DE60120658T2

DE60120658T2 - Verfahren zum gefrierkonservieren von oozyten

Info

Publication number: DE60120658T2
Application number: DE60120658T
Authority: DE
Inventors: Raffaella Fabbri
Original assignee: Medi-Cult AS
Current assignee: Medi-Cult AS
Priority date: 2000-03-20
Filing date: 2001-03-20
Publication date: 2007-05-31
Anticipated expiration: 2021-03-21
Also published as: ITPI20000020A1; ATE329486T1; IT1317301B1; DE60120658D1; EP1267613A2; WO2001070020A2; US20060105317A1; AU2001246812A1; WO2001070020A3; US20080286863A1; US20030077567A1; EP1267613B1; ITPI20000020A0; US7011937B2

Description

Diese Erfindung betrifft ein langsames Gefrierverfahren zum Gefrierkonservieren von menschlichen Oozyten.
Hintergrund der Erfindung
In US 5,985,538 wird der Einfluss von 0,1 M und 0,2 M Saccharose auf die Oozyten-Gefrierkonservierung offenbart. Dieses Dokument offenbart jedoch kein Verfahren zum Gefrierkonservieren von Oozyten, worin das nicht-penetrierende Gefrierschutzmittel Saccharose mit einer Konzentration von 0,3 M ist.
Palasz und Mapletoft, „Cryopreservation of mammalian embryos and oocytes: recent advances", Biotechnology Advances, Elsevier Publishing, Barking, GB, Vol. 14, No. 2, 1996, Seiten 127–149, offenbaren zur Benutzung als nicht-penetrierendes Gefrierschutzmittel geeignete Lösungen umfassend 0,25 M bis 0,5 M Saccharose, Trehalose, Lactose oder Galactose.
Otoi Takeshige et al., „The development of immature bovine oocytes cryopreserved by 1,2-propanediol", Journal of Reproduction and Development, 1995, Vol. 41, Seiten 361–366, offenbaren ein Verfahren zum Gefrierkonservieren von Rinderoozyten umfassend die Schritte des Äquilibrierens besagter Oozyten mit einer Mischung aus 0,16 M 1,2-Propandiol und verschiedenen Saccharosekonzentrationen, darunter 0,3 M, mittels des Drei-Schritt-Verfahrens. Die Oozyten werden dann gekühlt und in flüssigem Stickstoff eingefroren. Nach dem Auf tauen und Verdünnen ihrer Gefrierschutzmittel mittels des Drei-Schritt-Verfahrens wurde die Oozyten-Überlebensrate angegangen.
Otoi T et al., „Cryopreservation of mature bovine oocytes by vitrification in straws", Cryobiology, 1998, Vol. 37, Seiten 77–85, offenbaren Versuche, die durchgeführt worden sind, um die optimalen Bedingungen zur Vitrifikation von in vitro gereiften Rinderoozyten in Strohhalmen zu ermitteln. Eine schrittweise Zugabe von Oozyten zu einer Vitrifikationslösung bestehend aus 30% Ethylenglykol, 0,35 M Saccharose wurde vor dem Vitrifizieren durch das Drei-Schritt-Zugabe-Verfahren durchgeführt. Der Einfluss der Dauer des Aussetzens der Oozyten einer 0,5 M Saccharose im ersten Schritt während der Drei-Schritt-Verdünnung wurde des Weiteren untersucht.
Es ist bekannt, dass die Gefrierkonservierung von unbefruchteten menschlichen Oozyten eine Methode ist, die verschiedene Vorteile bietet, besonders wenn Oozyten konserviert werden müssen von Patienten, die bezüglich einer ovarialen Hyperstimulation gefährdet sind und keine Embryonen während der in vitro Fertilisationsbehandlung transferieren können. Jedoch ist die Gefrierkonservierung von Oozyten, besonders von frischen menschlichen Oozyten aufgrund der zytologischen Eigenart von Oozyten in größere technische Schwierigkeiten geraten als die Konservierung von männlichen Keimzellen oder Embryonen.
Renard et al. (J. Reprod. Fert., 1984, 71, Seiten 573–580) beschreiben ein Verfahren zum Gefrierkonservieren von Kaninchenembryonen, worin die Embryonen mit verschiedenen Gefrierschutzmittel enthaltenden Lösungen, wie etwa Lösungen enthaltend Saccharose in Konzentrationen von 0 bis 1,0 M behandelt worden sind. Das Erhöhen der Konzentration an Saccharose auf 1,0 M beeinflusste die Entwicklung der Embryonen negativ. Diese Veröffentlichung sieht nicht vor, dass das Verfahren für andere Zelltypen als embryonale Zellen verwendet werden kann.
Die geringe Anzahl an Geburten aus menschlichen gefrierkonservierten Oozyten, die in der Literatur berichtet werden, zeigt die technischen Schwierigkeiten des Gefrierkonservierens von Oozyten. Bisher liefern die über die Gefrierkonservierung von Oozyten durchgeführten Untersuchungen gegensätzliche Ergebnisse bezüglich geeigneterer und weniger schädlicher Verfahren zur Aufrechterhaltung der zellulären Unversehrtheit und zum Erhalt eines höheren Anteils an brauchbaren Oozyten.
Bisher ist kein maßgebliches Protokoll zum Gefrierkonservieren menschlicher Oozyten festgelegt worden und die Anzahl an bisher verwendeten Oozyten ist noch zu niedrig, um eine maßgeblich anzuwendende Methodik zu ermitteln.
Die menschliche Oozyten-Überlebensrate bei der Gefrierkonservierung hängt sowohl von der Oozyten-Größe als auch vom verwendeten Gefrierschutzmittel (Zusammensetzung, Konzentration und Aussetzungsdauer) und von der Einfrier-/Auftau-Geschwindigkeit ab.
In dem Gefrierkonservierungsverfahren ist die Oozytengröße ein sehr wichtiger Parameter, der die Überlebensrate beeinflusst, da die große Wassermenge im Ooplasma intrazelluläre Eisbildung während des Gefrierprozesses verursacht: intrazelluläres Eis ist einer der hauptverantwortlichen Faktoren für die intrazellulären Strukturschädigungen.
Die Oozytengefrierkonservierungsprotokolle umfassen üblicherweise die folgenden Schritte:
a) zunächst das Aussetzen der Oozyten einer Lösung umfassend ein penetrierendes Gefrierschutzmittel (z.B. 1,2-Propandiol (PROH)), dessen Zweck es ist, die durch Wasserkristallisation hervorgerufenen intrazellulären Strukturschädigungen auf ein. Minimum zu reduzieren, b) anschließend das Aussetzen der Oozyten für eine Dauer von 2–5 Minuten einer sogenannten Ladelösung enthaltend eine Mischung aus einem penetrierenden Gefrierschutzmittel und einem nicht-penetrierenden Gefrierschutzmittel (z.B. Saccharose), um die Oozyten-Dehydratisierung zu erhöhen, c) langsames Abkühlen auf –150°C, d) Aufbewahren in flüssigem Stickstoff (–196°C), e) Auftauen, f) Verdünnen und Entfernen der Gefrierschutzmittel durch Aussetzen von sogenannten Auftaulösungen und Rückführen auf die physiologische Umgebung für weitere Handhabungen.
Die Vorteile der Gefrierschutzmittel beziehen sich auf I) ihre Konzentration, II) Aussetzungsdauer, III) die Temperatur, bei der sie zu den Oozyten hinzugefügt werden.
Offenbarung der Erfindung
In einem erfindungsgemäßen Verfahren zum Gefrierkonservieren menschlicher Oozyten ist es vorgesehen, Lade-/Auftaulösungen enthaltend Saccharose mit einer Konzentration von 0,3 M oder größer zu verwenden.
In der Tat ist überraschenderweise festgestellt worden, dass die Gegenwart von Saccharose mit einer Konzentration von 0,3 M oder größer außerhalb der Zellmembran die Zell-Dehydratisierung/Rehydratation mit einer Verbesserung der Überlebensrate der gefrierkonservierten Oozyten stark erhöht.
Des Weiteren sieht das vorliegende Verfahren in einer bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform vor, menschliche Oozyten einer Ladelösung enthaltend mindestens 0,3 M Saccharose für eine Dauer von 15 min auszusetzen, bevor das Gefrierverfahren begonnen wird.
In diesem letzten Fall hat eine durch ein invertiertes Mikroskop erfolgte morphologische Analyse eine zytoplasmatische Volumenreduktion der Oozyten von etwa 30% mit weiterer Dehydratisierung gezeigt; dies reduziert auch die Möglichkeit der intrazellulären Eisbildung.
Detaillierte Beschreibung einer Ausführungsform
Die wesentlichen Stadien eines erfindungsgemäßen Verfahrens zum Gefrierkonservieren frischer menschlicher Oozyten werden nachstehend beschrieben.
Die folgenden Lösungen werden in dem Gefrierverfahren verwendet:

– eine PBS-Lösung (Dulbecco's Phosphat-gepufferte Salzlösung w/o Natriumbicarbonat)
– eine Äquilibrierlösung (1,5 M PROH),
– eine Ladelösung (1,5 M PROH + 0,3 M Saccharose),
– eine SSS-Lösung (Synthetisches Serum-Substitut)

Die Zusammensetzung der obigen Lösungen ist wie folgt:
PBS-Lösung 8 ml PBS
Äquilibrierlösung (1,5 M PROH) 6,79 ml PBS 1,21 ml PROH (1,2-Propandiol)
Ladelösung (1,5 M PROH + 0,3 M Saccharose) 6,79 ml PBS 1,21 ml PROH 1,128 gr Saccharose.
Diese Lösungen werden in einem langsamen Gefrierprogramm verwendet. Die Lösungen werden hergestellt, gemischt, gefiltert und bei +4°C aufbewahrt. Es ist besser, die Lösungen vor dem Verwenden für 15 min bei Raumtemperatur aufzubewahren.
Wenn die oben beschriebenen Lösungen fertig sind, wird eine Petri-Schale mit 2,1 ml PBS-Lösung + 0,9 ml SSS (Synthetisches Serum-Substitut) hergestellt. In dieser Lösung werden alle Oozyten von ihrem Nährmedium ausgewaschen, bevor sie in die Äquilibrierlösung überführt werden.
Dann wird eine geeignete Schale mit einer Mehrzahl an Kammern hergestellt:
Einige dieser Kammern enthalten 0,350 ml Äquilibrierlösung (1,5 M PROH) + 0,150 ml SSS (Synthetisches Serum-Substitut). In diese Lösung werden ein oder zwei Oozyten/Kammer überführt und für 10 min aufbewahrt, bevor sie in die Ladelösung überführt werden.
Die anderen Kammern enthalten 0,350 ml Ladelösung (1,5 M PROH + 0,3 M Saccharose) + 0,150 ml SSS (Synthetisches Serum-Substitut). Die (aus der Äquilibrierlösung genommenen) Oozyten werden in die Ladelösung überführt und schnell in Plastik-Strohhalme geladen.
Danach werden die Strohhalme in einen progammierbaren Gefrierschrank, z.B. ein Kryo 10 series III (Planer Kryo 10/1,7 GB) gestellt.
Gemäß einer besonders vorteilhaften Ausführungsform des vorliegenden Verfahrens werden die Oozyten vor dem Beginn des Gefrierprogramms der Ladelösung (enthaltend Saccharose mit einer Konzentration von mindestens 0,3 M) für 13–15 min und vorzugsweise für etwa 15 min ausgesetzt.
Dann wird ein langsames Gefrierverfahren auf die Oozyten wie folgt angewandt. Die Anfangskammertemperatur ist 20°C. Dann wird die Temperatur langsam (2°C/min) auf –7°C erniedrigt, bei der die Eiskeimbildung manuell induziert wird. Nach einer Haltezeit von 10 min bei –7°C werden die Strohhalme langsam (0,3°C/min) auf –30°C runtergekühlt und dann schnell (50°C/min) auf –150°C.
Nach 10–12 min Stabilitätstemperatur werden die Strohhalme in Flüssig-Stickstofftanks überführt und bis zum Auftauen aufbewahrt.
Die folgenden Lösungen werden in dem Auftauverfahren verwendet:

– eine Stammlösung 1,0 M PROH zusammengesetzt aus 14,35 ml PBS 1,65 ml PROH und verwendet, um
– A) 1,0 M PROH-Lösung + 0,3 M Saccharose, zusammengesetzt aus 8 ml Stammlösung (1,0 M PROH) 1,128 gr Saccharose
– B) 0,5 M PROH-Lösung + 0,3 M Saccharose, zusammengesetzt aus 4 ml Stammlösung (1,0 M PROH) 4 ml PBS 1,128 gr Saccharose herzustellen.

Die folgenden Lösungen werden auch verwendet:

– C) 0,3 M Saccharose-Lösung, zusammengesetzt aus: 8 ml PBS 1,128 gr Saccharose
– D) PBS-Lösung, zusammengesetzt aus: 8 ml PBS
– E) SSS-Lösung (Synthetisches Serum-Substitut).

Diese Lösungen werden in einem schnellen Auftauprogramm verwendet. Die Lösungen werden hergestellt, gemischt, gefiltert und bei +4°C aufbewahrt. Es ist besser, die Lösungen vor dem Verwenden für 15 min bei Raumtemperatur aufzubewahren.
Zum Auftauen werden die Strohhalme zunächst für 30 s Luft erwärmt und dann in ein 30°C-Wasserbad für 40 s eingetaucht, bis alle Eisspuren verschwunden sind.
Dann wird für jeden Strohhalm eine Vier-Kammer-Schale zum Entfernen des Gefrierschutzmittels durch schrittweises Verdünnen von PROH in den Auftaulösungen hergestellt.
Besonders bevorzugt enthält die erste Kammer 0,350 ml Lösung A (1,0 M PROH-Lösung + 0,3 M Saccharose) + 0,150 ml Lösung E SSS (Synthetisches Serum-Substitut). Der Inhalt des Strohhalms wird in diese Lösung ausgestoßen und die Oozyten werden für 5 min bei Raumtemperatur äquilibriert.
Die zweite Kammer enthält 0,350 ml Lösung B (0,5 M PROH-Lösung + 0,3 M Saccharose) + 0,150 ml SSS (Synthetisches Serum-Substitut). Die aus der ersten Kammer genommenen Oozyten werden in diese Lösung überführt und für zusätzliche 5 min bei Raumtemperatur aufbewahrt.
Die dritte Kammer enthält 0,350 ml Lösung C (0,3 M Saccharose-Lösung) + 0,150 ml SSS-Lösung (Synthetisches Serum-Substitut). Die aus der zweiten Kammer genommenen Oozyten werden in diese Lösung überführt und für 10 min bei Raumtemperatur aufbewahrt.
Die vierte Kammer enthält 0,350 ml Lösung D (PBS-Lösung) + 0,150 ml SSS-Lösung (Synthetisches Serum-Substitut). Die aus der dritten Kammer genommenen Oozyten werden in diese Lösung überführt und für 10 min bei Raumtemperatur und für zusätzliche 10 min bei 37°C aufbewahrt.
Schließlich können die Oozyten vor der Befruchtung in ein herkömmliches Nährmedium überführt werden.
Experimentelle Daten haben eine sehr hohe Überlebensrate (82%) von frischen menschlichen Oozyten, die mit einer Lade-/Auftaulösung enthaltend Saccharose mit einer Konzentration von 0,3 M gefrierkonserviert wurden, gezeigt. Eine höhere Überlebensrate wird auch beobachtet, wenn die Oozyten der Ladelösung für 13–15 min anstelle von 2–5 min ausgesetzt werden.

Claims

Ein Verfahren zum Gefrierkonservieren von menschlichen Oozyten umfassend die Schritte: – das Aussetzen der Oozyten einer ersten Lösung umfassend ein penetrierendes Gefrierschutzmittel, – das Aussetzen der Oozyten einer zweiten Ladelösung umfassend ein penetrierendes Gefrierschutzmittel und ein nicht-penetrierendes Gefrierschutzmittel, – Anwenden eines langsamen Gefrierverfahrens auf die Oozyten, – Aufbewahren der gefrorenen Oozyten in flüssigem Stickstoff, – Auftauen der Oozyten, – Verdünnen und Entfernen der Gefrierschutzmittel durch Aussetzen einer oder mehrerer Auftaulösungen, – die physiologische Umgebung der Oozyten wird für weitere Bearbeitungen wiederhergestellt, wobei – das in der Ladelösung enthaltene nicht-penetrierende Gefrierschutzmittel Saccharose mit einer Konzentration von 0,3 M oder größer ist, wobei – die Auftaulösungen Saccharose mit einer Konzentration von 0,3 M oder größer umfassen.
Das Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Ladelösung Saccharose mit einer Konzentration von 0,3 M umfasst.
Das Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass das penetrierende Gefrierschutzmittel 1,2-Propandiol (PROH) mit einer Konzentration von 1,5 M ist.
Das Verfahren nach einem der Ansprüche 1–3, dadurch gekennzeichnet, dass vor dem Beginn des Gefrierverfahrens die Oozyten einer Ladelösung für eine Dauer von 13–15 Minuten und vorzugsweise für etwa 15 Minuten ausgesetzt werden.
Das Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Oozyten frische menschliche Oozyten sind.