DE60026708T2

DE60026708T2 - Verfahren zur entschützung von geschützten thiolen

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Publication number: DE60026708T2
Application number: DE60026708T
Authority: DE
Inventors: Alan Cuthbertson
Original assignee: Amersham Health AS
Current assignee: GE Healthcare AS
Priority date: 1999-07-19
Filing date: 2000-07-19
Publication date: 2006-12-14
Anticipated expiration: 2020-07-20
Also published as: DE60026708D1; JP4738683B2; WO2001005757A2; ES2267551T3; JP2003505368A; EP1196429B1; US6906171B2; ATE320442T1; EP1196429A2; AU6004100A; US20020143207A1; WO2001005757A3

Description

Diese Erfindung bezieht sich auf ein neues Verfahren für die Entschützung von geschützten Thiol-Verbindungen, insbesondere auf Thiole, die durch Acetamidomethyl-, 4-Methylbenzyl- und t-Butyl-Gruppen (im Folgenden bezeichnet als Acm, MBzl beziehungsweise tBu) geschützt sind, mit einer gleichzeitigen Oxidation der entschützten Thiole, um Disulfide zu bilden. Derartige Prozesse sind in der Peptidsynthese besonders nützlich.
Während organischen Synthesen ist es ziemlich Routine, dass bestimmte reaktive Funktionalitäten geschützt werden, um ihre Teilnahme an unerwünschten Nebenreaktionen zu verhindern. Zum Beispiel werden reaktive Carbonylfunktionalitäten oft als Ketale und reaktive Hydroxyl- und Carboxyl-Gruppen oft als Ester geschützt.
Die neutrale, aber stark nukleophile Thiol-Gruppe, die in Cystein vorhanden ist, erfordert allgemein einen Schutz während Peptidsynthesen. Eine breite Vielfalt von Thiol-Schutzgruppen sind bekannt, einschließlich Benzyl, MBzl, 4-Methoxybenzyl, Trityl, Methoxytrityl, tBu, t-Butylthiol, Acetyl, 3-Nitro-2-pyridinsulfenyl und Acm. All diese Gruppen wurden in der Peptidsynthese erfolgreich verwendet und sind von Barany und Merrifield in „The Peptides" Band 2, Hgs. Gross und Minehoffer, Academic Press, Seiten 233–240 (1980) in einem Überblick angegeben.
Acm ist eine Thiol-Schutzgruppe, die normalerweise durch oxidative Spaltung entfernt wird, zum Beispiel durch Behandlung mit Quecksilber (II), Iod, Silber (I) oder Thalium (III). Sie wird im allgemeinen als säurestabil betrachtet, obwohl eine acidolytische Spaltung von Acm theoretisch in wasserfreien oder wässrigen Säuren möglich ist, sind derartige Reaktionen in der Praxis ungünstigerweise langsam aufgrund von Schwierigkeiten beim Protonieren des Schwefelatoms.
In diesem Zusammenhang beschreiben Fujii et al. in Chem. Pharm. Bull. 41 (6), Seiten 1030–1034 (1993) die Synthese und Oxidation von Oxytocin unter Verwenden von Cys (Acm) und Trifluoressigsäure (TFA)/10% Dimethylsulfoxid (DMSO). Die Autoren geben an, dass Cys (Acm)-Oxytocin nahezu intakt nach einer 12-stündigen Behandlung in der oben genannten TFA/DMSO-Mischung überlebte, was zeigt, dass der Acm-Schutz unter derartigen sauren Bedingungen stabil ist. Es wurde auch von Veber et al. in J. Am. Chem. Soc. 94, Seiten 5456–5461 (1972) berichtet, dass die S-Acm-Gruppe gegenüber Fluorwasserstoffsäure (HF) und starken Nukleophilen, wie Hydrazin, stabil ist.
Van Rietschoten et al. berichteten in Peptides (1977), Seiten 522–524, dass die Behandlung eines Peptids, das vier Acm-Gruppen enthielt, mit HF-Anisol dazu führte, dass 20% der Acm-Gruppen entfernt wurden. Kürzlich beschrieb Fisher et al. in J. Pept. Res. 49 (4), Seiten 341–346 (1997) eine Modifikation an einem Tyrosinrest aufgrund einer acidolytischen Spaltung von Acm, und Singh et al. in Tetrahedron Letters Band 37, Nr. 24, Seiten 4117–4120 (1996) berichten über die teilweise acidolytische Spaltung von Acm von C-terminalen Cys(Acm)-Peptiden. Diese Säureinduzierte Entschützungsreaktionen werden als unerwünschte Nebenreaktionen während der Peptidspaltung betrachtet.
Die MBzl-Thiol-Schutzgruppe wird traditionell unter Verwenden starker Säuren wie HF bei einer Temperatur von –5°C bis 0°C gespalten. Otaka et al. in Tetrahedron Letters Band 32, Nr. 9, Seiten 1223–1226 (1991) berichten, dass die MBzl-Gruppe gegenüber TFA stabil ist, und dass MBzl-geschütztes Cystein nicht zu Cystein bei der Behandlung mit TFA/10% DMSO bei Raumtemperatur umgewandelt wird.
Die tBu-Thiol-Schutzgruppe wird typischerweise durch oxidative Spaltung entfernt, zum Beispiel durch Behandlung mit Quecksilber (II), oder durch Acidolyse mit Trifluormethansulfonsäure. Die Gruppe wird als stabil gegenüber TFA und gegenüber Iodoxidation betrachtet.
B. Hargittai und G. Barany berichteten in „Controlled synthesis of natural and disulfide-mispaired regioisomers of alpha.concotoxin SI", Journal of Peptide Research Band 54, Nr. 6, Juni 1999, Seiten 468–479, von einem Verfahren für orthogonale Synthese eines synthetischen Peptids mit mehrfachen Disulfidbindungen.
In „Investigation of the dimethyl sulfoxide-trifluoroacetic acid oxidation system for the synthesis of cystine-containing peptides", Chemical and Pharmaceutical Bulletin. Band 41, Nr. 6, 1993, Seiten 1030–1034, beschreiben Koide et al. eine Thiol-Entschützung unter Verwenden von TFA/DMSO in Zusammenhang mit einer Vielfalt von Schutzgruppen. Jedoch berichten Koide et al. in Tabelle 1, dass Acm-Thiol-Entschützung unter Verwenden von DMSO/TFA-Oxidation versagte.
J. P. Tam et al. „Disulphide Bond Formation in Peptides by Dimethyl Sulphoxide. Scope and Application.", J. Am. Chem. Soc., 1991, Nr. 113, Seiten 6657–6662, offenbaren ein Verfahren, bei dem DMSO als ein Oxidationsmittel für die Bildung von Disulfidbindungen in Cys-enthaltenden synthetischen Peptiden verwendet wird.
Obwohl Akaji et al. in J. Am. Chem. Soc., Band 114, Nr. 11, Seiten 4137–4143 (1992) über die acidolytische Entfernung einer Vielfalt von Cystein-schützenden Gruppen einschließlich MBzl, tBu und Acm berichten, ist die Reaktion von dem Vorhandensein eines geeigneten Silylchlorids abhängig.
Die vorliegende Erfindung basiert auf der unerwarteten Erkenntnis, dass Acm, MBzl und tBu-Thiol-Schutzgruppen gegenüber Säuren unter oxidierenden Bedingungen labil sind, insbesondere, wenn die Reaktionstemperatur vergrößert wird. So können tBu-Thiol-Schutzgruppen schnell auf diese Weise bei Raumtemperatur gespalten werden und sogar noch schneller bei erhöhten Temperaturen. Acm- und MBzl-Thiol-Schutzgruppen werden zunehmend labil unter derartigen Bedingungen bei Temperaturen über 30°C, insbesondere bei Temperaturen von 50°C und darüber, sodass es möglich ist, eine im Wesentlichen quantitative Entschützung mit Reaktionszeiten von einigen Stunden oder weniger zu erreichen. Derartige Säureinduzierte Entschützung ist besonders vorteilhaft darin, dass es die Notwendigkeit für eine Verwendung der toxischeren Reagenzien vermeidet, die gegenwärtig zum Entfernen von Acm-, MBzl- und tBu-Gruppen eingesetzt werden. Durch Ausführen des Entschützens bei Vorhandensein eines Oxidationsmittels werden die freigesetzten Thiol-Gruppen direkt in intermolekulare oder intramolekulare Disulfidgruppen umgewandelt; wie im Folgenden diskutiert wird, besitzt dies besonders wertvolle Anwendungen bei der Synthese von zyklischen Peptiden, die Disulfidbindungen enthalten.
So stellt gemäß eines Aspektes die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer Verbindung bereit, die zwei oder mehr Disulfid-Bindungen umfasst, von einem Precursor mit zwei oder mehr Paaren von Thiol-Gruppen, wobei jedes Paar von Thiol-Gruppen mit unterschiedlichen Thiol-Schutzgruppen geschützt ist, die ausgewählt sind aus Acetamidomethyl (Acm), 4-Methylbenzyl (MBzl) und t-Butyl (tBu), wobei das Verfahren umfasst:

(i) Umsetzen des Precursors mit einer Säure bei Vorhandensein eines Oxidationsmittels bei einer ersten Temperatur, die ausreicht, um die Entschützung von tBu-geschützten Thiolen und die Disulfidbindungs-Bildung für ein erstes Paar von geschützten Thiol-Gruppen zu bewirken;
(ii) Anheben der Temperatur der Reaktionsmischung aus Schritt (i) auf eine zweite Temperatur, die ausreicht, um die Entschützung und die Disulfidbindungs-Bildung für ein zweites Paar von geschützten Thiol-Gruppen zu bewirken.

Sowohl wässrige als auch wasserfreie Säuren können in dem Verfahren verwendet werden. So können zum Beispiel wässrige anorganische Säuren, zum Beispiel Mineralsäuren wie Salzsäure, und wässrige oder wasserfreie organische Säuren, z.B. Carbonsäuren wie Essigsäure oder, bevorzugter, starke Carbonsäuren, wie TFA und Sulfonsäuren, wie Methansulfonsäure, nützlich sein.
DMSO ist ein bevorzugtes Beispiel eines Oxidationsmittels, das in dem Verfahren nützlich ist. Andere Sulfoxide, wie Tetramethylensulfoxid können auch nützlich sein, wie Metallsuperoxide und Peroxide, wie Kaliumsuperoxid oder Nickelperoxid, Thiocarbonate, wie Natriumtrithiocarbonat und organometallische Carbonate, wie Triphenylwismutcarbonat.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist das zu entschützende Thiol ein Peptid, das einen oder mehrere Acm-, MBzl- und/oder tBu-geschützte Cysteinreste enthält.
Peptide repräsentieren eine Klasse von Molekülen, die extrem gut für das Zielausrichten von krankheitsspezifischen Markern in vivo geeignet sind, und beträchtliche Aufmerksamkeit wird der Herstellung von synthetischen Peptiden als mögliche Komponenten von zielausgerichteten Bildgebungsmitteln gewidmet.
Die Synthese von Cystein-enthaltenden Peptiden stellt für einen Peptidchemiker spezielle Herausforderungen dar, da das Peptid in entweder einem reduzierten oder einem oxidierten Zustand existieren kann. Oxidierte Peptide, die mehr als einen Cysteinrest enthalten, können intramolekulare Disulfide oder intermolekulare Disulfide, wie Dimere, Trimere oder Multimere bilden. So ist zum Beispiel ein Peptid, das sechs Cysteinreste enthält, möglicherweise fähig zum Bilden von 15 Disulfidisomeren, und sorgfältiges Planen und Auswahl einer geeigneten Schutzstrategie ist deshalb erforderlich, falls korrekte Disulfidpaarbildungen in derartigen Peptiden erreicht werden sollen. Es wird anerkannt werden, dass korrekte Paarbildung häufig für korrektes Falten des Peptidrückgrats und gleichzeitige Orientierung der Seitenkettenfunktionalitäten entscheidend ist, um eine biologische aktive Konformation zu ergeben, die zum Hochaffinitäts-Rezeptorbinden geeignet ist.
Typische existierende Strategien für die selektive Bildung zweier oder mehrerer Disulfidbindungen benutzen Kombinationen von Schutzgruppen, wie Trityl und Acm oder t-Butylthio und Acm, wobei die erste Disulfidbindung nach der Entfernung der Trityl- oder t-Butylthiogruppen gebildet werden und die zweite durch oxidative Spaltung der Acm-Gruppen gebildet werden, unter Verwenden von zum Beispiel von Iod- oder Thaliumtrifluoracetat. Andere Beispiele der Synthese von vielfach verbrückten Peptiden umfassen die Lösungssynthese von Insulin durch Sieber et al., beschrieben in Helv. Chim. Acta. 57, Seiten 2617–2621 (1974) und die Prozeduren von Atherton et al., J. Chem. Soc. Perkin Trans. 1, Seite 2065 (1985) und Akaji et al., J. Am. Chem. Soc. 115, Seite 11384 (1993).
Entschützen gemäß der vorliegenden Erfindung ermöglicht eine beträchtliche Vereinfachung derartiger Strategien, derart, dass zwei oder mehr Disulfidbindungen in einer „Ein-Topf"-Reaktion erzeugt werden, wodurch die Notwendigkeit für eine zwischenzeitliche Reinigung teilweise oxidierter oder teilweise geschützter Peptide vermieden wird und so eine Ersparnis in der Verwendung von Lösungsmittel und in der Zeit und Verbesserungen in der Produktausbeute erreicht wird. So kann durch Herstellen eines Peptids, das zwei Säure-labile Thiol-Schutzgruppen (z.B. Tritylgruppen), wie auch zwei oder mehr Acm- und/oder MBzl-Gruppen enthält, eine erste Disulfidbindung durch Säurebehandlung des Peptids bei einer relativ niedrigen (z.B. Umgebungs-) Temperatur gebildet werden, und eine oder mehrere weitere Disulfidbindungen können einfach durch Erhöhen der Temperatur der Reaktionsmischung auf eine Temperatur über 30°C derart gebildet werden, dass die Acm- und/oder MBzl-Gruppen gespalten werden. Das erforderliche Oxidationsmittel kann vor oder nach der Niedrigtemperatur-Behandlung zugegeben werden, wie erwünscht.
Die Positionen der Säure-labilen Schutzgruppen sind vorteilhafterweise derart, dass die zuerst gebildete Disulfidbindung das Molekül in eine gefaltete Konformation derart bringt, dass die Acm-geschützten und/oder MBzl-geschützten Thiolgruppen in einer Weise nebeneinander angeordnet sind, die die korrekte Bildung der verbleibenden Disulfidbindung oder -bindungen vereinfacht.
Da, wie oben angegeben, tBu-Thiol-Schutzgruppen leicht bei Raumtemperatur durch eine saure und oxidative Behandlung gespalten werden, kann eine Kombination von tBu mit Acm- und/oder MBzl-Schutz verwendet werden, wobei die tBu-Gruppen bei Raumtemperatur gespalten werden und die Acm- und/oder MBzl-Gruppen nachfolgend beim Erwärmen auf eine Temperatur über 30°C entfernt werden. Die spezifische Bildung von mehrfachen Disulfiden kann deshalb in einer hohen Ausbeute unter Verwenden einer „Ein-Topf"-Strategie bewirkt werden, ohne die Notwendigkeit zum Isolieren von Zwischenprodukten durch Chromatographie.
Die Verwendung von TFA/DMSO-Mischungen, z.B. mit einem DMSO-Gehalt von 1 bis 20%, z.B. 2–10%, um das Entschützen und die Disulfidbindungs-Bildung zu fördern, ist in derartigen Ausführungsformen der Erfindung besonders bevorzugt, da sowohl die S-geschützten Ausgangsmaterialien, als auch die Disulfid-verknüpften Zwischenprodukte und Endprodukte typischerweise in derartigen Mischungen löslich sein werden. Sowohl TFA als auch DMSO können auf einfache Weise für die weitere Verwendung recycelt werden.
Die Tatsache, dass Thiol-Schutzgruppen, wie Trityl und Methoxytrityl im Allgemeinen säurelabil sind, während tBu-Thiol-Schutzgruppen nur säurelabil unter oxidierenden Bedingungen sind, kann bei der Synthese von Peptiden, die drei Disulfidbindungen enthalten, durch einen regioselektiven „Ein-Topf"-Oxidationsprozess verwertet werden. So kann ein Harz-getragenes synthetisches Peptid, das annähernd positionierte Paare von Cysteinresten enthält, die mit Trityl-, Methoxytrityl- oder anderen säurelabilen Gruppen geschützt sind, mit tBu-Gruppen beziehungsweise Acm- und/oder MBzl-Gruppen anfänglich mit Säure behandelt werden, um die Spaltung vom Harz und die Spaltung der Trityl-, Methoxytrityl- oder anderer säurelabiler Schutzgruppen zu bewirken. Das so erzeugte Paar von Thiol-Gruppen kann in wässriger Lösung bei einem basischen pH oder in wässrigem DMSO oxidiert werden, um die erste erwünschte Disulfidbindung zu bilden, wonach das Lösungsmittel in vacuo oder durch Gefriertrocknen verdampft werden kann. Nachfolgende Niedrig-(z.B. Raum-)Temperatur- und Hoch-(d.h. > 30°C)Temperatur-, saure und oxidative Behandlung des Produktes, wie oben beschrieben, führt dann zur Bildung der erwünschten zweiten und dritten Disulfidbindungen, durch sukzessive Reaktion der tBu-geschützten und Acm- und/oder MBzl-geschützten Paare von Thiolgruppen.
Die vorliegende Prozedur ermöglicht, dass Cystein-enthaltende Peptide bei Konzentrationen über 1 mg/ml oxidiert werden, wodurch im Wesentlichen Lösungsmittelvolumen-Erfordernisse im Vergleich zu existierenden Protokollen, wie die Iod-Spaltung von Acm und Luftoxidation, verringert werden, welche typischerweise Peptidkonzentrationen der Größenordnung von 0,1 mg/ml einsetzen und so erfordern, dass das Produkt konzentriert wird, z.B. durch Ionenaustauschchromatographie, vor der Endreinigung. Gemäß der vorliegenden Prozedur kann andererseits eine Produktkonzentration einfach durch Lösungsmittel-Verdampfen in vacuo bewirkt werden.
Die folgenden Beispiele dienen zum Veranschaulichen der Erfindung.
Beispiel 1: "Ein-Topf"-Synthese von α-Conotoxin SI[Ile-Cys-Cys-Asn-Pro-Ala-Cys-Gly-Pro-Lys-Tyr-Ser-Cys-NH₂ mit Disulfidbindungen, die Cys 2 mit Cys 7 und Cys 3 mit Cys 131 verbinden
Die Peptidsequenz wurde auf einem automatischen ABI 433A-Peptidsynthetisierer zusammengebaut, ausgehend von Rink-Amid-Harz (Novabiochem) in einem 0,12 mmol-Maßstab unter Verwenden von 1 mmol-Aminosäurekartuschen. Cysteinreste 2 und 7 wurden mit Trityl-Gruppen geschützt, während Reste 3 und 13 mit Acetamidomethyl-Gruppen geschützt wurden. Alle Aminosäuren wurden voraktiviert unter Verwenden von O-Benzotriazol-1-yl-N,N,N',N'-tetramethyluroniumhexafluorphosphat (HBTU).
Gleichzeitiges Entfernen des Peptids vom Harz und der Seitenketten-Schutzgruppen (mit Ausnahme von Acm) vom Peptid wurde durch Behandlung mit Trifluoressigsäure (TFA) bewirkt, die 5% Triisopropylsilan und 5% Wasser enthielt, für 2 Stunden, was eine Ausbeute des Rohproduktes von 130 mg ergab. HPLC-Analyse des Rohproduktes (Vydac 218TP54-Säule) wurde ausgeführt unter Verwenden eines Gradienten von 5 bis 30% B über 20 Minuten (A = 0,1% TFA/Wasser und B = 0,1% TFA/Acetonitril) bei einer Fließgeschwindigkeit von 1 ml/Minute; es wurde gefunden, dass das Produkt > 90% rein war. Eine weitere Produktcharakterisierung wurde ausgeführt unter Verwenden von MALDI-Massenspektrometrie: M + H für Acm-geschütztes Produkt, erwartet bei 1496, gefunden bei 1502.
Zu 2 mg des Rohproduktes wurden TFA (10 ml) und Dimethylsulfoxid (DMSO) (0,1 ml) gegeben. Die Mischung wurde auf Eis gerührt und der Verlauf der Oxidation wurde durch HPLC verfolgt. Das Ausgangsprodukt, Retentionszeit 16,2 Minuten (0 bis 30% B über 20 Minuten, wobei A = 0,1% TFA/Wasser und B = 0,1% TFA/Acetonitril) wurde langsam durch ein neues Produkt mit einer Retentionszeit von 16,4 Minuten ersetzt, und nach 2 Stunden war das Produkt vollständig verschwunden. 0,05 ml Anisol wurde dann zur Peptidlösung gegeben und die Mischung wurde auf 60°C für weitere 2 Stunden erwärmt, wonach das TFA in vacuo entfernt wurde und das Peptid wurde durch die Zugabe von Diethylether ausgefällt. Das rohe, voll oxidierte Material (1,4 mg) umfasste 2 Hauptprodukte, Verhältnis 1:5, mit HPLC-Retentionszeiten von 16,9 bzw. 17,8 Minuten. Es wurde gefunden, dass das 17,8 Minuten-Produkt, das circa 80% des Materials umfasste, mit einer authentischen Probe von α-Conotoxin (Bachem, H-1112) zusammen eluierte.
Reinigung auf einer halb-präparativen Vydac 218TP152010-Säule unter Verwenden eines Gradienten von 0 bis 30% B über 30 Minuten (A = 0,1% TFA/Wasser und B = 0,1% TFA/Acetonitril)) bei einer Fließgeschwindigkeit von 5 ml/Minute, gefolgt von Gefriertrocknen, ergab Conotoxin (0,7 mg, 35% Ausbeute), was als > 90% rein gefunden wurde. Weitere Charakterisierung wurde ausgeführt unter Verwenden von MALDI-Massenspektrometrie: M + H für das Produkt erwartet bei 1354, gefunden bei 1356.
Beispiel 2: „Ein-Topf"-Synthese von α-Conotoxin SI
Die Peptidsequenz wurde wie in Beispiel 1 beschrieben zusammengebaut mit der Ausnahme, dass die Cysteinreste 2 und 7 mit t-Butyl-Gruppen geschützt wurden, während die Reste 3 und 13 mit 4-Methylbenzyl-Gruppen geschützt wurden. Alle Aminosäuren wurden unter Verwenden von HBTU voraktiviert.
Gleichzeitiges Entfernen des Peptids vom Harz und der Seitenketten-Schutzgruppen (mit Ausnahme von t-Butyl und 4-Methylbenzyl) vom Peptid wurde durch Behandlung mit TFA bewirkt, das 5% Triisopropylsilan und 5% Wasser enthielt, für 2 Stunden, was eine Ausbeute des Rohproduktes von 125 mg ergab. HPLC-Analyse des Rohproduktes (Vydac 218TP54-Säule) wurde ausgeführt unter Verwenden eines Gradienten von 20 bis 60% B über 20 Minuten (A = 0,1% TFA/Wasser und B = 0,1% TFA/Acetonitril) bei einer Fließgeschwindigkeit von 1 ml/Minute; es wurde gefunden, dass das Produkt eine Retentionszeit von 15,7 Minuten und eine Reinheit > 90% besaß. Eine weitere Produktcharakterisierung wurde ausgeführt unter Verwenden von MALDI-Massenspektrometrie: M + H für teilweise geschütztes Produkt, erwartet bei 1680, gefunden bei 1685.
Zu 50 mg des rohen, teilweise geschützten Produktes in einem sauberen Kolben wurde TFA (98 ml), DMSO (2,0 ml) und Anisol (0,1 ml) gegeben. Die Mischung wurde bei Raumtemperatur 40 Minuten lang gerührt und man ließ eine Probe der Reaktionsmischung auf einem MALDI-Massenspektometer laufen. Ein neues Produkt erschien, das als das einzelne Disulfid bestätigt wurde, wobei die 4-Methylbenzyl-Schutzgruppen verblieben: M + H für das teilweise geschützte Produkt erwartet bei 1565, gefunden bei 1568.
Der Kolben wurde dann in einem Ölbad angeordnet und auf 70°C 3 Stunden lang erwärmt, wonach das TFA in vacuo entfernt wurde und das Peptid wurde durch die Zugabe von Diethylether ausgefällt. Das Präzipitat wurde mit Ether verrieben und an Luft getrocknet, um das rohe, voll oxidierte Produkt (45 mg) in einer fast quantitativen Ausbeute und mit einer HPLC-Reinheit von > 90% zu ergeben.
Eine aliquote Menge von 20 mg des rohen, voll oxidierten Produktes wurde durch präparative HPLC auf einer präparativen Vydac 218TP1022 C18-Säule unter Verwenden eines Gradienten von 0 bis 30% B über 40 Minuten (A = 0,1% TFA/Wasser und B = 0,1% TFA/Acetonitril) bei einer Fließgeschwindigkeit von 9 ml/Minute gereinigt. Die Fraktionen, die das reine Produkt enthielten, wurden gesammelt und gefriergetrocknet (10 mg, 50% Ausbeute). Es wurde gefunden, dass das Produkt > 99% rein war, durch analytische HPLC. Eine weitere Charakterisierung wurde ausgeführt unter Verwenden von MALDI-Massenspektrometrie: M + H für das Produkt erwartet bei 1354, gefunden bei 1356.
Es wurde gezeigt, dass das Material mit einer authentischen Probe von α-Conotoxin (Bachem, H-1112) zusammen eluierte.
Beispiel 3: Synthese von Oxytocin a) Synthese von Cys(Acm)-geschütztem Oxytocin: NH₂-Cys(Acm)-Tyr-Ile-Gln-Asn-Cys(Acm)-Pro-Leu-Gly-NH₂
Das Peptid wurde auf einem automatischen ABI 433A-Peptidsynthetisierer synthetisiert, ausgehend von Rink-Amid-AM-Harz in einem 0,25 mmol-Maßstab unter Verwenden von 1 mmol-Aminosäure-Kartuschen. Die Aminosäuren wurden unter Verwenden von HBTU vor dem Koppeln voraktiviert. Gleichzeitiges Entfernen des Peptids vom Harz und der Seitenketten-Schutzgruppen (mit Ausnahme von Acm) vom Peptid wurde bewirkt durch eine Behandlung mit TFA, das 5% Triisopropylsilan und 5% Wasser enthielt, für eine Stunde.
Das resultierende rohe Material (300 mg) wurde durch präparative HPLC (Vydac C18 218TP1022-Säule) unter Verwenden eines Gradienten von 5 bis 30% B über 40 Minuten (A = 0,1% TFA/Wasser und B = 0,1% TFA/Acetonitril) bei einer Fließgeschwindigkeit von 9 ml/Minute gereinigt. Nach der Lyophilisierung wurden 166 mg reines Material erhalten. Eine HPLC-Analyse dieses gereinigten Produktes (Vydac C18 218TP54-Säule) wurde ausgeführt unter Verwenden eines Gradienten von 5 bis 50% B (A = 0,1% TFA/Wasser und B = 0,1% TFA/Acetonitril) mit einer Produktdetektion durch UV bei 214 nm; die Produktretentionszeit betrug 14,30 Minuten. Eine weitere Produktcharakterisierung wurde ausgeführt unter Verwenden von MALDI-Massenspektrometrie: M + H für das Produkt erwartet bei 1151,0, gefunden bei 1551,5.
b) Entschützung und Oxidation, um Oxytocin [NH₂-Cys-Tyr-Ile-Gln-Asn-Cys-Pro-Leu-Gly-NH₂, mit einer Disulfidbindung, die Cys 1 mit Cys 6 verbindet] zu bilden
5 mg Cys(Acm)-geschütztes Oxytocin wurde in TFA (2 ml) aufgelöst, dann zu einer Mischung von Anisol (40 μl), DMSO (1 ml) und TFA (18 ml) gegeben, die auf 60°C vorerwärmt war. Nach 5 Stunden bei dieser Temperatur wurde das Auftreten einer quantitativen Umwandlung zu Oxytocin durch analytische HPLC (Vydac C18 218TP54-Säule) unter Verwenden eines Gradienten von 5 bis 50% B (A = 0,1% TFA/Wasser und B = 0,1% TFA/Acetonitril) mit einer Produktdetektion durch UV bei 214 nm bestätigt; die Produktretentionszeit betrug 12,98 Minuten. Eine weitere Produktcharakterisierung wurde ausgeführt unter Verwenden von MALDI-Massenspektrometrie: M + H für das Produkt erwartet bei 1007, gefunden bei 1011. Es wurde gefunden, dass das Produkt mit einer authentischen Probe von Oxytocin zusammen eluierte, die von Novabiochem bezogen war.
Beispiel 4: Vergleichsstudie der Entschützung und der Oxidationsgeschwindigkeiten von Cystein-geschützten Oxytocin-Analoga bei Raumtemperatur und 60°C
Die Prozedur des Beispiels 3 (a) wurde wiederholt, um Cys(tBu)-geschützte und Cys(MBzl)-geschützte Analoga von Oxytocin herzustellen. Entschützung und Oxidation dieser Analoga und Cys(Acm)-geschützten Oxytocins wurden ausgeführt wie beschrieben in Beispiel 3 (b) bei Raumtemperatur und bei 60°C. Die folgende Tabelle fasst das Ausmaß der Umwandlung zu Oxytocin zusammen, wie bestimmt durch analytische HPLC; das Auftreten einer quantitativen Umwandlung bei 60°C wurde bestätigt durch MALDI-Massenspektrometrie.
Beispiel 5: "Ein-Topf"-Synthese von wärmestabilem Enterotoxin-ST-Peptid [NH₂-Cys-Cys-Glu-Leu-Cys-Cys-Asn-Pro-Ala-Cys-Ala-Gly-Cys-Tyr-OH mit Disulfidbindungen, die Cys 1 mit Cys 6, Cys 2 mit Cys 10 und Cys 5 mit Cys 131 verbinden
Die Peptidsequenz wurde auf eine Weise zusammengebaut, die jener, die in Beispiel 1 beschrieben ist, ähnlich ist; Cysteinreste 1 und 6 wurden mit Tritylgruppen geschützt, die Reste 2 und 10 mit t-Butyl-Gruppen und die Reste 5 und 13 mit 4-Methylbenzyl-Gruppen. Das Peptid wurde vom festen Träger wie in Beispiel 1 beschrieben gespalten, mit einer rohen Ausbeute von 190 mg (Cysteinreste 1 und 6 in der Thiol-Form, die verbleibenden Cysteine noch geschützt). 50 mg des rohen, teilweise geschützten Peptids wurden in 400 ml Wasser/Acetonitril (60:40) aufgelöst und der pH wurde auf 8 durch Zugabe von verdünntem Ammoniumhydroxid eingestellt. DMSO (10 ml) wurde zugegeben und man verfolgte den Verlauf der folgenden Oxidation mit analytischer HPLC und MALDI-TOF. Es wurde gefunden, dass ein neues Produkt mit einer Disulfidbindung, die Cys 1 mit Cys 6 verband, innerhalb einer Stunde gebildet wurde, wonach das Lösungsmittel in vacuo entfernt wurde.
Zum resultierenden DMSO-enthaltenden Rest im selben Kolben wurde TFA (75 ml) und Anisol (0,1 ml) gegeben, und die Mischung wurde eine Stunde lang gerührt. MALDI-TOF-Analyse zeigte, dass die t-Butyl-Gruppen entfernt worden waren und dass eine zweite Disulfidbindung gebildet worden war, die Cys 2 mit Cys 10 verband. Der Kolben wurde dann mit einem Kühler ausgerüstet und die Temperatur wurde auf 70°C eine Stunde lang erhöht. MALDI-TOF-Analyse zeigte, dass eine vollständige Spaltung der 4-Methylbenzyl-Gruppen stattgefunden hatte. Das TFA wurde entfernt und das Produkt wurde durch Zugabe von Diethylether ausgefällt. Das rohe Produkt wurde wiedergewonnen nach dem Verrühren mit Diethylether und dem Trocknen an Luft. Reinigen durch HPLC ergab das reine Produkt in einer 30%-igen Ausbeute.
Es wurde gezeigt, dass das Produkt mit einer authentischen Probe von ST-Peptid zusammen eluierte und wurde als (Ki = 3 nM) in einem in-vitro-Screening-Assay aktiv bestätigt.

Claims

Verfahren zur Herstellung einer Verbindung, die zwei oder mehr Disulfid-Bindungen umfasst, von einem Precursor mit zwei oder mehr Paaren von Thiol-Gruppen, wobei jedes Paar von Thiol-Gruppen mit unterschiedlichen Thiol-Schutzgruppen geschützt ist, die ausgewählt sind aus Acetamido-methyl (Acm), 4-Methylbenzyl (MBzl) und t-Butyl (tBu), wobei das Verfahren umfasst: (i) Umsetzen des Precursors mit einer Säure bei Vorhandensein eines Oxidationsmittels bei einer ersten Temperatur, die ausreicht, um die Entschützung von tBu-geschützten Thiolen und die Disulfidbindungs-Bildung für ein erstes Paar von geschützten Thiol-Gruppen zu bewirken; (ii) Anheben der Temperatur der Reaktionsmischung aus Schritt (i) auf eine zweite Temperatur, die ausreicht, um die Entschützung und die Disulfidbindungs-Bildung für ein zweites Paar von geschützten Thiol-Gruppen zu bewirken.
Verfahren nach Anspruch 1, bei dem die Säure Trifluoressigsäure (TFA) ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 2, bei dem das Oxidationsmittel Dimethylsulfoxid (DMSO) ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, bei dem die Entschützung bewirkt wird unter Verwenden einer TFA/DMSO-Mischung, die 1 bis 20% DMSO umfasst.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, bei dem die geschützten Thiol-Gruppen in einem Peptid vorhanden sind.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, bei dem die Verbindung mindestens zwei t-Butyl(tBu)-geschützte Thiole und mindestens zwei Acetamidomethyl(Acm)- oder 4-Methylbenzyl(MBzl)-geschützte Thiole umfasst.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, bei dem tBU-geschützte Thiole in Schritt (i) bei Raumtemperatur entschützt werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, bei dem Acm- oder MBzl-geschützte Thiole in Schritt (ii) bei Temperaturen von 30°C oder darüber entschützt werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, bei dem Acm- oder MBzl-geschützte Thiole in Schritt (ii) bei Temperaturen von 50°C oder darüber entschützt werden.