DE60034601T2

DE60034601T2 - Verfahren zur herstellung von polyphenolischen adhäsionsproteinen

Info

Publication number: DE60034601T2
Application number: DE60034601T
Authority: DE
Inventors: Magnus Qvist
Original assignee: BIO POLYMER PRODUCTS OF SWEDEN; BIO POLYMER PRODUCTS OF SWEDEN AB
Current assignee: BIO POLYMER PRODUCTS OF SWEDEN; BIO POLYMER PRODUCTS OF SWEDEN AB
Priority date: 1998-09-28
Filing date: 2000-10-23
Publication date: 2007-12-27
Anticipated expiration: 2020-10-24
Also published as: DK1334116T3; US6335430B1; AU2001213184A1; CY1106678T1; ATE360637T1; DE60034601D1; CA2426242C; CA2426242A1; WO2002034764A1; EP1334116B1; PT1334116E; EP1334116A1; ES2284539T3

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zum Herstellen von polyphenolischen Adhäsionsproteinen aus Muschelfüßen; solche Proteine werden hier als MAP bezeichnet. Die Erfindung bezieht sich auch auf MAP-Produkte, die durch das Verfahren hergestellt sind.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Der Ausdruck MAP ist ein Akronym des englischen Ausdrucks Muscheladhäsionsprotein. Die Bezeichnung basiert auf der Herstellung des betreffenden Proteins aus einer Drüse in den Füßen von Muscheln. Das Protein haftet stark an allen Oberflächentypen, z. B. an lebenden Zellen und anderen Materialien, wie Stein, Holz und ähnliche Materialien, die sich unter Wasser befinden. Die Muscheln haften so an einem geeigneten Unterwassergegenstand und leben dort.
Muscheladhäsionsprotein hat ein Molekulargewicht von etwa 130000 und besteht aus 75 bis 85 wiederholten Sequenzen von Hexapeptiden und Decapeptiden. Das Protein enthält bis zu 20% Lysin und einen ungewöhnlich hohen Anteil von bis zu 50% von Hydroxy enthaltenden Aminosäuren, wie Hydroxyproline, Serine, Threonine, Tyrosine und (was sehr ungewöhnlich in einem Polypeptid ist) 3,4-Dihydroxyphenylalanin (DOPA). Die DOPA-Gruppen bilden 10 bis 15% des Adhäsionsproteins.
Die Adhäsionsfestigkeit von MAP pro Gewichtseinheit ist vergleichbar mit derjenigen von synthetischem Cyanacrylat und Epoxyharzen. MAP ist auch wasserbeständig und bindet sehr wirksam in Wasser und haftet sehr wirksam an zahlreichen Feststoff- und Halbfeststoffoberflächen, wie Glas, Metall, biologisches Gewebe und Kunststoffe, selbst an Teflon^®-Oberflächen.
Die hohe Lysinkonzentration von Muscheladhäsionsprotein trägt wahrscheinlich zu ihrer guten Haftung bei, insbesondere über Ionenbindungen zu negativ geladenen Oberflächen, wie zu zahlreichen Proteinen und Polysacchariden.
Der sehr hohe Hydroxylgehalt und die o-diphenolische Natur der DOPA-Gruppen sind wahrscheinlich für die einzigartige wasserabstoßende Eigenschaft von Muscheladhäsi onsprotein und folglich für seine Fähigkeit verantwortlich, an Unterwassergegenständen zu haften und in solchen Umgebungen zu härten.
Die Hydroxyaminosäuren tragen auch bemerkenswert zu Wasserstoffbindungen zum Erreichen der Haftfestigkeit bei.
Die o-diphenolischen DOPA-Reste bilden starke Chelate mit Metallionen und -oxiden und Halbmetallen, wie Silicium. Dies ist ein wesentlicher Teil der Fähigkeit von Muscheladhäsionsprotein, an Stein, Glas und ähnlichen Oberflächen zu haften.
DOPA wird durch molekularen Sauerstoff zu einem Chinon oxidiert, und es wird angenommen, dass es mit biogenen Aminen unter Bildung starker kovalenter Bindungen reagiert. Intermolekulare Bindungen zu u. a. Lysinresten tragen zu der "inneren" Haftung und einer stärkeren Adhäsionsbindung bei.
Muscheladhäsionsprotein wird in biologischen Systemen gut angenommen. Es ist nichttoxisch und ist im allgemeinen biokompatibel und weist nur eine geringe oder keine Antigenität auf. Dies macht es potenziell für zahlreiche Zwecke verwendbar, wie mit Adhäsionsbiofilm zum Immobilisieren von Zellen und Enzymen, als ein feuchtigkeitsverträglicher Klebstoff zur Zahnbehandlung, als Zusatz zu oder als Ersatz für Wundnähte bei der Behandlung von Wunden und Entzündungen, zum Fixieren und Heilen komplizierter Knochenbrüche, als Matrix für Arzneimittel mit verzögerter Wirkung usw. Muscheladhäsionsprotein kann auch als ein Antikorrosionsmittel, einfach durch Beschichten, z. B. eine Stahloberfläche mit einem dünnen Muscheladhäsionsfilm, der an die Eisenatome des Stahls bildet, verwendet werden.
In der US-Patentschrift 4,496,397 ist ein Verfahren zum Herstellen von Muscheladhäsionsprotein beschrieben, das DOPA und Hydroxyprolin (hyp) enthält. Dieses Verfahren basiert auf Muschelfüßen und beinhaltet die Bildung eines wässrigen Extrakts der Proteine, zu welchem dann ein Borat bei pH 7,0 bis 9,0 zugesetzt wird zum Herstellen eines löslichen Boratkomplexes des DOPA enthaltenden Proteins, wobei die Verunreinigungen ausgefällt werden. Der Boratkomplex wird dann abgetrennt und auf verschiedene Weise behandelt, wie mit einer Essigsäurelösung oder lyophilisiert in einer inerten Atmosphäre. Die gemäß diesem Verfahren hergestellten Proteine haben einen Reinheitsfaktor von wenigstens 0,10, wobei ein Produkt von maximaler Reinheit einen Faktor von größer als 0,16 haben sollte.
Ein weiteres Verfahren zum Herstellen von Muscheladhäsionsprotein ist in der Veröffentlichung Protein Expression and Purification 1 147 150 (1990) beschrieben. Diese Veröffentlichung beschreibt die Herstellung von Muscheladhäsionsprotein (MAP) auf der Grundlage von Muschelfüßen, wo die Proteine in einer Lösung extrahiert werden, die Tris-HCl (pH 7,5, der pH-Puffer) NaCl, ETA (Ethylendiamintetraessigsäure), EGTA (Ethylenglycolbis(aminoallylether)-N,N,N,N-tetraessigsäure, PMSF (Phenylmethylsulfonylfluorid), KCN, NEM (N-Ethylmaleamid) und Trypsin-Inhibitor aus Sojabohnen enthält. Die Suspension wird in eine feste und eine flüssige Schicht getrennt, und die feste Schicht wird in verdünnter Essigsäure homogenisiert, die PMSF und 2-Mercaptoethanol enthält. Anschließend an eine Zentrifugation wird konzentrierte Perchlorsäure tropfenweise zu der festen Schicht zugesetzt, die dann zentrifugiert wird, und die flüssige Schicht wird wieder gesammelt. Die flüssige Schicht wird dann mit kaltem Aceton vermischt, das Triton X 100, HCl und 2-Mercaptoethanol enthält. Die Muscheladhäsionsproteine fallen dann aus und werden für die weitere Verarbeitung isoliert.
TECHNISCHES PROBLEM
Das vorstehend beschriebene Verfahren und auch andere bekannte Verfahren zur Herstellung von Muscheladhäsionsproteinen erfordern die Verwendung einer Anzahl von Hilfschemikalien und führen zu einer niedrigen Ausbeute und zu relativ unreinen Produkten im Hinblick auf bestimmte Muschelarten. Sie sind auch zeitaufwändig und unwirtschaftlich.
LÖSUNG
Es ist lange Zeit erwünscht gewesen, Muscheladhäsionsproteine in wirtschaftlicher Weise in größerem Maßstab herzustellen, wobei Produkte von erwünschter Reinheit erhalten werden. Demgemäß wird gemäß der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zum Herstellen von Muscheladhäsionsproteinprodukten aus Muschelfüßen bereitgestellt. Das Verfahren ist gekennzeichnet durch das Extrahieren der Muschelfüße in einer schwach sauren wässrigen Lösung, die 1 bis 10 Gew.-% Essigsäure und 0,5 bis 3 Gew.-% Perchlorsäure enthält, wonach feste Substanzen aus der Lösung entfernt und die Proteine durch Zugabe organischer oder anorganischer Salze ausgefällt werden und die Proteinausfällung dann von der Lösung abgetrennt wird.
Gemäß der Erfindung sind geeignete Ausfällungssalze Natriumchlorid, Kaliumchlorid, Ammoniumsulfat, Ammoniumacetat, Natriumsulfat und Kaliumsulfat in einer Konzentration von 5 bis 15 Gew.-% der Lösung.
Gemäß der Erfindung werden die abgetrennten Proteine in geeigneter Weise in verdünnter Essigsäure wieder aufgelöst, und das nicht aufgelöste Material wird dann von dem System abgetrennt. Gemäß der Erfindung wird Perchlorsäure in geeigneter Weise zu der wieder aufgelösten und abgetrennten Proteinlösung für die selektive Ausfällung von unerwünschten Proteinen zugesetzt, wonach die Ausfällung von dem System abgetrennt wird.
Gemäß der Erfindung ist es vorteilhaft, die abgetrennte Lösung einer Dialyse in verdünnter Essiglösung zu unterwerfen, um Perchlorsäure und Material mit niedrigem Molekulargewicht zu entfernen. Gemäß der Erfindung kann das Muscheladhäsionsprotein in Lösung durch Zugabe von Ethanol, Propanol oder Aceton ausgefällt und dann aus dem System abgetrennt und optional wieder in verdünnter Essigsäure aufgelöst werden.
Die Erfindung bezieht sich auch auf Muscheladhäsionsproteine, die gemäß dem vorstehenden Verfahren hergestellt sind.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Das erfindungsgemäße Verfahren wird mit Muschelfüßen, die tiefgefroren sein können, durchgeführt, die zu einer wässrigen Mischung zugesetzt werden, die Essigsäure in einer Konzentration von 1 bis 10%, bevorzugt in dem Bereich von 5%, und Perchlorsäure in einer Konzentration von 0,5 bis 3%, bevorzugt in dem Bereich von 1,5%, enthält. Die Extraktionsmischung wird dann einige Minuten in einem Mixer homogenisiert, wonach die Suspension bei hoher Geschwindigkeit, z. B. bei einer 15000 g erzeugenden Geschwindigkeit, zentrifugiert wird.
Die wässrige Lösung, welche die Muscheladhäsionsproteine enthält, wird gesammelt, und die MAP-Proteine werden durch Zugabe von anorganischen Salzen, bevorzugt Natriumchlorid, in hoher Konzentration ausgefällt. Es ist notwendig, dass die Konzentration dieser anorganischen Salze hoch ist und in dem Bereich von 10 Gew.-% liegt. Bei dieser hohen Salzkonzentration fallen die Muscheladhäsionsproteine aus, während der Hauptteil von anderen nicht interessierenden Proteinen in Lösung bleibt. Die Muscheladhäsionsproteine fallen auch bei niedrigeren Konzentrationen aus. Die Ausfällungschemikalie ist nicht auf lediglich Natriumchlorid beschränkt. Kaliumchlorid, Ammoniumsulfat, Natriumsulfat usw. können alternativ für diesen Zweck verwendet werden. Nach einigen Stunden in einem Kühlschrank hat sich eine Ausfällung gebildet, die dann aus dem System entfernt wird, in geeigneter Weise z. B. durch Zentrifugation bei 5000 g.
Diese MAP-Ausfällung kann direkt ohne weitere Reinigung in einigen Fällen verwendet werden. In solchen Fällen kann sie optional mit anderen Substanzen, z. B. Kollagen, als Verstärkung vermischt und auf Wunden oder Ähnlichem verwendet werden, wobei Wasser angewandt wird und das MAP-Protein sowohl an sich selbst als auch an die Umgebung bindet.
Die MAP-Ausfällung kann jedoch alternativ z. B. in 5%iger Essigsäure aufgelöst werden, wobei bestimmte unerwünschte Proteine ausgefällt werden. Die Mischung kann dann so zentrifugiert werden, dass nicht aufgelöstes Material sich davon abtrennt, das dann aus dem System entfernt wird.
Die MAP-Mischung kann weiter durch Zugabe von Perchlorsäure gereinigt werden, wobei unerwünschtes aufgelöstes Material ausgefällt wird. Die Perchlorsäure mit einer Konzentration in dem Bereich von 15% wird bevorzugt langsam zu der Mischung und in einer Menge entsprechend zu 5 bis 15% des Volumens der Lösung zugesetzt. Die Mischung wird dann eine halbe Stunde abgekühlt, und die Ausfällung wird entfernt, in geeigneter Weise durch Zentrifugation.
Ein hochreines Muscheladhäsionsproteinprodukt kann erhalten werden, indem dann die Lösung, bevorzugt zwei- bis dreimal in großen Volumina in schwacher Essigsäure, z. B. 3%ige Essigsäure, dialysiert wird, wobei unerwünschte Perchlorsäure durch die Dialysemembran zusammen mit Material mit niedrigem Molekulargewicht durchtritt. Diese Dialyseverfahren sind allgemein bekannt und brauchen daher hier nicht im Einzelnen beschrieben zu werden. Die Dialyse führt zu einem MAP-Produkt mit einer Reinheit von 90 bis 97% und einer Ausbeute von 1 bis 2 mg Muscheladhäsionsprotein pro Gramm des Muschelfuß-Ausgangsmaterials.
Die wässrige MAP-Lösung, die mit Perchlorsäure behandelt wurde, kann auch durch Ausfällen des Muscheladhäsionsproteins mit Hilfe von Aceton in einer sauren Umgebung, in geeigneter Weise über Nacht, gereinigt werden. Die Ausfällung wird abgetrennt, bevorzugt durch Zentrifugation, und wird dann in einem kleinen Volumen von 5%iger Essigsäure aufgelöst. Das Protein hat dann eine Reinheit von 95 bis 100%, wobei die Ausbeute im Vergleich zu der durch Dialyse erhaltenen Ausbeute geringfügig abfällt, nämlich auf 0,5 bis 1 mg Muscheladhäsionsprotein pro Gramm Muschelfuß-Ausgangsmaterial.
Eine extreme Reinheit kann durch Kombinieren der zwei Reinigungsverfahren unter Verwendung von Dialyse und Acetonausfällung erhalten werden.
Die Erfindung stellt somit ein Verfahren zum Herstellen von Muscheladhäsionsproteinen, die verschiedene Reinheitsgrade haben und für verschiedene Verwendungen angepasst sind, in einer besonders einfachen Weise ohne die Verwendung einer großen Anzahl von unnötigen Chemikalien und in einer einfachen und wirtschaftlichen Weise bereit.

Claims

Verfahren zum Herstellen polyphenolischer Adhäsionsproteine aus Muschelfüßen, gekennzeichnet durch Extrahieren der Muschelfüße in einer schwach sauren wässrigen Lösung, die 1 bis 10 Gew.-% Essigsäure und 0,5 bis 3 Gew.-% Perchlorsäure enthält, Abtrennen fester Substanzen von den Proteinen in der wässrigen Lösung, Ausfällen der Proteine in der wässrigen Lösung nach Entfernung von Feststoffen durch Zugabe von anorganischen oder organischen Salzen und Abtrennen der Proteine.
Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die anorganischen Salze Natriumchlorid, Kaliumchlorid, Ammoniumsulfat, Natriumsulfat und Kaliumsulfat in einer Konzentration von 5 bis 15 Gew.-% der Lösung umfassen.
Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, gekennzeichnet durch Wiederauflösen der abgetrennten Proteine in verdünnter Essigsäure und danach Entfernung von nicht aufgelöstem Material aus dem System.
Verfahren gemäß Anspruch 3, gekennzeichnet durch Zusetzen von Perchloressigsäure zu der wieder aufgelösten und abgetrennten Proteinlösung, um so selektiv unerwünschte Proteine auszufällen, und dann Abtrennen der Ausfällung aus dem System.
Verfahren gemäß Anspruch 4, gekennzeichnet durch Dialysieren der abgetrennten Lösung in einer verdünnten Essigsäurelösung, um so Perchlorsäure und Material mit niedrigem Molekulargewicht aus dem System zu entfernen.
Verfahren gemäß Anspruch 4 oder 5, gekennzeichnet durch Zusetzen von Ethanol, Propanol oder Aceton zu der Lösung, um die polyphenolischen Proteine daraus auszufällen, Abtrennen der polyphenolischen Proteine aus dem System und optional Wiederauflösen der Proteine in verdünnter Essigsäure.