DE60213274T2

DE60213274T2 - Peptide zum einsatz in der behandlung von tumoren und anderen zuständen, die das entfernen oder zerstören von zellen erfordern

Info

Publication number: DE60213274T2
Application number: DE60213274T
Authority: DE
Inventors: Paul Beaconsfield AVERBACK; Jack Mississauga GEMMELL
Original assignee: Nymox Corp Canada; Nymox Corp
Current assignee: Nymox Corp Canada; Nymox Corp
Priority date: 2001-11-16
Filing date: 2002-11-18
Publication date: 2007-10-31
Anticipated expiration: 2022-11-19
Also published as: JP5357196B2; AU2002342463A1; US8293703B2; IL161591A0; IL161591A; CA2467053C; ATE333467T1; KR20050044471A; WO2003044053A2; AU2002342463B2; EP1442058A2; KR101375026B1; US7745572B2; DK1442058T3; KR20140044399A; US20050032704A1; US20030166569A1; US8569446B2; CA2467053A1; CN1589279A

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG 1. Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung ist auf die Verwendung von NTP-Peptiden, bestehend aus SEQ ID NR 9-15, zur Behandlung von Zuständen abgestellt, die das Entfernen oder Zerstören von Zellelementen wie gutartigen oder malignen Tumoren in Menschen erfordern.
2. Beschreibung des verwandten Stands der Technik
Das Wesentliche vieler medizinischer Behandlungen und Verfahren liegt im Entfernen oder Zerstören von schädlichem oder unerwünschtem Gewebe. Beispiele für derartige wichtige Behandlungen umfassen das chirurgische Entfernen von kanzerösem Wachstum, das Zerstören von Tumormetastasen durch Chemotherapie und die Verringerung von glandulärer (z. B. Prostata) Hyperplasie. Andere Beispiele umfassen das Entfernen von unerwünschten Gesichtshaaren, das Entfernen von Warzen und das Entfernen von unerwünschtem Fettgewebe.
Es besteht ein offensichtlicher Bedarf an einem wirksamen Mittel, das schädliches) oder unerwünschtes) Zellen und Gewebe zerstört und damit entweder das Entfernen von diesen erleichtert oder das weitere Wachstum von diesen hemmt, aber in erster Linie lokale Wirkungen und eine minimale oder gar keine systemische Toxizität aufweist.
Neurale Faserproteine und ihre verwandten Moleküle sind eine Klasse von derartigen Mitteln, wie in der US 2003/0054990 mit dem Titel: Methods of Treating Tumors and Related Conditions Using Neural Thread Proteins offenbart ist. Bestimmte Fragmente von neuralen Faserproteinen und verwandten Proteinen werden in folgenden Druckschriften als nützlich bei der Behandlung von Tumoren und anderen Zuständen offenbart, die das Entfernen oder Zerstören von Zellen erfordern: US 2003/0096350 mit dem Titel: Peptides Effective In The Treatment Of Tumors And Other Conditions Requiring The Removal Or Destruction Of Cells; US 2003/0096756 mit dem Titel: Peptides Effective In The Treatment Of Tumors And Other Conditions Requiring The Removal Or Destruction Of Cells; und US 2003/0109437 mit dem Titel: Peptides Effective In The Treatment Of Tumors And Other Conditions Requiring The Removal Or Destruction Of Cells.
Hier sind gewisse andere Fragmente von neuralen Faserproteinen offenbart, die auch bei der Behandlung von Tumoren und anderen Zuständen, die das Entfernen oder Zerstören von Zellen erfordern, nützlich sind.
Krebs ist eine Abnormalität in den zellinternen regulatorischen Mechanismen, die zu einem unkontrollierten Wachstum und einer Vermehrung der Zelle führt. Normale Zellen bilden Gewebe, und wenn diese Zellen ihre Fähigkeit verlieren, als eine spezifizierte, gesteuerte und koordinierte Einheit zu wirken (Entdifferenzierung), führt der Defekt zu einer Unordnung bei der Zellpopulation. Wenn dies vorkommt, bildet sich ein Tumor.
Gutartige Wucherungen von Gewebe sind Abnormalitäten, bei denen es wünschenswert ist, die Zellen aus einem Organismus zu entfernen. Gutartige Tumore sind Zellproliferationen, die nicht im gesamten Körper Metastasen bilden, aber Krankheitssymptome verursachen. Derartige Tumore können tödlich sein, wenn sie sich in unzugänglichen Bereichen in Organen wie dem Hirn befinden. Es gibt gutartige Tumore von Organen, einschließlich Lunge, Hirn, Haut, Hypophyse, Thyroidea, Nebennierenrinde und -mark, Ovarium, Uterus, Testis, Bindegewebe, Muskel, Darm, Ohr, Nase, Hals, Mandeln, Mund, Leber, Gallenblase, Bauchspeicheldrüse, Prostata, Herz und anderen Organen.
Die Chirurgie ist oft der erste Schritt bei der Behandlung von Krebs. Das Ziel der Chirurgie variiert. Manchmal wird sie verwendet, um möglichst viel von dem offensichtlichen Tumor zu entfernen, oder zumindest ein Debulking vorzunehmen (den/die größeren Hauptteil/e des Tumors zu entfernen, so dass von ihm weniger vorhanden ist, das durch andere Mittel behandelt werden muss). Je nach Art und Ort des Krebses kann die Chirurgie dem Patienten auch eine Erleichterung der Symptome schaffen. Wenn ein Chirurg zum Beispiel einen großen Teil eines sich ausbreitenden Hirntumors entfernen kann, wird der Druck im Schädel abnehmen, was zu einer Verbesserung der Symptome des Patienten führt.
Nicht alle Tumore sind für die Chirurgie zugänglich. Manche können sich in Teilen des Körpers befinden, die es unmöglich machen, diese vollständig zu entfernen. Beispiele für diese wären Tumore im Hirnstamm (ein Teil des Hirns, der die Atmung reguliert) oder ein Tumor, der in und um ein größeres Blutgefäß gewachsen ist. In diesen Fällen ist die Rolle der Chirurgie auf Grund des hohen Risikos im Zusammenhang mit der Entfernung des Tumors begrenzt.
In manchen Fällen wird die Chirurgie nicht verwendet, um bei einem Tumor ein Debulking vorzunehmen, weil es einfach nicht notwendig ist. Ein Beispiel hierfür ist das Hodgkin-Lymphom, ein Krebs der Lymphknoten, der sehr gut auf Kombinationen von Chemotherapie und Strahlentherapie anspricht. Beim Hodgkin-Lymphom ist die Chirurgie selten notwendig, um eine Heilung zu erreichen, sie wird jedoch fast immer verwendet, um eine Diagnose zu erstellen.
Die Chemotherapie ist eine andere übliche Form der Krebsbehandlung. Im Wesentlichen beinhaltet sie die Verwendung von Arzneimittelanwendungen (normalerweise über den Mund oder durch Injektion verabreicht), die sich schnell teilende Zellen (wie diejenigen, die sich in einem Tumor befinden) im gesamten Körper spezifisch angreifen. Dies macht die Chemotherapie bei der Behandlung von Krebs, bei dem sich bereits Metastasen gebildet haben, sowie von Tumoren nützlich, bei denen eine hohe Wahrscheinlichkeit besteht, dass sie sich durch das Blut- und Lymphsystem ausbreiten, die aber über den Primärtumor hinaus nicht offensichtlich sind. Die Chemotherapie kann auch verwendet werden, um das Ansprechen von lokalisierten Tumoren auf Chirurgie und Strahlentherapie zu verbessern. Dies ist zum Beispiel bei manchen Krebsarten des Kopfes und Halses der Fall.
Leider werden andere Zellen im menschlichen Körper, die sich auch normalerweise schnell teilen (wie die Deckschicht von Magen und Haar), auch von der Chemotherapie betroffen. Aus diesem Grund induzieren viele Chemotherapie-Mittel unerwünschte Nebenwirkungen wie Übelkeit, Erbrechen, Anämie, Haarausfall oder andere Symptome. Diese Nebenwirkungen sind vorübergehend, und es gibt Medikamente, die zur Milderung vieler dieser Nebenwirkungen beitragen können. Mit zunehmendem Wissen haben Forscher neuere chemotherapeutische Mittel entworfen, die nicht nur in Bezug auf das Abtöten von Krebszellen besser sind, sondern auch weniger Nebenwirkungen für den Patienten haben.
Chemotherapie wird Patienten auf eine Vielzahl von Arten verabreicht. Einige beinhalten Pillen und andere werden durch eine intravenöse oder andere Injektion verabreicht. Für die injizierbare Chemotherapie geht der Patient zur Behandlung in die Arztpraxis oder ins Krankenhaus. Andere chemotherapeutische Mittel erfordern eine kontinuierliche Infusion in den Blutfluss, 24 Stunden am Tag. Für diese Arten der Chemotherapie wird eine kleinere chirurgische Prozedur durchgeführt, um eine kleine Pumpe zu implantieren, die von dem Patienten getragen wird. Die Pumpe verabreicht dann langsam die Medikamente. In vielen Fällen wird ein dauerhafter Zugang in die Vene eines Patienten platziert, um die Notwendigkeit wiederholter Nadelstiche zu eliminieren. Strahlentherapie ist eine weitere üblicherweise verwendete Waffe im Kampf gegen den Krebs. Strahlung tötet Krebs durch Zerstörung der DNA innerhalb der Tumorzellen. Die Strahlung erfolgt auf verschiedene Arten. Die üblichste Art beinhaltet das höchst präzise Richten eines Strahlenbündels auf den Patienten, wobei der Tumor fokussiert wird. Hierfür liegt ein Patient auf einem Tisch und der Strahl bewegt sich um ihn herum. Die Prozedur dauert Minuten, kann aber über mehrere Wochen täglich erfolgen (je nach Art des Tumors), um eine bestimmte verschriebene Gesamtdosis zu erreichen.
Ein anderes Strahlungsverfahren, das manchmal eingesetzt und als Brachytherapie bezeichnet wird, beinhaltet die Verwendung von radioaktiven Pellets (Seeds) oder Drähten und das Implantieren dieser in den Körper im Bereich des Tumors. Die Implantate können vorübergehend oder permanent sein. Bei permanenten Implantaten nimmt die Strahlung in den Seeds über einen Zeitraum von Tagen oder Wochen ab, so dass der Patient nicht radioaktiv ist. Bei vorübergehenden Implantaten wird normalerweise die gesamte Strahlendosis in ein paar Tagen abgegeben, und der Patient muss während dieser Zeit im Krankenhaus bleiben. Bei beiden Arten der Brachytherapie wird die Strahlung im Allgemeinen an einen sehr gezielten Bereich abgegeben, um eine lokale Kontrolle über einen Krebs zu gewinnen (im Gegensatz zur Behandlung des ganzen Körpers, wie es bei der Chemotherapie der Fall ist).
Manche sehr ausgewählte Patienten können für Knochenmarktransplantation in Frage kommen. Diese Prozedur wird normalerweise entweder durchgeführt, weil ein Patient einen Krebs hat, der besonders aggressiv ist, oder weil er einen Krebs hat, der wieder auftritt, nachdem er mit einer herkömmlichen Therapie behandelt wurde. Knochenmarktransplantation ist eine komplizierte Prozedur. Es gibt viele Arten und sie variieren in Bezug auf ihr Potential, Nebenwirkungen zu haben und eine Heilung zu bewirken. Die meisten Transplantationen werden in bestimmten Zentren durchgeführt, und in vielen Fällen wird ihre Verwendung als Forschungsbeitrag angesehen.
Es gibt eine Reihe anderer Therapien, obwohl die meisten noch in klinischen Tests erforscht werden und noch keine Standardversorgung geworden sind. Beispiele umfassen die Verwendung von Immuntherapie, monoclonalen Antikörpern, anti-Angiogenese-Faktoren und Gentherapie.
Immuntherapie: Es gibt verschiedene Techniken, die entworfen wurden, um das patienteneigene Immunsystem dabei zu unterstützen, den Krebs zu bekämpfen, was ganz separat von Strahlung oder Chemotherapie geschieht. Häufig injizieren die Forscher, um das Ziel zu erreichen, den Patienten einen speziell hergeleiteten Impfstoff.
Monoclonale Antikörper: Dies sind Antikörper, die entworfen wurden, um sich an kanzeröse Zellen (und nicht an normale Zellen) zu binden, indem Unterschiede zwischen kanzerösen und nicht-kanzerösen Zellen in ihren antigenen und/oder anderen Kennzeichen ausgenutzt werden. Die Antikörper können dem Patienten alleine oder konjugiert mit verschiedenen cytotoxischen Verbindungen oder in radioaktiver Form verabreicht werden, so dass der Antikörper vorzugsweise auf die kanzerösen Zellen abzielt, wodurch das toxische Mittel oder die Radioaktivität an die gewünschten Zellen abgegeben wird.
Anti-Angiogenese-Faktoren: Da sich Krebszellen schnell teilen und Tumore wachsen, können sie schnell über ihre Blutzufuhr hinauswachsen. Um dies auszugleichen, sezernieren manche Tumore eine Substanz, von der angenommen wird, dass sie das Wachstum von Blutgefäßen in ihrer Nähe induzieren, wodurch die Krebszellen mit einer vaskulären Nährstoffquelle versorgt werden. Es wurden experimentelle Therapien entworfen, um das Wachstum von Blutgefäßen zu Tumoren aufzuhalten.
Gentherapie: Krebs ist das Produkt einer Reihe von Mutationen, die schließlich zur Erzeugung einer Krebszelle und ihrer übermäßigen Proliferation führen. Krebs kann behandelt werden, indem Gene in die Krebszellen eingeführt werden, die entweder dahingehend wirken, die Proliferation des Krebses einzudämmen oder zu stoppen, den zelleigenen programmierten Zellmechanismus zum Zerstören der Zelle zu aktivieren, die Immunerkennung der Zelle zu verbessern oder ein Prodrug zu exprimieren, das sich in einen toxischen Metaboliten oder ein Zytokin umwandelt, das das Tumorwachstum hemmt.
Gutartige Tumore und Missbildungen können auch durch eine Vielfalt von Verfahren behandelt werden, einschließlich Chirurgie, Radiotherapie, Arzneistofftherapie, thermische oder elektrische Ablation, Kryotherapie und anderer. Obwohl gutartige Tumore keine Metastasen bilden, können sie groß werden und wiederkehren. Eine chirurgische Exstirpation von gutartigen Tumoren weist im Allgemeinen alle Schwierigkeiten und Nebenwirkungen der Chirurgie auf und muss bei manchen gutartigen Tumoren häufig wiederholt durchgeführt werden, wie bei Hypophyse-Adenomen, Meningioma des Gehirns, Prostata-Hyperplasie und anderen.
Es gibt andere Zustände, die unerwünschte Zellelemente einschließen, wo eine selektive Zellentfernung wünschenswert ist. Zum Beispiel werden Herzerkrankungen und Schlaganfälle normalerweise durch Atherosklerose verursacht, was eine proliferative Läsion von fibrös-fettigen und modifizierten glatten Muskelelementen ist, die die Blutgefäßwand verzerrt, das Lumen verengt, den Blutfluss einschränkt, eine Neigung zu fokalen Blutgerinnseln verursacht und schließlich zur Verstopfung und zum Infarkt führt. Es gibt verschiedene Behandlungen für Atherosklerose wie Bypass-Transplantate; künstliche Transplantate; Angioplastie mit Rekanalisierung, Ausschabung, Strahlung, Laser oder ein anderes Entfernen; Pharmakotherapie zum Hemmen von Atherosklerose durch Lipidreduktion; Therapien gegen Gerinnsel und allgemeine Maßnahmen wie Ernährung, sportliche Betätigung und Lebensart. Ein Verfahren zum Entfernen von atherosklerosen Läsionen ohne das Risiko und die Nebenwirkungen von chirurgischen Verfahren wird benötigt.
Andere Beispiele für unerwünschte Zellelemente, wo ein selektives Zellentfernen wünschenswert ist, umfassen viral induziertes Wachstum wie Warzen. Ein weiteres Beispiel sind hypertrophische entzündliche Massen, die in entzündlichen Zuständen zu finden sind, und hypertrophe Narben oder Wulstnarben. Noch weitere Beispiele finden sich im Zusammenhang mit der Kosmetik, wie das Entfernen von unerwünschtem Haar, z. B. Gesichtshaar, oder zum Schrumpfen von unerwünschten Gewebebereichen zu Kosmetikzwecken, wie in der Gesichtsdermis und Bindegeweben oder in der Dermis und dem Bindegewebe der Extremitäten.
Andere Beispiele für unerwünschte Zellelemente, wo ein selektives Zellentfernen oder das Hemmen von Zellproliferation wünschenswert ist, schließen Stenose und Restenose irgendeiner Arterie, Klappe oder eines Kanals im Kreislauf ein, einschließlich, ohne darauf beschränkt zu sein, Klappen (z. B. Aortenstenose, die das Verengen der Aortenklappenöffnung einschließt), Koronararterien (z. B. Koronar-Ostiumsklerose, die das Verengen der Öffnungen der Koronararterien einschließt), Halsschlagadern und Nierenarterien. Andere Beispiele beinhalten die Hemmung oder das Entfernen von unerwünschtem Zellwachstum oder unerwünschter Zellakkumulation, das/die die partielle oder vollständige Okklusion von medizinischen Vorrichtungen verursacht, wie Stents, die in einem Blutgefäß zur Behandlung von Stenosen, Strikturen oder Aneurismen darin oder in harnausscheidenden Organen und in Gallengängen platziert oder implantiert wurden.
Noch weitere Verfahren werden für den Durchschnittsfachmann offensichtlich sein. Bei allen oder den meisten dieser Beispiele besteht ein Bedarf an Behandlungen, die die unerwünschten Zellelemente ohne die Risiken und Nebenwirkungen von herkömmlichen Therapien entfernen oder zerstören können oder die die unerwünschten Zellelemente präziser entfernen können.
Neurale Faserproteine (NTP) sind eine Familie von kürzlich charakterisierten Hirnproteinen. Ein Mitglied dieser Familie, AD7c-NTP, ist ein Membran-assoziiertes ∼41 kD-Phosphoprotein mit Funktionen, die mit neuritischem Sprossen verbunden sind (de la Monte et al., J. Clin. Invest., 100:3093-3104 (1997); de la Monte et al., Alz., Rep., 2:327-332 (1999); de la Monte SM und Wands JR, Journal of Alzheimer's Disease, 3:345-353 (2001)). Das Gen, das AD7c-NTP codiert, und die vorhergesagte Proteinsequenz für AD7c-NTP wurden identifiziert und beschrieben (de la Monte et al., J. Clin. Invest., 100:3093-3104 (1997)). Zusätzlich zu den ∼41-kD-Spezies wurden andere Spezies von neuralem Faserprotein (∼26 kD, ∼21 kD, ∼17 kD und ∼15 kD) identifiziert und mit neuroektodermalen Tumoren, Astrocytomen und Glioblastomen und mit Verletzungen auf Grund von Hypoxie, Schema oder Hirninfarkt in Zusammenhang gebracht (Xu et al., Cancer Research, 53:3823-3829 (1993); de la Monte et al., J. Neuropathol. Exp. Neurol., 55(10):1038-50 (1996), de la Monte et al., J. Neurol. Sci., 138(1-2):26-35 (1996); de la Monte et al., J. Neurol. Sci., 135(2):118-25 (1996); de la Monte et al., J. Clin. Invest., 100:3093-3104 (1997); und de la Monte et al., Alz.. Rep., 2:327-332 (1999)).
Spezies von neuralem Faserprotein wurden in den US-Patenten mit den Nummern 5,948,634; 5,948,888 und 5,830,670, und zwar alle für "Neural Thread Protein Gene Expression and Detection of Alzheimer's Disease", und in dem US-Patent Nr. 6,071,705 für "Method of Detecting Neurological Disease or Dysfunction" beschrieben und beansprucht. Wie hier beschrieben, wird NTP während des Zelltods hochreguliert und erzeugt. Somit werden tote und absterbende Zellen als NTP überproduzierend beschrieben, und demnach zeigt ihr Vorliegen den Tod von Nervenzellen und den Beginn der Alzheimer Krankheit (AD) an.
Andere Spezies von neuralem Faserprotein wurden als andere Produkte des AD7c-NTP-Gens (z. B. ein 112-Aminosäuren-Protein, beschrieben in der NCBI-Entrez-Protein-Datenbank Zugang #XP_032307 PID g15928971) oder als ähnlich zu neuralen Faserproteinen identifiziert (z. B. ein 106 Aminosäuren-Protein, beschrieben in der NCBI-Entrez-Protein-Datenbank Zugang #AAH14951 PID g15928971, und ein 61 Aminosäuren-Protein, beschrieben in der NCBI-Entrez-Protein-Datenbank Zugang #AAH02534 PID g12803421).
Neurales Faserprotein steht mit AD im Zusammenhang, und NTP wird im Zusammenhang mit Zelltod bei AD hochreguliert. AD7c-NTP-mRNA wird im AD-Hirn im Vergleich zu Kontrollen hochreguliert; AD7c-NTP-Proteinspiegel im Gehirn und in CSF sind bei AD höher als bei Kontrollen; und AD7c-NTP-Immunreaktivität findet sich in senilen Plaques, in neurofibrillären Knäueln (NFT), in degenerierenden Neuronen, neurophilen Fasern und dystrophen neurotischen Sprossen im Hirn von AD und Down-Syndrom (Ozturk et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:419-423 (1989); de la Monte et al., J. Clin. Invest., 86(3):1004-13 (1990); de la Monte et al., J. Neurol. Sci., 113(2):152-64 (1992); de la Monte et al., Ann. Neurol., 32(6):733-42 (1992); de la Monte et al., J. Neuropathol. Exp. Neurol., 55(10):1038-50 (1996), de la Monte et al., J. Neurol. Sci., 138(1-2):26-35 (1996); de la Monte et al., J. Neurol. Sci., 135(2):118-25 (1996); de la Monte et al., J. Clin. Invest., 100:3093-3104 (1997); und de la Monte et al., Alz.. Rep., 2:327-332 (1999)). NTP befindet sich innerhalb von Zellen, innerhalb von feinen Fortsätzen innerhalb des Neuropils oder ist extrazellulär sowohl im AD- als auch im Down-Syndrom-Hirn. de la Monte et al., Ann. Neurol., 32(6):733-42 (1992).
Erhöhte Spiegel von AD7c-NTP-Protein wurden sowohl in CSF als auch im Urin von AD-Patienten gefunden (de la Monte and Wands, Front Biosci 7:989-96 (2002); de la Monte and Wands, Journal of Alzheimer's Disease 3:345-353 (2001); Munzar et al, Alzheimer's Reports 4:61-65 (2001); Kahle et al, Neurology 54:1498-1504 (2000); Munzar et al, Alzheimer Reports 3:155-159 (2000); de la Monte et al, Alzheimer's Reports 2:327-332 (1999); und de la Monte et al, J Clin Invest 100:3093-3104 (1997).
Überexpression von NTP wurde auch mit dem Prozess des Zelltods bei der Alzheimer-Krankheit in Verbindung gebracht (de la Monte and Wands, J. Neuropathol. Exp. Neurol., 60:195-207 (2001); de la Monte and Wands, Cell Mol Life Sci 58: 844-49 (2001). AD7c-NTP wurde auch im Hirngewebe beim Down-Syndrom identifiziert (Wands et al., Internationale Patentveröffentlichung Nr. WO 90/06993; de la Monte et al, J Neurol Sci 135:118-25 (1996); de la Monte et al., Alz.. Rep., 2:327-332 (1999)). Es gibt einen Hinweis, dass Überexpression von NTP auch mit normalem Spannungsglaukom zusammenhängen kann (Golubnitschaja-Labudova et al, Curr Eye Res 21:867-76 (2000)).
Es wurde nachgewiesen, dass NTP ein wirksames Mittel zum Bewirken von Zelltod sowohl in vitro in Gliom- und Neuroblastom-Zellkulturen als auch in vivo in normalem Muskelgewebe, subkutanem Bindegewebe und der Dermis von Nagern und in einer Vielfalt von verschiedenen Tumoren menschlichen und nicht-menschlichen Ursprungs, einschließlich Mammakarzinom, Hautkarzinom und -papillom, Dickdarmkarzinom, Hirngliom und anderen in Nagermodellen sein kann. Siehe US 2003/0054990 mit dem Titel: Methods of Treating Tumors and Related Conditions Using Neural Thread Proteins.
Bestimmte Peptidsequenzen und -Fragmente von AD7c-NTP und anderen Spezies von NTP haben sich auch als wirksame Mittel zum Bewirken von Zelltod in vitro in Gliom- und Neuroblastom-Zellkulturen und/oder in vivo in normalem Muskelgewebe, subkutanem Bindegewebe, der Dermis und anderem Gewebe von Nagern erwiesen. Siehe US 2003/0096350 mit dem Titel: Peptides Effective In The Treatment of Tumors And Other Conditions Requiring The Removal Or Destruction Of Cells; US 2003/0096756 mit dem Titel: Peptides Effective In The Treatment of Tumors And Other Conditions Requiring The Removal Or Destruction Of Cells; und US 2003/0109437 mit dem Titel: Peptides Effective In The Treatment of Tumors And Other Conditions Requiring The Removal Or Destruction Of Cells.
Die US 5,948,634 offenbart ein mer-neurales 122-Faserprotein sowie NTP-hergeleitete Moleküle und Fragmente davon zur Behandlung von neuronaler Degeneration vom Alzheimertyp.
Es bleibt auf dem Fachgebiet ein Bedarf an neuen, weniger toxischen Behandlungen zur Behandlung von unerwünschten Zellelementen. Die vorliegende Erfindung erfüllt diesen Bedarf.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Diese Erfindung basiert teilweise auf der Entdeckung, dass Peptide, die Aminosäuresequenzen enthalten, die einem Teil der Aminosäuresequenzen von anderen Spezies von anderen neuralen Faserproteinen als AD7c-NTP entsprechen, in der Lage sind, unerwünschte Zellproliferationen zu behandeln und/oder abzutöten. Diese unerwünschten Zellproliferationen umfassen unter anderem gutartige und maligne Tumore, glanduläre (z. B. Prostata) Hyperplasie, unerwünschtes Gesichtshaar, Warzen und unerwünschtes Fettgewebe.
Die vorliegende Erfindung ist auf NTP-Peptide, bestehend aus den Aminosäuresequenzen SEQ ID NR 9-15, und die Verwendung derartiger Peptide zur Behandlung von unerwünschten Zellproliferationen (gutartigen und malignen Tumoren, glandulärer (z. B. Prostata) Hyperplasie, unerwünschtem Gesichtshaar, Warzen und unerwünschtem Fettgewebe) gerichtet.
Ein derartiges Peptid ("NTP-Peptid") kann alleine oder konjugiert mit einem Träger oder einem Antikörper verabreicht werden. Das NTP-Peptid kann intramuskulär, oral, intravenös, intraperitoneal, intrazerebral (intraparenchymal), intrazerebroventrikulär, intratumoral, intraläsional, intradermal, intrathekal, intranasal, intraokulär, intraarteriell, topisch, transdermal, über ein Aerosol, eine Infusion, Bolusinjektion, Implantationsvorrichtung, ein System mit Langzeitwirkung usw., entweder allein oder mit einem Träger konjugiert, verabreicht werden.
Zusätzlich kann das NTP-Peptid zusammen mit anderen Therapien zur Behandlung von gutartigen und malignen Tumoren und anderem unerwünschtem oder schädlichem Zellwachstum verwendet werden.
KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN
1: zeigt die vollständigen Aminosäuresequenzen des neuralen 122-Aminosäuren-Faserproteins (Sequenz 40 der US-Patente mit den Nummern 5,830,670, 5,948,634 und 5,948,888; NCBI Entrez-Protein Zugang #AAE25447 PID g10048540) [SEQ ID NR. 1].
2: zeigt die vollständigen Aminosäuresequenzen des neuralen 112-Aminosäuren-Faserproteins (NCBI-Entrez-Protein Zugang #XP_032307 PID g15928971) [SEQ ID NR. 2].
3: zeigt die vollständigen Aminosäuresequenzen eines neuralen Faserprotein-artigen 106-Aminosäuren Proteins (NCBI-Entrez-Protein Zugang #AAH14951 PID g15928971) [SEQ ID NR. 3].
4: zeigt die vollständigen Aminosäuresequenzen des neuralen 98-Aminosäuren-Faserproteins (Sequenz 30 der US-Patente mit den Nummern 5,830,670, 5,948,634 und 5,948,888; NCBI Entrez-Protein Zugang #AAE25445, PID g10048538) [SEQ ID NR. 4].
5: zeigt die vollständigen Aminosäuresequenzen des neuralen 75-Aminosäuren-Faserproteins (Sequenz 48 der US-Patente mit den Nummern 5,830,670, 5,948,634 und 5,948,888; NCBI Entrez-Protein Zugang #AAE25448, PID g10048541) [SEQ ID NR. 5].
6: zeigt die vollständigen Aminosäuresequenzen des neuralen 68-Aminosäuren-Faserproteins (Sequenz 36 der US-Patente mit den Nummern 5,830,670, 5,948,634 und 5,948,888; NCBI Entrez-Protein Zugang #AAE25446, PID g10048539) [SEQ ID NR. 6].
7: zeigt die vollständigen Aminosäuresequenzen des neuralen 61-Aminosäuren-Faserprotein-artigen Proteins (NCBI-Entrez-Protein Zugang #AAH02534, PID g12803421) [SEQ ID NR. 7].
GENAUE BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
Die hier verwendeten Begriffe und Ausdrücke sind, wie nachstehend angegeben, definiert, wenn sie nicht anders spezifiziert sind.
In der gesamten Beschreibung schließen die Singularformen "ein", "eine" und "der/die/das" den Plural ein, wenn es nicht der Kontext eindeutig anders angibt. Somit schließt zum Beispiel eine Bezugnahme auf "eine Wirtszelle" eine Vielzahl derartiger Wirtszellen ein, und eine Bezugnahme auf "einen Antikörper" ist eine Bezugnahme auf einen oder mehrere Antikörper und Äquivalente davon, die den Fachleuten bekannt sind, und so weiter.
Der Begriff "AD7c-NTP" bezieht sich auf das ∼41-kD-Protein und das Gen und die Nucleinsäuresequenzen, die für dieses codieren, die in de la Monte et al., J. Clin. Invest., 100:3093-104 (1997), in Sequences 120 und 121 der US-Patente mit den Nummern 5,948, 634, 5,948,888 und 5,830,670 beschrieben sind.
Der Begriff "NTP" bezieht sich auf andere neurale Faserproteine und verwandte Moleküle (einschließlich Pankreas-Faserprotein) als AD7c-NTP, wie in den US-Patenten mit den Nummern 5,948,634, 5,948,888, 5,830,670 und 6,071,705 und in de la Monte et al., J. Neuropathol. Exp. Neural., 55(10):1038-50 (1996), de la Monte et al., J. Neural. Sci., 138(1-2):26-35 (1996); de la Monte et al., J. Neural. Sci., 135(2):118-25 (1996), de la Monte et al., J. Clin. Invest., 100:3093-3104 (1997) und de la Monte et al., Alz.. Rep., 2:327-332 (1999) beschrieben ist. Der Begriff "NTP" schließt ein, ist aber nicht beschränkt auf

(a) die ∼42-, ∼26-, ∼21-, ∼17-, ∼14- und ∼8-kD-Spezies von neuralem Faserprotein, wie in den US-Patenten mit den Nummern 5,948,634, 5,948,888, 5,830,670 und 6,071,705 sowie in de la Monte et al., J. Neuropathol. Exp. Neurol., 55(10):1038-50 (1996), de la Monte et al., J. Neurol. Sci., 138(1-2):26-35 (1996); de la Monte et al., J. Neurol. Sci., 135(2):118-25 (1996), de la Monte et al., J. Clin. Invest., 100:3093-3104 (1997) und de la Monte et al., Alz.. Rep., 2:327-332 (1999) beschrieben ist;
(b) Proteine, die spezifisch durch den monoclonalen Antikörper #2, der bei der American Type Culture Collection, Manassas, Va., unter der Zugangsnummer HB-12546 hinterlegt ist, oder durch den monoclonalen Antikörper #5, der bei der American Type Culture Collection, Manassas, Va., unter der Zugangsnummer HB-12545 hinterlegt ist, erkannt werden;
(c) Proteine, die durch das AD7c-NTP-Gen codiert sind, einschließlich Spleißvarianten;
(d) das neurale 122-Aminosäuren-Faserprotein, das in Sequenz 40 aus den US-Patenten mit den Nummern 5,830,670, 5,948,634 und 5,948,888 beschrieben und in NCBI-Entrez-Protein, Zugang #AAE25447, PID g10048540 aufgeführt ist, dessen Aminosäuresequenzen in 1 veranschaulicht sind ("NTP[122]");
(d) das neurale 112-Aminosäuren-Faserprotein, das in NCBI-Entrez-Protein, Zugang #XP_032307, PID g14725132 aufgeführt ist, dessen Aminosäuresequenzen in 2 veranschaulicht sind ("NTP[112]");
(f) ein neurales Faserprotein-artiges 106-Aminosäuren Protein, das in NCBI-Entrez-Protein Zugang #AAH14951 PID g15928971 aufgeführt ist, dessen Aminosäuresequenzen in 3 veranschaulicht sind ("NTP[106]");
(g) das neurale 98-Aminosäure-Faserprotein, das in Sequenz 30 aus den US-Patenten mit den Nummern 5,830,670, 5,948,634 und 5,948,888 beschrieben und in NCBI-Entrez-Protein, Zugang #AAE25445, PID g10048538 aufgeführt ist, dessen Aminosäuresequenzen in 4 veranschaulicht sind ("NTP[98]");
(h) das neurale 75-Aminosäuren-Faserprotein, das in Sequenz 48 aus den US-Patenten mit den Nummern 5,830,670, 5,948,634 und 5,948,888 beschrieben und in NCBI-Entrez-Protein, Zugang #AAE25448, PID g10048541 aufgeführt ist, dessen Aminosäuresequenzen in 5 veranschaulicht sind ("NTP[75]");
(i) das neurale 68-Aminosäuren-Faserprotein, das in Sequenz 36 aus den US-Patenten mit den Nummern 5,830,670, 5,948,634 und 5,948,888 beschrieben und in NCBI-Entrez-Protein, Zugang #AAE25446, PID g10048539 aufgeführt ist, dessen Aminosäuresequenzen in 6 veranschaulicht sind ("NTP[68]");
(j) das neurale Faserprotein-artige 61-Aminosäuren Protein, das in NCBI-Entrez-Protein, Zugang #AAH02534, PID g12803421 aufgelistet ist, dessen Aminosäuresequenzen in 7 veranschaulicht sind ("NTP[61]");
(k) Pankreas-Faserprotein;
(l) das neurale Pankreas-Faserprotein (nPTP), das in dem US-Patent Nr. 6,071,705 beschrieben ist; und
(m) Proteine, die spezifisch durch die Antikörper erkannt werden, die durch ein Hybridom aus der Gruppe, bestehend aus HB 9934, HB 9935 und HB 9936, erzeugt wurden, die bei der American Type Culture Collection hinterlegt sind.

Eine "Zusammensetzung", wie sie hier verwendet wird, bezieht sich breit auf irgendeine Zusammensetzung, die ein genanntes Peptid oder eine genannte Aminosäuresequenz enthält. Die Zusammensetzung kann eine trockene Formulierung, eine wässrige Lösung oder eine sterile Zusammensetzung umfassen. Zusammensetzungen, die NTP-Peptide umfassen, können als Hybridisierungssonden verwendet werden. Die Sonden können in gefriergetrockneter Form gelagert und mit einem Stabilisierungsmittel wie einem Kohlenhydrat assoziiert werden. Bei Hybridisierungen kann die Sonde in einer wässrigen Lösung, die Salze, z. B. NaCl, Reinigungsmittel, z. B. Natriumdodecylsulfat (SDS), und andere Komponenten enthält, z. B. Denhardt-Lösung, Trockenmilch, Lachssperma-DNA usw, ausgebracht werden.
Auf Aminosäuren und Aminosäurereste, die hier beschrieben werden, kann sich gemäß dem anerkannten Ein- oder Drei-Buchstaben-Code, der in der nachstehenden Tabelle angegeben ist, bezogen werden. Wenn es nicht anders spezifiziert ist, haben diese Aminosäuren oder Reste die natürlich vorkommende L-Stereoisomer-Form. Tabelle 1
Die vorliegende Erfindung ist auf eine Zusammensetzung gerichtet, die NTP-Peptide umfasst, wie vorstehend in dieser Erfindung definiert.
NTP-Peptide dieser Erfindung, die Aminosäuresequenzen enthalten, die einem Teil der Aminosäuresequenz für NTP[122] entsprechen, umfassen:

NTP[122]-Peptid #2 [SEQ ID NR. 9], NTP[122] p1-15 MMVCWNRFGKWVYFI Met-Met-Val-Cys-Trp-Asn-Arg-Phe-Gly-Lys-Trp-Val-Tyr-Phe-Ile
NTP[122]-Peptid #3[SEQ ID NR. 10], NTP[122] p16-30 SAIFNFGPRYLYHGV Ser-Ala-Ile-Phe-Asn-Phe-Gly-Pro-Arg-Tyr-Leu-Tyr-His-Gly-Val-
NTP[122]-Peptid #4 [SEQ ID NR. 11], NTP[122] p31-45 PFYFLILVRIISFLI Pro-Phe-Tyr-Phe-Leu-ne-Leu-Val-Arg-ne-Ile-Ser-Phe-Leu-ne
NTP[122]-Peptid #5 [SEQ ID NR. 12], NTP[122] p46-60 GDMEDVLLNCTLLKR Gly-Asp-Met-Glu-Asp-Val-Leu-Leu-Asn-Cys-Thr-Leu-Leu-Lys-Arg
NTP[122]-Peptid #6 [SEQ ID NR. 13], NTP[122] p60-75 SSRFRFWGALVCSMD Ser-Ser-Arg-Phe-Arg-Phe-Trp-Gly-Ala-Leu-Val-Cys-Ser-Met-Asp
NTP[122]-Peptid #7 [SEQ ID NR. 14], NTP[122] p76-90 SCRFSRVAVTYRFIT Ser-Cys-Arg-Phe-Ser-Arg-Val-Ala-Val-Thr-Tyr-Arg-Phe-Ile-Thr
NTP[122]-Peptid #8 [SEQ ID NR. 15], NTP[122] p91-105 LLNIPSPAVWMARNT Leu-Leu-Asn-Ile-Pro-Ser-Pro-Ala-Val-Trp-Met-Ala-Arg-Asn-Thr

In dem Maße, in dem ein NTP-Peptid die gewünschte biologische Aktivität aufweist, wird gefolgert, dass zwei derartige NTP-Peptide auch die gewünschte biologische Aktivität aufweisen würden, selbst wenn diese Segmente nicht innerhalb der Sequenz von Aminosäuren der Spezies von NTP zusammenhängen würden, von denen die NTP-Peptide hergeleitet wurden.
NTP-Peptide dieser Erfindung können hergestellt werden unter Verwendung von Verfahren, die den Fachleuten bekannt sind, wie rekombinante DNA-Technologie, Proteinsynthese und Isolation von natürlich vorkommenden NTP-Peptiden, NTP-Proteinen, AD7c-NTP-Protein und Fragmenten, Varianten, Derivaten und Homologen davon.
NTP-Peptide können durch Verwendung von Proteanen hergestellt werden, um das NTP-Peptid, NTP-Protein oder AD7c-NTP-Protein in das gewünschte NTP-Peptid zu spalten.
Ein NTP-Peptid kann unter Verwendung bekannter rekombinanter DNA-Technologieverfahren hergestellt werden, wie diejenigen, die in Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. [1989] und/oder Ausubel et al., Hrsg., Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishers Inc. and Wiley and Sons, N.Y. [1994] aufgeführt sind.
Ein Gen oder eine cDNA, das/die ein NTP-Peptid codiert, kann zum Beispiel durch Absuchen einer Genom- oder cDNA-Genbank oder durch PCR-Amplifikation erhalten werden. Sonden oder Primer, die zum Absuchen der Genbank nützlich sind, können basierend auf Sequenzinformationen für andere bekannte Gene oder Genfragmente von der gleichen oder einer verwandten Familie von Genen erzeugt werden, wie zum Beispiel konservierte Motive, die sich in anderen NTP-Peptiden finden. Zusätzlich kann, wenn ein Gen, das ein NTP-Peptid codiert, von einer Spezies identifiziert wurde, das gesamte oder ein Teil dieses Gens als eine Sonde verwendet werden, um homologe Gene von anderen Spezies zu identifizieren. Die Sonden oder Primer können verwendet werden, um cDNA-Banken von verschiedenen Gewebequellen abzusuchen, von denen angenommen wird, dass sie ein NTP-Peptid-Gen exprimieren. Typischerweise werden für das Absuchen Bedingungen hoher Stringenz verwendet, um die Anzahl an falschen positiven Ergebnissen, die aus der Suche erhalten werden, zu minimieren.
Ein anderes Mittel zum Herstellen eines Gens, das ein NTP-Peptid codiert, besteht darin, eine chemische Synthese unter Verwendung von dem Fachmann bekannten Verfahren einzusetzen, wie diejenigen, die von Engels et al,. Angew. Chem. Intl. Aufl., 28:716-734 [1989] beschrieben sind. Diese Verfahren schließen unter anderem die Phosphotriester-, Phosphoramidit- und H-Phosphonat-Verfahren zur Nucleinsäuresynthese ein. Ein bevorzugtes Verfahren für eine derartige chemische Synthese ist die Polymer-gestützte Synthese unter Verwendung von Standard-Phosphoramiditchemie. Typischerweise hat die DNA, die ein NTP-Peptid codiert, eine Länge von mehreren hundert Nucleotiden. Nucleinsäuren, die größer als etwa 100 Nucleotide sind, können unter Verwendung dieser Verfahren als mehrere Fragmente synthetisiert werden. Die Fragmente können dann miteinander ligiert werden, um das Volllängen-NTP-Peptid zu bilden. Normalerweise hat das DNA-Fragment, das das Aminoende des Proteins codiert, ein ATG, das einen Methioninrest codiert. Dieses Methionin kann gegebenenfalls auf der reifen Form des NTP-Peptids vorhanden sein, je nachdem, ob das in der Wirtszelle erzeugte Protein so gestaltet ist, dass es von dieser Zelle sezerniert wird.
Das Gen, die cDNA oder das Fragment davon, das/die das NTP-Peptid codiert, kann in einen geeigneten Expressions- oder Amplifikations-Vektor unter Verwendung von Standard-Ligierungstechniken eingefügt werden. Der Vektor wird normalerweise so ausgewählt, dass er in der besonderen verwendeten Wirtszelle funktional ist (d. h. der Vektor ist mit der Wirtszellenmaschinerie so kompatibel, dass die Amplifikation des Gens und/oder die Expression des Gens vorkommen kann). Das Gen, die cDNA oder das Fragment davon, das/die das NTP-Peptid codiert, kann in prokaryontischen, Hefe-, Insekten (Baculovirus-Systeme) und/oder eukaryontischen Wirtszellen amplifiziert/exprimiert werden. Die Auswahl der Wirtszelle hängt teilweise davon ab, ob das NTP-Peptid glycosyliert und/oder phosphoryliert werden soll. In diesem Fall werden Hefe-, Insekten- oder Säuger-Wirtszellen bevorzugt.
Typischerweise enthalten die in irgendeiner der Wirtszellen verwendeten Vektoren mindestens eine flankierende 5'-Sequenz (auch als Promotor bezeichnet) und auch andere regulatorische Elemente wie einen (oder mehrere) Enhancer, ein Replikationsursprungselement, ein Transkriptionsterminationselement, eine vollständige Intronsequenz, die eine Donor- und eine Akzeptorspleißstelle enthält, eine Signalpeptidsequenz, ein Ribosomen-Bindungsstellenelement, eine Polyadenylierungssequenz, eine Polylinkerregion für die Insertion der Nucleinsäure, die das zu exprimierende Polypeptid codiert, und ein selektierbares Markerelement. Jedes dieser Elemente wird nachstehend besprochen. Gegebenenfalls kann der Vektor eine Markierungssequenz enthalten, d. h. ein Oligonucleotidmolekül, das sich an dem 5'- oder 3'-Ende der das NTP-Peptid codierenden Sequenz befindet; das Oligonucleotidmolekül codiert polyHis (wie hexaHis) oder eine andere Markierung wie FLAG, HA (Hämagglutinin-Influenza-Virus) oder myc, wofür es handelsübliche Antikörper gibt. Diese Markierung wird normalerweise bei Expression des Polypeptids mit dem Polypeptid verschmolzen und kann als Mittel zur Affinitätsreinigung des NTP-Peptids aus der Wirtszelle dienen. Die Affinitätsreinigung kann zum Beispiel durch Säulenchromatographie unter Verwendung von Antikörpern gegen die Markierung als eine Affinitätsmatrix erfolgen. Gegebenenfalls kann die Markierung anschließend durch verschiedene Mittel wie unter Verwendung von bestimmten Peptidasen aus dem gereinigten NTP-Protein oder NTP-Peptid entfernt werden.
Die menschliche Immunglobulin-Gelenk-Region und Fc-Region könnte von einem Fachmann entweder an den N-Terminus oder an den C-Terminus des NTP-Peptids fusioniert werden. Das daraus folgende Fc-Fusionsprotein könnte unter Verwendung einer Protein-A-Affinitätssäule gereinigt werden. Es ist bekannt, dass Fc eine lange pharmakokinetische Halbwertszeit in vivo aufweist, und es wurde festgestellt, dass Proteine, die mit Fc fusioniert sind, eine im Wesentlichen größere Halbwertszeit in vivo zeigen als das nicht-fusionierte Gegenstück. Die Fusion an die Fc-Region ermöglicht auch eine Dimerisierung/Multimerisierung des Moleküls, das für die Bioaktivität mancher Moleküle nützlich sein kann.
Die flankierende 5'-Sequenz kann homolog (d. h. von der gleichen Spezies und/oder dem gleichen Stamm wie die Wirtszelle), heterolog (d. h. von einer anderen Spezies als die Spezies oder der Stamm der Wirtszelle), hybrid (d. h. eine Kombination von flankierenden 5'-Sequenzen von mehr als einer Quelle), synthetisch oder sie kann die flankierende 5'-Sequenz des nativen NTP-Peptid-Gens sein. Als solches kann die Quelle der flankierenden 5'-Sequenz jeder einzellige prokaryontische oder eukaryontische Organismus, jeder Organismus mit Wirbel oder wirbellose Organismus oder jede Pflanze sein, mit der Maßgabe, dass die flankierende 5'-Sequenz in der Wirtszellenmaschinerie funktional ist und durch diese aktiviert werden kann.
Die flankierenden 5'-Sequenzen, die in den Vektoren nützlich sind, können durch jedes von mehreren auf dem Fachgebiet bekannten Verfahren erhalten werden. Typischerweise werden hier nützliche flankierende 5'-Sequenzen, neben der das NTP-Peptid-Gen flankierenden Sequenz, zuvor durch Kartierung und/oder durch Restriktionsendonuclease-Verdau identifiziert worden sein und können somit unter Verwendung der geeigneten Restriktionsendonucleasen von der richtigen Gewebequelle isoliert werden. In manchen Fällen kann die gesamte Nucleotidsequenz der flankierenden 5'-Sequenz bekannt sein. Hier kann die flankierende 5'-Sequenz unter Verwendung der vorstehend beschriebenen Verfahren für Nucleinsäure-Synthese oder -Clonierung synthetisiert werden.
Wo alle oder nur ein Abschnitt der flankierenden 5'-Sequenz bekannt sind, kann sie unter Verwendung von PCR und/oder durch Absuchen einer Genbank mit geeigneten Oligonucleotid- und/oder flankierenden 5'-Sequenzfragmenten von der gleichen oder einer anderen Spezies erhalten werden.
Wenn die flankierende 5'-Sequenz nicht bekannt ist, kann ein Fragment von DNA, das eine flankierende 5'-Sequenz enthält, von einem größeren Stück DNA isoliert werden, das zum Beispiel eine codierende Sequenz oder sogar ein anderes Gen oder andere Gene enthalten kann. Die Isolierung kann durch Restriktionsendonuclease-Verdau unter Verwendung von einem oder mehreren sorgfältig ausgewählten Enzymen zum Isolieren des geeigneten DNA-Fragments erfolgen. Nach dem Verdau kann das gewünschte Fragment durch Agarosegelreinigung, Qiagen^®-Säule oder andere Verfahren, die dem Fachmann bekannt sind, isoliert werden. Die Auswahl von geeigneten Enzymen zum Erfüllen dieses Zwecks ist für einen durchschnittlichen Fachmann ohne weiteres offensichtlich.
Das Replikationsursprungselement ist normalerweise ein Teil der prokaryontischen Expressionsvektoren, die im Handel erworben werden, und unterstützt die Amplifikation des Vektors in einer Wirtszelle. Die Amplifikation des Vektors auf eine gewisse Kopienanzahl kann in manchen Fällen für eine optimale Expression des NTP-Peptids wichtig sein. Wenn der gewählte Vektor keine Replikationsursprungsstelle enthält, kann einer auf Basis einer bekannten Sequenz chemisch synthetisiert und in den Vektor ligiert werden. Das Transkriptionsterminationselement befindet sich normalerweise 3' von dem Ende der das NTP-Peptid codierenden Sequenz und dient der Terminierung der Transkription des NTP-Peptids. Normalerweise ist das Transkriptionsterminationselement in prokaryontischen Zellen ein G-C-reiches Fragment, gefolgt von einer poly-T-Sequenz. Während das Element von einer Genbank cloniert oder im Handel als Teil eines Vektors erworben werden kann, kann es auch ohne weiteres unter Verwendung von Verfahren zur Nucleinsäuresynthese, wie vorstehend beschrieben, synthetisiert werden.
Ein selektierbares Markergenelement codiert ein Protein, das für das Überleben und Wachstum einer Wirtszelle, die in einem selektiven Kultursubstrat wächst, notwendig ist. Typische Selektionsmarkergene codieren Proteine, die (a) eine Resistenz gegen Antibiotika oder andere Toxine, z. B. Ampicillin, Tetracyclin oder Kanamycin für prokaryontische Wirtszellen verleihen, (b) auxotrophe Mängel der Zelle komplementieren; oder (c) wesentliche Nährstoffe zuführen, die von komplexen Substraten nicht erhältlich sind.
Bevorzugte selektierbare Marker sind das Kanamycin-Resistenz-Gen, das Ampicillin-Resistenz-Gen und das Tetracyclin-Resistenz-Gen.
Das Ribosomen-Bindungselement, das üblicherweise als Shine-Dalgarno-Sequenz (Prokaryont) oder die Kozak-Sequenz (Eukaryont) bezeichnet wird, ist normalerweise für die Translationsinitiierung von mRNA notwendig. Das Element befindet sich normalerweise 3' zum Promotor und 5' zu der codierenden Sequenz des zu synthetisierenden NTP-Peptids. Die Shine-Dalgarno-Sequenz variiert, sie ist jedoch normalerweise ein Polypurin (d. h. mit einem hohen A-G-Gehalt). Viele Shine-Dalgarno-Sequenzen wurden identifiziert, von denen jede ohne weiteres unter Verwendung der vorstehend aufgeführten Verfahren synthetisiert und in einem prokaryontischen Vektor verwendet werden kann.
In den Fällen, in denen es wünschenswert ist, dass das NTP-Peptid von der Wirtszelle sezerniert wird, kann eine Signalsequenz verwendet werden, um das NTP-Peptid aus der Wirtszelle, wo es synthetisiert wird, zu leiten, und der Carboxy-terminale Teil des Proteins kann deletiert werden, um eine Membranverankerung zu vermeiden. Typischerweise befindet sich die Signalsequenz in der codierenden Region des NTP-Peptid-Gens oder der cDNA oder direkt an dem 5'-Ende der das NTP-Peptid-Gen codierenden Region. Es wurden viele Signalsequenzen identifiziert, und einige von ihnen, die in der ausgewählten Wirtszelle funktional sind, können zusammen mit dem NTP-Peptid-Gen oder der cDNA verwendet werden. Daher kann die Signalsequenz zu dem NTP-Peptid-Gen oder der cDNA homolog oder heterolog sein, und sie kann zu dem NTP-Peptid-Gen oder der cDNA homolog oder heterolog sein. Zusätzlich kann die Signalsequenz unter Verwendung der vorstehend aufgeführten Verfahren chemisch synthetisiert werden. In den meisten Fällen führt die Sezernierung des Polypeptids von der Wirtszelle über das Vorliegen eines Signalpeptids zum Entfernen des Amino-terminalen Methionins von dem Polypeptid.
In vielen Fällen wird die Transkription des NTP-Peptid-Gens oder der cDNA durch das Vorhandensein von einem oder mehreren Introns in dem Vektor erhöht; dies gilt insbesondere, wenn das NTP-Peptid in eukaryontischen Wirtszellen hergestellt wird, insbesondere in Säuger-Wirtszellen. Die verwendeten Introns können innerhalb des NTP-Peptid-Gens natürlich vorkommen, insbesondere, wenn das verwendete Gen eine Volllängen-Genomsequenz oder ein Fragment von dieser ist. Wenn das Intron nicht innerhalb des Gens natürlich vorkommt (wie bei den meisten cDNAs), kann das Intron (können die Introns) von einer anderen Quelle erhalten werden. Die Position des Introns in Bezug auf die flankierende Sequenz und das NTP-Peptid-Gen ist im Allgemeinen wichtig, da das Intron transkribiert werden muss, um wirksam zu sein. So ist, wenn das NTP-Peptid-Gen, das in den Expressionsvektor eingefügt ist, ein cDNA-Molekül ist, die bevorzugte Position für das Intron 3' zu dem Transkriptionsausgangsort und 5' zu der polyA-Transkriptionsterminationssequenz. Vorzugsweise befinden sich bei der NTP-Peptid-cDNA das Intron oder die Introns auf einer oder der anderen Seite (z. B. 5' oder 3') der cDNA, so dass sie nicht diese codierende Sequenz unterbrechen. Jedes Intron von jeder Quelle, einschließlich aller viralen, prokaryontischen und eukaryontischen (Pflanze oder Tier) Organismen, kann verwendet werden, um diese Erfindung durchzuführen, mit der Maßgabe, dass es mit der Wirtszelle (den Wirtszellen), in die es eingeführt wird, kompatibel ist. Hierbei auch eingeschlossen sind synthetische Introns. Gegebenenfalls kann mehr als ein Intron in dem Vektor verwendet werden.
Wenn ein oder mehrere der vorstehend aufgeführten Elemente nicht bereits in dem zu verwendenden Vektor vorliegen, können sie individuell erhalten und in den Vektor ligiert werden. Verfahren, die verwendet werden, um jedes der Elemente zu erhalten, sind dem Fachmann bekannt und mit den vorstehend aufgeführten Verfahren vergleichbar (d. h. Synthese der DNA, Absuchen der Genbank und dergleichen).
Die Endvektoren, die verwendet werden, um diese Erfindung durchzuführen, können aus Ausgangsvektoren konstruiert werden, wie ein handelsüblicher Vektor. Derartige Vektoren können gegebenenfalls einige der Elemente enthalten, die in den vervollständigten Vektor einzuschließen sind. Wenn keines der gewünschten Elemente in dem Ausgangsvektor vorliegt, kann jedes Element individuell in den Vektor durch Schneiden des Vektors mit der (den) geeigneten Restriktionsendonuclease(n) ligiert werden, so dass die Enden des in den Vektor zu ligierenden Elements und die Enden des Vektors zur Ligierung kompatibel sind. In manchen Fällen kann es notwendig sein, die miteinander zu ligierenden Enden in glatte Enden zu überführen, um eine zufriedenstellende Ligierung zu erhalten. Das Überführen in glatte Enden erfolgt zunächst durch Füllen der "klebrigen Enden" unter Verwendung von Klenow-DNA-Polyermase oder T4-DNA-Polymerase in Gegenwart von allen vier Nucleotiden. Dieses Verfahren ist auf dem Fachgebiet bekannt und wird zum Beispiel in Sambrook et al., wie vorstehend genannt, beschrieben. In einer anderen Ausführungsform können zwei oder mehr der in den Vektor einzufügenden Elemente zunächst miteinander ligiert werden (wenn sie nebeneinander positioniert werden sollen) und dann in den Vektor ligiert werden.
Ein zusätzliches Verfahren zur Konstruktion des Vektors besteht darin, alle Ligierungen der verschiedenen Elemente gleichzeitig in einem Reaktionsgemisch durchzuführen. Hier werden viele Unsinn- oder nichtfunktionale Vektoren auf Grund nicht geeigneter Ligierung oder Insertion der Elemente erzeugt, aber der funktionale Vektor kann durch Restriktionsendonuclease-Verdau identifiziert und ausgewählt werden.
Bevorzugte Vektoren zur Durchführung dieser Erfindung sind diejenigen, die mit Bakterien-, Insekten- und Säuger-Wirtszellen kompatibel sind. Derartige Vektoren umfassen unter anderem pCRII, pCR3 und pcDNA3.1 (Invitrogen Company, San Diego, Calif.), pBSII (Stratagene Company, La Jolla, Kalif.), pET15b (Novagen, Madison, Wis.), PGEX (Pharmacia Biotech, Piscataway, N. J.), pEGFP-N2 (Clontech, Palo Alto, Kalif.), pETL (BlueBacII; Invitrogen), und pFastBacDual (Gibco/BRL, Grand Island, N. Y.).
Nachdem der Vektor konstruiert wurde und ein Nucleinsäuremolekül, das das NTP-Peptid codiert, in die geeignete Stelle des Vektors eingefügt wurde, kann der vervollständigte Vektor zur Amplifikation und/oder Polypeptid-Expression in eine geeignete Wirtszelle eingefügt werden. Wirtszellen können prokaryontische Wirtszellen (wie E. coli) oder eukaryontische Wirtszellen (wie eine Hefezelle, eine Insektenzelle oder eine Wirbeltierzelle) sein. Die Wirtszelle kann, wenn sie unter geeigneten Bedingungen kultiviert wird, das NTP-Peptid synthetisieren, das anschließend von dem Kulturmedium (wenn die Wirtszelle dieses in das Medium sezerniert) oder direkt von der Wirtszelle, die dieses erzeugt (wenn es nicht sezerniert wird), gewonnen werden kann.
Nach der Gewinnung kann das NTP-Peptid unter Verwendung von Verfahren wie Molekularsieb-Chromatographie, Affinitätschromatographie und dergleichen gereinigt werden. Die Auswahl der Wirtszelle für die NTP-Peptid-Erzeugung wird teilweise davon abhängen, ob das NTP-Peptid glycosyliert oder phosphoryliert werden soll (in welchem Fall eukaryontische Wirtszellen bevorzugt werden), und von der Art, wie die Wirtszelle in der Lage ist, das Protein in seine native tertiäre Struktur zu falten (z. B. geeignete Ausrichtung von Disulfidbrücken usw.), so dass biologisch aktives Protein durch das NTP-Peptid erzeugt wird, das eine biologische Aktivität aufweist; das NTP-Peptid kann nach der Synthese unter Verwendung von geeigneten chemischen Bedingungen, wie nachstehend besprochen, gefaltet werden. Geeignete Zellen oder Zelllinien können Säugerzellen wie Ovariumzellen von chinesischen Hamstern (CHO), menschliche embryonale Nieren (HEK)-293, 293T-Zellen oder 3T3-Zellen sein. Die Auswahl von geeigneten Säuger-Wirtszellen und Verfahren zur Transformation, Kultur, Amplifikation, zum Absuchen und zur Produkterzeugung und -reinigung sind auf dem Fachgebiet bekannt. Andere geeignete Säuger-Zelllinien sind die Affen-COS-1- und -COS-7-Zelllinien und die CV-1-Zelllinie. Weitere beispielhafte Säuger-Wirtszellen umfassen Primaten-Zelllinien und Nager-Zelllinien, einschließlich transformierte Zelllinien. Normale diploide Zellen, Zellstämme, die von der in-vitro-Kultur von primärem Gewebe hergeleitet sind, sowie primäre Explantate sind auch geeignet. Kandidatenzellen können im Selektionsgen genotypisch defizient sein, oder sie können ein dominant wirkendes Selektionsgen enthalten. Andere geeignete Säuger-Zelllinien umfassen unter anderem Maus Neuroblastom-N2A-Zellen, HeLa, Maus-L-929-Zellen, 3T3-Linien, hergeleitet von Schweizer, Balb-c- oder NIH-Mäusen, BHK- oder HaK-Hamster-Zelllinien.
Ähnlich nützlich als Wirtszellen, die für die vorliegende Erfindung geeignet sind, sind Bakterienzellen. Zum Beispiel sind die verschiedenen Stämme von E. coli (z. B. HB101, DHS.alpha, DH10 und MC1061) als Wirtszellen auf dem Gebiet der Biotechnologie bekannt. Verschiedene Stämme von B. subtilis, Pseudomonas spp., anderen Bacillus spp., Streptomyces spp. und dergleichen können auch in diesem Verfahren verwendet werden. Viele Stämme von Hefezellen, die den Fachleuten bekannt sind, sind auch als Wirtszellen zur Expression der Polypeptide der vorliegenden Erfindung erhältlich.
Zusätzlich können, wenn es gewünscht ist, Insekten-Zellsysteme bei den Verfahren der vorliegenden Erfindung genutzt werden. Derartige Systeme werden zum Beispiel in Kitts et al. (Biotechniques, 14:810-817 [1993]), Lucklow (Curr. Opin. Biotechnol., 4:564-572 [1993]) und Lucklow et al. (J. Virol., 67:4566-4579 [1993]) beschrieben. Bevorzugte Insektenzellen sind Sf-9 und Hi5 (Invitrogen, Carlsbad, Kalif.).
Die Insertion (auch als Transformation oder Transfektion bezeichnet) des Vektors in die ausgewählte Wirtszelle kann unter Verwendung derartiger Verfahren wie Calciumchlorid, Elektroporation, Mikroinjektion, Lipofektion oder dem DEAE-Dextranverfahren erfolgen. Das ausgewählte Verfahren wird teilweise eine Funktion der Art der zu verwendenden Wirtszelle sein. Diese Verfahren und andere geeignete Verfahren sind dem Fachmann bekannt und zum Beispiel in Sambrook et al., wie vorstehend angegeben, aufgeführt.
Die Wirtszellen, die den Vektor enthalten (d. h. transformiert oder transfiziert) können unter Verwendung von Standardmedien, die dem Fachmann bekannt sind, angezogen werden. Die Medien enthalten normalerweise alle Nährstoffe, die für das Wachstum und Überleben der Zellen notwendig sind. Geeignete Substrate zum Kultivieren von E. coli-Zellen sind zum Beispiel Luria Broth (LB) und/oder Terrific Broth (TB). Geeignete Medien zum Kultivieren von eukaryontischen Zellen sind RPMI 1640, MEM, DMEM, von denen alle mit Serum und/oder Wachstumsfaktoren ergänzt werden können, wie es von der besonderen kultivierten Zelllinie benötigt wird. Ein geeignetes Medium für Insektenkulturen ist Grace-Medium, gegebenenfalls ergänzt mit Yeastolat, Lactalbuminhydrolysat und/oder fötalem Kälberserum. Typischerweise wird ein Antibiotikum oder eine andere Verbindung, die zum selektiven Wachstum der transformierten Zellen nützlich ist, dem Medium nur als eine Ergänzung zugegeben. Die zu verwendende Verbindung wird durch das selektierbare Markerelement, das auf dem Plasmid vorliegt, mit dem die Wirtszelle transformiert wurde, bestimmt. Wenn zum Beispiel das selektierbare Markerelement Kanamycin-Resistenz ist, ist die dem Kulturmedium zugegebene Verbindung Kanamycin.
Die Menge an NTP-Peptid, die in der Wirtszelle erzeugt wird, kann unter Verwendung von auf dem Fachgebiet bekannten Standardverfahren bewertet werden. Derartige Verfahren umfassen unter anderem Western-Blot-Analyse, SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese, nicht denaturierende Gelelektrophorese, HPLC-Trennung, Massenspektroskopie, Immunfällung und/oder Aktivitätstests wie DNA-bindende Gel-Shifttests.
Wenn das NTP-Peptid so gestaltet wurde, dass es von den Wirtszellen sezerniert wird, kann man den Großteil des NTP-Peptids in dem Zellkulturmedium finden. Auf diese Weise hergestellte Proteine besitzen normalerweise kein aminoterminales Methionin, da es während der Sekretion von der Zelle entfernt wird. Wenn jedoch das NTP-Peptid nicht von den Wirtszellen sezerniert wird, liegt es in dem Cytoplasma und/oder dem Kern (bei eukaryontischen Wirtszellen) oder in dem Cytosol (bei Gram-negativen Bakterienwirtszellen) vor und kann ein aminoterminales Methionin haben.
Bei NTP-Peptid, das sich in dem Wirtszellencytoplasma und/oder -kern befindet, werden die Wirtszellen normalerweise zunächst mechanisch oder mit Detergens gespalten, um den intrazellulären Inhalt in eine gepufferte Lösung freizusetzen. NTP-Peptid kann dann von dieser Lösung isoliert werden.
Die Reinigung von NTP-Peptid aus der Lösung kann unter Verwendung einer Vielfalt von Techniken erfolgen. Wenn das Protein so synthetisiert wurde, dass es eine Markierung, wie hexaHistidin (z. B. NTP-Peptid/hexaHis) oder ein anderes kleines Peptid wie FLAG (Sigma-Aldrich, St. Louis, MI) oder Calmodulin-bindendes Peptid (Stratagene, La Jolla, CA) entweder an seinem Carboxyl- oder seinem Aminoende enthält, kann es im Wesentlichen in einem Verfahren in einem Schritt gereinigt werden, indem die Lösung durch eine Affinitätssäule geschickt wird, wobei die Säulenmatrix eine hohe Affinität für die Markierung oder direkt für das Protein aufweist (d. h. ein monoclonaler Antikörper, der spezifisch das NTP-Peptid erkennt). Zum Beispiel bindet sich Polyhistidin mit einer großen Affinität und Spezifizität an Nickel, Zink und Kobalt; somit kann immobilisierte Metallionen-Affinitätschromatographie für die Reinigung von NTP-Peptid/polyHis verwendet werden, wobei ein auf Nickel basierendes Affinitätsharz (wie im Quiagen-QIAexpress-System oder Invitrogen-Xpress System verwendet) oder ein auf Kobalt basierendes Affinitätsharz eingesetzt wird (wie in BD Biosciences-CLONTECH-Talon-System verwendet). (Siehe zum Beispiel Ausubel et al., Hrsg., Current Protocols in Molecular Biology, Abschnitt 10.11.8, John Wiley & Sons, New York [1993]).
Wenn das NTP-Peptid ohne eine angeheftete Markierung hergestellt wird und keine Antikörper verfügbar sind, können andere bekannte Verfahren zur Reinigung verwendet werden. Derartige Verfahren umfassen unter anderem Ionenaustausch-Chromatographie, Hydroxyapatit-Chromatographie, hydrophobe Wechselwirkungschromatographie, Molekularsieb-Chromatographie, HPLC, native Gelelektrophorese in Kombination mit Gelelution und präparatives isoelektrisches Fokussieren (Isoprime-Maschine/Technik, Hoefer Scientific). In manchen Fällen können zwei oder mehr von diesen Techniken kombiniert werden, um eine erhöhte Reinheit zu erreichen.
Wenn angenommen wird, dass sich das NTP-Peptid in erster Linie intrazellulär befindet, kann das intrazelluläre Material (einschließlich Einschlusskörpern bei Gram-negativen Bakterien) unter Verwendung irgendeiner dem Fachmann bekannten Standardtechnik von der Wirtszelle extrahiert werden. Zum Beispiel können die Wirtszellen lysiert werden, um den Gehalt an Periplasma/Cytoplasma durch French-Presse, Homogenisierung und/oder Beschallung, gefolgt von Zentrifugieren, freizusetzen. Wenn das NTP-Peptid Einschlusskörper in dem Cytosol gebildet hat, können sich die Einschlusskörper oft an die innere und/oder äußere Zellmembran binden und finden sich somit in erster Linie in dem Pelletmaterial nach dem Zentrifugieren. Das Pelletmaterial kann dann bei pH-Wert-Extremen oder mit einem chaotropen Wirkstoff wie einem Detergens, Guanidin, Guanidinderivaten, Harnstoff oder Harnstoffderivaten in Gegenwart eines Reduktionsmittels wie Dithiothreit bei einem alkalinen pH-Wert oder tris-Carboxyethylphosphin bei einem sauren pH-Wert, behandelt werden, um die Einschlusskörper freizusetzen, auseinanderzubrechen und zu solubilisieren. Das NTP-Peptid in seiner nun löslichen Form kann dann unter Verwendung von Gelelektrophorese, Immunfällung oder dergleichen analysiert werden. Falls es gewünscht ist, das NTP-Peptid zu isolieren, kann die Isolierung unter Verwendung von Standardverfahren erfolgen, wie sie nachstehend und in Marston et al., Meth. Enz., 182:264-275 [1990], angegeben sind.
In manchen Fällen kann das NTP-Peptid nach der Isolierung nicht biologisch aktiv sein. Verschiedene Verfahren zum Rückfalten oder Überführen des Polypeptids in seine tertiäre Struktur und Erzeugen von Disulfidverbindungen können verwendet werden, um die biologische Aktivität wiederherzustellen. Derartige Verfahren umfassen das Aussetzen des solubilisierten Polypeptids einem pH-Wert normalerweise oberhalb von 7 und in Gegenwart einer besonderen Konzentration eines chaotropen Mittels. Die Auswahl eines chaotropen Mittels ist der Auswahl, die für die Solubilisierung von Einschlusskörpern verwendet wird, sehr ähnlich, erfolgt aber normalerweise bei einer geringeren Konzentration und ist nicht unbedingt das gleiche chaotrope Mittel, wie es für die Solubilisierung verwendet wird. In den meisten Fällen enthält die Rückfaltungs-/Oxidationslösung auch ein Reduktionsmittel oder das Reduktionsmittel plus dessen oxidierte Form in einem spezifischen Verhältnis, um ein besonderes Redoxpotential zu erzeugen, was das Auftreten von Disulfid-Hin-und Herverschiebung bei der Bildung der Cysteinbrücke(n) des Proteins ermöglicht. Manche der üblicherweise verwendeten Redoxpaare umfassen Cystein/Cystamin, Glutathion(GSH)/Dithiobis-GSH, Kupferchlorid, Dithiothreit(DTT)/Dithian DTT, 2-Mercaptoethanol(bME)/Dithio-b (ME). In vielen Fällen ist ein Co-Lösungsmittel notwendig, um die Wirksamkeit der Rückfaltung zu erhöhen, und die üblicheren Reagenzien, die zu diesem Zweck verwendet werden, umfassen Glycerin, Polyethylenglykol mit verschiedenen Molekulargewichten und Arginin.
Wenn sich keine NTP-Peptid-Einschlusskörper zu einem wesentlichen Maß in der Wirtszelle bilden, findet sich das NTP-Peptid in erster Linie in dem Überstand nach der Zentrifugierung des Zellhomogenats, und das NTP-Peptid kann von dem Überstand unter Verwendung von Verfahren, wie sie nachstehend angegeben sind, isoliert werden.
In den Situationen, in denen es bevorzugt ist, das NTP-Peptid partiell oder vollständig zu isolieren, kann die Reinigung unter Verwendung von dem Fachmann bekannten Standardverfahren erfolgen. Derartige Verfahren umfassen unter anderem die Trennung durch Elektrophorese, gefolgt von Elektroelution, verschiedene Arten von Chromatographie (Immunaffinität, Molekularsieb und/oder Ionenaustausch) und/oder Hochdruck-Flüssigchromatographie. In manchen Fällen kann es bevorzugt sein, mehr als eines dieser Verfahren zur vollständigen Reinigung zu verwenden.
Zusätzlich zum Herstellen und Reinigen von NTP-Peptiden unter Verwendung von rekombinanten DNA-Techniken können die NTP-Peptide durch chemische Syntheseverfahren hergestellt werden (wie Festphase-Peptidsynthese), und zwar unter Verwendung von auf dem Fachgebiet bekannten Techniken, wie von Merrifield et al., J. Am. Chem. Soc., 85:2149 [1963], Houghten et al., Proc Natl Acad. Sci USA, 82:5132 [1985], und Stewart and Young, Solid Phase Peptide Synthesis, Pierce Chemical Co., Rockford, III. [1984], aufgeführt. Derartige Polypeptide können mit oder ohne Methionin am Aminoende synthetisiert werden. Chemisch synthetisierte NTP-Proteine oder NTP-Peptide können unter Verwendung von Verfahren oxidiert werden, die in diesen Referenzen aufgeführt sind, um Disulfidbrücken zu bilden. Es wird erwartet, dass die NTP-Proteine oder NTP-Peptide eine biologische Aktivität aufweisen, die vergleichbar mit NTP-Proteinen oder NTP-Peptiden ist, die rekombinant hergestellt oder aus natürlichen Quellen gereinigt wurden, und somit austauschbar mit rekombinantem oder natürlichem NTP-Protein oder NTP-Peptid verwendet werden können.
NTP-Peptide und Salze davon können auch unter Verwendung von herkömmlichen Peptidsynthese-Techniken, die dem Fachmann bekannt sind, hergestellt werden. Diese Techniken umfassen chemische Kopplungsverfahren (vgl. Wunsch, E: "Methoden der organischen Chemie", Band 15, Band 1+2, Synthese von Peptiden, Thieme Verlag, Stuttgart (1974), und Barrany, G.: Marrifield, R. B.: "The Peptides," Hrsg. E. Gross, J. Meienhofer, Band 2, Kapitel 1, S. 1-284, Academic Press (1980)), enzymatische Kopplungsverfahren (vgl. Widmer, F. Johansen, J. T., Carlsberg Res. Commun., Band 44, S. 37-46 (1979); Kullmann, W.: "Enzymatic Peptide Synthesis", CRC Press Inc. Boca Raton, Fla. (1987); und Widmer, F. Johansen, J. T. in "Synthetic Peptides in Biology and Medicine," Hrsg. Alitalo, K., Partanen, P., Vatieri, A., S. 79-86, Elsevier, Amsterdam (1985)), oder eine Kombination von chemischen and enzymatischen Verfahren, wenn dies für die Verfahrensgestaltung und Wirtschaftlichkeit vorteilhaft ist.
Es gibt heute eine Reihe von Organisationen, die in der Lage sind, die hier beschriebenen NTP-Peptide zu synthetisieren. Wenn zum Beispiel die Sequenz eines NTP-Peptids gegeben ist, kann die Organisation das Peptid synthetisieren und das synthetisierte Peptid mit einer beigefügten Dokumentation und einem Identitätsnachweis des Peptids zuschicken.
Die NTP-Peptide der Erfindung sind nützlich zur Behandlung von Zuständen, die das Entfernen von Zellen wie gutartigen und malignen Tumoren, glandulärer (z. B. Prostata) Hyperplasie, unerwünschtem Gesichtshaar, Warzen und unerwünschtem Fettgewebe, oder die Hemmung oder Vermeidung von unerwünschter Zellproliferation wie Stenose eines Stent erfordern.
Der Zustand kann zum Beispiel Tumore von Lunge, Brust, Magen, Bauchspeicheldrüse, Prostata, Blase, Knochen, Ovarium, Haut, Niere, Sinus, Dickdarm, Darm, Magen, Rektum, Speiseröhre, Blut, Hirn und seinen Schutzschichten, Rückenmark und seinen Schutzschichten, Muskel, Bindegewebe, Nebenniere, Nebenschilddrüse, Thyroidea, Uterus, Testis, Hypophyse, Geschlechtsorgane, Leber, Gallenblase, Auge, Ohr, Nase, Hals, Mandeln, Mund, Lymphknoten und Lymphsystem und anderen Organen sein.
Wie er hier verwendet wird, soll der Begriff "maligner Tumor" alle Formen von menschlichen Karzinomen, Sarkomen und Melanomen einschließen, die in den gering differenzierten, mittelgradig differenzierten und hochdifferenzierten Formen auftreten.
Diese Erfindung erfüllt den Bedarf in der Technik an Behandlungen, durch die gutartige Tumore mit einem geringeren Risiko und weniger der unerwünschten Nebenwirkungen der Chirurgie entfernt werden können. Ein Verfahren zum Entfernen von gutartigen Tumoren in chirurgisch gefährlichen Bereichen wie in tiefen Stellen in dem Körper (z. B. Hirn, Herz, Lunge und andere) wird insbesondere benötigt.
Die Behandlung von Zuständen, bei denen Zellen entfernt werden müssen, kann im Zusammenhang mit herkömmlichen Verfahren zur Behandlung derartiger Zustände verwendet werden, wie chirurgische Exzision, Chemotherapie und Bestrahlung. NTP-Peptide können vor, während oder nach derartigen herkömmlichen Behandlungen verabreicht werden.
Der zu behandelnde Zustand kann auch eine Hyperplasie, Hypertrophie oder Wucherung eines Gewebes sein, ausgewählt aus Lunge, Brust, Magen, Bauchspeicheldrüse, Prostata, Blase, Knochen, Ovarium, Haut, Niere, Sinus, Dickdarm, Darm, Magen, Rektum, Speiseröhre, Blut, Hirn und seinen Schutzschichten, Rückenmark und seinen Schutzschichten, Muskel, Bindegewebe, Nebenniere, Nebenschilddrüse, Thyroidea, Uterus, Testis, Hypophyse, Geschlechtsorgane, Leber, Gallenblase, Auge, Ohr, Nase, Hals, Mandeln, Mund, Lymphknoten und Lymphsystem.
Andere Zustände, die unter Verwendung des Verfahrens der Erfindung behandelt werden können, sind viral, bakteriell oder durch Parasiten verändertes Gewebe, ausgewählt aus Lunge, Brust, Magen, Bauchspeicheldrüse, Prostata, Blase, Knochen, Ovarium, Haut, Niere, Sinus, Dickdarm, Darm, Magen, Rektum, Speiseröhre, Blut, Hirn und seinen Schutzschichten, Rückenmark und seinen Schutzschichten, Muskel, Bindegewebe, Nebenniere, Nebenschilddrüse, Thyroidea, Uterus, Testis, Hypophyse, Geschlechtsorgane, Leber, Gallenblase, Auge, Ohr, Nase, Hals, Mandeln, Mund, und Lymphknoten und Lymphsystem.
Der zu behandelnde Zustand kann auch eine Missbildung oder Störung eines Gewebes sein, ausgewählt aus Lunge, Brust, Magen, Bauchspeicheldrüse, Prostata, Blase, Knochen, Ovarium, Haut, Niere, Sinus, Dickdarm, Darm, Magen, Rektum, Speiseröhre, Blut, Hirn und seinen Schutzschichten, Rückenmark und seinen Schutzschichten, Muskel, Bindegewebe, Nebenniere, Nebenschilddrüse, Thyroidea, Uterus, Testis, Hypophyse, Geschlechtsorgane, Leber, Gallenblase, Auge, Ohr, Nase, Hals, Mandeln, Mund, und Lymphknoten und Lymphsystem.
Insbesondere kann der zu behandelnde Zustand Tonsillenhypertrophie, Prostatahyperplasie, Psoriasis, Ekzem, Dermatosen oder Hämorrhoiden sein. Der zu behandelnde Zustand kann eine Gefäßerkrankung sein, wie Atherosklerose oder Arteriosklerose, oder eine Gefäßstörung wie Krampfadern, Stenose oder Restenose einer Arterie oder eines Stent. Der zu behandelnde Zustand kann auch eine kosmetische Veränderung eines Gewebes sein, wie Haut, Auge, Ohr, Nase, Hals, Mund, Muskel, Bindegewebe, Haar oder Brustgewebe.
Therapeutische Zusammensetzungen von NTP-Peptiden werden bei der vorliegenden Erfindung auch in Betracht gezogen. Derartige Zusammensetzungen können eine therapeutisch wirksame Menge eines NTP-Peptids in einem Gemisch mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger umfassen. Das Trägermaterial kann Wasser zur Injektion, vorzugsweise ergänzt mit anderen Materialien gemeinsam in Lösungen zur Verabreichung an Säuger sein. Typischerweise wird ein NTP-Peptid zur therapeutischen Verwendung in Form einer Zusammensetzung verabreicht, die gereinigtes NTP-Peptid zusammen mit einem oder mehreren physiologisch verträglichen Trägern, Exzipienten oder Verdünnungsmitteln umfassen. Neutrale gepufferte Kochsalzlösung oder Kochsalzlösung mit Serumalbumin gemischt sind beispielhafte geeignete Träger. Vorzugsweise wird das Produkt unter Verwendung von geeigneten Exzipienten (z. B. Saccharose) als ein Lyophilisat formuliert. Andere Standardträger, -verdünnungsmittel und -exzipienten können gegebenenfalls eingeschlossen sein. Zusammensetzungen der Erfindung können auch Puffer umfassen, die den durchschnittlichen Fachleuten bekannt sind, mit einem geeigneten Bereich von pH-Werten, einschließlich Tris-Puffer mit einem pH-Wert von etwa 7,0-8,5 oder Acetatpuffer mit einem pH-Wert von etwa 4,0-5,5, die ferner Sorbit oder ein geeignetes Substitut hierfür enthalten können.
Die NTP-Peptide können alleine, zusammen oder in Kombination mit anderen Arzneimitteln verwendet werden, wie Cytokinen, Wachstumsfaktoren, Antibiotika, Apoptoseinduzierenden Mitteln, entzündungshemmenden Mitteln und/oder chemotherapeutischen Mitteln, wie es für die behandelte Indikation geeignet ist.
Diese Erfindung umfasst auch therapeutische Zusammensetzungen von NTP-Peptiden, bei denen Dendrimere, Fullerene und andere synthetische Moleküle, Polymere und Makromoleküle eingesetzt werden, bei denen das NTP-Peptid in dem Molekül, Polymer oder Makromolekül eingeschlossen ist, entweder für sich oder zusammen mit anderen Molekülspezies wie einem Tumor-spezifischen Marker. Zum Beispiel stellt das US-Patent Nr. 5,714,166, Bioactive and/or Targeted Dendinier Conjugates, ein Verfahren zur Herstellung und Verwendung von unter anderem dendritischen Polymerkonjugaten bereit, zusammengesetzt aus mindestens einem Dendrimer mit (einem) Zielweiser(n) und mindestens einem bioaktiven Mittel, das mit diesem konjugiert ist. Die Offenbarung des US-Patents Nr. 5,714,166 ist hier in ihrer Gesamtheit durch Bezugnahme aufgenommen.
Feste Dosierungsformen zur oralen Verabreichung umfassen unter anderem Kapseln, Tabletten, Pillen, Pulver und Granulate. In derartigen festen Dosierungsformen wird die aktive Verbindung mit mindestens einem der folgenden Mittel gemischt: (a) einem oder mehr inerten Exzipienten (oder Trägern) wie Natriumcitrat oder Dicalciumphosphat; (b) Füllstoffen oder Streckmitteln wie Stärken, Lactose, Saccharose, Glucose, Mannit und Kieselsäure; (c) Bindemitteln wie Carboxymethylcellulose, Alginate, Gelatine, Polyvinylpyrrolidon, Saccharose und Gummi arabicum; (d) Feuchthaltemitteln wie Glycerin; (e) Aufspaltungsmitteln wie Agar-Agar, Calciumcarbonat, Kartoffel- oder Tapioka-Stärke, Alginsäure, bestimmten Komplexsilikaten und Natriumcarbonat; (f) Lösungsretardationsmittel, wie Paraffin; (g) Absorptionsbeschleunigern wie quaternären Ammoniumverbindungen; (h) Benetzungsmitteln wie Acetylalkohol und Glycerinmonostearat; (i) Adsorptionsmitteln wie Kaolin und Bentonit; und (j) Gleitmitteln wie Talk, Calciumstearat, Magnesiumstearat, festen Polyethylenglycolen Natriumlaurylsulfat oder Gemischen davon. Für Kapseln, Tabletten und Pillen können die Dosierungsformen auch Puffermittel umfassen.
Flüssige Dosierungsformen zur oralen Verabreichung umfassen pharmazeutisch verträgliche Emulsionen, Lösungen, Suspensionen, Sirupe und Elixiere. Zusätzlich zu den aktiven Verbindungen können die flüssigen Dosierungsformen inerte Verdünnungsmittel umfassen, die üblicherweise auf dem Fachgebiet verwendet werden, wie Wasser oder andere Lösungsmittel, Solubilisierungsmittel und Emulgatoren. Beispielhafte Emulgatoren sind Ethylalkohol, Isopropylalkohol, Ethylcarbonat, Ethylacetat, Benzylalkohol, Benzylbenzoat, Propylenglycol, 1,3-Butylenglycol, Dimethylformamid, Öle wie Baumwollsamenöl, Erdnussöl, Maiskeimöl, Olivenöl, Rizinusöl und Sesamöl, Glycerin, Tetrahydrofurfurylalkohol, Polyethylenglykole, Fettsäureester von Sorbitan oder Mischungen von diesen Substanzen und dergleichen.
Neben derartigen inerten Verdünnungsmitteln kann die Zusammensetzung auch Adjuvantien einschließen, wie Benetzungsmittel, Emulgatoren und Suspensionsmittel, Süßungs-, Geschmacks- und Duftmittel.
Tatsächliche Dosierungsmengen von aktiven Bestandteilen in den Zusammensetzungen der Erfindung können schwanken, um eine Menge an NTP-Peptid zu erhalten, die wirksam ist, um ein gewünschtes therapeutisches Ansprechen auf eine besondere Zusammensetzung und ein besonderes Verfahren der Verabreichung zu erhalten. Die ausgewählte Dosierungsmenge hängt daher von der gewünschten therapeutischen Wirkung, dem Verabreichungsweg, der gewünschten Dauer der Behandlung und anderen Faktoren ab.
Bei Säugern, einschließlich Menschen, können die wirksamen Mengen auf Grundlage der Körperoberfläche verabreicht werden. Die Beziehung von Dosierungen für Tiere verschiedener Größen, Spezies und Menschen (basierend auf mg/m² Körperoberfläche) wird von E. J. Freireich et al., Cancer Chemother. Rep., 50 (4):219 (1966) beschrieben. Die Körperoberfläche kann in etwa aus der Größe und dem Gewicht einer Person bestimmt werden (siehe z. B. Scientific Tables, Geigy Pharmaceuticals, Ardsley, N. Y. S. 537-538(1970)).
Die tägliche Gesamtdosis des NTP-Peptids, das einem Wirt verabreicht wird, kann in einzelnen oder geteilten Dosen sein. Die Zusammensetzungen einer Dosierungseinheit können derartige Mengen solcher Teile davon enthalten, wie sie verwendet werden können, um die tägliche Dosis zu ergeben. Es versteht sich jedoch, dass die spezifische Dosismenge für jeden besonderen Patienten von einer Vielzahl von Faktoren abhängen wird, einschließlich Körpergewicht, allgemeiner Gesundheitszustand, Geschlecht, Ernährung, Zeitpunkt und Weg der Verabreichung, Wirksamkeit des verabreichten Arzneistoffes, Absorptions- und Exkretionsraten, Kombination mit anderen Arzneistoffen und Schwere der besonderen behandelten Krankheit.
Die NTP-Peptid-Zusammensetzung gemäß der Erfindung kann intramuskulär, oral, intravenös, intraperitoneal, intrazerebral (intraparenchymal), intrazerebroventrikulär, intratumoral, intraläsional, intradermal, intrathekal, intranasal, intraokulär, intraarteriell, topisch, transdermal, über ein Aerosol, eine Infusion, Bolusinjektion, eine Implantationsvorrichtung, ein System mit Langzeitwirkung usw. verabreicht werden.
Das NTP-Peptid der Erfindung kann auch auf transdermalem oder transkutanem Weg verabreicht werden. Ein Beispiel für eine derartige Ausführungsform ist die Verwendung eines Heftpflasters. Insbesondere kann ein Heftpflaster mit einer feinen Suspension von NTP-Peptid in zum Beispiel Dimethylsulfoxid (DMSO) oder einem Gemisch von DMSO mit Baumwollsamenöl hergestellt und mit der Haut der vom Tumor befallenen Säuger abseits der Tumorstelle in einem Hautbeutel in Berührung gebracht werden. Andere Medien oder Gemische davon mit anderen Lösungsmitteln und festen Trägern funktionieren genauso gut. Das Heftpflaster kann die NTP-Peptid-Verbindung in Form einer Lösung oder einer Suspension enthalten. Das Heftpflaster kann dann auf die Haut des Patienten aufgebracht werden, zum Beispiel durch Einfügen in einen Hautbeutel des Patienten, der durch Falten und Zusammenhalten der Haut durch Stiche, Klammern oder andere Haltevorrichtungen gebildet wird. Dieser Beutel sollte derart eingesetzt werden, dass eine kontinuierliche Berührung mit der Haut ohne Störung des Säugers gewährleistet wird. Neben der Verwendung eines Hautbeutels kann jede Vorrichtung verwendet werden, die das feste Platzieren des Heftpflasters in Berührung mit der Haut gewährleistet. Zum Beispiel könnte eine Haftbandage verwendet werden, um das Heftpflaster auf der Haut an Ort und Stelle zu halten.
NTP-Peptid kann in einer Formulierung oder einem Präparat mit Langzeitwirkung verabreicht werden. Geeignete Beispiele für Präparate mit Langzeitwirkung umfassen semipermeable Polymermatrizen in Form von geformten Gegenständen, z. B. Filmen oder Mikrokapseln. Matrizen mit Langzeitwirkung umfassen Polyester, Hydrogele, Polylactide ( US 3,773,919 , EP 58,481 ), Copolymere von L-Glutaminsäure und Gamma-Ethyl-L-glutamat (Sidman et al., Biopolymers, 22: 547-556 [1983]), Poly(2-hydroxyethylmethacrylat) (Langer et al., J. Biomed. Mater. Res., 15: 167-277 [1981]) und Langer, Chem. Tech., 12: 98-105 [1982]), Ethylenvinylacetat (Langer et al., wie vorstehend) oder Poly-D(-)-3-hydroxybuttersäure ( EP 133,988 ). Zusammensetzungen mit Langzeitwirkung können auch Liposome einschließen, die durch irgendeines von mehreren auf dem Fachgebiet bekannten Verfahren hergestellt werden können (e. g., Eppstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:3688-3692 [1985]; EP 36,676 ; EP 88,046 ; und EP 143,949 ).
Ein weiterer Verabreichungsweg für ein NTP-Peptid der Erfindung ist die direkte oder indirekte Infusion des NTP-Peptids in den Tumor oder ein anderes zu behandelndes Gewebe. Ein Beispiel für eine derartige Ausführungsform ist die direkte Injektion von NTP-Peptid in den Tumor oder ein anderes zu behandelndes Gewebe. Die Behandlung kann aus einer einzelnen Injektion, mehreren Injektionen auf einmal oder einer Reihe von Injektionen über einen Zeitraum von Stunden, Tagen oder Monaten bestehen, wobei die Rückbildung oder Zerstörung des Tumors oder eines anderen zu behandelnden Gewebes durch Biopsie, Abbildung oder andere Verfahren zur Überwachung von Gewebewachstum überwacht wird. Die Injektion in den Tumor oder ein anderes zu behandelndes Gewebe kann durch eine Vorrichtung erfolgen, die in eine Öffnung eingeführt wird, wie Nase, Mund, Ohr, Vagina, Rektum oder Harnröhre, oder durch einen Einschnitt, um den Tumor oder das Gewebe in vivo zu erreichen, und zusammen mit einem Bildgebungs- oder optischen System durchgeführt werden, wie Ultraschall oder Fibroskop („fiber optic scope"), um die richtige Stelle für die Injektionen) zu identifizieren. Ein weiteres Beispiel für eine derartige Ausführungsform ist die Verwendung einer Vorrichtung, die eine konstante Infusion von NTP-Peptid in das Gewebe über die Zeit schaffen kann.
Ein weiterer Verabreichungsweg für ein NTP-Peptid der Erfindung ist im Zusammenhang mit einem chirurgischen oder ähnlichen Verfahren, das verwendet wird, um den Tumor oder anderes Gewebe oder andere Zellelemente, die entfernt oder zerstört werden sollen, physikalisch herauszuschneiden, zu entfernen oder anderweitig zu töten oder zu zerstören, wobei ein NTP-Peptid der Erfindung an den unmittelbaren Bereich (die unmittelbaren Bereiche), der(die) den Bereich (die Bereiche) umgibt(umgeben), wo der Tumor oder anderes Gewebe entfernt wurde, verabreicht wird, um alle Tumorzellen oder andere Zellelemente, die durch das Verfahren nicht entfernt oder zerstört wurden, zu zerstören oder deren Wachstum zu hemmen.
Ein weiterer Verabreichungsweg für ein NTP-Peptid der Erfindung ist durch Implantieren einer Vorrichtung in den Tumor oder anderes zu behandelndes Gewebe. Ein Beispiel für eine derartige Ausführungsform ist die Implantation eines Wafers, das NTP-Peptid enthält, in den Tumor oder ein anderes zu behandelndes Gewebe. Der Wafer setzt über einen Zeitraum eine therapeutische Dosis von NTP-Peptid in das Gewebe frei. In einer anderen Ausführungsform oder zusätzlich kann die Zusammensetzung lokal über Implantieren einer Membran, eines Schwamms oder eines anderen geeigneten Materials, auf dem das NTP-Peptid absorbiert wurde, in den betroffenen Bereich verabreicht werden. Wenn eine Implantierungsvorrichtung verwendet wird, kann die Vorrichtung in jedes geeignete Gewebe oder Organ implantiert werden, und die Abgabe des NTP-Peptids kann direkt durch die Vorrichtung über eine Bolus oder über eine kontinuierliche Verabreichung oder über einen Katheter unter Verwendung einer kontinuierlichen Infusion erfolgen.
Beispiel 1 (Nur zum Vergleich)
Der Zweck dieses Beispiels bestand darin, die Wirkung von NTP[122]-Peptid #1 auf Gewebe an Injektionsstellen zu bestimmen.
Männliche Sprague-Dawley-Ratten (300 Gramm Gewichtsbereich) wurden mit Ether betäubt und ihnen wurde durch intraprostatische Infusion NTP[122]-Peptid #1 verabreicht, nachdem die Prostata durch chirurgisches Öffnen gesichtet wurde. Die Injektionen bestanden aus 300 μl NTP[122]-Peptid #1, 1 mg/ml, in PBS, pH-Wert 7,4, (1,0 mg/kg) (n = 8), Kontrollinjektionen von PBS alleine (n = 6) und Kontrollen ohne Injektion (n = 2). Die Ratten wurden nach 72 Stunden schmerzlos getötet. Die Prostatadrüsen wurden seziert, in 10% gepuffertem Formalin für 24 Stunden fixiert, in Paraffin eingebettet, geschnitten und mit H & E gefärbt. Bei jedem Tier wurde die gesamte Prostatadrüse eingebettet und geschnitten. Alle gefärbten Abschnitte wurden histologisch untersucht und gemessen. Bei jeder Prostata wurden mindestens 4 histologische Schnitte untersucht, und bei jedem histologischen Schnitt wurden zwei Querschnittsdurchmesser (D) mit einem Winkel von 90° zueinander gemessen (insgesamt ≥ 8 Messungen pro Prostata). Der mittlere Durchmesser von diesen Messungen für jede Prostata wurde verwendet, um das Volumen gemäß
zu schätzen.
Ergebnisse: Die Reduktion des Prostatavolumens bei Ratten, denen NTP[122]-Peptid #1 injiziert worden war, wurde im Durchschnitt auf 45% geschätzt, im Vergleich zu Kontrollen (es gab keinen erkennbaren Unterschied zwischen Kontroll-PBS-Injektionen alleine und Kontrollen ohne Injektionen). Behandelte Rattenprostata zeigte einen deutlichen Verlust von Drüsenepithel, Abflachung und Atrophie. Offene Infusionen von 1,0 mg/kg von NTP[122]-Peptid #1 in PBS, pH-Wert 7,4, in Rattenprostata erzeugten eine geschätzte Prostatavolumenreduktion von >40%, verglichen mit unbehandelten Kontrollen oder mit PBS behandelten Kontrollen, nach 72 Stunden.
Beispiel 2 (Nur zum Vergleich)
Der Zweck dieses Beispiels bestand darin, die Wirkung von NTP[112]-Peptid #1 auf Gewebe an Injektionsstellen zu bestimmen.
Männliche Sprague-Dawley-Ratten (300 Gramm Gewichtsbereich) wurden mit Ether betäubt und ihnen wurde durch intraprostatische Infusion NTP[112]-Peptid #1 verabreicht, nachdem die Prostata durch chirurgisches Öffnen gesichtet wurde. Die Injektionen bestanden aus 300 μl NTP[112]-Peptid #1, 1 mg/mL, in PBS, pH-Wert 7,4 (1,0 mg/kg) (n = 4), Kontrollinjektionen von PBS alleine (n = 3) und Kontrollen ohne Injektion (n = 1). Die Ratten wurden nach 72 Stunden schmerzlos getötet. Es wurden Prostatadrüsen seziert, in 10% gepuffertem Formalin für 24 Stunden fixiert, in Paraffin eingebettet, geschnitten und mit H & E gefärbt. Bei jedem Tier wurde die gesamte Prostatadrüse eingebettet und geschnitten. Alle gefärbten Schnitte wurden histologisch untersucht und gemessen. Bei jeder Prostata wurden mindestens 4 histologische Schnitte untersucht, und bei jedem histologischen Schnitt wurden zwei Querschnittsdurchmesser (D) mit einem Winkel von 90° zueinander gemessen (insgesamt ≥ 8 Messungen pro Prostata). Der mittlere Durchmesser von diesen Messungen für jede Prostata wurde verwendet, um das Volumen gemäß
zu schätzen.
Die Kontrollen waren die gleichen wie in Beispiel 1.
Ergebnisse: Wie in dem vorstehenden Beispiel 1 erzeugte die Injektion von NTP[112]-Peptid #1 einen erheblichen Zellverlust und Atrophie in der Prostata nach 72 Stunden. Die Kontrollen zeigten minimale oder gar keine Änderungen, die aus leichten fokalen Entzündungen von den Nadeln bestanden.
Beispiel 3
Der Zweck dieses Beispiels bestand darin, die Wirkung der vorstehend beschriebenen NTP-Peptide auf Gewebe an Injektionsstellen zu bestimmen.
NTP[122]-Peptid 1 wird nur zum Vergleich angegeben.
Acht normalen Ratten wurden Injektionen in die Haut und subkutan, jeweils an vier verschiedenen Stellen, und in Skelettmuskeln der Extremitäten, jeweils in zwei verschiedene Stellen, verabreicht, und zwar mit den NTP[122]-Peptiden 1-8, NTP[112]-Peptiden 1-7, wie vorstehend beschrieben, in Kochsalzlösung in Mengen von 100 bis 400 ml bei Konzentrationen von 0,1-1 mg/ml, abgegeben aus Kunststoffspritzen durch 26-Gauge-Edelstahlnadeln.
Die Tiere wurden 24 Stunden beobachtet und nach 24 Stunden schmerzlos getötet. Die einzelnen Stellen der Infiltration wurden herausgeschnitten, in 10% Formalin fixiert, in Paraffin eingebettet und gefärbt und durch histopathologische Standardverfahren untersucht.
Ähnlichen Gruppen von Kontrollratten wurden (1) Rinderserumalbumin, 0,1% in Kochsalzlösung, (2) normales Humanserum, (3) physiologische Kochsalzlösung, (4) nicht-infektiöse Bakterienproteine und (5) Kontrollpeptide injiziert und gereinigt und dann untersucht und wie vorstehend getötet, wobei die herausgeschnittenen Stellen der Injektion wie vorstehend behandelt wurden.
Ergebnisse: Die Injektion der NTP[122]-Peptide 1-8, NTP[112]-Peptide 1-7, NTP[106]-Peptide 1-7, NTP[98] 1-6, NTP[75]-Peptide 1-5, NTP[68]-Peptide 1-4 und NTP[61]-Peptide 1-4 in allen Beispielen erzeugten reichlich akute Nekrose von Gewebe an den Injektionsstellen. Die Nekrose ist offensichtlich in Muskelgewebe, subkutanem Bindegewebe und der Dermis an den Stellen, wo das NTP-Peptid injiziert wurde. Nach 24 Stunden erscheinen die Zellen blass, geschrumpft und nekrotisch, und es besteht eine Infiltration mit entzündlichen Zellen. Die Nekrose korreliert mit den Bereichen der Injektion und scheint sich nicht weit über die Stelle der Injektion hinaus auszubreiten.
Neben den milden Bereichen der Entzündung zeigten die Kontrollen keine Nekrose oder Zellverlust. Im Gegensatz zu den NTP-Peptid-Injektionen, bei denen ganze Felder von Muskelfaserschichten nekrotisch waren, zeigten die Kontrollen minimale oder gar keine Muskeländerungen. Die Kontrollinjektionen hatten milde bis minimale akute Entzündung an den Injektionsstellen und fokale Mikrohämorrhagien von den Nadeln.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

NTP-Peptid bestehend aus einer Aminosäuresequenz, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus:
NTP-Peptid nach Anspruch 1 zur Anwendung als ein Arzneimittel.
Zusammensetzung, die ein NTP-Peptid nach Anspruch 1 und ein Träger dafür umfasst.