DE60223340T2

DE60223340T2 - Serpin-arzneistoffe zur behandlung einer hiv-infektion und verfahren zu deren verwendung

Info

Publication number: DE60223340T2
Application number: DE60223340T
Authority: DE
Inventors: Ralf Geiben Watertown LYNN; Bruce D. Milton WALKER
Original assignee: General Hospital Corp
Current assignee: General Hospital Corp
Priority date: 2001-01-26
Filing date: 2002-01-25
Publication date: 2008-08-28
Anticipated expiration: 2022-01-26
Also published as: EP1362127A4; ATE377657T1; AU2002248384A1; EP1362127A2; ES2296914T3; WO2002058638A3; US20020127698A1; EP1362127B1; DE60223340D1; US7510828B2; WO2002058638A2; US20050058637A1

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft eine antivirale Behandlung unter Verwendung eines spezifischen Serpins, das Serin-Protease inhibiert und Heparin bindet.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Piepkorn M. et al., Biochemical and Biophysical Research Communications, 151: 327–332 (1988); Sudhalter J. et al., Journal of Biological Chemistry, 264: 6892–6897 (1989); Horner A. A., Biochemical Journal, 266: 553–560 (1990), und EP-A-0 048 898 beschreiben eine Chromatographie unter Verwendung von Heparin und Antithrombin III. Delvos U. et al., Thrombosis and Hemostasis, 57: 87–91 (1987), betrifft Antithrombin III in einer Vergleichsstudie von zwei Antikoagulans-Mechanismen.
Das menschliche Retrovirus, Human Immunodeficiency Virus (HIV), verursacht Acquired Immmunodeficiency Syndrome (AIDS), eine unheilbare Krankheit, in der das Immunsystem des Körpers zusammenbricht und das Opfer gegenüber opportunistischen Infektionen verwundbar macht, z. B. Lungenentzündung und gewissen Krebsarten, z. B. Karposis Sarcoma. AIDS ist ein wesentliches globales Gesundheitsproblem. Das Joint United Nations Programme für HIV/AIDS (UNAIDS), schätzt, dass nun weltweit mehr als 34 Millionen Menschen mit HIV leben und ca. 28,1 Millionen dieser infizierten Individuen im verarmten Afrika der Sub-Saharazone leben. In den Vereinigten Staaten ist einer von jeweils 250 Menschen mit HIV infiziert oder hat AIDS. Seit dem Beginn der Epidemie hat AIDS weltweit nahezu 19 Millionen Menschen getötet, einschließlich von ca. 425 Tausend Amerikanern. AIDS hat Malaria und Tuberkulose als die tödlichste Infektionskrankheit unter Erwachsenen abgelöst und liegt weltweit an vierter Stelle als Todesursache.
Es gibt noch keine Heilung für AIDS. Es gibt jedoch eine Anzahl antiretroviraler Arzneimittel, die HIV daran hindern, sich zu vermehren und das Immunsystem des Körpers zu verwüsten. Eine solche Klasse von Arzneimitteln sind die reverse Transkriptase-Inhibitoren, z. B. Abacavir, Delaviridin, Didanosin, Efavirenz, Lamivudin, Nevirapin, Stavudin, Zalcitabin und Zidovudin, die eine reverse Transkiptase genanntes HIV-Enzym attackieren. Eine andere Klasse von Arzneimitteln sind die Protease-Inhibitoren, wie z. B. Amprenavir, Idinavir, Nelfinavir, Ritonavir und Saquinavir, die HIV-Enzym-Protease inhibieren. Diese zuerst seit 1995 eingeführten Protease-Inhibitoren werden zur Behandlung einer HIV-Infektion allein oder in Kombination mit anderen antiretroviralen Arzneimitteln weit verbreitet verwendet. Zur Zeit nehmen in den Vereinigten Staaten ca. 215.000 der geschätzten 350.000 Patienten, die eine Behandlung gegen HIV-Infektion erhalten, mindestens einen Protease-Inhibitor.
Eine hoch wirksame antiretrovirale Arzneimitteltherapie (HAART) ist eine weit verbreitet verwendete anti-HIV-Therapie, die eine Dreifach-Protease-Inhibitor-Arzneimittel umfassende Therapie umfasst, die eine virale Replikation vollständig unterdrücken kann (Stephenson, JAMA, ,277: 614–6 (1997)). Die Persistenz von latentem HIV im Körper wurde jedoch unterschätzt. Es wird nun erkannt, dass ein HIV-Reservoir in vielleicht mehreren Zehntausend bis zu einer Million langlebender ruhender "Memory"-T-Lymphozyten (CD4) existiert, in dem das HIV-Genom in die zelleigene DNA integriert ist (Stephenson, JAMA, 279: 641–2 (1998)). Diese Ansammlung von latent infizierten Zellen wird wahrscheinlich durch eine primäre Infektion geschaffen.
Eine solche Kombinationstherapie ist oft nur teilweise wirksam, und es ist unbekannt, wie viel virale Unterdrückung erforderlich ist, um einen dauerhaften virologischen, immunologischen und klinischen Erfolg zu erzielen (Deeks, JAMA, 286: 224–6 (2001)). Anti-HIV-Arzneimittel sind hoch toxisch und können ernsthafte Nebenwirkungen hervorrufen, einschließlich von Herzinsuffizienz, Niereninsuffizienz und Osteoporose. Eine Langzeitverwendung von Protease-Inhibitoren wurde mit einen durch abnormale Ablagerung von Körperfett begleiteten peripheren Schwund verbunden. Andere Anzeigen von mit Protease-Inhibitoren verbundenen Stoffwechselstörungen umfassen erhöhte Spiegel von Triglyceriden und Cholesterin, Pankreatitis, Atherosklerose und Insulin-Resistenz (Carr et al., LANCET, 351: 1881–3 (1998)). Die Effizienz der derzeitigen anti-HIV-Therapie wird weiter durch die Komplexität der Therapie, Pillenbelastung und Arzneimittel-Arzneimittel-Wechselwirkungen beschränkt. Die Belastung mit den toxischen Wirkungen von antiretroviralen Arzneimitteln macht eine lebenslange Kombinationstherapie zu einer schwierigen Aufgabe, und viele Patienten können eine Langzeitbehandlung mit HAART nicht tolerieren. Aufgrund der schlechten Einstellung gegenüber einer Kombinationstherapie, die zum Auftreten von arzneimittelresistenten Stämmen von HIV führte, besteht ein dringendes Bedürfnis für andere antivirale Therapien. Andere Arzneimittel könnten die Einstellung durch eine wesentliche Reduzierung der täglichen "Pillenbelastung" und Vereinfachung der komplizierten diäterischen Richtlinien mit der Verwendung von derzeitigen Protease-Inhibitoren verbunden sind, verbessern.
Der HIV-Virus dringt in den Körper eines infizierten Individuums ein und lebt und vermehrt sich primär in den weißen Blutzellen. Das Kennzeichen einer HIV-Infektion ist deshalb ein Abfall in T-Helfer- oder CD4-Zellen genannten Zellen des Immunsystems. Der molekulare Mechanismus des HIV-Eintritts in Zellen umfasst spezifische Wechselwirkungen zwischen den viralen Hüllen-Glykoproteinen (env) und zwei Zielzellen-Proteinen, CD4 und einem Chemokin-Rezeptor. HIV-Tropismus wird durch die Spezifität der env für einen bestimmten Chemokin-Rezeptor bestimmt (Steigenberger et al., PROC. NATL. ACAD. SCI. USA, 97: 805–10 (2000)). T-Zelllinien-tropische (T-tropische) Viren (X4-Viren) erfordern für den Eintritt den Chemokin-Rezeptor CXR4. Makrophagen(M)-tropische Viren (R5-Viren) verwenden CCR5 für den Eintritt (Berger et al., NATURE, 391: 240 (1998)). T-Tropismus ist mit verschiedenen Aspekten von AIDS verbunden, einschließlich von AIDS-Demenz, und kann bei der Verbreitung des Virus über den Körper und zur Funktion als Virusvorrat im Körper wichtig sein.
CD8⁺-T-Zellen sekretieren lösliche(n) Faktor(en), der (die) dazu fähig sind, R5- und X4-tropische Stämme von HIV zu inhibieren, und von denen angenommen wird, dass sie in vivo eine kritische Rolle bei der antiviralen Wirtsverteidigung spielen (Garizino-Demo et al., PROC. NATL. ACAD. SCI. USA, 96: 111986–91 (1999)). Diese inhibitorischen Faktoren umfassen CC-Chemokine (Cocchi et al., SCIENCE, 270: 1811–5 (1995); Horuk et al., J. BIOL. CHEM., 273: 386–91 (1998); Pal et al., SCIENCE, 278: 695–8 (1997)), die an den CCR5-Co-Rezeptor binden und einen viralen R5-Eintritt in Zellen inhibieren (Garizino-Demo et al., PROC. NATL. ACAD. SCI. USA, 96: 111986–91 (1999); Liu et al., CELL, 86: 367–77 (1996); Samson et al., NATURE, 382: 722–5 (1996); Scarlatti et al., NAT. MED., 3: 1259–65 (1997)), sowie weniger gut charakterisierte lösliche Faktor(en), die durch CD8⁺-T-Zellen produziert werden und CD8+-T-Zell-antivirale(r) Faktor(en) genannt werden (nachstehend CAF) und dazu fähig sind, R5- und X4-HIV zu inhibieren (Walker et al., SCIENCE, 234: 1563–6 (1986); Chen et al., AIDS RES. HUM. RETROVIRUSES, 9: 1079–86 (1993); Mackewicz et al., PROC. NATL. ACAD. SCI. USA, 92: 2308–12 (1995); Mackewicz et al., J. GEN. VIROL., 81 Pt. 5: 1261–4 (2000); Leith et al., AIDS, 11: 575–80 (1997); Le Borgne et al., J. VIROL., 74: 4456–64 (2000); Tomaras et al. PROC. NATL. ACAD. SCI. USA, 97: 3503–8 (2000)). Diese CC-Chemokine sind jedoch nicht für die aus diesen Zellen freigesetzte gesamte CAF-antivirale Aktivität verantwortlich, insbesondere, weil CAF die Replikation von X4-HIV-Stämmen, die CXCR4 und nicht CCR5 als Co-Rezeptor verwenden, inhibieren können. Die Identität der aus CD8⁺-T-Zellen freigesetzten Faktor(en), die zur Inhibierung von X4-HIV fähig sind, blieb unbestimmt.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die Erfindung stellt die Verwendung eines spezifischen Antithrombin III (AT III) bereit, wie weiter im Anspruch 1 definiert, sowie Zusammensetzungen, die im wesentlichen gereinigtes Serpin umfassen, die in Verfahren zur Behandlung und Verhinderung einer HIV-Infektion geeignet sind. Zusätzlich stellt die Erfindung Antikörper und Kits bereit, die zur Bestimmung, Behandlung und Vorbeugung einer HIV-Infektion geeignet sind.
Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Inhibierung der Infektivität von HIV bereit durch in Kontakt bringen eines HIV-Virions mit einer Zusammensetzung, die ein im wesentlichen gereinigtes Präparat eines Serpins oder eines Analogen davon umfasst. Die Zusammensetzung wird mit dem Virion während eines Zeitraums inkubiert, der ausreicht, und um die Infektiösität von HIV zu inhibieren. Das Serpin ist ein spezifisches Antithrombin (ATIII) und kann chemisch oder enzymatisch vorbehandelt sein, z. B. mittels Elastase-Vorbehandlung. Das Serpin kann entweder vom Rind oder vom Menschen stammen. In einer bevorzugten Ausführungsform inhibiert das Serpin oder ein Analog davon Serin-Protease und bindet Heparin. In einer mehr bevorzugten Ausführungsform wird eine 43 kDa-modifizierte Form von Antithrombin III (nachstehend als mATIII bezeichnet) aus aktivierten CD8⁺-T-Zellen-Überständen als HIV-inhibierender Faktor verwendet, der dazu fähig ist, die Replikation von R5- und X4-HIV zu inhibieren. In einer am meisten bevorzugten Ausführungsform enthält die Zusammensetzung 43 kDa-ATIII (nachstehend mATIII), R-ATIII, S-ATIII oder eine Kombination davon.
Die Serpinzusammensetzung kann in einem Verfahren zur Verringerung der Infektiösität von HIV, falls ein solcher vorhanden ist, in einer biologischen Probe verwendet werden, indem man die biologische Probe mit einer Menge an Serpin in Kontakt bringt, die ausreicht, um die Infektiösität in der biologischen Probe zu verringern. In einer bevorzugten Ausführungsform werden biologische Proben mit Serpin bei der Konzentration von mindestens 2 E/ml endgültiges biologisches Probenvolumen in Kontakt gebracht. Biologische Proben, die auf eine HIV-Infektion behandelt werden können, umfassen, ohne darauf beschränkt zu sein, Blut, Plasma, Serum, Samen, Cervix-Sekrete, Speichel, Urin, Frauenmilch und amniotische Fluide.
Die vorliegende Erfindung stellt ferner ein Reinigungssystem bereit, das ein mit einer Oberfläche verbundenes Serpin umfasst, wobei das Serpin dazu fähig ist, die Infektiösität von HIV zu inhibieren. Durch die vorliegende Erfindung wird ein Verfahren zur Inhibierung der Infektiösität von HIV bereitgestellt, worin das HIV-Virion mit einer Zusammensetzung in Kontakt gebracht wird, die eine Oberfläche aufweist, die mit der Oberfläche assoziiertes im wesentlichen gereinigtes Serpin aufweist, während eines Zeitraums, der ausreicht, um die Infektiösität von HIV zu inhibieren. Das Serpin kann insbesondere mit einer Perle, einem Chip, einer Säule oder Matrix verbunden sein. Diese und andere Aufgabenstellungen der vorliegenden Erfindung werden aus der nachstehend angegebenen detaillierten Beschreibung der Erfindung ersichtlich.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
Die vorliegende Erfindung wird durch die folgende Beschreibung unter Bezugnahme auf die Figuren näher verstanden, in denen bedeuten:
1 nennt im Detail die Mitglieder der Serpin-Protein-Oberfamilie. Diese Tabelle wurde modifiziert von: Irvin et al., GENOME RESEARCH, 10: 1845–64 (2000).
2 gibt im Detail die analytischen Daten an, die zur Identifizierung von mATIII als löslicher, von CD8⁺-T-Zellen sekretierter HIV-Inhibitor verwendet wurden. 2A ist ein C4-HPLC-Chromatogramm des im wesentlichen gereinigten HIV-Inhibitors mATIII. 2B ist ein mit Silber angefärbtes SDS-PAGE-Gel des im wesentlichen gereinigten HIV-Inhibitors mATIII. 2C ist eine Tabelle der partiellen Proteinsequenz, durch In-Gel-Trypsin-Digestion des SDS-PAGE-HIV-Inhibitor-Proteinbandes, Elution der resultierenden, von HIV abgeleiteten Inhibitor-Peptide und Nanoelektrospray-Tandem-Massenspektrometrie erhalten.
3 zeigt die antivirale Wirkung von gereinigtem Rinder-ATIII auf HIV. 3A ist ein mit Silber angefärbtes SDS-PAGE-Gel von R-ATIII (mit Schweine-Elastase behandelt; Spur 1) und S-ATIII (undigestiert; Spur 2), verwendet für die HIV-Inhibierungstests. 3B ist ein Diagramm, das die HIV-inhibitorische Aktivität variierender Konzentrationen von R-ATIII und S-ATIII auf X4-HIV- bzw. R5-HIV-Infektiösität vergleicht. Die Virusinhibierung wurde unter Verwendung der Pufferkontrollen oder der Enzymkontrollen ermittelt.
4 ist ein Diagramm, das die Wirkung verschiedener Formen von ATIII auf X4-HIV-, SIV- und SHIV-Infektiösität vergleicht. 4A ist ein Diagramm, das die Wirkung der Hitzebehandlung (95°C, 10 Minuten und 60°C 30 Minuten) auf eine R- und S-ATIII-mediierte X4-HIV-Inhibierung unter Verwendung von Schweine-Elastase allein als experimentelle Kontrolle vergleicht. Die inhibitorische Wirkung eines prelatenten ATIII (60°C, 24 Stunden) und S-ATIII, vorbehandelt mit V8-Protease, wurde ebenfalls getestet.
4B ein Diagramm, das die HIV-inhibitorische Aktivität von R-ATIII und S-ATIII auf die SIV- und SHIV(SIV_Ku-1)-Infektiösität zeigt. Die Virusinhibierung wurde unter Verwendung der Pufferkontrollen und der Enzymkontrollen bestimmt.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Definitionen
Jede der folgenden Bezeichnungen besitzt die in diesem Abschnitt damit verbundene Bedeutung. Der Ausdruck "Serpin", wie er hier verwendet wird, soll natives Serpin-Polypeptid sowie biologisch aktive Fragment(en) oder Analog(e) davon umfassen. Der Ausdruck "Fragment" und "Analog" wird hier austauschbar verwendet, um Serpine zu beschreiben, die in den Verfahren der vorliegenden Erfindung brauchbar sind.
Der Ausdruck "im wesentlichen rein", wie er hier verwendet wird, beschreibt eine Verbindung, z. B. ein Protein oder Polypeptid, das von Komponenten, die dieses natürlich begleiten, getrennt ist. Typischerweise ist eine Verbindung im wesentlichen rein, wenn mindestens 10%, insbesondere mindestens 20%, mehr bevorzugt mindestens 50%, noch mehr bevorzugt mindestens 60%, noch bevorzugter mindestens 75%, noch mehr bevorzugt mindestens 90% und in erster Linie mindestens 99% des gesamten Materials (als Volumen, Nass- oder Trockengewicht, oder als Mol-Prozent oder Mol-Bruch) in einer Probe die interessierende Verbindung ist. Die Reinheit kann nach einem geeigneten Verfahren bestimmt werden, z. B. im Fall von Polypeptiden durch Säulenchromatographie, Gelelektrophorese oder HPLC-Analyse. Eine Verbindung, z. B. ein Protein, ist auch im wesentlichen rein, wenn es im wesentlichen frei ist von natürlich damit verbundenen Komponenten, oder wenn es von den nativen Verunreinigungen, die sie in ihrem natürlichen Zustand begleiten, abgetrennt ist. Innerhalb der Bedeutung des Ausdrucks "im wesentlichen rein", wie er hier verwendet wird, ist eine Verbindung umfasst, wie z. B. ein Protein oder Polypeptid, das homogen rein ist, worin z. B. mindestens 95% des Gesamt-Proteins (als Volumen, als Nass- oder Trockengewicht, oder als Mol-Prozent oder Mol-Bruch) in einer Probe das in Frage stehende Protein oder Polypeptid ist.
Der Ausdruck "spezifische Bindung" oder "spezifisch bindet", wie er hier verwendet wird, bedeutet ein Protein, wie z. B. Antikörper, der ein Serpin erkennt und bindet, z. B. ATIII, oder einen Liganden davon, aber im wesentlichen andere Moleküle in einer Probe nicht erkennt oder bindet.
Der Ausdruck "pharmazeutisch annehmbarer Träger", wie er hier verwendet wird, bedeutet eine chemische Zusammensetzung, mit der der Wirkstoff kombiniert sein kann, und die nach der Kombination verwendet werden kann, um den Wirkstoff einem Individuum zu verabreichen.
Der Ausdruck "physiologisch annehmbare(r)(s)" Ester oder Salz, wie er hier verwendet wird, bedeutet eine Ester- oder Salzform des Wirkstoffs, der mit anderen Bestandteilen der pharmazeutischen Zusammensetzung kompatibel ist, der für das Individuum, dem die Zusammensetzung verabreicht werden soll, nicht schädlich ist.
Der Ausdruck "ölige" Flüssigkeit, wie er hier verwendet wird, bezeichnet eine solche, die ein Kohlenstoff-enthaltendes flüssiges Molekül umfasst, und die einen weniger polaren Charakter als Wasser zeigt.
Der Ausdruck "zusätzliche Bestandteile", wie er hier verwendet wird, umfasst, ohne darauf beschränkt zu sein, eine oder mehrere der folgenden Komponenten: Exzipienten, oberflächenaktive Mittel, Dispersionsmittel, inerte Verdünnungsmittel, Granulier- und Zerfallsmittel, Bindemittel, Schmiermittel, Süßmittel, Geschmacksmittel, Farbmittel, Konservierungsmittel, physiologisch abbaubare Zusammensetzungen, wie z. B. Gelatine, wässerige Träger und Lösungsmittel, natürliche Träger und Lösungsmittel, Suspendiermittel, Dispergier- oder Netzmittel, Emulgiermittel, Milderungsmittel, Puffer, Salze, Verdickungsmittel, Füllkstoffe, Emulgiermittel, Antioxidantien, Antibiotika, Antipilzmittel, Stabilisierungsmittel und pharmazeutisch annehmbare Polymere oder hydrophobe Materialien. Andere "zusätzliche Bestandteile", wie die in den pharmazeutischen Zusammensetzungen der Erfindung enthalten sein können, sind auf diesem Gebiet bekannt und werden z. B. beschrieben in Genaro, herausgegeben 1985, REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, Mack Publishing Co., Easton, Pa., die hier durch Bezug darauf Bestandteil dieser Beschreibung ist.
Eine "Einheit" der ATIII-enzymatischen Aktivität, wie hier verwendet, ist die Aktivität, die in 0,1 ml eines normalen menschlichen gepoolten Plasmas, getestet in Gegenwart von 0,1 Einheit von Heparin, vorhanden ist (Damus und Rosenberg, METH. ENZYMOL., 45: 653 (1976); PROTEOLYTIC ENZYMES: A PRACTICAL APPROACH, herausgegeben von Beynon und Bond, S. 247 (1989)). Eine "Einheit" der Serpin-enzymatischen Aktivität, wie sie hier verwendet wird, wird als konventionelles Maß für die Serpin-Aktivität, wie sie auf diesem Gebiet definiert wird, verstanden.
Der Ausdruck "Transformation", wie er hier verwendet wird, bedeutet das Einführen von DNA in eine geeignete Wirtszelle so, dass die DNA replizierbar ist, entweder als extrachromosomales Element oder durch chromosomale Integration.
Der Ausdruck "Transfektion", wie er hier verwendet wird, bedeutet die Aufnahme eines Expressionsvektors durch eine geeignete Wirtszelle, egal ob kodierende Sequenzen tatsächlich exprimiert werden oder nicht. Der Ausdruck "Infektion", wie er hier verwendet wird, bezieht sich auf die Einführung von Nucleinsäuren in eine geeignete Wirtszelle unter Verwendung eines Virus oder viralen Vektors.
Der Ausdruck "Antikörper", wie er hier verwendet wird, bezieht sich auf ein Immunoglobulinmolekül, das dazu fähig ist, an ein spezifisches Epitop oder ein Antigen zu binden.
I. HIV-INHIBITOREN DER VORLIEGENDEN ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung identifiziert die antiretrovirale Aktivität von Serpinen (1). Die Erfindung umfasst auch Verfahren zur Behandlung und Vorbeugung der HIV-Infektion, umfassend das in Kontakt bringen einer erfindungsgemäßen Zusammensetzung mit einem menschlichen Patienten oder das Behandeln einer HIV-Infektion durch Einführen eines DNA-Moleküls, das ein Serpin kodiert, in eine Zelle, die für eine HIV-Infektion anfällig ist. Zusätzlich umfasst die Erfindung Antikörper und Kits, die zur Bestimmung, Behandlung und Vorbeugung einer HIV-Infektion geeignet sind.
Serpine stellen eine Oberfamilie von strukturell verwandten Proteinen dar, die in Eukaryoten, einschließlich Menschen, aufgefunden werden (Wright, BIOASSAYS, 18: 453–64 (1996); Skinner et al., J. MOL. BIOL., 283: 9–14 (1998); Huntington et al., J. MOL. BIOL., 293: 449–55 (1999); Interpro #IPR000215). Serpine sind ungewöhnlich lange Serin-Protease-Inhibitoren, z. B. ATIII, Protein-C-Inhibitor, aktiviertes Protein C, Plasminogen-Aktivator-Inhibitor und α-1-Antitrypsin. Auf molarer Basis umfassen inhibitorische Serpine einige 10% der menschlichen Serum-Proteine.
Obgleich die hier angegebenen experimentellen Beispiele sich auf Antithrombin (nachstehend ATIII) beziehen, sind andere Serpine, wie in 1 zusammengestellt, oder davon abgeleitete Peptid-Fragment(e) oder Analog(e) davon erfindungsgemäß einzuschließen. In einer bevorzugten Ausführungsform bindet das Serpin Heparin und inhibiert Serin-Protease und HIV. Der Ausdruck "Serpin" umfasst natürlich auftretende Serpine sowie synthetische oder rekombinante Serpine. Der Ausdruck "Serpin" umfasst ferner allelische Varianten, Speziesvarianten und konservative Aminosäure-Substitutionsvarianten. Der Ausdruck umfasst auch Serpine voller Länge sowie Serpin-Fragmente. Es ist deshalb zu verstehen, dass Fragmente von Serpin-Varianten in Mengen, die eine äquivalente biologische Aktivität von Serpinen voller Länge ergeben, wenn erwünscht, in den erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden können. Fragmente von Serpin umfassen mindestens die Aminosäurereste von Serpinen, die für eine biologische Aktivität, die ähnlich ist zu der von intaktem Serpin, erforderlich sind. Beispiele solcher Fragmente umfassen die in 1 angegebenen Serpine.
Der Ausdruck "Serpin" umfasst auch Varianten und funktionelle Analoga von Serpinen, die eine mit einem Serpin homologe Aminosäuresequenz aufweisen. Die vorliegende Erfindung umfasst damit pharmazeutische Formulierungen, die solche Serpin-Varianten und funktionelle Analoga umfassen, die Modifikationen, wie z. B. Substitutionen, Deletionen, Insertionen, Inversionen oder Cyclisierungen aufweisen, aber nichtsdestotrotz im wesentlichen die biologischen Aktivitäten der Serpine aufweisen.
Nach der vorliegenden Erfindung bedeutet "homologe Aminosäuresequenz" eine Aminosäuresequenz, die sich durch ein oder mehrere konservative Aminosäure-Substitutionen oder durch ein oder mehrere nicht-konservative Aminosäure-Substitutionen, -Deletionen oder -Additionen, die sich in Positionen befinden, an denen sie die biologischen Aktivitäten der Polypeptide nicht zerstören, unterscheidet. Konservative Aminosäure-Substitutionen umfassen typischerweise Substitutionen unter Aminosäuren der gleichen Klasse. Diese Klasse umfasst z. B. (a) Aminosäuren, die ungeladene polare Seitenketten aufweisen, wie z. B. Asparagin, Glutamin, Serin, Threonin und Tyrosin, (b) Aminosäuren, die basische Seitenketten aufweisen, wie z. B. Lysin, Arginin und Histidin, (c) Aminosäuren, die saure Seitenketten aufweisen, wie z. B. Asparaginsäure und Glutaminsäure und (d) Aminosäuren, die nicht-polare Seitenketten aufweisen, wie z. B. Glycin, Alanin, Valin, Leucin, Isoleucin, Prolin, Phenylalanin, Methionin, Tryptophan und Cystein. Vorzugsweise ist eine solche Sequenz mindestens 75%, bevorzugt 80%, mehr bevorzugt 85%, noch mehr bevorzugt 90% und am meisten bevorzugt 95% homolog zu der Aminosäuresequenz des Bezugs-Serpins.
Die Serpin-Struktur wird durch eine Multi-Domän-Faltung typifiziert, die ein Bündel von Helix-Strukturen und eine Sandwich-Struktur enthält, und eine gut definierte C-terminale reaktive Region, die als "Köder" für eine geeignete Serin-Protease dient. Viele Serpine weisen ein hohes Molekulargewicht (400 bis 500 Aminosäuren) auf, sind extrazellulär, irreversible Inhibitoren von Serin-Proteasen, deren Inhibierungsmechanismus dramatische Konfirmationsänderungen einschließt (Skinner et al., J. MOL. BIOL., 283: 9–14 (1998); Huntington et al., J. MOL. BIOL., 293: 449–55 (1999)). Signifikante tertiäre Strukturänderungen können die Einführung des reaktiven Zentrumpeptid-Schleifeninserts in einen Spalt in einer einen neuen Strang bildenden Haupt-β-Schicht einschließen (Stein und Carrell, NATURE STRUCT. BIOL., 2: 96–113 (1995); Sharp et al., STRUCTURE, 7: 111–8 (1999)). Auf der Basis starker Sequenzähnlichkeiten werden eine Anzahl von Proteinen, z. B. Angiotensinogen, Thyroxin-bindendes Globulin und Corticosteroid-bindendes Globulin, ohne bekannte inhibitorische Aktivität zu dieser Familie gezählt (Stein und Carrell, NATURE STRUCT. BIOL., 2: 96–113 (1995)).
Unter den Serpinen ist ATIII ein Glykoprotein, das im Blutplasma vorkommt und eine gut definierte Rolle bei der Blutgerinnung spielt. Spezifisch ist ATIII ein potenter Inhibitor der Reaktionen der Gerinnungskas kade mit einem scheinbaren Molekulargewicht zwischen 54 und 65 kDa (Rosenberg und Damus, J. BIOL., CHEM., 248: 6490–505 (1973); Nordenman et al., EUR. J. BIOCHEM., 78: 204 (1977); Kurachi et al., BIOCHEMISTRY, 15: 373–7 (1976)), wovon einige zehn Prozent durch vier Glucosamin-Basen-Kohlenhydratketten beigetragen werden (Kurachi et al., BIOCHEMISTRY, 15: 373–7 (1976); Petersen et al., IN THE PHYSIOLOGICAL INHIBITORS OF COAGULATION AND FIBRINOLYSIS (Collen, Winman und Verstraete, Herausgeber), Elsevier, Amsterdam, S. 48 (1979)). Obgleich der Name ATIII darauf hinweist, dass es nur auf Thrombin wirkt, dient es tatsächlich dazu, im wesentlichen alle Gerinnungsenzyme in zumindest einigem Ausmaß zu inhibieren. Die primären Enzyme, die es inhibiert, sind Faktor Xa, Faktor IXa und Thrombin (Faktor IIa). Es weist außerdem inhibitorische Wirkungen auf Faktor XIIa, Faktor XIa und den Komplex von Faktor VIIa und den Gewebsfaktor auf, aber nicht auf Faktor VIIa und aktiviertes Protein C. ATIII inhibiert außerdem Trypsin, Plasmin und Kallikrein (Charlotte und Church, SEMINARS IN HEMATOLOGY, 28: 3–9 (1995). Seine Fähigkeit, die Gerinnung durch mehrere Wechselwirkungen zu beschränken, macht es zu einem der primären natürlichen Antigerinnungsproteine.
ATIII wirkt selbst als relativ unwirksamer Inhibitor. ATIII kann jedoch durch einen einfachen Templat-Mechanismus aktiviert werden oder durch eine allosterische Konformationsänderung, die durch eine Heparinbindung herbeigeführt wird (Skinner et al., J. MOL. BIOL., 283: 9–14 (1998); Huntington et al., J. MOL. BIOL., 293: 449–55 (1999); Belar et al., J. BIOL. CHEM., 275: 8733–41 (2000)). Wenn ATIII Heparin bindet, wird die Geschwindigkeit, mit der die Reaktion, die eine Inhibierung verursacht, auftritt, stark beschleunigt. Dies macht den ATIII-Heparin-Komplex zu einer vitalen Komponente der Gerinnung. Diese Wechselwirkung ist auch die Basis für die Verwendung von Heparin und niedrigmolekularen Heparinen als Beimischungen zur Erzeugung einer Antikoagulation.
Es gibt eine wachsende Zahl von Beweisen, dass ATIII neben seiner Fähigkeit zur Inhibierung von Thrombin zusätzliche biologische Wirkung aufweist. Es wurde z. B. gezeigt, dass ATIII als entzündungshemmende Fraktion bei Blutvergiftung (Souter et al., CRIT. CARS MED., 29: 134–9 (2001)), als Antiangiogenese-Faktor bei Tumorwachstum (O'Reilly et al., SCIENCE, 285: 1926–8 (1999)) wirkt und gegenüber Neutrophilen durch den Sydecan-4-Rezeptor chemotaktisch ist (Dunzendorfer et al., BLOOD, 97: 1079–85 (2001); Kaneider et al., BIOCHEM. BIOPHYS. RES. COMMUN., 287: 42–6 (2001)). Der Mechanismus der Wirkung ist bis jetzt noch nicht vollständig klar.
A. Reinigung und Identifizierung von mATIII
Aktivierte CD8⁺-T-Zellen produzieren zumindest zwei Faktoren, die dazu fähig sind, den X4-Strang HIV_IIIB zu inhibieren (Geiben-Lynn et al., J. VIROL., 75: 8306–16 (2001)). Diese Faktoren unterscheiden sich in ihrer Größe und Fähigkeit zur Bindung von Heparin. Einer dieser Faktoren bindet Heparin bei einer physiologischen Salzkonzentration, eluiert aus einer Reinigungssäule bei 350 mM NaCl und wird durch ein 50 kDa-Cut-off-Centricon-Filter zurückgehalten. Der andere Faktor bindet Heparin nicht bei physiologischer Salzkonzentration und geht durch 50 kDa-Cut-off-Centricon-Filter hindurch. Die HIV-inhibitorische Wirkung dieser Faktoren ist mit CD8⁺-T-Zellen seropositiver Individuen und HIV-spezifischen cytotoxischen T-Lymphozyten (CTL) im Vergleich zu CD8⁺-T-Zellen von HIV-seronegativen Individuen höher (Geiben-Lynn et al., J. VIROL., 75: 8306–16 (2001)).
Ein X4-HIV-Inhibierungsassay (Geiben-Lynn et al., J. VIROL., 75: 8306–16 (2001), Shapiro et al. FASEB J., 15: 115–22 (2001)) wurde verwendet, um die in der Heparin-gebundenen Fraktion gefundene inhibitorische Aktivität von aktivierten CD8⁺-T-Zellen-Überstand zu reinigen (Geiben-Lynn et al., J. VIROL., 75: 8306–16 (2001)). Die HHV-inhibitorische Aktivität wurde auf eine scheinbare Homogenität, gemessen durch SDS-PAGE-Silberanfärbung und C4-HPLC (Van Patten et al., J. BIOL. CHEM., 274: 10268–76 (1999)) unter Verwendung von Heparin-Sepharose und Superdez-200-Größenausschlußchromatographie (2A) gereinigt. Der HIV-inhibitorische Faktor wurde als ein 43 kDa-ATIII-ähnliches Protein (mATIII; 2B) durch Umkehrphasen-HPLC-Nano-Elektrospray-Tandem-Massenspektrometrie (μLC/MS/MS) an einem Finnigan-LCQ-Quadrupol-Innenfallen-Massenspektrometer identifiziert (2C).
B. Charakterisierung der antiretroviralen Eigenschaften von ATIII-Formen
Die analytische Charakterisierung von CAF (vergl. 2) zeigte, dass aktivierte CD8⁺-T-Zellen ATIII zu mATIII modifizieren, einer Form mit erhöhter Fähigkeit zur Inhibierung der HIV-Infektiösität. Die in vitro antiretrovirale Aktivität von ATIII-Formen wurde deshalb gemessen und verglichen (3 und 4). Unter physiologischen Bedingungen existiert ATIII in verschiedenen Formen. In seiner am meisten vorhandenen Konfiguration zirkuliert ATIII in einer stillen Form, L-Form, in der seine reaktive COOH-terminale Schleife nicht vollständig ausgesetzt ist und Zielproteine nicht binden kann. Wenn an Heparin gebunden, wird eine gespannte Konformation, die S-Form des Moleküls, induziert: Die reaktive Schleife wird ausgesetzt, und die Thrombin-bindende Affinität wird bis zu einem Faktor von 100 erhöht. Der Thrombin-ATIII-Komplex dissoziiert dann langsam und die reaktive Schleife von ATIII wird durch das freigesetzte Thrombin gespalten. Das gespaltene ATIII besteht aus Disulfid-gebundenen A- und B-Ketten und bindet Ziel-Proteasen nicht. Zusätzlich induziert diese Spaltung eine Konformationsveränderung in eine entspannte Konformation, die R-Form, in der die reaktive Schleife irreversibel in eine A-β-Schicht eingeführt ist (Schreuder et al., NAT. STRUCT. BIOL., 1: 48–54 (1994)).
Eine R-ATIII-Form wurde als antiangiogenetischer Faktor beschrieben, der dazu fähig ist, Tumorwachstum zu inhibieren. Diese Form von ATIII wird zwischen Ser³⁸⁶ und Thr³⁸⁷ gespalten und kann durch Digestieren mit Schweine-Elastase gebildet werden (O'Reilly et al., SCIENCE, 285: 1926–8 (1999)). Andere Enzyme, die ATIII spalten können und RR-ATIII-Formen bilden können, sind Thrombin (Arg³⁹⁴ bis Ser³⁹⁵), Pankreatin-Elastase (Val³⁸⁸ bis Iso³⁸⁹) und humane neutrophile Elastase (Iso³⁹¹ bis Ala³⁹²) (Evans et al., BIOCHEMISTRY, 31: 12629–42 (1992); Mourey et al., J. MOL. BIOL., 232: 223–41 (1993)). Ein prälatentes ATIII, worin die ATIII-Aktivität noch erhalten und die Heparin-Bindungsaffinität erhalten ist, kann durch Inkubieren von S-ATIII bei 60°C während 24 Stunden unter physiologischen Salzbedingungen hergestellt werden (Larsson et al., J. BIOL. CHEM., 276: 11996–2002 (2001)).
Um zu bestimmen, welche Form(en) von ATIII dazu fähig ist (sind), die Retrovirus-Infektiösität zu inhibieren, wurden R-ATIII, prälatentes ATIII und L-ATIII aus einem im Handel erhältlichen S-ATIII (Serumgereinigtes Rinder-S-ATIII; Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA; 0,2 bis 0,4 E/μg)) hergestellt. R-ATIII wurde erhalten durch Inkubieren des S-ATIII (200 μg/ml) bei 37°C in 20 mM Tris-HCl (pH 8,0), enthaltend 150 mM NaCl und 2,5 E/ml Schweine-Pankreas-Elastase (Calbiochem-Novabiochem Corporation, San Diego, CA, USA; Auftrag Nr. 324682). Unter diesen Digestionsbedingungen wurde eine im wesentli chen vollständige Überführung von S-ATIII zu R-ATIII erhalten (3A; O'Reilly et al., SCIENCE, 285: 1926–8 (1999)). In ausgewählten Untersuchungen wurde S-ATIII in PBS unter Verwendung eines immobilisierten V-8-Protease-Kits (PIERCE) während 1 Stunde bei 4°C gemäß der Vorschrift des Herstellers digestiert.
X4-HTLV-IIIB (nachstehend X4-HIV; Chang et al., NATURE, 363: 466–9 (1993)), ein prototypischer T-tropischer Strang von HIV (American Type Tissue Collection, Monassass, VA, USA; ATCC Nr. CRL-8543), wurde verwendet, um die Wirkung von ATIII auf eine T-tropische HIV-Infektion zu bewerten. Die Menge des Virus in einem spezifischen Suspensionsvolumen (z. B. 0,1 ml), die 50% einer Anzahl von Zellkultur-Mikroplattenvertiefungen oder Röhrchen infiziert, wird als Tissue Culture Infectious Dose 50 [TCID₅₀] bezeichnet. TCID₅₀ wird als Alternative zum Bestimmen des Virustiters durch Plaque-Analyse (die Werte als PFUs oder Plaque-bildende Einheiten ergibt) verwendet. Karber, 1931.
Humane T-Lymphoplastoidzellen (H9-Zellen), die die humane Leukozyten-Antigenproteine (HLA) B6, Bw62 und Cw3 exprimieren, wurden mit X4-HIV bei einer MOI von 1 × 10^–2 TCID₅₀ pro Milliliter akut infiziert. Die infizierten H9-Zellen wurden auf 5 × 10⁵ Zellen/ml in R20-Zellen-Kulturmedium resuspendiert. Zwei Milliliter dieser Suspension wurden in jede Vertiefung einer Mikrotiterplatte mit 24 Vertiefungen pipettiert.
PM1-Makrophagen-ähnliche Zellen wurden mit R5-HIV_JR-CSF (nachstehend R5-HIV; Koyanagi et al., SCIENCE, 236: 819–22 (1987)) akut infiziert, um die Fähigkeit von ATIII zur Beeinträchtigung einer mono-cytropen HIV-Infektion zu prüfen. Das R5-HIV-Isolat JR-CSF wurde ursprünglich aus der Zerebrospinalflüssigkeit eines HIV-infizierten Individuums bei der Autopsie erhalten. Dieser Stamm zeigt Eigenschaften, die für primäre HIV-Isolate charakteristisch sind, es repliziert z. B. wirksam in primären Blutzellen, aber nicht in Zelllinien. Das heißt, JR-CSF zeigt Eigenschaften, die mehr charakteristisch für direkt von HIV-Patienten erhaltene klinische HIV-Isolate sind. Er ist nun ein Standardbezugsstamm, der Makrophagentropische Stämme von HIV repräsentiert. PM1-Zellen wurden akut mit HIV_IIIB bei MOI von 1 × 10^–2 TCID₅₀ pro Milliliter infiziert.
Simian Immunodeficiency Virus (SIV) gehört zur Familie Retroviridae (Unterfamilie Lentivirinae) und ist eng verwandt mit den Human Immunodeficiency Virus-Typen 1 und 2 (HIV-1 und HIV-2), den etiologischen Agentien von AIDS. Ursprünglich in 1985 berichtet, wurde das erste Isolat aus einem Rhesus-Macaque Simian-T-Iymphotropisches Virus III (STLV-III) genannt. Der SIVmac239-virale Stamm (Nachstehend SIV₂₃₉; P. Johnson, Harvard Medical School, Boston, MA, USA), der in diesen Untersuchungen verwendet wurde, ist ein dual-tropischer infektiöser Virus, der in Rhesus Macaque-Affen AIDS induziert. SHIV_Ku-1 (Narayan und Joag, AIDS Research and Reference Program, Division of AIDS, NIADS, Bethesda, MD, USA) ist ein zweiter dual-tropischer Stamm von SIV, der in diesen Untersuchungen verwendet wurde. SHIV_Ku-1 ist eine biologisch reine Suspension von SHIV, die in Pigtailed-Macaquen stark pathogen ist. Dieser Virus wurde durch sequentiellen Hindurchgang des molekularen Konstrukts von SIV(mac)239XHIV-1-HxB2 durch Knochenmark von Pigtailed-Macaque-Affen abgeleitet (Joag et al., J. VIROLOGY, 70: 3189–3197 (1996)).
Der Zelltropismus von SIV in einer Kultur hängt teilweise vom Starrem des vermehrten Virus lind den Bedingungen der Zellkultur ab. In den vorliegenden Untersuchungen wurde die Macaque-T-Zelllinie SEM-174 Zellen akut mit entweder SIV₂₃₉ oder SHIV_Ku-1 bei MOI von 1 × 10^–2 TCID₅₀ pro Milliliter infiziert.
Wie in 3B gezeigt, inhibierte R-ATIII X4-Virus mit einer halb-maximalen Inhibition (ID₅₀) bei ca. 25 μg/ml. S-ATIII war potenter als R-ATIII und zeigte bei einer ID₅₀ bei 10 μg/ml (~3 E/ml) eine Aktivität, die mit der CD8⁺-T-Zell-modifizierten Form von ATIII vergleichbar ist (3B). Dies ähnlich zum ID₅₀ (5,5 μg/ml), die für mATIII bestimmt wurde und mit 130 nM ähnlich zu der ist, die für Stromal-Derived-Faktor (SDF-1) gefunden wurde, dem einzigen natürlich auftretenden Liganden, der den CXCR4-Co-Rezeptor bindet (Leiben-Lynn et al., J. VIROL., 75: 8306–16 (2001)).
Wie in 4 gezeigt, war S-ATIII- und R-ATIII-vermittelte antivirale Aktivität gegenüber einer Inaktivierung durch Hitzebehandlung resistent, sowie prälatentes ATIII inhibierte X4-HIV-Infaktiosität (4A). ATIII-vermittelte antiretrovirale Aktivität wurde nicht durch Cytotoxizität hervorgerufen, weil ATIII-Behandlung die Zellfähigkeit oder das Zellwachstum nicht beeinträchtigte, wie dies durch Trypanblau-Ausschluß beurteilt wurde (Daten nicht angegeben). Bei einer Konzentration von 50 μg/ml (15 E/ml) inhibierte S-ATIII SIV- und HSIV-Infektiösität um 92 bzw. 91% (4B). R-ATIII inhibierte die Simianretroviralen Stämme in einen geringeren Ausmaß mit einer 36- bzw. 57%igen Unterdrückung des SIV-Kernproteins (p27) (4B).
Dieses gereinigte Protein wies eine ähnliche Molekülgröße auf, war aber nicht das gleiche wie der vorher beschriebene CD8⁺-T-Zellen-antivirale Faktor CAF (Levy et al., IMMUNOL. TODAY, 17: 217–24 (1996)). Das heißt, das gereinigte ATIII-ähnliche Protein der vorliegenden Erfindung ist in der Größe ähnlich zu CAF und in seiner Fähigkeit zur Inhibierung von X4-Viren, aber im Hinblick auf die Hitzestabilität verschieden (Geiben-Lynn et al., J. VIROL., 75: 8306–16 (2001)). CAF wurde auf molekularem Niveau nicht definiert, sondern nur als unfraktionierter Überstand getestet. Die anti-HIV-Aktivität von CAF kann mehrere Faktoren wiederspiegeln, die mit verschiedenen Punkten der Inhibierung im Lebenszyklus von HIV beteiligt sind.
Gereinigtes CD8⁺-T-Zellen-ATIII ist molekular von ATIII verschieden. Natives, unmodifziertes ATIII weist ein Molekulargewicht von 54 bis 65 kDa auf, während das der gereinigten ATIII-Form-CD8⁺-T-Zellen durch SDS-PAGE-Analyse festgestellt, 43 kDa betrug. Gereinigtes CD8⁺-T-Zellen-ATIII ist kleiner als das S-ATIII und eluiert aus einer Heparin-Sepharose-Säule bei einer niedrigeren Salzkonzentration (350 nM NaCl versus 1 M NaCl). Gereinigtes CD8⁺-T-Zellen-ATIII ist auch kleiner als R-ATIII und dissoziiert nicht unter in SDS-PAGE verwendeten reduzierenden Bedingungen. Schließlich zeigten gereinigtes CD8⁺-T-Zellen-ATIII und prälatentes ATIII eine ähnliche anti-HIV-Potenz in vitro, unterscheiden sich aber im Molekulargewicht.
Unter den Bedingungen einer Enzym-Vorbehandlung digestiert V8-Protease vorzugsweise die Heparinbindende Domäne von ATIII. Das Fehlen einer antiretroviralen Aktivität in ATIII in einem mit V8-Protease vorbehandelten ATIII-Präparat legt deshalb nahe, dass die Heparin-bindende Domäne von ATIII wichtig für die antivirale Aktivität ist (4A). Es wird gezeigt, dass ATIII an die Syndekan-Familie der Proteoglykane bindet, die diese biologischen Aktivitäten vermitteln kann. In dieser Hinsicht weisen HIV, SIV und SHIV ein Erfordernis für Syndekane zur Anlagerung auf, das einen HIV/SIV-Eintritt in Zellen erleichtert (Valen zuela-Fernandez et al., J. BIOL. CHEM., 276: 26550–8 (2001); Saphire et al., J. VIROL., 75: 9187–200 (2001)). ATIII scheint mit der HIV-Syndekan-Bindungsdomäne in Wechselwirkung zu treten, und ATIII inhibiert damit den HIV-Eintritt in Zellen, was mit anderen Wegen synergistisch sein könnte. ATIII und andere Serin-Protease-Inhibitoren offerieren das Potential für eine verbesserte Wirksamkeit und verringerte Toxizität bei der Behandlung von HIV und anderen Viruskrankheiten.
II. Verwendung der vorliegenden Erfindung zur Behandlung, Vorbeugung und Bestimmung einer retroviralen Infektion
Die Erfindung umfasst die Verwendung einer Zusammensetzung, die im wesentlichen gereinigtes ATIII aufweist. ATIII ist dazu fähig, die Infektiösität von HIV, wie hier beschrieben, zu inhibieren, und ist deshalb in Verfahren zur Vorbeugung einer HIV-Infektion in einem Patienten oder zur Inhibierung der Infektiösität von HIV-enthaltenden Körperfluiden brauchbar. Das in der vorliegenden Erfindung zu verwendende ATIII ist nicht besonders beschränkt, solange es auf ein Ausmaß gereinigt wurde, dass es als pharmazeutisches Mittel verwendet werden kann. Es kann z. B. aus Vollblut, Blutplasma, Serum oder durch Kompression von geronnenem Blut erhaltenen Serum gereinigt werden. Das Ausgangsmaterial zur Herstellung von ATIII kann z. B. Fraktion IV-1 oder IV, oder der Überstand I oder II + III, erhalten durch Cohn's Fraktionierung von Blutplasma, sein. ATIII kann auch z. B. durch E. coli-Zellkultur (z. B. EP 339 919 , Isahiko et al.), Gentechnik (z. B. EP-90505 , Botsuku und Roon), transgenes Tier (Larrik und Thomas, CURR. OPIN. BIOTECHNOL., 12: 41111–41118 (2001); Edmunds et al., BLOOD, 12: 4561–4571 (1998)) und dergleichen hergestellt werden. Alternativ kann ein handelsüblich erhältliches ATIII-Präparat verwendet werden. Zusammensetzungen, die im wesentlichen gereinigtes ATIII umfassen, können ATIII allein oder in Kombination mit anderen Proteinen enthalten. ATIII kann wesentlich gereinigt sein durch irgendeines der für einen Fachmann auf diesem Gebiet bekannten Verfahren. Im wesentlichen reines Protein kann durch die folgenden bekannten Verfahren zur Proteinreinigung gereinigt werden, wobei ein immunologischer, chromatographischer, enzymatischer oder anderer Assay verwendet wird, um die Reinigung in jeder Stufe des Verfahrens zu verfolgen. Protein-Reinigungsverfahren sind auf diesem Gebiet allgemein bekannt und werden z. B. beschrieben bei Deutscher et al., GUIDE TO PROTEIN PURIFICATION, Harcourt Brace Jovanovich, San Diego (1990). ATIII kann nach einem Verfahren gereinigt werden, das z. B. beschrieben ist in US-Patent Nr. 3 842 061 (Anderson et al.) und US-Patent Nr. 4 340 589 (Uemura et al.).
In einer Ausführungsform ist das erfindungsgemäße ATIII eine Komponente einer pharmazeutischen Zusammensetzung, die auch Puffer, Salze, andere Proteine oder andere Bestandteile, die als pharmazeutische Zusammensetzung annehmbar sind, enthalten kann. Die Erfindung umfasst auch eine modifizierte Form von ATIII, die dazu fähig ist, HIV zu kontaktieren und die Infektiösität von HIV, wie hier beschrieben, zu inhibieren. Das modifizierte ATIII kann als Komponente einer Zusammensetzung zur Verwendung der im Verfahren zur Vorbeugung der HIV-Infektion eines Patienten oder zur Inhibierung einer HIV-Infektiösität biologischer Fluide verwendet werden.
Das erfindungsgemäße ATIII kann ein Molekül sein, das das Protein allein umfasst, oder andere Komponente umfassen kann, wie z. B. ein Protein oder ein anderes Kohlehydrat oder ein anderes Molekül, das kovalent an ATIII gebunden sein kann, oder nicht-kovalent mit ATIII verbunden sein kann.
Das erfindungsgemäße ATIII kann durch enzymatische Digestion oder chemische Behandlung eines Gesamt-Protein-ATIII gebildet werden. Chemische Behandlungsmethoden können z. B. umfassen einen Digestion unter Verwendung milder saurer Hydrolyse, eine Behandlung mit 0,9 M Guanidin (Carrell et al., NATURE, 353: 576–8 (1991)) oder Inkubieren von S-ATIII in 0,25 mM Trinatriumcitrat bei 60°C während 18 Stunden (Wardell et al., BIOCHEMISTRY, 36: 13133–42 (1997)). Enzymatische Digestionsmethoden können z. B. umfassen eine Digestion unter Verwendung einer Elastase oder anderen Protease. Enzymatische Digestionsmethoden können auch z. B. umfassen eine Digestion unter Verwendung einer spezifischen Exoglykosidase (z. B. Neuraminidase, Mannosidase, Fucosidase) oder einer spezifischen Endoglykosidase (z. B. N-Glykanase, O-Glykanase).
In einer anderen Ausführungsform kann das erfindungsgemäße ATIII hergestellt werden unter Verwendung eines biochemischen Syntheseverfahrens. Biochemische Verfahren zur Synthese von Proteinen sind für einen Fachmann auf diesem Gebiet allgemein bekannt.
Die Fähigkeit, ein HIV-Virion zu kontaktieren, kann unter Verwendung von Assays, die hier im Beispielabschnitt beschrieben sind, bewertet werden. Der Virus kann z. B. mit dem Molekül, das ein erfindungsgemäßes ATIII umfasst, inkubiert werden, auf ein Sucrose-Kissen gegeben werden und zentrifugiert werden. Das erhaltene Virus-Pellet wird resuspendiert, mit Trichloressigsäure (TCA) zur Konzentration der Proteine konzentriert, und aliquote Teile des Pellets und des Überstands werden durch Western-Blotting unter Verwendung von Antikörpern gegenüber p24 analysiert (Nagashurmugam und Friedman, DNA CELL BIOL., 15: 353–61 (1996)) oder durch ein ELISA-Verfahren.
In einer weiteren Ausführungsform ist das das erfindungsgemäße ATIII umfassende Molekül dazu fähig, die Infektiösität von HIV in einem Patienten durch Kontaktieren eines HIV-Virions zu inhibieren. Das das erfindungsgemäße ATIII umfassende Molekül ist als Komponente in einer pharmazeutischen Zusammensetzung vorhanden, die einem Patienten verabreicht werden kann, um die HIV-Infektiösität zu inhibieren oder einer Infektion durch HIV vorzubeugen. Die Inhibierung der Infektiösität von HIV durch das Molekül, das das erfindungsgemäße ATIII umfasst, kann, wie hier beschrieben, bewertet werden. Solche Verfahren können umfassen p24-Assay, reverse Transkriptase-Aktivitätsassay oder TCID₅₀.
Die Erfindung umfasst auch einen Antkörper, der dazu fähig ist, spezifisch an ATIII zu binden. Der Antikörper der Erfindung kann ein monoklonaler oder ein polyklonaler Antikörper sein, oder er kann ein synthetischer, humanisierter oder Phagen-Antikörper (phage displayed antibody) sein. Antikörper können intakte Immunoglobuline sein, die aus natürlichen Quellen oder aus rekombinanten Quellen abgeleitet sind und können immunoreaktive Teile intakter Immunoglobuline sein. Antikörper sind typischerweise Tetramere von Immunoglobulinmolekülen. Die Antikörper der vorliegenden Erfindung können in einer Vielzahl von Formen existieren, einschließlich von z. B. polyklonalen Antikörpern, monoklonalen Antikörpern, Fv, Fab und F(ab)₂, sowie als einzelkettige Antikörper und humanisierte Antikörper (Harlow et al., 1988, ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL, Cold Sprin Harbor, N. Y.; Houston et al., PROC. NATL. ACAD. SCI. USA, 85: 5879–83 (1988); Bird et al., SCIENCE, 242: 423–6 (1988)). Durch den Ausdruck "synthetischer Antikörper", wie er hier verwendet wird, wird ein Antikörper verstanden, der unter Verwendung einer rekombinanten DNA-Technologie gebildet wird, wie z. B. ein wie hier beschrieben durch einen Bakteriophagen exprimierter Antikörper. Der Ausdruck sollte auch die Bedeutung eines Antikörpers umfas sen, der durch Synthese eines DNA-Molekuls, das den Antikörper kodiert, gebildet wurde, worin das DNA-Molekül ein Antikörper-Protein exprimiert, oder der Aminosäuresequenz, die den Antikörper spezifiziert, worin die DNA oder Aminosäuresequenz unter Verwendung synthetischer DNA oder eine Aminosäuresequenz-Technologie erhalten wurde, die verfügbar und auf diesem Gebiet allgemein bekannt ist.
Die Erfindung umfasst auch einen Kit zum Bestimmen eines Proteins, das die Infektiösität von HIV inhibiert. Die Proteine umfassen ATIII. Der erfindungsgemäße Kit kann z. B. sein ein ELISA-Kit, der einen Antikörper, ein Bestimmungsreagens und eine Reaktionsoberfläche aufweist. In einer Ausführungsform ist der Antikörper ein erfindungsgemäßer Antikörper, der spezifisch mit ATIII bindet. Der Antikörper kann irgendein Typus des hier beschriebenen Antikörpers sein und kann unter Verwendung irgendeiner hier beschriebenen Methode gebildet werden. Die Reaktionsoberfläche kann eine Mikrotiterplatte sein, wie z. B. eine ELISA-Platte. Das Bestimmungsreagens kann irgendein Bestimmungsreagens sein, das für einen Fachmann auf diesem Gebiet bekannt ist. Das Bestimmungsreagens kann z. B. ein Enzym oder ein Radionucleotid sein. In einer Ausführungsform ist der erfindungsgemäße Kit ein ELISA-Kit zur Bestimmung des Vorhandenseins von ATIII in einem Körperfluid, z. B. einem Serum, eines menschlichen Patienten.
Der Kit kann eine Mikrotiterplatte, einen Antikörper, der dazu fähig ist, spezifisch ATIII zu binden, und ein sekundäres Enzym, das dazu fähig ist, den erfindungsgemäßen Antikörper zu binden, und auch Meerrettichperoxidase umfassen. Der erfindungsgemäße ELISA-Kit kann z. B. verwendet werden, um einen ELISA-Assay eines Körperfluids eines Patienten, z. B. einer Serumprobe, durchzuführen. Der Assay kann verwendet werden, um im Serum eines Patienten vorhandenes ATIII zu bestimmen und zu quantifizieren. Die Menge an ATIII im Patientenserum kann mit der Fähigkeit des Patientenserums, die Infektiösität von HIV zu inhibieren, korreliert werden.
In einer anderen Ausführungsform ist der erfindungsgemäße Kit ein Western-Blotting- oder Dot-Blotting-Kit zur Bestimmung des Vorhandenseins von ATIII in einem Körperfluid, wie z. B. einem Serum, eines menschlichen Patienten.
Die erfindungsgemäßen Kits können z. B. verwendet werden, um die Neigung eines Patienten gegenüber einer HIV-Infektion zu bewerten. Patienten mit einer hohen Neigung gegenüber einer HIV-Infektion aufgrund geringer Spiegel von ATIII können mit einer der pharmazeutischen Zusammensetzungen der Erfindung behandelt werden, um die Resistenz dieser Individuen gegenüber einer HIV-Infektion zu erhöhen. Die Korrelation zwischen den ATIII-Spiegeln und der Fähigkeit eines Patienten, die Infektiösität von HIV zu inhibieren, wird unter Verwendung der in den hier angegebenen experimentellen Beispielen beschriebenen Verfahren aufgestellt.
Die Erfindung umfasst auch ein Verfahren zur Inhibierung der Infektiösität von HIV in Körperfluiden, oder in infektiösen Mundsekreten. Das Verfahren ist brauchbar zur Vorbeugung einer HIV-Infektion oder zur Inhibierung der Infektiösität von HIV. Das Verfahren kann z. B. verwendet werden, um die Infektiösität biologischer Fluide, z. B. in einer Krankenhausabteilung, wo medizinisches Personal infektiösen HIV-Sekreten ausgesetzt ist, zu inhibieren.
In einer anderen Ausführungsform umfasst das Verfahren das Kontaktieren eines HIV-Virions mit den hier beschriebenen ATIII-Zusammensetzungen. In einer Ausführungsform kann die ATIII-Zusammensetzung im wesentlichen gereinigtes ATIII umfassen. Die Probe von einem Patienten, die das HIV-Virion enthält, kann erhalten werden aus irgendeiner Probe von Körperfluid, wie z. B. Blatt, Plasma, Serum, Samen, Zervix-Sekreten, Speichel, Urin, Frauenmilch oder amniotischen Fluiden. In einer Ausführungsform wird eine Zusammensetzung, die im wesentlichen gereinigtes ATIII enthält, mit einem HIV-Virion aus einer Patientenprobe während eines Zeitraums in Kontakt gebracht, der für das ATIII ausreicht, um die Infektiösität von HIV zu inhibieren. Die Inhibierung der Infektiösität von HIV kann wie hier in den Beispielen beschrieben bewertet werden.
In einer anderen Ausführungsform umfasst das Verfahren zur Inhibierung der Infektiösität von HIV das in Kontakt bringen eines aus einer Körperfluidprobe eines Patienten erhaltenen HIV-Virions mit einer Zusammensetzung, die eine Oberfläche aufweist, die ein im wesentlichen gereinigtes humanes ATIII mit der Oberfläche verbunden enthält. Beispiele für solche Oberflächen umfassen Kunststoff oder andere Polymeroberflächen, die gegenüber einer Reaktion mit Körperfluid inert sind und als biokompatibel betrachtet werden. In einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird die Zusammensetzung, die im wesentlichen gereinigtes humanes ATIII mit der Oberfläche verbunden aufweist, mit einem Körperfluid eines Patienten oder einer infektiösen Oralsekretion, die ein HIV-Virion enthält, in Kontakt gebracht. Die Zusammensetzung wird mit der Körperfluidprobe, die das HIV-Virion enthält, während eines Zeitraums in Kontakt gebracht oder inkubiert, die ausreicht, um die Infektiösität von HIV zu inhibieren. Die Inhibierung der Infektiösität von HIV kann wie hier im Beispielabschnitt beschrieben bewertet werden. Parameter, die zur Bewertung der HIV-Replikation verwendet werden, wie z. B. das Vorhandensein oder die Abwesenheit spezifischer HIV-Komponenten, wie z. B. Nucleinsäure oder Protein, und im letzteren Fall die Aktivität von spezifischen HIV-Komponenten, wie z. B. reverse Transkriptase, können verwendet werden, um die Inhibierung von HIV in einer Probe zu bewerten.
Die Erfindung umfasst die Herstellung und die Verwendung von pharmazeutischen Zusammensetzungen, die eine Verbindung, die zur Vorbeugung einer HIV-Infektion oder Inhibierung der HIV-Infektiösität geeignet ist, als Wirkstoff enthalten. Eine solche pharmazeutische Zusammensetzung kann aus dem Wirkstoff allein in einer zur Verabreichung an ein Individuum geeigneten Form bestehen, oder die pharmazeutische Zusammensetzung kann den Wirkstoff und einen oder mehrere pharmazeutisch annehmbare Träger, einen oder mehrere zusätzliche Bestandteile oder eine Kombination davon enthalten. Der Wirkstoff kann in der pharmazeutischen Zusammensetzung in Form eines physiologisch annehmbaren Esters oder Salzes vorhanden sein, wie z. B. in Kombination mit einem physiologisch annehmbaren Kation oder Anion, wie dies auf diesem Gebiet allgemein bekannt ist. Das in der vorliegenden Erfindung verwendete ATIII (oder ein biologisch aktives Analog davon) kann pharmakologisch annehmbare Additive (z. B. Trägersubstanzen, Exzipientien und Verdünner), Stabilisatoren oder Komponenten enthalten, die zur Formulierung von Präparaten erforderlich sind, und die üblicherweise für pharmazeutische Produkte verwendet werden, solange dies die Aufgabenstellung der vorliegenden Erfindung nicht nachteilig beeinflusst.
Beispiele für die Additive und Stabilisatoren umfassen Saccharide, wie z. B. Monosaccharide (z. B. Glucose und Fructose), Disaccharide (z. B. Sucrose, Lactose und Maltose) und Zuckeralkohole (z. B. Mannitol und Sorbitol); organische Säuren, wie z. B. Citronensäure, Maleinsäure und Weinsäure und Salze davon (z. B. Natriumsalz, Kaliumsalz und Calciumsalz); Aminosäuren, wie z. B. Glycin, Asparaginsäure und Glutamin säure und Salze davon (z. B. Natriumsalz); oberflächenaktive Mittel, wie z. B. Polyethylenglykol, Polyoxyethylen/Polyoxypropylen-Copolymer und Polyoxyethylensorbitanfettsäureester; Heparin; und Albumin. Die Formulierungen der hier beschriebenen pharmazeutischen Zusammensetzungen können nach irgendeiner bekannten oder gemäß einer auf dem Gebiet der Pharmakologie entwickelten Methode wurden, hergestellt werden. Im allgemeinen umfassen solche Herstellungsverfahren die Stufe des in Verbund bringen mit einem Träger oder einem oder mehreren anderen Hilfsmitteln, und dann, wenn erforderlich oder gewünscht, Formen oder Verpacken des Produkts in eine gewünschte Einzel- oder Mehrfachdosis.
Obwohl die Beschreibungen der hier angegebenen pharmazeutischen Zusammensetzungen im Prinzip auf pharmazeutische Zusammensetzungen gerichtet sind, die für eine verschreibungspflichtige Verabreichung an Menschen geeignet sind, ist es für einen Fachmann auf diesem Gebiet verständlich, dass solche Zusammensetzungen im allgemeinen auch zur Verabreichung an Tiere aller Sorten geeignet sind. Die Modifizierung von pharmazeutischen Zusammensetzungen, die zur Verabreichung an Menschen geeignet sind, um die Zusammensetzungen zur Verabreichung an verschiedene Tiere geeignet zu machen, ist allgemein bekannt, und ein Veterinärpharmakologe kann solche Modifikationen mit üblichen, wenn überhaupt, experimentellen Versuchen gestalten und durchführen. Individuen, für die eine Verabreichung der pharmazeutischen Zusammensetzungen der Erfindung beabsichtigt ist, umfassen ohne darauf beschränkt zu sein, Menschen und andere Primaten.
Pharmazeutische Zusammensetzungen, die in den erfindungsgemäßen Verfahren geeignet sind, können in Formulierungen hergestellt, verpackt oder vertrieben werden, die für einen oralen, rektalen, vaginalen, parenteralen, topischen, pulmonaren, intranasalen, bukkalen, ophthalmischen oder anderen Verabreichungsweg geeignet sind. Die bevorzugte Art ist eine intravenöse Verabreichung.
Das ATIII und die vorstehend genannten Bestandteile werden wie zweckmäßig gemischt, um ein Pulver, Granulat, Tablette, Kapsel, Sirup, Injektionslösung oder dergleichen zu ergeben. Andere in Erwägung gezogene Formulierungen umfassen Nanopartikel, liposomale Präparate, verschlossene Erythrozyten, die den Wirkstoff enthalten, und Formulierungen auf immunologischer Basis.
Eine erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung kann als Produkt als solches, als Einzeldosis oder als Vielzahl von Einzeldosen, hergestellt, verpackt oder vertrieben werden. Der hier verwendete Ausdruck "Einzeldosis" ist eine bestimmte Menge der pharmazeutischen Zusammensetzung, die eine bestimmte Menge des Wirkstoffs enthält. Die Menge des Wirkstoffs ist im allgemeinen gleich der Dosierung des Wirkstoffs, die an ein Individuum verabreicht wird, oder ein zweckmäßiger Bruchteil einer solchen Dosierung, wie z. B. die Hälfte oder ein Drittel einer solchen Dosierung.
Die relativen Mengen des Wirkstoffs, des pharmazeutisch annehmbaren Trägersund irgendwelcher zusätzlicher Bestandteile in einer pharmazeutischen Zusammensetzung der Erfindung wird abhängig von der Identität, Größe und dem Zustand des behandelten Individuums variieren, und außerdem vom Weg abhängen, auf dem die Zusammensetzung verabreicht werden soll. Als Beispiel kann die Zusammensetzung zwischen 0,1 und 100% (Gew./Gew.) aktiven Wirkstoff enthalten.
Zusätzlich zum aktiven Wirkstoff kann eine erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung ferner ein oder mehrere zusätzliche pharmazeutisch wirksame Mittel enthalten.
Besonders in Erwägung gezogene zusätzliche Mittel umfassen Anti-Emetika und Einfangmittel, wie z. B. Cyanid- und Cyanat-Einfangmittel. Formulierungen zur kontrollierten oder verzögerten Abgabe einer pharmazeutischen Zusammensetzung der Erfindung können unter Verwendung konventioneller Verfahren hergestellt werden.
Eine Formulierung einer pharmazeutischen Zusammensetzung der Erfindung, die zur oralen Verabreichung geeignet ist, kann in Form einer bestimmten festen Dosiseinheit, einschließlich, aber nicht beschränkt darauf, einer Tablette, einer Hart- oder Weichkapsel, einer Oblatenkapsel, einer Pastille oder einer Lutschtablette, hergestellt, verpackt oder vertrieben werden, von denen jede eine bestimmte Menge des Wirkstoffs enthält. Andere für eine orale Verabreichung geeignete Formulierungen umfassen, ohne darauf beschränkt zu sein, eine pulverförmige oder granulatförmige Formulierung, eine wässerige oder ölige Suspension oder eine wässerige oder ölige Lösung, oder eine Emulsion.
Eine Tablette, die den Wirkstoff enthält, kann z. B. hergestellt werden durch Komprimieren oder Formen des Wirkstoffs, gegebenenfalls mit einem oder mehreren zusätzlichen Bestandteilen. Komprimierte Tabletten können hergestellt werden durch Komprimieren des Wirkstoffs in einer geeigneten Vorrichtung, in freifließender Form, z. B. als Pulver oder Granulat, gegebenenfalls gemischt mit einem oder mehreren Bindemitteln, Schmiermitteln, Exzipientien, oberflächenaktiven Mitteln und Dispersionsmitteln. Geformte Tabletten können hergestellt werden durch Formen in einer geeigneten Vorrichtung, einer Mischung des Wirkstoffs, eines annehmbaren Trägers und mindestens einer ausreichenden Menge an Flüssigkeit, um die Mischung zu befeuchten. Pharmazeutisch annehmbare Exzipientien, die bei der Herstellung von Tabletten verwendet werden, umfassen, ohne darauf beschränkt zu sein, inerte Verdünner, Granulier- und Zerfallsmittel, Bindemittel und Schmiermittel. Bekannte Dispersionsmittel umfassen, ohne darauf beschränkt zu sein, Kartoffelstärke und Natriumstärkeglykolat. Bekannte oberflächenaktive Mittel umfassen, ohne darauf beschränkt zu sein, Natriumlaurylsulfat. Bekannte Verdünner umfassen, ohne darauf beschränkt zu sein, Calciumcarbonat, Natriumcarbonat, Lactose, mikrokristalline Cellulose, Calciumphosphat, Calciumhydrogenphosphat und Natriumphosphat. Bekannte Granulier- und Zerfallsmittel umfassen, ohne darauf beschränkt zu sein, Maisstärke und Alginsäure. Bekannte Bindemittel umfassen, ohne darauf beschränkt zu sein, Gelatine, Akaziengummi, prä-gelatinisierte Maisstärke, Polyvinylpyrrolidon und Hydroxypropylmethylcellulose. Bekannte Schmiermittel umfassen, ohne darauf beschränkt zu sein, Magnesiumstearat, Stearinsäure, Siliciumdioxid und Talk. Tabletten können nicht beschichtet sein oder sie können unter Verwendung bekannter Methoden beschichtet sein, um einen verzögerten Zerfall im Gastrointestinaltrakt eines Individuums zu erreichen, wodurch eine verzögerte Freigabe und Absorption des Wirkstoffs bereitgestellt wird. Beispielhaft kann ein Material, wie z. B. Glycerinmonostearat oder Glycerindistearat, verwendet werden, um Tabletten zu beschichten. Beispielhaft können Tabletten beschichtet werden unter Verwendung von in US-Patent Nr. 4 256 108 (Theeuwes), 4 160 452 (Theeuwes) und 4 265 874 (Bonsen et al.) beschriebenen Methoden, um osmotisch kontrollierte Freisetzungstabletten zu bilden. Tabletten können ferner ein Süßmittel, ein Geschmacksmittel, ein Farbmittel, ein Konservierungsmittel oder eine Kombination davon umfassen, um ein pharmazeutisch schönes und schmackhaftes Präparat herzustellen.
Hartkapseln, die den Wirkstoff umfassen, können hergestellt werden unter Verwendung einer physiologisch abbaubaren Zusammensetzung, wie z. B. Gelatine. Solche Hartkapseln umfassen den Wirkstoff und können ferner zusätzliche Bestandteile umfassen, einschließlich von z. B. einem inerten festen Verdünnungsmittel, wie z. B. Calciumcarbonat, Calciumphosphat oder Kaolin.
Weichgelatinekapseln, die den Wirkstoff umfassen, können hergestellt werden unter Verwendung einer physiologisch abbaubaren Zusammensetzung, wie z. B. Gelatine. Solche Weichkapseln umfassen den Wirkstoff, der mit Wasser oder einem öligen Medium, wie z. B. Erdnussöl, flüssigem Paraffin oder Olivenöl, gemischt sein kann.
Flüssige Formulierungen einer pharmazeutischen Zusammensetzung der Erfindung, die zur oralen Verabreichung geeignet sind, können entweder in flüssiger Form oder in Form eines trockenen Produkts, das zur Rekonstitution mit Wasser oder einem anderen geeigneten Träger vor der Verwendung dienen soll, hergestellt, verpackt und vertrieben werden.
Flüssige Suspensionen können hergestellt werden unter Verwendung konventioneller Methoden, um Suspensionen des Wirkstoffs in einem wässerigen oder öligen Vehikel zu erhalten. Wässerige Vehikel umfassen z. B. Wasser und isotonische Salzlösung. Ölige Vehikel umfassen z. B. Mandelöl, ölige Ester, Ethylalkohol, Pflanzenöle, wie z. B. Arachis-, Oliven-, Sesam- oder Kokosnussöl, fraktionierte Pflanzenöle und Mineralöle, wie z. B. flüssiges Paraffin. Flüssige Suspensionen können ferner einen oder mehrere zusätzliche Bestandteile umfassen, einschließlich von, aber nicht darauf beschränkt, Suspendiermitteln, Dispergier- oder Netzmitteln, Emulgiermitteln, Milderungsmitteln, Konservierungsmitteln, Puffern, Salzen, Geschmacksmitteln, Farbmitteln und Süßmitteln. Ölige Suspensionen können ferner ein Verdickungsmittel enthalten. Bekannte Suspendiermittel umfassen, ohne darauf beschränkt zu sein, Sorbitolsirup, hydrierte essbare Fette, Natriumalginat, Polyvinylpyrrolidon, Tragantgummi, Akaziengummi und Cellulose-Derivate, wie z. B. Natriumcarboxymethylcellulose, Methylcellulose, Hydroxypropylcellulose. Bekannte Dispergier- oder Netzmittel umfassen, ohne darauf beschränkt zu sein, natürlich vorkommende Phosphatide, wie z. B. Lecithin, Kondensationsprodukte eines Alkylenoxids mit einer Fettsäure mit einem langkettigen aliphatischen Alkohol, mit einem von einer Fettsäure und einem Hexitol abgeleiteten Partialester oder mit einem von einer Fettsäure und einem Hexitolanhydrid abgeleiteten Partialester (z. B. Polyoxyethylenstearat, Heptadecaethyienoxycetanol, Polyoxyethylensorbitolmonooleat bzw. Polyoxyethylensorbitanmonooleat). Bekannte Emulgiermittel umfassen, ohne darauf beschränkt zu sein, Lecithin und Akazien. Bekannte Konservierungsmittel umfassen, ohne darauf beschränkt zu sein, Methyl, Ethyl oder n-Propyl-para-hydroxybenzoate, Ascorbinsäure und Sorbinsäure. Bekannte Süßmittel umfassen, ohne darauf beschränkt zu sein, Glycerin, Propylenglykol, Sorbitol, Sucrose und Saccharin. Bekannte Verdickungsmittel für ölige Suspensionen umfassen z. B. Bienenwachs, Hartparaffin und Acetylalkohol. Flüssige Lösungen des Wirkstoffs in wässerigen oder öligen Lösungsmitteln können auf im wesentlichen die gleiche Weise wie flüssige Suspensionen hergestellt werden, wobei der primäre Unterschied der ist, dass der Wirkstoff in dem Lösungsmittel gelöst und nicht suspendiert wird. Flüssige Lösungen der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzung können umfassen jede der im Hinblick auf die flüssigen Suspensionen beschriebenen Komponenten, wobei es verständlich ist, dass Suspendiermittel nicht notwendigerweise die Auflösung des Wirkstoffs im Lösungsmittel unterstützen. Wässerige Lösungsmittel umfassen z. B. Wasser und isotonische Salzlösung. Ölige Lösungsmittel umfassen z. B. Mandelöl, ölige Ester, Ethylalkohol, Pflanzenöle, wie z. B. Arachis-, Oliven-, Sesam- oder Kokosnussöl, fraktionierte Pflanzenöle und Mineralöle, wie z. B. flüssiges Paraffin.
Pulverförmige und granulierte Formulierungen eines erfindungsgemäßen pharmazeutischen Präparats können unter Verwendung bekannter Methoden hergestellt werden. Solche Formulierungen können einem Individuum verabreicht werden, oder können z. B. verendet werden, um Tabletten auszubilden, Kapseln zu füllen oder eine wässerige oder ölige Suspension oder Lösung durch Zugabe eines wässerigen oder öligen Trägers herzustellen. Jede dieser Formulierungen kann ferner ein oder mehrere Dispergier- oder Netzmittel, Suspensionsmittel und Konservierungsmittel umfassen. Zusätzliche Exzipientien, wie z. B. Füller und Süßmittel, Geschmacksmittel oder Farbmittel, können ebenfalls in diesen Formulierungen vorhanden sein. Eine erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung kann auch in Form einer Öl-in-Wasser-Emulsion oder einer Wasser-in-Öl-Emulsion hergestellt, verpackt oder vertrieben werden. Die ölige Phase kann ein Pflanzenöl, wie z. B. Oliven- oder Arachisöl, ein Mineralöl, wie z. B. flüssiges Paraffin oder eine Kombination, sein. Solche Zusammensetzungen können ferner ein oder mehrere Emulgiermittel umfassen, wie z. B. natürlich auftretende Gummi, wie z. B. Akaziengummi oder Tragantgummi, natürlich auftretende Phosphatide, wie z. B. Sojabohnen- oder Lecithinphosphatid, von Kombinationen von Fettsäuren und Hexitolanhydriden abgeleitete Ester oder partielle Ester, wie z. B. Sorbitanmonooleat, und Kondensationsprodukte solcher partieller Ester mit Ethylenoxid, wie z. B. Polyoxyethylensorbitanmonooleat. Diese Emulsionen können auch zusätzliche Bestandteile enthalten, einschließlich von z. B. Süß- oder Geschmacksmitteln.
Eine erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung kann in einer zur rektalen Verabreichung geeigneten Formulierung hergestellt, verpackt oder vertrieben werden. Eine solche Zusammensetzung kann in Form von z. B. einem Suppositorium, einem Retentionseinlaufpräparat und einer Lösung zur Rektal- oder Kolonspülung vorhanden sein.
Suppositorienformulierungen können hergestellt werden durch Kombinieren des Wirkstoffs mit einem nicht-reizenden pharmazeutisch annehmbaren Träger, der bei normaler Temperatur (d. h. ca. 20°C) fest ist, der bei Rektaltemperatur des Individuums (d. h. ca. 37°C in einem gesunden Menschen) flüssig ist. Geeignete pharmazeutisch annehmbare Trägersubstanzen umfassen, ohne darauf beschränkt zu sein, Kakaobutter, Polyethylenglykole und verschiedene Glyceride. Suppositorienformulierungen können ferner verschiedene zusätzliche Bestandteile aufweisen, einschließlich, ohne darauf beschränkt zu sein, Antioxidantien und Konservierungsmitteln.
Retentionseinlaufpräparate oder -lösungen zur Rektal- oder Kolonspülung können hergestellt werden durch Kombinieren des Wirkstoffs mit einem pharmazeutisch annehmbaren flüssigen Träger. Wie dies auf diesem Gebiet allgemein bekannt ist, können Einlaufpräparate verabreicht werden unter Verwendung von, und können verpackt werden innerhalb einer Abgabevorrichtung, die der rektalen Anatomie des Individuums angepasst ist. Einlaufpräparate können ferner verschiedene zusätzliche Bestandteile enthalten, einschließlich von, aber nicht darauf beschränkt, Antioxidantien und Konservierungsmitteln.
Eine erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung kann in einer für eine vaginale Verabreichung geeigneten Form hergestellt, verpackt oder vertrieben werden. Eine solche Zusammensetzung kann in Form von z. B. einem Suppositorium, einem imprägnierten oder beschichteten Vaginal-einführbaren Material, wie z. B. einem Tampon, einem Duschpräparat, einem Gel oder einer Creme oder einer Lösung für eine Vaginalspülung vorhanden sein.
Methoden zum Imprägnieren oder Beschichten eines Materials mit einer chemischen Zusammensetzung sind auf diesem Gebiet bekannt und umfassen, ohne darauf beschränkt zu sein, Methoden der Ablagerung oder des Bindens einer chemischen Zusammensetzung auf eine Oberfläche und Methoden des Einbaus einer chemischen Zusammensetzung in die Struktur eines Materials während der Synthese des Materials (d. h., wie z. B. mit einem physiologisch abbaubaren Material) und Methoden des Absorbierens einer wässerigen oder ölige Lösung oder Suspension in ein absorbierendes Material, mit oder ohne nachfolgendes Trocknen. Duschpräparate oder Lösungen zur Vaginalspülung können hergestellt werden, indem man den Wirkstoff mit einem pharmazeutisch annehmbaren flüssigen Träger kombiniert. Wie dies auf diesem Gebiet allgemein bekannt ist, können Duschpräparate verabreicht werden unter Verwendung von, und können verpackt werden innerhalb, einer Abgabevorrichtung, die der vaginalen Anatomie des Individuums angepasst ist. Duschpräparate können ferner verschiedene zusätzliche Bestandteile umfassen, einschließlich von, ohne darauf beschränkt zu sein, Antioxidantien, Antibiotika, Antipilzmitteln und Konservierungsmitteln. Zusätzliche Verabreichungsmethoden zur Verabreichung von Verbindungen umfassen eine Arzneimittelabgabevorrichtung, wie sie im US-Patent Nr. 5 928 195 (Malamud et al.) beschrieben ist.
Der hier verwendete Ausdruck "parenterale Verabreichung" einer pharmazeutischen Zusammensetzung umfasst irgendeinen Verabreichungsweg, der charakterisiert ist durch physikalisches Durchstoßen eines Gewebes eines Individuums und Verabreichen der pharmazeutischen Zusammensetzung durch den Durchstich im Gewebe. Eine parenterale Verabreichung umfasst deshalb, ohne darauf beschränkt zu sein, die Verabreichung einer pharmazeutischen Zusammensetzung mittels Injektion der Zusammensetzung, durch Applizieren der Zusammensetzung durch einen chirurgischen Schnitt, durch Applizieren der Zusammensetzung durch eine Gewebe-durchdringende nicht-chirurgische Wunde und dergleichen. Eine parenterale Verabreichung wird insbesondere als eine solche angesehen, die, ohne darauf beschränkt zu sein, eine subkutane Intraperitoneale, intramuskuläre, intrasternale Injektion und dialytische Niereninfusionsverfahren umfasst.
Formulierungen einer pharmazeutischen Zusammensetzung, die für eine parenterale Verabreichung geeignet sind, umfassen den Wirkstoff in Kombination mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger, wie z. B. sterilem Wasser oder steriler isotonischer Salzlösung. Solche Formulierungen können in einer für eine Bolusinjektion oder für eine kontinuierliche Verabreichung geeigneten Form hergestellt, verpackt oder vertrieben werden. Injizierbare Formulierungen können in Einheitsdosierungsform, wie z. B. in Ampullen oder in Multi-Dosierbehälter, die ein Konservierungsmittel enthalten, hergestellt, verpackt oder vertrieben werden. Formulierungen zur parenteralen Verabreichung umfassen, ohne darauf beschränkt zu sein, Suspensionen, Lösungen, Emulsionen in öligen oder wässerigen Trägern, Pasten und implantierbare abgabeverzögerte oder bioabbaubare Formulierungen. Solche Formulierungen können ferner ein oder mehrere zusätzliche Bestandteile enthalten, einschließlich von, ohne darauf beschränkt zu sein, Suspendier-, Stabilisier- oder Dispergiermitteln. In einer Ausführungsform einer Formulierung für die parenterale Verabreichung wird der Wirkstoff in trockener (d. h., pulverförmiger oder granulatförmiger) Form zur Rekonstitution mit einem geeigneten Träger (z. B. steriles pyrogenfreies Wasser) vor der parenteralen Administration der rekonstituierten Zusammensetzung bereitgestellt.
Die pharmazeutischen Zusammensetzungen können in Form eine sterilen injizierbaren Lösung oder öligen Suspension oder Lösung hergestellt, verpackt oder vertrieben werden. Diese Suspension oder Lösung kann gemäß bekannter Techniken formuliert werden, und kann zusätzlich zum Wirkstoff zusätzliche Bestandteile enthalten, wie z. B. die hier beschriebenen Dispergiermittel, Netzmittel oder Suspensionsmittel. Eine solche sterile injizierbare Formulierung kann unter Verwendung eines nicht-toxischen parenteral akzeptierbaren Verdünnungs- oder Lösungsmittels, wie z. B. Wasser oder 1,3-Butandiol, hergestellt werden. Andere annehmbare Verdünnungs- und Lösungsmittel umfassen, ohne darauf beschränkt zu sein, Ringer's-Lösung, isotonische Natriumchlorid-Lösung und fettige Öle, wie z. B. synthetische Mono- oder Diglyceride. Andere parenteral verabreichbare Formulierungen, die geeignet sind, umfassen solche, die den Wirkstoff in mikrokristalliner Form in einem liposomalen Präparat oder als Komponente eines bioabbaubaren Polymersystems enthalten. Zusammensetzungen zur verzögerten Freisetzung oder zur Implantation können pharmazeutisch annehmbare Polymere oder hydrophobe Materialien umfassen, wie z. B. eine Emulsion, ein Ionenaustauschharz, ein schwerlösliches Polymer oder ein schwerlösliches Salz.
Für eine topische Verabreichung geeignete Formulierungen umfassen, ohne darauf beschränkt zu sein, flüssige oder halbflüssige Präparate, wie z. B. Linimente, Lotionen, Öl-in-Wasser- oder Wasser-in-Öl-Emulsionen, wie z. B. Cremes, Salben oder Pasten, und Lösungen oder Suspensionen. Topisch verabreichbare Formulierungen können z. B. ca. 1% bis ca. 10% (Gew./Gew.) Wirkstoff umfassen, obwohl die Konzentration des Wirkstoffs so hoch sein kann wie die Löslichkeitsgrenze des Wirkstoffs im Lösungsmittel. Formulierungen für eine topische Verabreichung können ferner einen oder mehrere zusätzliche hier beschriebene Bestandteile enthalten.
Eine erfindungsgemäße pharmazeutische Suspension kann z. B. in einer zur pulmonaren Verabreichung über die Bukkalhöhle geeigneten Formulierung hergestellt, verpackt oder vertrieben werden. Eine solche Formulierung kann trockene Teilchen umfassen, die den Wirkstoff aufweisen und die einen Durchmesser im Bereich von ca. 0,5 bis ca. 7 Nanometer und vorzugsweise von ca. 1 bis ca. 6 Nanometer besitzen. Solche Zusammensetzungen liegen zweckmäßigerweise in Form von trockenen Pulvern zur Verabreichung unter Verwendung einer Vorrichtung vor, die einen Behälter für ein trockenes Pulver aufweist, und in die ein Strom eines Treibmittels gerichtet werden kann, um das Pulver zu dispergieren, oder unter Verwendung eines selbsttreibende Lösungsmittels/Pulver-Abgabebehälters, z. B. einer Vorrichtung, die den Wirkstoff in einem niedrigsiedenden Treibmittel in einem verschlossenen Behälter gelöst oder suspendiert enthält, vorliegen. Vorzugsweise umfassen solche Pulver Teilchen, in denen mindestens 98% der Teilchen (Gewicht) einen Durchmesser von größer als 0,5 Nanometer und mindestens 95% der Teilchen (Zahl) einen Durchmesser von weniger als 7 Nanometer aufweisen. Besonders bevorzugt weisen mindestens 95% der Teilchen (Gewicht) einen Durchmesser von größer als 1 Nanometer und mindestens 90% der Teilchen (Zahl) einen Durchmesser von weniger als 6 Nanometer auf. Trockene Pulverzusammensetzungen umfassen vorzugsweise ein festes feines pulverförmiges Verdünnungsmittel, wie z. B. einen Zucker, und werden zweckmäßigerweise in Einheitsdosisform bereitgestellt.
Niedrigsiedende Treibmittel umfassen im allgemeinen flüssige Treibmittel mit einem Siedepunkt von unter 65°F bei Atmosphärendruck. Im allgemeinen kann das Treibmittel 50 bis 99,9% (Gew./Gew.) der Zusammensetzung ausmachen, und der Wirkstoff kann 0,1 bis 20% (Gew./Gew.) der Zusammensetzung bilden. Das Treibmittel kann ferner zusätzliche Bestandteile aufweisen, wie z. B. ein flüssiges nichtionisches oder festes anionisches oberflächenaktives Mittel oder ein festes Verdünnungsmittel (vorzugsweise mit einer Teilchengröße in der gleichen Ordnung wie die Teilchen, die den Wirkstoff aufweisen).
Erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzungen in einer Formulierung zur pulmonaren Verabreichung können den Wirkstoff auch in Form von Tröpfchen einer Lösung oder Suspension bereitstellen. Solche Formulierungen können als wässerige oder verdünnte alkoholische Lösungen oder Suspensionen, gegebenenfalls steril, die den Wirkstoff aufweisen, hergestellt, verpackt oder vertrieben werden, und werden zweckmäßigerweise unter Verwendung eines Sprühapparats oder Feinstsprühapparats verabreicht. Solche Formulierungen können ferner einen oder mehrere zusätzliche Bestandteile aufweisen, einschließlich von, aber ohne darauf beschränkt zu sein, Geschmacksmitteln, wie z. B. Saccharinnatrium, einem flüchtigen Öl, einem Puffermittel, einem oberflächenaktiven Mittel oder einem Konserviermittel, wie z. B. Methylhydroxybenzoat. Die durch diesen Verabreichungsweg bereitgestellten Tröpfchen weisen vorzugsweise einen mittleren Durchmesser im Bereich von ca. 0,1 bis ca. 200 Nanometer auf.
Die hier beschriebenen zur pulmonaren Verabreichung geeigneten Formulierungen sind auch zur intranasalen Verabreichung einer erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzung brauchbar.
Eine andere Formulierung, die für eine intranasale Verabreichung geeignet ist, ist ein grobes Pulver, das den Wirkstoff enthält und eine mittlere Teilchengröße von ca. 0,5 bis 500 μm aufweist. Eine solche Formulierung kann auf die Weise, in der Schnupftabak aufgenommen wird, verabreicht werden, d. h., durch rasche Inhalation durch den Nasenkanal aus einem nahe an die Nase gehaltenen Behälter des Pulvers.
Zur nasalen Verabreichung geeignete Formulierungen können z. B. so wenig wie ca. 0,1% (Gew./Gew.) und so viel wie ca. 100% (Gew./Gew.) des Wirkstoffs enthalten und können ferner einen oder mehrere hier beschriebene zusätzliche Bestandteile enthalten.
Eine erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung kann in einer für eine bukkale Verabreichung geeigneten Formulierung hergestellt, verpackt oder vertrieben werden. Solche Formulierungen können z. B. in Form von Tabletten oder rautenförmigen Pastillen unter Verwendung konventioneller Methoden vorliegen, und können z. B. 0,1 bis 20% (Gew./Gew.) Wirkstoff aufweisen, wobei der Rest eine oral lösliche oder abbaubare Zusammensetzung und gegebenenfalls einen oder mehrere hier beschriebene zusätzliche Bestandteile aufweist. Alternativ können zur bukkalen Verabreichung geeignete Formulierungen ein Pulver oder eine Lösung oder Suspension, das/die den Wirkstoff aufweist, in Aerosol- oder zerstäubter Form aufweisen. Solche gepulverten oder in Aersolform vorliegenden Formulierungen weisen, wenn sie abgegeben werden, vorzugsweise eine mittlere Teilchen- oder Tropfengröße im Bereich von ca. 0,1 bis ca. 200 Nanometer auf und können ferner einen oder mehrere der hier beschriebenen zusätzlichen Bestandteile enthalten.
Die erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung kann in einer für eine ophthalmische Verabreichung geeigneten Formulierung hergestellt, verpackt oder vertrieben werden. Solche Formulierungen können z. B. in Form von Augentropfen vorliegen, die z. B. 0,1 bis 1,0% (Gew./Gew.) Lösung oder Suspension des Wirkstoffs in einem wässerigen oder öligen flüssigen Träger umfassen. Solche Tropfen können ferner Puffermittel, Salze oder einen oder mehrere der hier beschriebenen zusätzlichen Bestandteile aufweisen. Andere ophthalmische verabreichbare Formulierungen, die geeignet sind, umfassen solche, die den Wirkstoff in mikrokristalliner Form oder in einem Liposomalenpräparat aufweisen.
Die Mischung von ATIII und pharmakologisch annehmbaren Additiven wird vorzugsweise als lyophilisiertes Produkt hergestellt und zum Gebrauch zur Lösung verdünnt. Ein solches Präparat kann zu einer Lösung, die ca. 1 bis 100 Einheiten/ml ATIII enthält, durch Auflösen in destilliertem Wasser zur Injektion oder sterilem gereinigtem Wasser hergestellt werden. Insbesondere wird es so eingestellt, dass es eine physiologische isotonische Salzkonzentration und einen physiologisch wünschenswerten pH-Wert (pH 6 bis 8) aufweist.
Es wurde gezeigt, dass ATIII gut toleriert wird, wenn es in einer Dosis von ungefähr 100 E/kg/Tag verabreicht wird (Warren et al., JAMA, 286: 1869–78 (2001) und weist eine Gesamteliminierungs-Halbwertszeit von 18,6 Stunden auf (Ilias et al., INTENSIVE CARE MEDICIN 26: 7104 bis 7115 (2000)). Obgleich die Dosis abhängig vom Symptom, dem Körpergewicht, dem Geschlecht, der tierischen Spezies und dergleichen geeigneterweise bestimmt wird, beträgt sie im allgemeinen 1 bis 1.000 Einheiten/kg Körpergewicht/Tag, vorzugsweise 10 bis 500 Einheiten/kg Körpergewicht/Tag ATIII für einen erwachsenen Menschen und wird in einer oder mehreren Dosen am Tag verabreicht. Im Fahle einer intravenösen Verabreichung beträgt die Dosis z. B. vorzugsweise 10 bis 100 Einheiten/kg Körpergewicht/Tag. Die Verbindung kann so häufig wie mehrere Male am Tag verabreicht werden, oder sie kann weniger häufig verabreicht werden, z. B. einmal pro Tag, einmal pro Woche, einmal alle 2 Wochen, einmal pro Monat oder sogar weniger häufig, wie z. B. einmal während mehrerer Monate oder sogar einmal im Jahr oder weniger. Die Häufigkeit der Dosierung ist für einen Fachmann auf diesem Gebiet leicht erkennbar und hängt von einer Anzahl von Faktoren ab, wie z. B., ohne darauf beschränkt zu sein, der Art und Schwere der zu behandelnden Erkrankung, der Art und dem Alter des Tieres.
Die vorliegende Erfindung stellt ferner gentechnisch verarbeitete Wirtszellen bereit, die die Polynucleotide, die ATIII oder Analoga von ATIII kodieren, und das ATIII-Polypeptid in einer Menge exprimieren, die ausreicht, um die Infektion der Zelle mit HIV zu inhibieren, enthalten. Ferner stellt die vorliegende Erfindung Verfahren zur Behandlung einer HIV-Infektion in einem Individuum bereit, nachdem in das Individuum eine Zelle eingeführt wird, die ATIII in einer ausreichenden Menge zur Inhibierung der Infektion einer endogenen Zelle des Individuums exprimiert. Solche Wirtszellen können z. B. Nucleinsäuren enthalten, die ATIII kodieren und in die Wirtszelle unter Verwendung bekannter Transformations-, Transfektions- oder Infektionsmethoden eingeführt sind. Die vorliegende Erfindung stellt ferner gentechnisch erhaltene Wirtszellen bereit, um die Polynucleotide von ATIII zu exprimieren, worin solche Polynucleotide in operativem Verbund mit einer regulatorischen Sequenz, die gegenüber der Wirtszelle heterologisch ist, vorliegen, die die Expression der Polynucleotide in der Zeile steuern. Siehe z. B. US-Patent Nr. 4 632 981 (Bock und Lawn) und EP-90505 (Butsuku und Roon).
Die Kenntnis der ATIII-Nucleinsäuresequenzen ermöglicht die Modifikation von Zellen, um eine Expression von endogenem Polypeptid zu ermöglichen oder zu erhöhen. Zellen können modifiziert werden (z. B. durch homologe Rekombination), um eine erhöhte Polypeptid-Expression zu ergeben, indem man den natürlich vorkommenden Promotor durch einen gesamten oder Teil eines heterologen Promotors ersetzt, damit die Zellen das Polypeptid in einem höheren Ausmaß exprimieren. Der heterologe Promotor wird auf eine solche Weise eingeführt, dass er operativ mit den kodierenden Sequenzen verbunden ist. Siehe z. B. PCT International Publication Nr. WO 94/12650 (Hartlein et al.), PCT International Publication Nr. WO 92/20808 (Smithies) und PCT International Publication Nr. WO 91/09955 (Chappel). Es wird auch in Erwä gung gezogen, dass zusätzlich zur heterologen Promotor-DNA amplifizierbare Marker-DNA (z. B. ada, dhfr und das multifunktionale CAD-Gen, das Carbamylphosphat-Synthase, Aspartat-Transcarbamylase und Dihydroorotase kodiert) und/oder Intron-DNA zusammen mit der heterologen Promotor-DNA eingeführt werden kann. Wenn an die kodierende Sequenz gebunden, ergibt die Amplifikation der Marker-DNA durch Standard-Selektionsmethoden eine Co-Amplifikation des gewünschten Proteins, das die Sequenzen in den Zellen kodiert.
Die Wirtszelle kann eine höhere eukaryotische Wirtszelle sein, wie z. B. eine Säugetierzelle, eine niedere eukaryotische Wirtszelle, wie z. B. eine Hefezelle, oder die Wirtszelle kann eine prokaryotische Zelle sein, wie z. B. eine Bakterienzelle. Die Einführung des rekombinanten Konstrukts in die Wirtszelle kann bewirkt werden durch Calciumphosphat-Transfektion, DEAE, Dextran-vermittelte Transfektion oder Elektroporation (Davis et al., BASIC METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY (1986)). Die Wirtszellen, die ATIII-kodierendes Polynucleotid enthalten, können auf konventionelle Weise verwendet werden, um das durch das isolierte Analog oder Fragment (im Fall eines offenen Leserahmens) kodierte Genprodukt zu erzeugen, oder können verwendet werden, um ein heterologes Protein unter der Kontrolle des EMF zu bilden.
Irgendein Wirt/Vektor-System kann verwendet werden, um eine oder mehrere ATIII-Proteinformen zu exprimieren. Potentielle Wirte umfassen, ohne darauf beschränkt zu sein, eukaryotische Wirte, wie z. B. HeLa-Zellen, Cv-1-Zellen, COS-Zellen, 293-Zellen und Sf9-Zellen, sowie prokaryotische Wirte, wie z. B. E. coli und B. subtilis. Die am meisten bevorzugten Zellen sind solche, die normalerweise das bestimmte Polypeptid oder Protein nicht exprimieren, oder die das Polypeptid oder Protein in einem geringen natürlichen Ausmaß exprimieren. Reife Proteine können in Säugetierzellen, Hefe, Bakterien, oder anderen Zellen unter der Kontrolle geeigneter Promotoren exprimiert werden. Zellfreie Translationssysteme können ebenfalls verwendet werden, um unter Verwendung von von den DNA-Konstrukten der vorliegenden Erfindung abgeleiteten RNAs solche Proteine zu bilden. Geeignete Klonier- und Expressionsvektoren zur Verwendung in prokaryotischen und eukaryotischen Wirten werden von Sambrook et al., in MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, SECOND EDITION, COLD SPRING HARBOR, NEW YORK (1989) beschrieben, deren Offenbarung durch Bezugnahme darauf hiermit Bestandteil dieser Beschreibung ist.
Es können auch verschiedene Säugetierzell-Kultursysteme verwendet werden, um rekombinantes ATIII-Protein zu exprimieren. Beispiele für Säugetier-Expressionssysteme umfassen die COS-7-Linien von Affennierenfibroplasten, beschrieben von Gluzman, CELL, 23: 175–82 (1981). Andere Zelllinien, die zur Expression eines kompatiblen Vektors fähig sind, sind z. B. die C127-, Affen-COS-Zellen, Chinese-Hamster-Ovary(CHO)-Zellen, menschliche Nieren-293-Zellen, menschliche epidermale A431-Zellen, menschliche Colo205-Zellen, 3T3-Zellen, CV-1-Zellen, andere transformierte Primat-Zelllinien, normale Diploidzellen, von in vitro-Kulturen primärer Gewebe, primärer Explantate, abgeleitete Zellstämme, HeLa-Zellen, Maus-L-Zellen, BHK-, HL-60-, U937-, Hak- oder Jurkat-Zellen. Säugetier-Expressionsvektoren umfassen einen Replikationsursprung, einen geeigneten Promotor und ebenfalls erforderliche ribosomale Bindungsstellen, Polyadenylierungsstellen, Spleißdonatoren und Akzeptorstellen, Transkriptions-Terminationssequenzen und 5'-flankierende nicht-transkribierbare Sequenzen. Vom SV40-viralen Genom abgeleitete DNA-Sequenzen, z. B. S40-Ursprungs-, frühe Promotor-, Enhancer-, Splice- und Polyadenylierungsstellen, können verwendet werden, um die gewünschten nicht-transkribierten genetischen Elemente bereitzustellen. Rekombinante Polypeptide und Proteine, die in einer Bakterienkultur erzeugt werden, werden üblicherweise durch anfängliche Extraktion aus Zell-Pellets isoliert, gefolgt von ein oder mehreren Aussalz-Stufen, wässeriger Ionenaustausch- oder Größenausschlusschromatographie-Stufen. Protein/Wiederfaltungsstufen können, wenn erforderlich, verwendet werden, um die Konfiguration des reifen Proteins zu vervollständigen. Schließlich kann eine Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) für endgültige Reinigungsstufen verwendet werden. Bei Expression von Proteinen verwendete mikrobielle Zellen können durch irgendein zweckmäßiges Verfahren, einschließlich von Gefrier-Tau-Zyklen, Beschallung, mechanischer Zerstörung oder Verwendung von Zell-Lysiermittlen, zerstört werden.
Die vorliegende Erfindung stellt auch ein Verfahren zur Behandlung einer HIV-Infektion bereit, worin eine ein Serpin, z. B. ATIII oder ein Analog davon, kodierende DNA in eine Zelle eingeführt wird, die für eine HIV-Infektion empfänglich ist, und in einer ausreichenden Menge zur Inhibierung der Infektion der Zelle durch den HIV exprimiert wird. Das heißt, die Erfindung stellt eine Gentherapie zur Behandlung von Retrovirus-induzierten Krankheitszuständen bereit, die Serpin, z. B. ATIII, umfasst. Die Abgabe eines funktionellen Serpin-kodierenden Gens an geeignete Zellen ex vivo, in situ oder in vivo wird unter Verwendung von Vektoren bewirkt, und insbesondere von viralen Vektoren (z. B. Adenovirus, Adeno-verbundenem Virus oder einem Retrovirus), oder ex vivo unter Verwendung von physikalischen DNA-Trasfermethoden (z. B. Liposomen- oder chemische Behandlung). Siehe z. B. Anderson, NATURE, 392 (6679Suppl.): 25–30 (1998); siehe auch Friedmann, SCIENCE, 244: 1275–81 (1989); Verma, SCI. AM., 263: 68–84 (1990); Miller, NATURE, 357: 455–60 (1992). Die Einführung eines ein Serpin kodierenden Gens kann auch durch extrachromosomale Substrate (transiente Expression) oder künstliche Chromosomen (stabile Expression) erzielt werden. Zellen können auch ex vivo in Gegenwart von Serpin kultiviert werden, um eine gewünschte Wirkung auf oder die Aktivität in solchen Zellen zu vermehren oder zu produzieren. Behandelte Zellen können dann in vivo für therapeutische Zwecke eingeführt werden. Alternativ wird in Erwägung gezogen, dass eine Antisense-Therapie oder Gentherapie angewendet werden könnte, um die Expression von erfindungsgemäßen Serpinen negativ zu regulieren.
Andere, die Expression eines Proteins inhibierende, Methoden, umfassen die Einführung von Antisense-Molekülen in erfindungsgemäße Nucleinsäuren, ihre Komplemente oder ihre translatierten RNA-Sequenzen, durch auf diesem Gebiet bekannte Methoden. Die Serpine können ferner unter Verwendung von gezielten Deletionsmethoden oder die Insertion eines negativ regulierenden Elements, wie z. B. eines Silencers, der gewebespezifisch ist, inhibiert werden.
Die vorliegende Erfindung stellt ferner gentechnisch veränderte Zellen im in vivo-Bereich bereit, um Polynucleotide-kodierendes Serpin, z. B. ATIII, zu exprimieren, wobei solche Polynucleotide in operativer Verbindung mit einer regulatorischen, gegen die Wirtszelle heterologen Sequenz, die die Expression der Polynucleotide in der Zelle steuert, vorliegen. Diese Methoden können verwendet werden, um die Expression der Serpin-Polynucleotide zu erhöhen oder zu verringern.
In einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung können Zellen und Gewebe gentechnisch verarbeitet werden, um ein endogenes Gen, das Serpin, z. B. ATIII, umfasst, unter der Kontrolle induzierbarer regulatorischer Elemente zu exprimieren, in welchem Fall die regulatorischen Sequenzen des endogenen Gens durch homologe Rekombination ersetzt sein können. Wie hier beschrieben, kann ein Gen-Targeting verwendet werden, um eine in einem Gen existierende regulatorische Region durch eine aus einem verschiedenen Gen oder einer neuen regulatorischen Sequenz, synthetisiert durch gentechnische Verfahren, zu ersetzen. Solche regulatorischen Sequenzen können aus Promotoren, Enhancern, Gerüst-Anfügungsregionen, negativen regulatorischen Elementen, transkriptionalen Initiationsstellen, regulatorischen Protein-bindenden Stellen oder Kombinationen dieser Sequenzen bestehen. Alternativ können Sequenzen, die die Struktur oder Stabilität der RNA oder des produzierten Proteins beeinträchtigen, ersetzt, entfernt, zugefügt oder auf andere Weise durch Targeting modifiziert werden. Diese Sequenzen umfassen Polyadenylierungssignale, mRNA-Stabilitätselemente, Spleißstellen, Leader-Sequenzen zur Verstärkung oder Modifizierung der Transport- oder Sekretionseigenschaften des Proteins, oder andere Sequenzen, die die Funktion oder Stabilität von Protein oder RNA-Molekülen verändern oder verbessern.
In allen obigen Ausführungsformen, die die Vermehrung von zellulärer Serpin-, z. B. ATIII, Expression beinhalten, kann die Targeting-Maßnahme eine einfache Insertion der regulatorischen Sequenz, ein Platzieren des Gens oder die Kontrolle der neuen regulatorischen Sequenz, d. h., Insertieren eines neuen Promotors oder Enhancers oder beider stromaufwärts eines Gens, sein. Alternativ kann die Targeting-Maßnahme eine einfache Deletion eines regulatorischen Elements, wie z. B. die Deletion eines gewebespezifischen negativen regulatorischen Elements, sein. Alternativ kann die Targeting-Maßnahme ein existierendes Element ersetzen; z. B. kann ein gewebespezifischer Enhancer durch einen Enhancer ersetzt werden, der eine breitere oder verschiedene Zell-Typ-Spezifität als die natürlich vorkommenden Elemente aufweist. Die natürlich vorkommenden Sequenzen werden hier deletiert und neue Sequenzen zugefügt. In allen Fällen kann die Identifizierung der Targeting-Maßnahme durch die Verwendung von einem oder mehreren selektierbaren Marker-Genen erleichtert werden, die zur Targeting-DNA benachbart sind, was die Selektion von Zellen ermöglicht, in denen die exogene DNA in das Wirtszellen-Genom integriert wurde. Die Identifizierung der Targeting-Maßnahme kann auch erleichtert werden durch die Verwendung von einem oder mehreren Marker-Genen, die Eigenschaften einer negativen Selektion so aufweisen, dass der negativ selektierbare Marker an die exogene DNA gebunden ist, aber so konfiguriert ist, dass der negativ selektierbare Marker die Targeting-Sequenz flankiert, und so, dass eine korrekte homologe Rekombination mit Sequenzen im Wirtszellen-Genom nicht zu einer stabilen Integration des negativ selektierbaren Markers führt. Marker, die für diesen Zweck geeignet sind, umfassen das Herpex-Simplex-Virus-Thymidinkinase(TK)-Gen oder das bakterielle Xanthin-Guanidin-Phosphoribosyltransferase(gpt)-Gen.
Die Gen-Targeting- oder Gen-Aktivierungstechniken, die gemäß diesem erfinderischen Aspekt verwendet werden können, sind insbesondere beschrieben im US-Patent Nr. 5 272 071 (Chappel); US-Patent Nr. 5 578 461 (Sherwin et al.); Internationale Anmeldung Nr. PCT/US92/09627 ( WO 93/09222 ) (Selden et al.); und Internationale Anmeldung Nr. PCT/US90/06436 ( WO 91/06667 ) (Skoultchi et al.), von denen jedes/jede von ihnen durch Bezugnahme darauf in ihrer Gesamtheit Bestandteil dieser Beschreibung ist.
Die vorliegende Erfindung wird im folgenden detaillierter durch veranschaulichende Beispiele beschrieben, auf die die vorliegende Erfindung nicht beschränkt ist.
BEISPIELE
Diese Beispiele werden nur zum Zweck einer Veranschaulichung angegeben, und die Erfindung ist keinesfalls auf diese Beispiele beschränkt, sondern soll vielmehr so ausgelegt werden, dass sie irgendwelche und alle Variationen, die als Ergebnis der hier angegebenen Lehre offenbar werden, umfasst.
BEISPIEL 1: HPLC-REINIGUNG EINES HIV-INHIBITORISCHEN FAKTORS AUS CD8⁺-T-ZELLEN UND SEINE IDENTIFIZIERUNG ALS ANTITHROMBIN III UNTER VERWENDUNG VON NANO-ELEKTROSPRAY-TANDEM-MASSEN-SPEKTROMETRIE
Zur Reinigung des ATIII-ähnlichen HIV-inhibitorischen Faktors wurden HIV-spezifische CTL- oder Massen-CD8⁺-T-Zellen von Langzeit-Nicht-Progressoren in vitro kultiviert und mit CD3-Vernetzung stimuliert (Geiben-Lynn et al., J. VIROL., 75: 8306–16 (2001)) in entweder 10% hitzeinaktiviertem fetalen Rinderserum oder 10% hitzeinaktiviertem menschlichen Serum. Nach 4 Stunden bei 37°C wurde das Medium gesammelt, zentrifugiert und auf eine Heparin-Sepharose-Säule appliziert. Die Säule wurde mit einem kontinuierlichen Gradienten von 1 M NaCl in Phosphat gepufferter Salzlösung (PBS, pH 7,4) eluiert. Inhibitorische Fraktionen wurden gesammelt und mit einem Centricon 50K-Zentrifugenkonzentrator konzentriert. Die Probe wurde auf eine Superdex 200-Säule appliziert. Inhibierende Fraktionen wurden auf eine Vydac RP-4 HPLC-Säule, mit destilliertem Wasser und 0,1% (Gew./Gew.) Trifluoressigsäure (TFA) equilibriert, gegeben und auf Reinheit getestet (2A). Gebundenes Protein wurde mit einem Gradienten von Acetonitril in TFA eluiert (Van Patten et al., J. BIOL. CHEM., 274: 10268–76 (1999)). Zusätzlich wurde die Reinheit der endgültigen Proben mittels SDS-Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese (PAGE) mit Silberfärbung bewertet, und die Proteinkonzentration wurde mit einem Bio-Rad-Proteinassay bestimmt. Fraktionen mit > 95% Reinheit durch C4-HPLC und Silberanfärben wurden für Inhibierungstests verwendet, um ID₅₀ zu bestimmen (Schreuder et al., NAT. STRUCT. BIOL., 1: 48–54 (1994)).
Die Fraktionen aus der Superdex-200-Säule, die anti-HIV-Aktivität enthielten, wurden gesammelt und mittels SDS-PAGE unter reduzierenden und nicht-reduzierenden Bedingungen und Silberanfärbung analysiert, was eine einzige molekulare Spezies ergab, die bei 43 kDa wanderte (2B). Es wurde eine In-Gel-Trypsin-Digestion auf dem bei 43 kDa-Band wandernden Material durchgeführt, um Peptid-Fragmente zu erhalten, die nachfolgend aus dem Gel eluiert und mittels Umkehrphasen-HPLC-Nano-Elektrospray-Tandem-Massenspektrometrie (μLC/MS/MS) auf einem Finnigan-LCQ-Quadrupol-Ionenfallen-Massenspektrometer identifiziert (2C). Rinder-ATIII (53%) wurde mit Massen von 14 Peptiden bestimmt.
Im Gegensatz dazu inhibierte Serum, das unbehandeltes Medium und Überstände aus unstimuliertem CD8⁺-T-Zellen-Wachstum im Serum enthaltenden Serum enthielt, die HIV_IIIB-Replikation, selbst bei Applikation auf die Heparin-Sepharose-Säule, nicht wesentlich. Zusätzlich wurde unter Verwendung von unbehandeltes Serum enthaltendem Medium die 43 kDa-Form von ATIII nach der Heparin-Sepharose-Chromatographie und Superdex-200-Chromatographie durch SDS-PAGE, Silberanfärben oder C4-HPLC nicht festgestellt. Diese Daten zeigen, dass aktivierte CD8⁺-T-Zellen ATIII in eine Form modifizieren, die zur Inhibierung von HIV fähig ist. Unverarbeitetes ATIII weist normalerweise ein Molekulargewicht von 54 bis 65 kDa auf, während bei der gereinigten Form mittels SDS-PAGE 43 kDa gefunden wurden. Dies führte uns zu der Hypothese, dass der Heparin-nicht-bindende < 50 kDa-Faktor notwendig sein könnte, um ATIII zu aktivieren.
BEISPIEL 2: ANTIVIRALE AKTIVITÄT VON ATIII
1. Vergleichende Beurteilung der Wirkung von gereinigten Rinder-ATIII-Formen auf HIV-, SIV- und SHIV-Infektiösität in vitro
Um die Wirkung von ATIII auf die Lentivirus-Infektiösität (X4 HIV, R5 HIV, SIV₂₃₉ oder SHIV_Ku-1) zu testen, wurden Zelllinien (H9, PM1, SEM-174) in Gegenwart oder Abwesenheit der verschiedenen Formen von ATIII bis zu 9 Tagen kultiviert (vergl. 3 und 4). Alle drei Tage (Tag 3, 6 und 9) wurde ein 1 ml Zellüberstand aus den Testvertiefungen entfernt und mit einem gleichen Volumen R20-Kulturmedium, das entweder Rinder-ATIII oder menschliches ATIII enthielt, ersetzt. Kontrollvertiefungen wurden auf ähnliche Weise behandelt, erhielten aber Medium ohne die ATIII-Ergänzung.
Aus den Test- und Kontrollvertiefungen wurden am neunten Tag der Kultur wieder Proben entnommen und die Konzentration des viralen Kernproteins p24 (gag) für HIV (Alliance^® HIV-1 p24 ELISA-Kit; NEN^® Life Science, Boston, MA, USA) oder p27-Antigen (SIV-Kern-Antigen-ELISA-Kit, Coulter, Miami, FL) wurde für HIV- bzw. SIV- oder SHIV-infizierte Zellen gemessen. Die Inhibierung der viralen Replikation in den Testproben wurde als Prozentsatz der in den Kontrollvertiefungen festgestellten p24-Immunoreaktivität bestimmt.
2. In vivo-Beurteilung der ATIII-antiretroviralen Aktivität
Es gibt zur Zeit kein durch die U. S. Food and Drug Administration zur Beurteilung antiretroviraler Mittel, wie z. B. ATIII, registriertes Standard-in vivo-Modell, und für eine IND-Zulassung in den USA ist kein in vivo-Modell erforderlich. Menschliche Zelllinien können jedoch in Hohlfasern in den subkutanen und intraperitonealen Kompartementen von Mäusen kultiviert werden (Hollingshead et al., LIFE SCI., 57: 131–41 (1995)). Eine in vivo-Beurteilung der ATIII-antiretroviralen Aktivität kann in dem von Hollingshead und Mitarbeitern (ANTIVIRAL RES., 28: 256–79 (1995)) entwickelten Mäuse-Hohlfaser-Modell durchgeführt werden.
H9- oder PM1-Zellen-tragende Polyvinylidenfluorid-Fasern (Mw-Ausschluss: 500.000; 1 mm innerer Durchmesser; Spectrum Medical Corp., Houston, TX, USA) werden hergestellt durch Füllen von konditionierten Hohlfasern mit Zellinokulum (uninfizierte Zellen, akut HIV-infizierte Zellen oder chronisch HIV-infizierte Zellen) (Hollingshead et al., LIFE SCI., 57: 131–41 (1995)). Diese inokulierten Hohlfasern werden entweder subkutan oder in die Peritonealhöhle von SCID-Mäusen (SCID/NCr; NCI Animal Production Facility, NCI-FCRDC, Frederick, MD, USA) chirurgisch implantiert. Hohlfaser-tragende SCID-Mäuse werden entweder akut oder chronisch mit steigenden Mengen von gereinigtem ATIII-Präparat versetzt. Das ATIII-Präparat (3 bis 500 E/Maus/Tag) wird den Hohlfasern-tragenden SCID-Mäusen durch subkutane Injektion, intraperitoneale Injektion, intravenös oder auf oralem Wege verabreicht. Zu bestimmten Zeiten wird aus Kontroll- und Testtieren Blut entnommen und Serum zubereitet. Die Menge der viralen Teilchen im Test- und Kontrollserum wird mittels p24-ELISA gemessen. Eine ATIII-vermittelte antivirale Wirkung ergibt einen beträchtlichen Abfall in der viralen Belastung, ersichtlich durch einen mindestens 15%igen Abfall im Serum-p24-Proteingehalt in ATIII-behandelten Tieren, relativ zum Serum p24-Gehalt in den unbehandelten Kontrolltieren.
ÄQUIVALENTE
Obwohl hier besondere Ausführungsformen detailliert beschrieben wurden, wurde dies beispielhaft nur zu Veranschaulichungszwecken durchgeführt und soll keinesfalls im Hinblick auf den Rahmen der anliegenden Ansprüche, die folgen, begrenzend wirken. Insbesondere sind die Erfinder der Auffassung, dass verschiedene Substitutionen, Veränderungen und Modifikationen der Erfindung durchgeführt werden können. Andere Aspekte, Vorteile und Modifikationen liegen im Rahmen der Erfindung. ATIII kann z. B. als antivirales Arzneimittel gegen andere Viren (z. B. HTLV-1, HTLV-2, HSV, EBV, HBV, HCV oder CMV) verwendet werden. SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Verwendung von ATIII, ausgewählt aus der Gruppe von (a) 43 kDa-modifiziertem Antithrombin; (b) R-Antithrombin; (c) S-Antithrombin, erhältlich durch Binden von Heparin an L-Antithrombin; (d) prälatentem Antithrombin; und (e) einer Kombination davon, das gegebenenfalls durch in Kontakt bringen mit Elastase vorbehandelt sein kann, zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung oder Vorbeugung einer Virusinfektion durch einen Virus, ausgewählt aus HIV, HTLV-1, HTLV-2, HSV, EBV, HBV, HCV und CMV.
Verfahren zur Verringerung der Infektiosität eines Virus, ausgewählt aus HIV, HTLV-1, HTLV-2, HSV, EBV, HBV, HCV und CMV, falls ein solcher vorhanden ist, in einer biologischen Probe, wie z. B. Blutplasma, Serum, Speichel, Samen, Cervixsekreten, Urin, Frauenmilch und amniotischen Fluiden, wobei das Verfahren die Stufenumfasst: (a) Identifizieren einer biologischen Probe, in der eine Verringerung oder Eliminierung einer Virusinfektiosität wünschenswert ist; und (b) in Kontakt bringen der biologischen Probe mit einem wie in Anspruch 1 definierten ATIII in einer Menge, die ausreicht, um die Infektiosität des Virus in der biologischen Probe zu verringern.
Verfahren nach Anspruch 2, worin die Menge des ATIII mindestens 2 Einheiten pro Milliliter des Volumens der biologischen Probe beträgt.
Zusammensetzung, die ein mit einer Oberfläche verbundenes ATIII umfasst, wobei das ATIII ausgewählt ist aus (a) 43 kDa-modifiziertem Antithrombin; (b) R-Antithrombin; (d) prälatentem Antithrombin; und (e) einer Kombination davon.
Zusammensetzung nach Anspruch 4, worin die Oberfläche eine Perle, ein Span, eine Säule oder eine Matrix ist.
Verfahren zur Inhibierung der Infektiosität eines Virus, ausgewählt aus HIV, HTLV-1, HTLV-2, HSV, EBV, HBV, HCV und CMV, wobei das Verfahren die Stufen umfasst: (a) in Kontakt bringen eines Virus-Virions mit einer Zusammensetzung nach Anspruch 4 oder 5; und (b) Inkubieren dieses Virus-Virions mit dem ATIII während eines Zeitraums, der ausreicht, um die Infektiosität des Virus zu inhibieren, worin Verfahren zur Behandlung des menschlichen oder tierischen Körpers durch therapeutische und diagnostische Verfahren, die am menschlichen oder tierischen Körper durchgeführt werden, ausgeschlossen sind.
Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend einen pharmazeutisch annehmbaren Träger und eine therapeutisch wirksame Menge eines ATIII, ausgewählt (a) 43 kDa-modifiziertem Antithrombin (b) prälatentem Antithrombin, erhältlich durch Inkubieren von S-Antithrombin bei 60°C während 24 Stunden unter physiologisches Salz-Bedingungen; und (e) einer Kombination davon, um eine Virusinfektion durch einen Virus, ausgewählt aus HIV, HTLV-1, HTLV-2, HSV, EBV, HBV, HCV und CMV, zu inhibieren, zu behandeln oder zu verhindern.