenschaft. Bevorzugt wird die Eigenschaft mit Hilfe einer optischen Messung gemessen. Stärker bevorzugt handelt es sich bei der optischen Messung um Extinktion oder Reflexion bei einer spezifizierten Wellenlänge.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Quantifizierung von glykiertem Hämoglobin in einer biologischen Probe bereitgestellt, das umfasst: (a) Inkontaktbringen der biologischen Probe mit einer festen Trägermatrix, die negativ geladene Gruppen und eine Dihydroxyborylverbindung umfasst und die einen Messbereich aufweist, an einem Probenauftragsort, der mit der festen Trägermatrix in Verbindung steht; (b) Zugabe eines Aliquots eines ersten Puffers zu dem Probenauftragsort, wobei der erste Puffer einen pH-Wert von etwa 5,0 bis etwa 7,0 hat; (c) Durchführen einer ersten optischen Messung des Messbereichs bei einer Wellenlänge, bei der Hämoglobin Licht absorbiert; (d) Zugabe eines Aliquots eines zweiten Puffers zu dem Probenauftragsort, wobei der zweite Puffer einen pH-Wert von etwa 8,0 bis etwa 10,0 hat; (e) Durchführen einer zweiten optischen Messung des Messbereichs bei einer Wellenlänge, bei der Hämoglobin Licht absorbiert; und (f) Berechnen des Prozentsatzes an glykiertem Hämoglobin in der Blutprobe unter Verwendung der ersten und der zweiten optischen Messung. Wenn es sich bei der biologischen Probe um eine Blutprobe handelt, die rote Blutkörperchen umfasst, wird die Probe mit einem Mittel in Kontakt gebracht, das rote Blutkörperchen lysiert, bevor die erste optische Messung durchgeführt wird. Die Blutprobe kann mit einem Mittel vorbehandelt werden, das die roten Blutkörperchen lysiert, bevor sie mit dem festen Träger in Kontakt gebracht wird. Alternativ kann der erste Puffer ferner ein Mittel enthalten, das rote Blutkörperchen lysiert, oder die feste Trägermatrix kann mit einem Mittel behandelt werden, das rote Blutkörperchen lysiert, bevor sie mit der biologischen Probe in Kontakt kommt.
Gemäß einer anderen bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Quantifizierung eines glykierten Proteins bereitgestellt, das nicht Hämoglobin ist, das umfasst: (a) Inkontaktbringen einer biologischen Probe mit einem Probenauftragsort, der mit einer festen Trägermatrix in Verbindung steht, die negativ geladene Gruppen und eine Dihydroxyborylverbindung umfasst und die einen Messbereich aufweist; (b) Zugabe eines Aliquots eines ersten Puffers zu dem Probenauftragsort, wobei der erste Puffer einen pH-Wert von etwa 5,0 bis etwa 7,0 hat; (c) Durchführen einer ersten optischen Messung des Messbereichs bei einer Wellenlänge, bei der das Protein Licht absorbiert; (d) Zugabe eines Aliquots eines zweiten Puffers zu dem Probenauftragsort, wobei der zweite Puffer einen pH-Wert zwischen etwa 8,0 und etwa 10,0 hat; (e) Durchführen einer zweiten optischen Messung des Messbereichs bei einer Wellenlänge, bei der das Protein Licht absorbiert; und (f) Berechnen des Prozentsatzes an glykiertem Protein in der biologischen Probe unter Verwendung der ersten und der zweiten optischen Messung. Geeignete biologische Proben zur Verwendung in dem Verfahren dieser Ausführungsform der vorliegenden Erfindung schließen Plasma- und Serumproben ein. Ein geeignetes glykiertes Protein zur Quantifizierung gemäß dieser Ausführungsform ist Albumin. Für die Quantifizierung bestimmter glykierter Proteine kann es bevorzugt sein, dass das Protein mit einem geeigneten proteinspezifischen Markierungsmittel markiert ist.
Bevorzugte Puffersysteme zur Verwendung als der erste Puffer umfassen MES [2(N-Morpholino)ethansulfonsäure], MOPS [3(N-Morpholino)propansulfonsäure] und HEPES [N-2-Hydroxyethylpiperazin-N'-2-ethansulfonsäure].
Bevorzugte Puffer zur Verwendung als der zweite Puffer schließen Ammoniumacetat- und Taurinpuffer ein.
Des Weiteren wird hierin eine diagnostische Vorrichtung zur Quantifizierung von glykiertem Protein bereitgestellt, welche die vorstehenden Verfahren verwendet. Das Protein ist Hämoglobin oder Albumin.
Schließlich wird ein Kit beschrieben, der die vorstehend beschriebene diagnostische Vorrichtung; einen ersten Puffer, der einen pH-Wert von etwa 5,0 bis etwa 7,0 hat; und einen zweiten Puffer umfasst, der einen pH-Wert von etwa 8,0 bis etwa 10,0 hat.
BEGRIFFSERKLÄRUNGEN
Gemäß der vorliegenden Erfindung und, wie hierin verwendet, wird definiert, dass die folgenden Begriffe die folgenden Bedeutungen haben, sofern nichts Anderweitiges explicit angegeben ist:
Der Begriff „Alkyl" bezieht sich auf gesättigte aliphatische Gruppen, wozu geradkettige, verzweigte und cyclische (einschließlich polycyclische) Gruppen gehören.
Der Begriff „Carboxylat" oder „Carboxy" bezieht sich auf die COOH-Gruppe.
Der Begriff „Phosphat" bezieht sich auf auf die -PO₄-Gruppe.
Der Begriff „Sulfat" bezieht sich auf auf die -SO₄-Gruppe.
Der Begriff „Sulfinat" bezieht sich auf auf die -SO₂H-Gruppe.
Der Begriff „Sulfonyl" bezieht sich auf auf die -SO₃H-Gruppe.
„Hb" bezieht sich auf Hämoglobin.
„HEPES" bezieht sich auf [N-2-Hydroxyethylpiperazin-N'-2,-ethansulfonsäure].
„K", sofern es im Kontext der Messung einer Lichtmenge verwendet wird, die absorbiert oder reflektiert wird, bezieht sich auf den Absorptionskoeffizienten.
„MES" bezieht sich auf [2(N-Morpholino)ethansulfonsäure].
„MOPS" bezieht sich auf [3-(N-Morpholino)propansulfonsäure].
„S", sofern es im Kontext der Messung einer Lichtmenge verwendet wird, die absorbiert oder reflektiert wird, bezieht sich auf den Streuungskoeffizienten.
KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN
1 stellt eine graphische Darstellung der Absorption von glykiertem Hämoglobin (gefüllte Dreiecke) und Gesamt-Hämoglobin (offene Dreiecke), die in dem Assay an den festen Träger gebunden sind, sowie eine graphische Darstellung des Verhältnisses von glykiertem zu Gesamt-Hämoglobin (offene Kreise) gegen die Einwirkzeit dar. Es wurden unterschiedliche Träger verwendet, die für zunehmende Zeitdauer mit Boronat derivatisiert worden waren.
2 zeigt einen Graphen der optischen Absorption von gebundenem Hämoglobin bei 415 nm gegen die Inkubationszeit für Blutlysat einer Probe von einem Diabetiker, wobei ein Einzelmess-Assay (
für glykiert) mit dem Verfahren der vorliegenden Erfindung (Kreise für Gesamt-Hb, offene Dreiecke für glykiertes Hb) verglichen wurde.
3 zeigt einen Graphen der optischen Extinktion bei 415 nm von glykiertem Hämoglobin oder einer Fraktion an glykiertem Hämoglobin gegen die Inkubationszeit für Blutlysat einer Probe von einem Diabetiker, wobei man einen Einzelmess-Assay (wobei das Verfahren der veröffentlichten PCT-Anmeldung WO 98/40750
adaptiert wurde) mit dem Verfahren der vorliegenden Erfindung (offene Dreiecke) verglich.
4 zeigt einen Graphen der Extinktion von Hämoglobin, das an den Carboxycellulose-Träger bindet (keine hinzugefügten Boronat-Gruppen) über einen pH-Bereich.
5 zeigt einen Graphen der Extinktion von Hämoglobin (gefüllte Kreise) und Albumin (offene Dreiecke), die an einen mit Boronat modifizierten Träger gebunden sind, über einen pH-Bereich.
Die 6A, 6B und 6C zeigen drei Streifenkonfigurationen, die gemäß den Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet werden können.
7 zeigt einen Graphen von K/S gegen den Prozentsatz an glykiertem Hämoglobin (
), der die Proportionalität der Assay-Ergebnisse der vorliegenden Erfindung mit der Konzentration an glykiertem Hämoglobin in der Probe in einem Streifen-Assay-Format zeigt, wobei das Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet wurde (offene Dreiecke stellen Gesamt-Hämoglobin dar).
8 zeigt einen Graphen der K/S-Fraktion von glykiertem Hämoglobin (glykiertes Hämoglobin geteilt durch Gesamt-Hämoglobin) gegen den Prozentsatz an glykiertem Hämoglobin, der Proportionalität der Fraktion zur Konzentration von glykiertem Hämoglobin in der Probe in einem Streifen-Assay-Format zeigt, wobei das Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet wurde.
9 zeigt einen Graphen der optischen Extinktion bei 280 nm für Gesamtoffene Dreiecke) und glykiertes Albumin (
) gegen den relativen Fructosamin-Gehalt (proportional zur anteiligen Menge an glykiertem Albumin) in einer Probe.
10 zeigt einen Graphen des Verhältnisses von glykiertem Albumin zu Gesamt-Albumin (Extinktion bei 280 nm) gegen den relativen Fructosamin-Gehalt (proportional zur anteiligen Menge an glykiertem Albumin) in einer Probe.
11 zeigt einen Graphen der optischen Extinktion bei 415 nm von gebundenem Gesamt-Hämoglobin (gefüllte Dreiecke) und glykiertem Hämoglobin (offene Dreiecke) gegen das Volumen einer Vollblut-Probe in einer Lateral-Flow-Vorrichtung. (Siehe 6A).
12 zeigt einen Graphen des Verhältnisses von glykiertem Hämoglobin, geteilt durch Gesamt-Hämoglobin, gegen das Volumen einer Vollblut-Probe in einer Lateral-Flow-Vorrichtung. (Siehe 6A).
13 zeigt einen Graphen der optischen Extinktion bei 415 nm von Gesamt-Hämoglobin (offene Dreiecke) und glykiertem Hämoglobin (
) gegen die Verdünnung des Lysats einer normalen Blutprobe.
14 zeigt einen Graphen der optischen Extinktion bei 415 nm von Gesamt-Hämoglobin (offene Dreiecke) und glykiertem Hämoglobin (
) gegen die Verdünnung des Lysats einer Blutprobe eines Diabetikers.
15 zeigt einen Graphen der optischen Extinktion bei 415 nm von glykiertem Hämoglobin, geteilt durch Gesamt-Hämoglobin, gegen die Verdünnung des Lysats einer normalen Blutprobe (
) und einer Blutprobe eines Diabetikers (offene Dreiecke).
Die 16A und 16B zeigen Graphen, die die Korrelation zwischen Testergebnissen aus Vollblut mit einem Assay der vorliegenden Erfindung und mit zwei anderen im Handel erhältlichen Assays für Hämoglobin A1c zeigen. 16A zeigt eine graphische Darstellung von Resultaten, die mit einem Assay der vorliegenden Erfindung erhalten wurden (siehe Beispiel 9), gegenüber Resultaten, die mit dem Roche Integra 400 (Roche Diagnostics) erhalten wurden. 16B zeigt eine graphische Darstellung von Resultaten, die mit einem Assay der vorliegenden Erfindung erhalten wurden (siehe Beispiel 9), gegenüber Resultaten, die mit dem DCA 2000 (Bayer) erhalten wurden.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Gemäß einer Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Quantifizierung von glykierten Proteinen in einer biologischen Probe bereit, in welchem die Probe und das (die) Reagenz(ien) auf eine feste Trägermatrix auf gebracht werden, welche bevorzugt eine negativ geladene Gruppe und eine Dihydroxyborylverbindung umfasst. Die Messung der Gesamt- und der glykierten Proteine wird an einem einzigen Ort auf dem festen Träger durchgeführt. Diese Messung kann praktischerweise durchgeführt werden, indem man eine ausgewählte Eigenschaft des Proteins misst. Vorteilhafterweise erfordert dieses Verfahren nicht die Messung des Volumens der biologischen Probe.
In einer Ausführungsform ist die vorliegende Erfindung auf ein Verfahren zur Quantifizierung von glykiertem Protein in einer Probe gerichtet, bei dem eine feste Trägermatrix, die eine negativ geladene Gruppe und eine Hydroxyborylverbindung umfasst und die einen Messbereich aufweist, mit einem Aliquot der biologischen Probe in Kontakt gebracht wird, das ausreicht, um den Messbereich zu bedecken. Die feste Trägermatrix wird dann mit einem ersten Puffer, der einen pH-Wert hat, der so gewählt ist, dass sowohl glykiertes als auch nicht glykiertes Protein an die feste Matrix binden können, in einer Menge in Kontakt gebracht, die ausreicht, um ungebundenes Protein abzuspülen. Die Menge des an den Messbereich gebundenen Proteins wird durch Messung einer ausgewählten Eigenschaft des Proteins quantifiziert, so dass man eine erste Messung von gebundenem Protein erhält. Die feste Trägermatrix wird dann mit einem zweiten Puffer in Kontakt gebracht, der einen pH-Wert hat, der so gewählt ist, dass glykiertes Protein an die feste Trägermatrix binden kann, aber bei dem nicht glykiertes Protein nicht wesentlich an die feste Trägermatrix bindet, in einer Menge, die ausreicht, um ungebundenes Protein abzuspülen. Die Menge des an den Messbereich gebundenen Proteins wird durch Messung derselben gewählten Eigenschaft quantifiziert (wie sie verwendet worden ist, um die erste Messung von gebundenem Protein zu erhalten), so dass man eine zweite Messung von gebundenem Protein erhält. Der Prozentsatz an glykiertem Protein wird unter Verwendung der ersten und der zweiten Messung von gebundenem Protein berechnet.
Gemäß einer anderen Ausführungsform ist die vorliegende Erfindung auf Verfahren zur Quantifizierung von glykiertem Protein in einer Probe gerichtet, bei denen eine feste Trägermatrix, die eine negativ geladene Gruppe und eine Hydroxyborylverbindung umfasst und die einen Messbereich aufweist, mit einem Aliquot einer biologischen Probe in Kontakt gebracht wird, das ausreicht, um den Messbereich zu bedecken. Die feste Trägermatrix wird dann mit einem ersten Puffer, der einen pH-Wert von etwa 5,0 bis etwa 7,0 hat, in einer Menge in Kontakt gebracht, die ausreicht, um ungebundenes Protein abzuspülen. Die Menge des an den Messbereich gebundenen Proteins wird quantifiziert, so dass man eine erste Messung von gebundenem Protein erhält. Die feste Trägermatrix wird dann mit einem zweiten Puffer, der einen pH-Wert von etwa 8,0 bis etwa 10,0 hat, in einer Menge in Kontakt gebracht, die ausreicht, um ungebundenes Protein abzuspülen. Die Menge an Protein, das an den Messbereich gebunden ist, wird quantifiziert, so dass man eine zweite Messung von gebundenem Protein erhält. Der Prozentsatz an glykiertem Protein in der biologischen Probe wird unter Verwendung der ersten und der zweiten Messung von gebundenem Protein berechnet.
Die Verfahren der vorliegenden Erfindung können praktischerweise dazu verwendet werden, um die Mengen von entweder glykiertem Hämoglobin oder glykiertem Nicht-Hämoglobin-Protein (wie z. B. Albumin) zu quantifizieren.
Bei der Quantifizierung von glykiertem Hämoglobin wird üblicherweise eine Blutprobe verwendet. Die Blutprobe wird mit einem Mittel in Kontakt gebracht, das rote Blutkörperchen lysiert, bevor die erste Messung von gebundenem Protein durchgeführt wird. Die Probe kann vor der Zugabe zu dem festen Träger mit dem Mittel, das rote Blutkörperchen lysiert, in Kontakt gebracht werden (wie etwa durch Vorbehandlung der Probe). Das die rote Blutkörperchen lysierende Mittel kann auch durch eine Vorspülung zu dem festen Träger hinzugegeben werden, bevor die Probe zu dem Träger hinzugefügt wird. Alternativ kann der erste Puffer ein Mittel enthalten, das rote Blutkörperchen lysiert. Geeignete Mittel, die rote Blutkörperchen lysieren, sind Fachleuten bekannt und umfassen Triton X-100 und Igepal CA-630.
Bevorzugt umfassen die erste und zweite Messung von gebundenem Protein eine optische Messung. Stärker bevorzugt ist die gewählte gemessene Eigenschaft Extinktion oder Reflexion bei einer spezifizierten Wellenlänge.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung hat die Dihydroxyborylverbindung der festen Trägermatrix die Struktur:
wobei R aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus Phenyl, substituiertem Phenyl, Wasserstoff und Alkyl von 1 bis 6 Kohlenstoffatomen. Falls R ein Alkyl ist, umfassen geeignete Alkylgruppen Ethyl, 1-Propyl und 3-Methyl-1-butyl. Bevorzugt ist R m-Aminophenyl.
Geeignete feste Trägermatrizen umfassen Träger, die aus der Gruppe ausgewählt sind, bestehend aus Cellulose, Nitrocellulose, Celluloseacetat, Polyacrylamid, Agarose-Polyacrylamid-Copolymer, Agarose, Stärke, Nylon, Nylonpolyester, Dextran, vernetztes Dextran, Dextran-Acrylamid-Copolymer, vernetztes Hydroxyethylmethacrylat, substituierte vernetzte Polystyrole, Polyvinylalkohol, Wolle, Metalloxide, poröse Keramik, die mit hydrophilen organischen Polymeren beschichtet ist, sowie Glas. Bevorzugt umfasst die feste Trägermatrix eine negativ geladene Gruppe. Eine bevorzugte feste Trägermatrix ist Cellulose. Bevorzugt wird die negativ geladene Gruppe aus der Gruppe ausgewählt, bestehend aus Phosphat, Sulfat, Sulfonat, Sulfinat und Carboxylat (oder Carboxy). Bevorzugt handelt es sich bei der negativ geladenen Gruppe um Carboxylat.
I. Der Assay
Gemäß einer Ausführungsform des Verfahrens der vorliegenden Erfindung sind sowohl glykiertes als auch nicht glykiertes Protein bei einem pH-Zustand an eine feste Trägermatrix gebunden, die eine negativ geladene Gruppe und eine immobilisierte Dihydroxyboryl enthaltende Verbindung umfasst. Das gebundene nicht glykierte Protein wird dann bei einem zweiten pH-Zustand selektiv entfernt. Das glykierte Protein bleibt bei dem zweiten pH-Zustand an den Träger gebunden. Die Messung des Gesamt-Proteins wird nach der Bindung bei dem ersten pH-Zustand durchgeführt. Die Messung des glykierten Proteins wird durchgeführt, nachdem der an den Träger gebundene Protein-Komplex bei dem zweiten pH-Zustand gespült worden ist, um ungebundenes Protein zu entfernen. Der Prozentsatz der Glykierung wird aus dem prozentualen Anteil der zweiten Messung relativ zu der ersten berechnet. Dieser Assay ist besonders nützlich zur Messung von glykiertem Hämoglobin und glykiertem Protein in einer Blut-, Serum- oder Plasmaprobe.
Das Verfahren kann für eine biologische Probe wie z. B. Kapillarblut, Vollblut, Serum oder Plasma eingesetzt werden. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform kann eine Wellenlänge für beide Messungen (Gesamt und glykiert) verwendet werden. Der Assay kann leicht angepasst werden, dass er mit denselben Mess geräten verwendet werden kann, die bei der Selbstüberwachung von Blutglucose von Diabetikern verwendet werden. Da beide Messungen an derselben Stelle auf dem festen Träger durchgeführt werden (siehe Beispiel 5), würden irgendwelche Unterschiede auf dem Träger von einer zur anderen Stelle die Ergebnisse nicht beeinflussen.
II. Feste Trägermatrix und immobilisierter Bindemittel
Bei der festen Trägermatrix kann es sich um eine von einer Reihe von natürlichen oder synthetischen polymeren Materialien handeln, an die negativ geladene Gruppen und die Dihydroxyborylverbindung gebunden werden können und durch die die Probe und Reagenzien passieren können. Geeignete Trägermatrizen umfassen zum Beispiel Cellulose, Nylon, Nitrocellulose, Celluloseacetat, Polyacrylamid, Agarose-Polyacrylamid-Copolymer, Agarose, Stärke, Nylonpolyester, Dextran, vernetztes Dextran, Dextran-Acrylamid-Copolymer, vernetztes Hydroxyethylmethacrylat, substituierte vernetzte Polystyrole und Polyvinylalkohol. Andere Träger, die bei der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, schließen jene ein, die im US-Patent Nr. 4,269,605 aufgeführt sind. Darüber hinaus sind Fachleuten andere geeignete Träger bekannt. Eine bevorzugte feste Trägermatrix ist Cellulosepapier.
Die Dihydroxyborylverbindung (bevorzugt Phenylboron-, Bor- oder andere Boronsäuren, stärker bevorzugt m-Aminophenylboronsäure) können durch mechanische, physikalische oder chemische Methoden an den festen Träger gebunden werden, bevorzugt durch eine kovalente chemische Bindung. Eine Bindung an die feste Trägermatrix kann durch auf dem Fachgebiet bekannte Verfahren erfolgen. Solche Verfahren schließen zum Beispiel jene ein, die im US-Patent Nr. 4,269,605 an Dean et al. (erteilt am 26. Mai 1989) aufgeführt sind.
Nach der Bindung der Dihydroxyborylverbindung an den Träger kann der Träger mit Puffer oder Wasser gespült werden. Falls die zu testende biologische Probe rote Blutkörperchen aufweist, kann gegebenenfalls ein Detergens oder ein anderes Mittel, das rote Blutkörperchen lysiert, beim Spülvorgang enthalten sein, falls der Assay glykiertes Hämoglobin messen soll. Geeignete Detergenzien zur Verwendung als ein Mittel, das rote Blutkörperchen lysiert, schließen Triton X-100 ein. Die Anwesenheit eines lysierenden Mittels auf dem Träger kann das Lysieren von roten Blutkörperchen aus einer Vollblutprobe erleichtern. Alternativ kann die Probe mit dem Mittel, das rote Blutkörperchen lysiert, vorbehandelt werden oder das Mittel, das rote Blutkörperchen lysiert, kann in dem ersten Puffer eingeschlossen sein.
III. Konfiguration der festen Trägermatrix
Gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird die feste Trägermatrix zusammen mit anderen Komponenten in einer Streifentyp-Konfiguration platziert, um den Fluss der Probe und des Puffers abzuwickeln. Die Probe und der Puffer fließen durch die feste Trägermatrix, an der die Bindung stattfindet, und dann in ein Absorptionsmaterial, das die überschüssige Lösung aufsaugt, wobei passende Volumina an Puffer durchfließen können. Der Fluss der Lösung durch den Streifen kann entlang der Länge der festen Trägermatrix erfolgen, wie z. B. in einer Lateral-Flow-Vorrichtung, oder durch die Dichte des festen Trägers wie z. B. in einer Vertical-Flow-Vorrichtung (Beispiele für solche Streifen-Konfigurationen sind in den 6A, 6B und 6C dargestellt).
Geeignete Materialien zur Verwendung in dem festen Träger umfassen zum Beispiel Cellulose (einschließlich Cellulosepapier), Nitrocellulose, Celluloseacetat, Polyacrylamid, Agarose-Polyacrylamid-Copolymer, Agarose, Stärke, Nylon, Nylonpolyester, Dextran, vernetztes Dextran, Dextran-Acrylamid-Copolymer, vernetztes Hydroxyethylmethacrylat, substituierte vernetzte Polystyrole, Polyvinylalkohol, Wolle, Metalloxide, poröse Keramik, die mit hydrophilen organischen Polymeren beschichtet ist, sowie Glas.
IV. Die Probe und bevorzugte Puffer
Geeignete biologische Proben zur Verwendung gemäß den Verfahren der vorliegenden Erfindung umfassen Vollblut, Serum und Plasma. Rote Blutkörperchen können falls gewünscht mit Hilfe von auf dem Fachgebiet bekannten Verfahren aus der Probe entfernt werden. Dazu gehören solche Verfahren, bei denen Glasfasern ( US-Patent Nr. 4,477,575 , das am 16.10.1984 an Vogel et al. erteilt wurde), Träger, die Kohlenhydrat enthalten ( US-Patent Nr. 4,678,757 , das am 7.7.1987 an Rapkin erteilt wurde) oder eine Matrix verwendet werden, die ein Polyol enthält ( US-Patent Nr. 5,725,774 , das am 10.3.1998 an Neyer erteilt wurde).
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform (besonders zur Quantifizierung von glykiertem Nicht-Hämoglobin-Protein) kann die Probe mit einem Protein-spezifischen Bindungsmittel wie z. B. einem „Farbstoff" vorbehandelt werden, um Proteine zu markieren und um die Messung von deren Konzentration zu erleichtern. Fachleuten auf dem Gebiet sind eine Vielzahl solcher Farbstoffe bekannt und diese können bei dem Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Zum Beispiel kann ein fluoreszierender Farbstoff wie z. B. Fluoresceinisothiocyanat („FITC") verwendet werden.
Man fügt die Probe zu dem festen Träger hinzu und lässt diese durch den Träger fließen. Der Fluss kann durch die Länge des Trägers oder durch die Dicke des Trägers erfolgen. Das Volumen der hinzugefügten Probe kann in einem Bereich eines Volumens, das gerade groß genug ist, um den Messbereich gleichmäßig zu bedecken (wie z. B. etwa 3 bis 5 μl), bis zu einem Volumen liegen, das in einer akzeptablen Zeit durch den Träger fließt (ungefähr 40 μl). Die tatsächlichen Volumenbegrenzungen hängen von den Dimensionen des festen Trägers und der anderen Streifenkomponenten ab. Ein größerer (breiterer oder längerer) Streifen ist in der Lage, größere Probenvolumina zu handhaben, erfordert jedoch größere Minimalvolumina, um den Messbereich zu bedecken. Ein kleinerer Streifen funktioniert mit kleinen Volumina, kann aber keine großen Volumina handhaben.
Nachdem die Probe an den Streifen adsorbiert worden ist, wird der erste Puffer hinzugegeben. Der pH-Wert des ersten Puffers ist bevorzugt zwischen etwa 5,0 und etwa 7,0. Stärker bevorzugt ist der pH-Wert des ersten Puffers etwa 5,5 bis etwa 7,0 zur Quantifizierung von glykiertem Hämoglobin und etwa 5,0 bis etwa 6,5 zur Quantifizierung von glykiertem Hämoglobin. Der Puffer enthält ein geeignetes Puffermittel, das einen pKa hat, der für die Kontrolle des pH-Werts innerhalb des vorgegebenen Bereichs geeignet ist, der aber andererseits nicht die Bindung des Proteins beeinflusst. Puffermittel, die zur Verwendung in dem ersten Puffer geeignet sind, sind Fachleuten auf dem Gebiet bekannt. Bevorzugte Puffermittel zur Verwendung in dem ersten Puffer umfassen MES, MOPS und HEPES. Das Puffermittel liegt in einer Konzentration vor, die ausreichend ist, um den pH-Wert in dem gewünschten Bereich zu halten. Geeignete Konzentrationen für das Puffermittel können in einem Bereich von etwa 5 mM bis etwa 500 mM liegen. Falls die biologische Probe rote Blutkörperchen enthält, kann der Puffer ferner ein Mittel umfassen, das Zellen lysiert, wie z. B. Triton X-100 oder Igepal CA-630. Das Volumen des hinzugefügten Puffers kann auf eine spezifische Anzahl von Tropfen standardisiert sein, die angemessen sind, um überschüssige, nicht gebundene Probe durchzuspülen. Ob der Spülvorgang ausreichend ist, kann auch mit dem Reflexionsmessgerät verfolgt werden, indem man mehrere Messungen durchführt, wobei die Schlussmessung erfolgt, wenn die Veränderung praktisch null ist.
Der zweite Puffer hat bevorzugt einen pH-Wert von etwa 8,0 bis etwa 10,0. Der zweite Puffer enthält ein geeignetes Puffermittel, das einen pKa hat, der für die Kontrolle des pH-Werts innerhalb des vorgegebenen Bereichs geeignet ist, der aber nicht die Bindung des glykierten Proteins an die immobilisierte Dihydroxyboronatverbindung stört. Puffermittel, die zur Verwendung in dem zweiten Puffer geeignet sind, sind Fachleuten auf dem Gebiet bekannt. Bevorzugte Puffermittel zur Verwendung in dem zweiten Puffer umfassen Ammoniumacetat und Taurin. Das Puffermittel liegt in einer Konzentration vor, die ausreichend ist, um den pH-Wert in dem gewünschten Bereich zu halten. Geeignete Konzentrationen für das Puffermittel können in einem Bereich von etwa 5 mM bis etwa 500 mM oder alternativ bis zur Löslichkeitsgrenze des Puffermittels liegen. Ob der Spülvorgang ausreichend ist, kann, wie für den ersten Puffer beschrieben, überwacht werden. Gegebenenfalls kann der Puffer ein divalentes Metallion wie z. B. Mg⁺⁺ enthalten, um dazu beizutragen, die Bindung des Proteins an das Boronat zu stabilisieren.
V. Quantifizierung
Die Menge an Protein, die nach jedem Spülvorgang an den Träger gebunden ist, kann quantifiziert werden, indem man Messmethoden verwendet, die Fachleuten auf dem Gebiet bekannt sind, wozu die Messung der optischen Extinktion oder Reflexion bei einer geeigneten Wellenlänge gehört.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens führt man eine erste Messung der Reflexion des festen Trägers durch, nachdem die Probe hinzugegeben ist und der Überschuss mit dem ersten Puffer durchgespült ist. Diese Reflexionsmessung wird zur Berechnung der Gesamtproteinkonzentration verwendet, wobei man einen Algorithmus verwendet, der von den Kalibrierungsdaten abgeleitet ist, oder indem man „K/S"-Werte als Werte verwendet, die proportional zur Konzentration sind. Eine zweite Reflexionsmessung wird nach dem Abspülen des nicht glykierten Proteins von dem festen Träger mit dem zweiten Puffer durchgeführt.
Diese Messung wird dazu verwendet, die Konzentration des glykierten Proteins auf dieselbe Weise zu berechnen wie bei der ersten Messung. Der Prozentsatz an glykiertem Protein wird als das Verhältnis der Konzentration des glykierten Proteins zur Gesamtproteinkonzentration × 100 berechnet.
Wenn Licht in ein transparentes Medium eintritt, wird ein Teil davon absorbiert und ein Teil geht durch das Medium hindurch. Das Beer-Lambertsche Gesetz sagt aus, dass die Menge an absorbiertem Licht („A") das Produkt der Konzentration des Materials, welches das Licht („c") absorbiert, und der Distanz ist, die das Licht durch das Medium wandert („d") (d. h. A = ecd, wobei e der Extinktionskoeffizient des absorbierenden Materials ist). Wenn Licht auf einen Feststoff trifft, wird die Menge, die von dem Feststoff reflektiert wird, aufgrund dessen bestimmt, was von dem Feststoff absorbiert wird und was von dem Feststoff gestreut wird. Das Modell, das verwendet wird, um dieses Verhältnis zu definieren, ist die Kubelka-Munk-Theorie. Dieses Modell definiert zwei Differentialgleichungen für die Veränderung in der Lichtstärke, wenn sie auf den Feststoff auftrifft und von dem Feststoff zurückgestreut wird. Diese Gleichungen umfassen das Symbol „K", das den Absorptionskoeffizienten in der Festphase darstellt, und das Symbol „S", das den Streuungskoeffizienten darstellt. In der vereinfachten Ableitung kürzen sich die Gleichungen auf das Folgende: K/S = [(1 – R)^2]/(2R), wobei R die gemessene Reflexion und K/S proportional zur Konzentration des absorbierenden/streuenden Materials ist. In bestimmten Figuren (siehe z. B. 7 und 8) werden die Daten, die mit dem Reflexionsmessgerät aufgenommen werden, mit y-Werten von K/S aufgetragen, die proportional zur Konzentration des Analyten sind.
Die in dem Assay verwendete Methodik lässt sich zur Verwendung in einem Streifen adaptieren, der bei einem Reflexions-Handmessgerät verwendet werden kann, das bei Glucose-Assays eingesetzt wird.
Die Gesamtmenge an Protein, die an den festen Träger bindet, wird durch die Bindungskapazität der negativ geladenen Gruppen bestimmt, die auf dem Träger immobilisiert sind. Wir haben beobachtet, dass glykiertes und nicht glykiertes Protein in demselben Verhältnis wie in der Probe schnell an den derivatisierten Träger binden. Man muss das Volumen der zu dem Träger hinzugegebenen Probe nicht messen, da jeglicher Überschuss durchgespült wird.
Der angezeigte Prozentsatz der Glykierung wird aus dem Verhältnis der beiden Messungen berechnet, die an derselben Stelle auf dem festen Träger in dem Streifen durchgeführt werden. Daher beeinflussen Schwankungen in der Gesamtmenge des von verschiedenen Streifen gebundenen Proteins das angezeigte Ergebnis nicht. Da sowohl das Gesamt- als auch das glykierte Protein mit derselben Methode an derselben Stelle auf dem festen Träger gemessen werden, haben Schwankungen, die die Messungen beeinflussen könnten, dieselbe Wirkung auf beide Messungen, was „Rauschen" minimiert.
Zum besseren Verständnis wird die vorliegende Erfindung nun weiter anhand der folgenden Beispiele veranschaulicht. Diese Beispiele, wie sie die vorliegende Erfindung betreffen, sollten natürlich nicht so interpretiert werden, dass sie die Erfindung spezifisch beschränken.
BEISPIELE
Beispiel 1
Herstellung der mit Boronat modifizierten festen Trägermatrix
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform des Nachweisverfahrens der vorliegenden Erfindung wird eine feste Trägermatrix, die zur Verwendung in einer Streifen-Konfiguration geeignet ist, dadurch hergestellt, indem man ein Derivat von Boronat, m-Aminophenylboronat, kovalent an ein Material auf der Basis von Carboxycellulose koppelt, wobei man herkömmliche Kopplungschemie einsetzt.
Materialien

1. feste Trägermatrix: Feststoff auf der Basis von Cellulose mit kovalent gebundenen Carbonsäuregruppen (Sartobind C-Membran, Sartorius).
2. EDC (1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid-hydrochlorid)(Pierce)
3. Boronatderivat: m-Aminophenylboronsäure (Sigma-Aldrich)
4. Puffer: 0,1 M MES-Puffer, pH 6,5

Prozedur
Eine Portion von 46,7 mg m-Aminophenylboronat wird in 25 ml eines 100 mM MES-Puffers gelöst. Der pH-Wert wird wieder auf 6,5 eingestellt, nachdem sich das Boronat gelöst hat. Eine Portion von 28,9 mg EDC wird in der MES-Boronat-Lösung gelöst. Die feste Trägermatrix wird für die gewünschte Zeit in die Lösung eingetaucht (25 ml Lösung war ausreichend, um ein 30 cm² großes Stück der Matrix zu behandeln). Die Matrix wird aus der Lösung entfernt und in dem MES-Puffer gespült und an der Luft trocknen gelassen.
Die Bindungseigenschaften der mit Boronat modifizierten festen Trägermatrix, die wie vorstehend mit verschiedenen Eintauchzeiten hergestellt worden ist, wurden gemessen, indem man den in Beispiel 2 beschriebenen Elutionsassay verwendete. Die so erhaltene Bindung von Gesamt-(offene Dreiecke) und glykierten Hämoglobin (gefüllte Dreiecke) ist in 1 dargestellt. Offene Kreise zeigen das Verhältnis von glykiertem zu Gesamt-Hämoglobin.
Je mehr Boronat-Gruppen zu der festen Trägermatrix hinzugegeben werden, desto weniger Carboxylgruppen bleiben für die ionische Bindung übrig. Das Verhältnis von glykiertem Hämoglobin zu Gesamt-Hämoglobin nimmt zu, bis ausreichend Boronatgruppen vorhanden sind, dann bleibt das Verhältnis gleich, obwohl die Gesamtbindung abnimmt.
Beispiel 2
Auswirkung von unterschiedlichen Inkubationszeiten
Ein Assay mit dem mit Boronat modifizierten Träger von Beispiel 1 in einem Einzelmess-Assay („Einzelmessverfahren") wurde mit einem Verfahren der vorliegenden Erfindung verglichen, um die Auswirkung unterschiedlicher Inkubationszeiten auf die mit jedem Verfahren erhaltenen Konzentrationsergebnisse zu bestimmen.
Die folgenden Assays wurden durchgeführt, um die zwei Verfahren zu vergleichen. Bei dem Assay des Einzelmessverfahrens wurden Blutlysatproben von einem Nicht-Diabetiker und einem Diabetiker 1:1 mit 500 mM Ammoniumacetatpuffer, pH 9,5 mit 50 mM Mg⁺⁺ verdünnt und man ließ die Proben für verschieden lange Zeiträume mit der in Beispiel 1 hergestellten mit Boronat modifizierten festen Trägermatrix in Kontakt kommen. Nach der Inkubation spülte man die mit Boronat modifizierten festen Träger mit Ammoniumacetatpuffer, pH 9. Glykiertes Hämoglobin wurde mit einem Elutionspuffer eluiert, der aus Tris-Puffer, pH 8,0 bestand, der 200 mM Sorbit enthielt. Die Extinktion des Eluenten wurde bei 415 nm gemessen.

Im zweiten Assay, der dem Verfahren der vorliegenden Erfindung entspricht, wurden Blutlysatproben von einem Nicht-Diabetiker und einem Diabetiker 1:1 mit MES-Puffer, pH 6,5 verdünnt. Man ließ die Proben für identische Zeiträume wie denen, die beim ersten Assay verwendet wurden, mit der mit Boronat modifizierten festen Trägermatrix in Kontakt und inkubierte diese für ähnliche Zeiträume, wie man es beim ersten Assay gemacht hatte. Nach der Inkubation wurden die verdünnten Proben verworfen und die mit Boronat modifizierten festen Träger wurden mit MES-Puffer, pH 6,5 gespült. Die festen Trägermatrizen wurden dann ein zweites Mal mit 500 mM Ammoniumacetatpuffer, pH 9,5 gespült, der 50 mM Mg⁺⁺ enthielt. Die Extinktion des Spülpuffers wurde bei 415 nm gemessen, was nicht glykiertem Hämoglobin entsprach. Glykiertes Hämoglobin wurde von der Matrix eluiert und die Extinktion dieses Spülpuffers wurde gemessen. Die Daten, die von der Probe des Diabetikers erhalten wurden, sind in der Tabelle I dargestellt (siehe auch 2 und 3). Tabelle I: Blutlysatprobe eines Diabetikers

	Vorliegende Erfindung			Einzelmessung
Einwirkzeit (min)	Ges.	Gly	Gly/Ges.	Gly
0.25	0.769	0.12	0.156	0.029
0.5	0.739	0.109	0.147	0.032
1	0.824	0.118	0.143	0.037
2	0.846	0.116	0.137	0.038
4	0.838	0.123	0.147	0.047
8	0.856	0.126	0.147	0.072
16	0.814	0.225	0.154	0.082
4	10.779	0.118	0.151	0.049
8	0.844	0.103	0.122	0.064
16	0.857	0.121	0.141	0.082

Eine lineare Regressionsanalyse dieser Daten zeigte klar, dass die Ergebnisse, die man mit dem Einzelmessverfahren erhielt, stark von der Inkubationszeit abhängig waren. Wenn man jedoch die Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet, waren die erhaltenen Ergebnisse unabhängig von der Inkubationszeit, was, wie man annimmt, verlässlichere Ergebnisse liefert und den Assay für ungeübte Anwender robuster und besser geeignet macht.
Beispiel 3
Auswirkung des pH-Werts auf die Bindung
Der pH-Wert des Puffers hat Einfluss auf die Menge von Hämoglobin, die an den mit Boronat modifizierten Träger bindet. Wenn der pH-Wert niedrig ist, dann werden sowohl glykiertes als auch nicht glykiertes Hämoglobin gebunden. Wenn der pH-Wert hoch ist, bindet nur glykiertes Hämoglobin. 4 stellt die Bindung von Hämoglobin an die Carboxycellulose-Membran (es liegen keine Boronatgruppen vor) nach der im Beispiel 2 beschriebenen Assay-Prozedur dar. Die Membran verliert ihre ionische Bindung von Hämoglobin zwischen pH 6 und 7, wenn kein Boronat vorliegt.
5 zeigt die Bindungseigenschaften des Carboxycelluloseträgers mit hinzugefügten Boronatgruppen, der, wie in Beispiel 1 beschrieben, hergestellt wurde, für Hämoglobin und menschliches Serumalbumin. Die Bindung des Proteins findet wegen der negativ geladenen Carboxylgruppen bei niedrigeren pH-Werten statt. Bei dem aufgrund des Phenylboronats bei dem höheren pH-Wert gebundenen Protein handelt es sich um das glykierte Protein, das in den Proben vorhanden ist.
Beispiel 4
Beschreibung von beispielhaften Streifendesign-Konfigurationen
Die mit Boronat modifizierten festen Trägermatrizen, die negativ geladene Gruppen enthalten, können in einen beliebigen Assay eingebaut werden, bei dem die Trennung von glykiertem und nicht glykiertem Protein erforderlich ist. Gemäß den bevorzugten Assayverfahren der vorliegenden Erfindung wird die mit Boronat modifizierte feste Trägermatrix in Kombination mit anderen Komponenten verwendet, um den Fluss der Probe und der Puffer zu steuern. Diese Komonenten können die Form eines Streifens annehmen, der zur Quantifizierung in ein kleines Reflexions-Handmessgerät platziert werden kann. Geeignete alternative Konfigurationen für den Streifen sind in den 6A, 6B und 6C dargestellt.
In der Lateral-Flow-Streifenkonfiguration (6A) bewegen sich die Flüssigkeiten durch die Länge des mit Boronat modifizierten Trägers (parallel zur Oberfläche des Trägers). In der Vertical-Flow-Streifenkonfiguration (6B) und der Kombinationsstreifen-Konfiguration (6C) findet die Bewegung der Flüssigkeit mehr durch die Dicke der festen Trägermatrix statt (senkrecht zur Oberfläche).
Jede dargestellte Konfiguration hat einen Probenauftragsort (1, 11 oder 21), bei dem es sich um ein Loch in einem Plastikstück handelt (das normalerweise weiß aussieht), (4, 14 oder 24). Der mit Boronat modifizierte feste Träger (2, 12 oder 22) ist in Kontakt mit dem Saugmaterial („wiching material") (6, 16 oder 26). In der in 6A dargestellten Konfiguration fließen die Flüssigkeiten von dem Auftragsbereich (1) durch das Saugmaterial (6) zu dem Träger (2) und durch den Träger zu dem Reservoir (3). In den in den 6B und 6C dargestellten Konfigurationen fließen die Flüssigkeiten von dem Auftragsbereich (11 oder 21) und dem mit Boronat modifizierten Träger (12 oder 22) zu dem Saugmaterial (16 oder 26) und dem Reservoir (13 oder 23). Alle Komponenten werden auf die Oberseite des unteren Plastikstücks platziert, das je nach der Konfiguration entweder weiß (15) oder transparent (5 oder 25) ist. Die Reflexion des mit Boronat modifizierten Trägers wird gemessen, indem man ein Licht der gewählten Wellenlänge auf die Oberfläche des Trägers strahlt und dessen Intensität misst (7, 17 oder 27). In den in den 6B und 6C dargestellten Konfigurationen gibt es ein Stück eines weißen reflektierenden Materials (18 oder 28), das hinter dem Träger platziert ist, um Licht, das durch den Träger hindurch geht, durch diesen zurück zu reflektieren, um den Intensitätsverlust zu verringern.
Beispiel 5
Proportionalität des Assays: Glykiertes Hämoglobin

Ein Vertical-Flow-Streifendesign, das in Beispiel 4 beschrieben worden ist und wie es in 6B dargestellt ist, wurde in Assays von Gemischen aus Blutlysatproben von Normalpersonen und von Diabetikern verwendet. Ungefähr 8 μl Blutlysat wurden auf der mit Boronat modifizierten festen Trägermatrix aufgetragen, die wie in Beispiel 1 hergestellt wurde. Der Probenauftragsort wurde dann mit ~50 μl MES-Puffer, pH 6,5 (100 mM) gespült und es wurde eine Reflexionsmessung bei 430 nm aufgezeichnet. Der Probenauftragsort wurde dann mit ~50 μl Ammoniumacetatpuffer (500 mM), pH 9,5 gespült, der 50 mM Mg⁺⁺ enthielt, und es wurde eine zweite Reflexionsmessung bei 430 nm am Probenauftragsort aufgezeichnet. Die Reflexionswerte wurden in K/S-Werte umgewandelt, die proportional zu der Konzentration von dem gemessenen Hämoglobin sind. Die Daten sind in der nachstehenden Tabelle II gezeigt (siehe 7 und 8). Tabelle II

		Reflexion		k/s
Norm.:Diab.	%gly Hb*	Ges.	gly	Ges.	gly	Verh. (gly/Ges.)
1:0	4.5	0.186	0.428	1.781	0.382	0.215
4:1	6.1	0.219	0.448	1.393	0.340	0.244
3:2	7.7	0.197	0.415	1.637	0.412	0.252
2:3	9.3	0.165	0.350	2,113	0.604	0.286
1:4	10.9	0.197	0.395	1.637	0.463	0.283
0:1	12.5	0.179	0.363	1.883	0.559	0.297

Die Regressionsstatistik der Datenauftragungen ist in der nachstehenden Tabelle III gezeigt. Tabelle III

Auftragung Steig. Achsenabs. S_y.x CV*

Ges. Hb 0.031 1.48 0.255 14.7

Glyk. Hb 0.026 0.24 0.076 15.9

Gly/Ges. 0.010 0.18 0.010 3.8

*berechnet unter Verwendung der Mittelwerte für jede Fraktion

Die Auftragungen, S_y.x und die daraus resultierenden CVs zeigen, dass die gemessenen Werte für Gesamt- und glykiertes [Hämoglobin] von Streifen zu Streifen variieren. Die großen Schwankungen werden jedoch verringert, wenn man das Verhältnis der zwei Werte nimmt, was den Vorteil der Verwendung der Verfahren der vorliegenden Erfindung zeigt.
Die Ergebnisse zeigen, dass die berechnete glykierte Fraktion proportional zu dem Prozentsatz an glykiertem Hämoglobin in der Probe ist.
Bei dem Term CV handelt es sich um den Variationskoeffizienten und dieser ist ein Maß für die Streuung von Wiederholungsmessungen um einen Mittelwert. Der Koeffizient wird aus der Standardabweichung („SD") und dem Mittelwert („M") der Wiederholungen berechnet (d. h. CV = 100 × SD/M). Der Vorteil bei der Verwendung dieses Wertes liegt darin, dass man ihn, weil er als ein Prozentsatz ausgedrückt wird, mit anderen CV-Werten vergleichen kann, ohne dass es erforderlich ist, die Mittelwerte zu kennen.
Der Term S_y.x ist ein Maß für die Variabilität, die bei der Berechnung der linearen Regression verwendet wird. Er ist das Maß für die Variabilität von „y" nach Entfernen der Auswirkung von „x" (d. h. er misst die Variabilität der Daten um die Regressionslinie herum).
Beispiel 6
Proportionalität des Assays: Glykiertes Protein
Eine normale Albumin-Probe wurde aus dem Serum eines Nicht-Diabetikers gewonnen. Eine Probe mit erhöhtem glykiertem Albumin wurde aus menschlichem Serumalbumin gewonnen, das in vitro glykiert worden war (siehe US-Patent Nr. 5,589,393 an Michael D. Fiechtner et al., erteilt am 31. Dezember 1996).
Beide Proben wurden auf den Gehalt an Fructosamin getestet, wobei man einen manuellen Fructosamin-Assay verwendete, der auf Tietz, Textbook of Clinical Chemistry, 2. Aufl. (W. B. Saunders Co., Carl A. Burtis, Edward Ashwood, Hrsg., 1994), Seite 986–988 basierte. Man stellte fest, dass die Probe mit dem erhöhten glykierten Albumin das 5,5-fache der Konzentration an Fructosamin der normalen Albumin-Probe enthielt. Die Proben wurden miteinander in den Verhältnissen gemischt, die in Tabelle IV gezeigt sind (siehe auch 9 und 10).

Die so erhaltenen Proben wurden, wie im Beispiel 2 beschrieben, getestet und die A₂₈₀-Absorptionswerte wurden vorstehend aufgezeichnet. Tabelle IV

Relative Fructosamin-Konzentration	Gemessen Gesamt-gly	Gemessen glykiert	Berechnet Gesamt	Gly/Gesamt
1.0	0.065	0.027	0.092	0.029
1.0	0.067	0.028	0.095	0.029
2.1	0.056	0.037	0.093	0.040
2.1	0.052	0.037	0.089	0.042
3.3	0.045	0.058	0.103	0.056
3.3	0.049	0.045	0.094	0.048
4.4	0.040	0.053	0.093	0.057
4.4	0.038	0.054	0.092	0.059
5.5	0.033	0.063	0.096	0.066
5.5	0.030	0.072	0.102	0.071

Die Regressionsstatistik für die vorstehende Datenauftragung ist in der nachstehenden Tabelle V gezeigt. Tabelle V

Fraktion Steig. Achsenabs. R^2

Gesamt 0.001 0.091 0.177

Glykiert 0.009 0.020 0.908

Gly/Ges. 0.008 0.022 0.962
Es wurde beobachtet, dass die berechnete glykierte Albumin-Fraktion proportional zum Fructosamin-Gehalt war. Die Ergebnisse sind proportional von der niedrigen Probenkonzentration bis zum 5,5-fachen der niedrigen Konzentration, wie durch die Regressionsstatistik von R^2 gezeigt ist. Daher ist das Assay-Verfahren, das verwendet wird, um glykiertes Hämoglobin zu messen, auch für die Messung von glykiertem Albumin geeignet.
Beispiel 7
Auswirkung des Probenvolumens
Ein Lateral-Flow-Streifenformat, wie in Beispiel 4 beschrieben und in 6A dargestellt, wurde verwendet, um Vollblut von Nicht-Diabetikern und von Diabetikern in unterschiedlichen Probenvolumina zu testen, um die Auswirkung des Probenvolumens auf den Assay zu bestimmen, bei dem man der in Beispiel 5 beschriebenen Methode folgte. Die gemessenen Extinktionswerte (415 nm) sind in der Tabelle VI aufgeführt (siehe 11 bis 12). Tabelle VI Extinktion (415)

μl Probe Ges. Hb Gly Hb Gly/Gesamt

10 1.164 0.183 0.157

20 1.053 0.167 0.159

30 1.233 0.164 0.133

40 1.206 0.195 0.162
Die Regressionsstatistik ist in der Tabelle VII gezeigt. Tabelle VII

Fraktion Steig. Achsenabs. S_y.x Steigung = 0?

Gesamt Hb 0.0031 1.088 0.084 Ja (P = 0.502)

Gly Hb 0.0003 0.169 0.017 Ja (P = 0.706)

Gly/Ges. –0.0001 0.156 0.016 Ja (P = 0.893)
Die Ergebnisse zeigen, dass die Bindung von Gesamt-Hämoglobin und glykiertem Hämoglobin in dem Assay unabhängig von dem Probenvolumen sind, wenn das Volumen in Vollblut-Assays in einem Bereich von etwa 10 μl bis etwa 40 μl liegt.
Beispiel 8
Auswirkung der Schwankung der Gesamt-Hämoglobin-Konzentration

Die Auswirkung von Schwankungen in der Menge von Gesamt-Hämoglobin in dem Assay wurde bestimmt, indem man die in Beispiel 2 beschriebene Assayprozedur verwendete, um verdünnte Blutproben zu testen. Die nachstehende Tabelle VIII führt die Extinktionswerte (415 nm) aus den Assays von Blutlysaten von Nicht-Diabetikern und Diabetikern auf, die um den Faktor 2, 4, 8 und 16 verdünnt worden waren (siehe 13 bis 15). Tabelle VIII

		A (415 nm)
Probe	Verd. Faktor	(Gesamt) Hb	gly	%gly
Normal	2	1.309	0.091	6.9
	4	0.754	0.054	7.2
	8	0.382	0.026	6.8
	16	0.178	0.014	7.9
Diabetiker	2	1.561	0.275	17.6
	4	0.929	0.157	16.9
	8	0.467	0.084	18.0
	16	0.199	0.036	18.1

Die Regressionsstatistik für die Graphen ist in der nachstehenden Tabelle IX gezeigt. Tabelle IX

Fraktion Steig. Achsenabs S_y.x Steigung = 0?

Normal 0.00060 0.067 0.0035 Ja (P = 0.202)

Diabetiker 0.00058 0.172 0.0049 Ja (P = 0.329)
Die Mengen von Gesamt-Hämoglobin und glykiertem Hämoglobin, die an die feste Trägermatrix binden, nehmen mit abnehmender Gesamt-Hämoglobin-Konzentration ab. Das berechnete glykierte Hämoglobin/Gesamt-Hämoglobin war jedoch über die getesteten Verdünnungen konstant, wie man in der Regressionsstatistik sehen kann (d. h. die Steigungen sind praktisch Null). Dies zeigte den Vorteil der Verfahren der vorliegenden Erfindung (d. h. die Verwendung des Verhältnisses von zwei Messungen, um Ergebnisse zu liefern, die unabhängig von der Probenverdünnung oder der Hämoglobin-Konzentration sind).
Beispiel 9
Vergleich mit anderen im Handel erhältlichen Assays
Man testete 25 Vollblut-Proben mit der Streifen-Anordnung, die in 6C dargestellt ist und in Beispiel 4 beschrieben worden ist, und folgte der in Beispiel 5 beschriebenen Assay-Methode. Die Proben wurden auch mit zwei im Handel erhältlichen Tests für Hämoglobin A1c getestet.
Bei den im Handel erhältlichen Tests, die mit dem Verfahren der vorliegenden Erfindung verglichen wurden, handelte es sich um:
1. Roche Integra 400 (Roche Diagnostics)
Dieser Test wurde auf einem Mehrfachproben-Tischanalysegerät durchgeführt, wobei eine immunturbidimetrische Bestimmung des glykierten N-terminalen Valins der β-Kette in Hämoglobin oder HbA1c gemäß den Vorschriften des Herstellers verwendet wurde. Jede Probe wurde einmal mit diesem Verfahren getestet.
2. DCA 2000 (Bayer)
Dieser Test wurde auf einem Einfachproben-Tischanalysegerät durchgeführt, wobei eine immunturbidimetrische Bestimmung von HbA1c gemäß den Vorschriften des Herstellers verwendet wurde. Jede Probe wurde einmal mit diesem Verfahren getestet.
Die Ergebnisse sind in den 16A und 16B aufgetragen und zeigen, dass die Ergebnisse, die mit den verglichenen Verfahren und den Verfahren der vorliegenden Erfindung erhalten wurden, korrelieren.

Claims

Verfahren zur Quantifizierung glykierten Proteins in einer Probe, das umfasst: (a) in Kontakt-Bringen einer festen Trägermatrix, die eine negativ geladene Gruppe und eine Hydroxyborylverbindung umfasst und die einen Messbereich aufweist, mit einem Aliquot einer biologischen Probe, das ausreicht, um den Messbereich zu bedecken; (b) in Kontakt-Bringen der festen Trägermatrix mit einem Aliquot eines ersten Puffers, das ausreicht, um ungebundenes Protein abzuspülen, wobei der erste Puffer einen pH-Wert hat, der so gewählt ist, dass sowohl glykiertes als auch nicht glykiertes Protein an die feste Trägermatrix binden kann; (c) Quantifizieren des an den Messbereich gebundenen Proteins unter Verwendung der Messung einer ausgewählten Eigenschaft des Proteins, wodurch eine erste Messung von gebundenem Protein erhalten wird; (d) in Kontakt-Bringen der festen Trägermatrix mit einem Aliquot eines zweiten Puffers, das ausreicht, um ungebundenes Protein abzuspülen, wobei der zweite Puffer einen pH-Wert hat, der so gewählt ist, dass glykiertes Protein an die feste Trägermatrix binden kann, nicht glykiertes Protein jedoch nicht wesentlich an die feste Trägermatrix gebunden wird; (e) Quantifizieren des an den Messbereich gebundenen Proteins unter Verwendung der Messung der in Schritt (c) gemessenen Eigenschaft, wodurch eine zweite Messung von gebundenem Protein erhalten wird; und (f) Berechnen des Prozentsatzes an glykiertem Protein unter Verwendung der ersten und zweiten Messung an gebundenem Protein.
Verfahren zur Quantifizierung der Menge an glykiertem Protein in einer biologischen Probe, das umfasst: (a) in Kontakt-Bringen einer festen Trägermatrix, die eine negativ geladene Gruppe und eine Hydroxyborylverbindung umfasst und die einen Messbereich aufweist, mit einem Aliquot einer biologischen Probe, das ausreicht, um den Messbereich zu bedecken; (b) in Kontakt-Bringen der festen Trägermatrix mit einem Aliquot eines ersten Puffers, das ausreicht, um ungebundenes Protein abzuspülen, wobei der erste Puffer einen pH-Wert von 5,0 bis 7,0 hat; (c) Quantifizieren des an den Messbereich gebundenen Proteins, wodurch eine erste Messung von gebundenem Protein erhalten wird; (d) in Kontakt-Bringen der festen Trägermatrix mit einem Aliquot eines zweiten Puffers, das ausreicht, um ungebundenes Protein abzuspülen, wobei der Puffer einen pH-Wert von 8,0 bis 10,0 hat; (e) Quantifizieren des an den Messbereich gebundenen Proteins, wodurch eine zweite Messung von gebundenem Protein erhalten wird; und (f) Berechnen des Prozentsatzes an glykiertem Protein in der Probe unter Verwendung der ersten und der zweiten Messung an gebundenem Protein.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei die erste und zweite Messung an gebundenem Protein die selbe Eigenschaft messen.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Eigenschaft mittels einer optischen Messung gemessen wird.
Verfahren nach Anspruch 4, wobei die optische Messung Absorption oder Reflexion bei einer spezifizierten Wellenlänge ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei das glykierte Protein glykiertes Hämoglobin ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei das glykierte Protein glykiertes Albumin ist.
Verfahren zur Quantifizierung glykierten Hämoglobins in einer biologischen Probe, das umfasst: (a) Zugabe der Probe zu einem Probenauftragsort, der in Verbindung mit einer festen Trägermatrix steht, die eine negativ geladene Gruppe und eine Dihydroxyborylverbindung umfasst und die einen Messbereich aufweist; (b) Zugabe eines Aliquots eines ersten Puffers zu dem Probenauftragsort, wobei der erste Puffer einen pH-Wert zwischen 5,0 und 7,0 hat; (c) Durchführen einer ersten optischen Messung des Messbereichs bei einer Wellenlänge, bei der Hämoglobin Licht absorbiert; (d) Zugabe eines Aliquots eines zweiten Puffers zu dem Probenauftragsort, wobei der zweite Puffer einen pH-Wert zwischen 8,0 und 10,0 hat; (e) Durchführen einer zweiten optischen Messung des Messbereichs bei einer Wellenlänge, bei der Hämoglobin Licht absorbiert; und (f) Berechnen des Prozentsatzes an glykiertem Hämoglobin in der Blutprobe unter Verwendung der ersten und zweiten optischen Messung.
Verfahren zur Quantifizierung glykierten Proteins, das nicht Hämoglobin ist, in einer biologischen Probe, das umfasst: (a) Zugabe der Probe zu einem Probenauftragsort, der in Verbindung mit einer festen Trägermatrix steht, die eine negativ geladene Gruppe und eine Dihydroxyborylverbindung umfasst und die einen Messbereich aufweist; (b) Zugabe eines Aliquots eines ersten Puffers zu dem Probenauftragsort, wobei der erste Puffer einen pH-Wert zwischen 5,0 und 7,0 hat; (c) Durchführen einer ersten optischen Messung des Messbereichs bei einer Wellenlänge, bei der das glykierte Protein, das nicht Hämoglobin ist, Licht absorbiert; (d) Zugabe eines Aliquots eines zweiten Puffers zu dem Probenauftragsort, wobei der zweite Puffer einen pH-Wert zwischen 8,0 und 10,0 hat; (e) Durchführen einer zweiten optischen Messung des Messbereichs bei einer Wellenlänge, bei der das glykierte Protein, das nicht Hämoglobin ist, Licht absorbiert; und (f) Berechnen des Prozentsatzes an glykiertem Protein in der Probe unter Verwendung der ersten und zweiten optischen Messung.
Verfahren nach Anspruch 8 oder 9, wobei die Dihydroxyborylverbindung die Formel
hat, wobei R ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Phenyl, substituiertem Phenyl, Wasserstoff und Alkyl mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen.
Verfahren nach Anspruch 10, wobei R ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Phenyl, m-Aminophenyl, Wasserstoff, Ethyl, 1-Propyl und 2-Methyl-1-butyl.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, wobei die negativ geladene Gruppe ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Carboxylat, Sulfat, Sulfonat, Sulfinat und Phosphat.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, wobei die feste Trägermatrix ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Zellulose, Nitrozellulose, Zelluloseazetat, Polyacrylamid, Agarose-Polyacrylamid-Copolymer, Agarose, Stärke, Nylon, Nylon-Polyester, Dextran, quervernetztes Dextran, Dextranacrylamid-Copolymer, quervernetztes Hydroxyethylmethacrylat, substituierte quervernetzte Polystyrole und Polyvinylalkohol.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13, wobei die feste Trägermatrix Carboxyzellulose ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14, wobei der erste Puffer ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus MES, MOPS und HEPES.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 15, wobei der zweite Puffer Ammoniumazetat oder Taurin ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 16, wobei die Probe mit einem proteinspezifischen Markierungswirkstoff markiert ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, 7 oder 9, wobei die Probe Serum oder Plasma ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 18, wobei das glykierte Protein, das nicht Hämoglobin ist, glykiertes Albumin ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 6 oder 8, wobei die Probe Vollblut ist.