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Gebiet der
Erfindung
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Die
Erfindung betrifft die Messung von Strahlung, typischerweise Fluoreszenz,
die von Proben auf dem Gebiet der Wissenschaften der Biologie, Biomedizin
und Chemie emittiert wird.
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Hintergrund
der Erfindung
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Solche
Proben werden normalerweise in Probenplatten oder -formaten hergestellt
und gemessen, darunter 96-Loch-Mikrotitrierplatten, Petrischalen,
Gelmatrizen, Membrane, Glasobjektträger und Kapillaren. Der Trend
geht zu einer höheren
Durchsatzmengenerfassung der Proben und der Verwendung von kleineren
Volumina bei jeder Probe, was zu so genannten miniaturisierten Probenformaten
führt.
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Dies
erfordert die entsprechende Entwicklung von Erfassungseinrichtungen,
die für
solche miniaturisierten Formate geeignet sind. Dies gilt besonders
für den
Fall des Hochdurchsatz-Screening (High Throughput Screening, HTS)
von biologischen Proben, die bei der Drogenfahndung und dem Testen von
Drogenverdächtigen
angewendet werden.
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Diese
Miniaturisierung wird erreicht, indem Proben für Test und Erfassung in Lochplatten
angeordnet werden, in denen typischerweise 96, 384, 864, 1536 oder
3456 Löcher
pro Platte sein können
und bei denen die Probenvolumina von 200 Mikroliter bis hinunter
zu 1 Mikroliter reichen können.
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Alternative
Formate für
die Miniaturisierung von Proben umfassen Kapillaren, Mikrokanäle oder mikrofluidische
Strukturen, darunter Mikrolöcher,
die in Substraten wie Glas (z.B. Siliziumdioxid oder Quarz) oder
Kunststoff geformt oder eingeätzt
sein können.
Bei diesen alternativen Formaten können die Probenvolumina im
Bereich von Nanolitern und Picolitern liegen.
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Um
ein Hochdurchsatz-Screening zu erreichen, ist es nötig, große Zahlen
solcher Proben gleichzeitig zu untersuchen. Bei fluorenszenzbasierten
Assays besteht die Erfassung oder Untersuchung daraus, dass jede
Probe mit Erregerlicht beleuchtet wird und nachfolgend die emittierte
Fluoreszenz von jeder Probe einzeln erfasst wird. Beispiele für fluoreszenzbasierte
Verfahren umfassen sofortige Fluoreszenz und zeitaufgelöste Fluoreszenz,
bei der eine Zeitverzögerung
zwischen der Photoaktivierung der Probe und der Emission besteht,
beispielsweise im Bereich von ps bis zu ms oder mehr. Ein weiteres Verfahren
ist die Fluoreszenz- oder Lumineszenz-Energieübertragung. Bei diesem Verfahren
wird ein Molekül
aktiviert, z.B. durch Erregerlicht, und überträgt Energie z.B. durch Resonanzenergieübertragung
oder chemische Übertragung
auf ein zweites Molekül,
das seinerseits Licht emittiert. Dieses Verfahren kann unterschiedliche
oder multiple Sekundärmoleküle umfassen,
die Strahlung über
eine Spanne von Wellenlängen
emittieren können.
Weitere Beispiele für
Lumineszenzverfahren umfassen Phosphoreszenz sowie chemische und
biologische Lumineszenz. Wellenlängenbereiche
für alle
diese Verfahren umfassen den UV-Bereich, den sichtbaren Bereich,
den Rot- und den Infrarotbereich (ungefähr 250–1.200 nm).
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Bei
einer typischen Anordnung untersucht ein Scannerkopf mit 96 Kanälen gleichzeitig
die 96 Stellen, die in dem 8 × 12-Muster
einer 96-Loch-Mikrotitrierplatte angeordnet sind. Durch Staffelung
einer höheren
Lochdichte im Verhältnis
zu einem 96-Kanal-Scannerkopf
können
die übrigen
Stellen abgelesen werden. Z.B. decken 2 × 2 Schritte 384 Proben ab,
6 × 6
Schritte decken 3.456 Proben ab, usw. Dies ermöglicht es dem Kopf, Probenpräsentationsformate
mit höherer
Dichte zu bearbeiten.
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Fluidproben,
z.B. Flüssigkeiten
oder Gele, können
in kleinen Probenstellen angeordnet werden, beispielsweise Mikrokapillaren
oder Mikrokanälen, deren
Querschnitt typischerweise 100 × 100 μm und deren
Länge typischerweise
1–100
mm betragen kann. Die Proben können
durch Pumpen oder elektrophoretisch oder elektroosmotisch bewegt
werden. Proben können
fest oder eine Matrix wie Tropfen, Agarose oder Mikropartikel sein,
die in einem Fluidmedium, darunter ein Geltypformat, suspendiert
oder auf andere Art enthalten ist. Andere Proben können Suspensionen
oder Monoschichten von Zellen umfassen.
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Anwendungen
umfassen die Zellbiologie, Hybridisierungstechniken und Immunassays
einschließlich
Bindungs-Assays. Bei solchen Assays können Materialien zur Identifizierung
mit einem Fluoreszenzmarker gekennzeichnet sein. Bei einem Bindungs-Assay kann ein gebundenes
Molekül
von einem ungebundenen Molekül
getrennt werden, wie zwischen einem festen und einem flüssigen Medium. Weitere
Anwendungen umfassen Elektrophorese- oder Elektroosmose-Fluide wie
Flüssigkeiten,
Gele und Medien einschließlich
Agarose. Diese Anwendungen können
in miniaturisierten Formaten, darunter Mikrokapillaren und Mikrofluid-Strukturen
durchgeführt
werden, bei denen Moleküle
oder Anteile nach Eigenschaften, darunter Molgewicht oder Ladung,
räumlich
getrennt werden und ebenfalls mit fluoreszenten oder lumineszenten
Markierungen oder Farbstoffen zur Erfassung und Identifizierung
gekennzeichnet sein. Die hier beschriebenen Techniken können bei
der Erfassung biologischer Verbindungen, darunter Proteine und Nukleinsäuren, sowie in
der Zellbiologie angewandt werden; auch Prozesse wie Zellinformationen
oder Zellbindungen können erfasst
werden.
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Getrennte
Moleküle
können
in einer festen Matrix enthalten sein, z.B. einem Gel oder Agarosekügelchen,
oder können
in einem Fluid getrennt sein, so dass die getrennten Moleküle oder
Anteile mit unterschiedlichen Durchsätzen durch ein Medium strömen und
an einem festgelegten Punkt entlang dem Strömungsweg als eine Reihe von
Emissionsspitzen auf der Grundlage ihres Zeit-Trennungs-Profils
erfasst werden. Es ist wichtig, dass die Emissionserfassungsverfahren
eine große
Genauigkeit und Empfindlichkeit für die Bestimmung solcher Spitzen
sowie die rasche und/oder kontinuierliche und/oder gleichzeitige
Messung von Proben haben.
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Mehrere
solcher Assay-Techniken umfassen zeitliche Änderungen bei der Lichtemission.
Die Messung solcher Änderungen
verlangt die Fähigkeit,
rasche, genaue, empfindliche und wiederholte Messungen durchzuführen, d.h.
kinetische Messungen durchzuführen.
Um einen hohen Durchsatz zu erreichen, ist es erforderlich, dass
ein System eine Vielzahl von Proben gleichzeitig misst, was eine
hohe Auflösung,
eine hohe Empfindlichkeit und eine hohe Signalerfassungseffizienz
erfordert.
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Meist
sind die Proben/Assays dafür
vorgesehen, Licht im mittleren Bereich zu emittieren, obwohl die
Mengen an Licht pro Probe sehr gering sein können.
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Eine
weitere Schwierigkeit bei fluoreszenzbasierten Assays ist das Problem
des Löschens,
das eine Reduzierung der Lichtemission verursacht. Dies kann bei
Proben und Assays auftreten, insbesondere bei solchen, die Zellen
umfassen, aufgrund chemischer Wirkungen, die mit dem Lichtsignal
interferieren, oder aufgrund von farbigen Substanzen oder Partikeln
in der Probe oder dem Medium, die das Lichtsignal reduzieren. Bei
bestimmten Anwendungen, z.B. Inhibitions-Assays, ist eine Änderung
oder Reduzierung des Lichtsignals das Merkmal dafür, dass
der Assay einer Messung bedarf.
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1(a) zeigt eine Anordnung von 8 × 12 Mikrokapillaren
in einem Substrat, in dem entweder eine Flüssigkeit oder Moleküle oder
Anteile in einem Fluid sich in X-Richtung
bewegen. Dies ist ein Beispiel für
eine Anordnung von miniaturisierten Proben wie die, auf die sich
diese Anmeldung bezieht.
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1(b) und 1(c) zeigen
weitere Beispiel für
Anordnungen, die eine hohe Dichte oder miniaturisierte Probenformate
aufweisen.
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Abbildungssysteme
zur Erfassung von Epi-Fluoreszenz sind in der GB-Patentschrift 2,339,901
beschrieben. Typischerweise ist, wie in 1(a) bis (c) der beigefügten Zeichnungen gezeigt, eine
Anordnung von 96 faseroptischen Bündeln so angeordnet, dass sie
mit dem Mittelpunkt jeder von einer Vielzahl an Probenstellen auf
einer Probenplatte fluchten – z.B.
einer 8 × 12-Matrixplatte
mit 96 Löchern,
wobei jedes Loch typischerweise einen Durchmesser im Bereich von
1 mm hat.
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Die
EP 0 902 280 A offenbart
in
5 ein System zur Abbildung von
Strahlung, die durch Lumineszenz von Proben (
7) auf eine
photoelektrische Erfassungseinrichtung (
6) emittiert wird,
bei der eine Linse (
25) zwischen der Lumineszenz und dem
faseroptischen Bündel
(
51) angeordnet ist. Es wird jedoch kein Versuch unternommen,
die Größe des Eingangsendes
des Bündels
an die Größe und numerische
Apertur (NA) des Bereichs anzupassen, der die Lumineszenz erzeugt.
Dies wird in der
EP 0 902 280 durch
Verwendung zusätzlicher
Linsen
21,
23 und einer Nadelstich-Öffnung
24 erreicht.
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Die
WO 8911743 offenbart ebenfalls die Verwendung optischer Faserbündel (wie 50 in 7) zur Übertragung von Licht von Licht
emittierenden Bereichen einer Probenplatte 56 zu der Eingangs-Schirmplatte
einer Erfassungseinrichtung oder Kamera 52. Jedoch wird
keines der vorgeschlagenen optisch leitenden Elemente zwischen den
Licht emittierenden Bereichen und dem Eingang des Faserbündels so gewählt, dass
es die gleiche NA wie der Licht emittierende Bereich hat, um das
Gesichtsfeld des Bündels auf
die Fläche
des untersuchten Licht emittierenden Bereichs zu reduzieren, und
es ist keine Einrichtung mit Öffnungen
zwischen diesem und einem optisch leitenden Element angeordnet (wie
oben beschrieben), um den Störabstand
des Systems zu verbessern.
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Aufgabe der
Erfindung
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Eine
Aufgabe der Erfindung ist es, ein System zur Abbildung von Strahlung
zur Verfügung
zu stellen, die von Proben an eine lichtempfindliche Erfassungseinrichtung
abgegeben wird, um es dadurch zu ermöglichen, viel kleinere Proben
(üblicherweise als
Mikroproben bezeichnet) zu untersuchen. Typischerweise haben Mikroproben
eine Dimension, die weniger als 500 μm groß ist und nur 50 μm oder weniger
groß sein
kann.
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Zusammenfassung
der Erfindung
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Erfindungsgemäß wird ein
System zur Abbildung von Strahlung zur Verfügung gestellt, die von Proben
an eine photoelektronische Erfassungseinrichtung abgegeben wird,
bei dem eine optische Abbildungseinrichtung (118) am Eingangsende
eines faseroptischen Bündels
(100) eines Abbildungssystems angeordnet ist, wobei das
Bündel
dafür eingerichtet
ist, Licht von seinem Eingangsende an eine lichtempfindliche Erfassungseinrichtung,
z.B. einen Zeilensensor, zu übertragen,
dadurch gekennzeichnet, dass die Eigenschaften der optischen Abbildungseinrichtung
(118) so gewählt
sind, dass die Größe des Eingangsendes
des faseroptischen Bündels
(100) im Wesentlichen der Größe und der numerischen Apertur
(NA) einer Mikroprobe (108) entspricht, in dem eine geeignete
Wahl der NA für
die optische Abbildungseinrichtung (118) getroffen wird,
um das Gesichtsfeld des Bündels
(100) auf im Wesentlichen die Fläche des untersuchten Bereichs
einer Mikroprobe einzuschränken,
um es dem Bündel
(100) zu ermöglichen,
genau eine Mikroprobe zu beobachten und dadurch seine empfangsoptischen
Eigenschaften bezüglich
kleiner Licht emittierender Flächen
zu verstärken,
und eine mit Öffnungen
versehene Platte (114) zwischen den Proben und dem Eingangsende
des faseroptischen Bündels
(100) angeordnet ist, wobei jede Öffnung (112) in der
Platte mit einer der Mikroproben fluchtet und die optische Abbildungseinrichtung
(118) zwischen der Öffnung
und dem Eingangsende des Bündels
(100) angeordnet ist, das Licht aus dieser Öffnung empfangen
soll, um dadurch die Hintergrundbeleuchtung zu reduzieren, die dem
Bündel
zugeführt
wird.
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Wenn
das Bündel
einen Durchmesser von typischerweise 1,4 mm und eine NA von typischerweise
0,22 hat, ist es erforderlich, dass die optische Einrichtung eine
NA von ungefähr
0,7 hat, wenn die Probe einen Durchmesser in der Größenordnung
von 130 μm
hat.
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Eine
bevorzugte zusätzliche
optische Einrichtung umfasst eine Mikrolinse und ist bevorzugt eine
Kugellinse, noch bevorzugter eine so genannte Gürtellinse.
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Wenn
die Proben insgesamt kreisförmig sind,
sind die Öffnungen
bevorzugt auch kreisförmig. Wenn
die Proben langgestreckt sind (was der Fall sein kann, wenn die
Proben Mikrokapillaren umfassen), kann die Öffnung quadratisch oder rechteckig sein
und kann so bemessen sein, dass sie eine Toleranz bei der Größe und der
seitlichen Position der Mikroproben erlaubt, die durch die seitliche
Position einer Mikrokapillare in einer Probenanordnung bestimmt
wird.
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Bei
Verwendung einer zusätzlichen
optischen Einrichtung mit den oben genannten Eigenschaften in Kombination
mit einer den Hintergrund reduzierenden Öffnung, wenn die Probe und
das Bündel
die oben genannten Abmessungen und die oben genannte NA haben, werden
die empfangsoptischen Eigenschaften des Bündels pro Volumeneinheit der Probe
um einen Faktor im Bereich von 10 bis 20 verstärkt.
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Beispiele
für Mikrokapillar-Anordnungen
sind in 1(a) bis (c) der
beigefügten
Zeichnungen gezeigt.
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Die
Hauptquelle der Hintergrundbeleuchtung (im Unterschied zur Probenfluoreszenz)
kommt von dem Licht, das von den Wänden und der Basis einer Mikrokapillare
oder eines Mikrolochs emittiert wird.
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Im
Fall einer Mikrokapillare neigt der Hintergrund dazu, konstant zu
bleiben, während
die Fluoreszenz aufgrund des Vorhandenseins von Zellen oder Zellenclustern
in einem Fluid, das durch den Kanal der Mikrokapillare strömt, zum
Variieren neigt. Daher sind Fehler bei der Messung von Hintergrundwerten
tendenziell Poisson-Fehler, und es ist zu erwarten, dass diese bei
den systematischen Fehlern dominant sind.
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Bei
einer bevorzugten Anordnung wird die Probe systematisch gescannt,
z.B. durch Bewegen der Platte, die die Mikrokapillaren oder Mikrolöcher enthält, bezüglich der
Anordnung der faseroptischen Bündel
und dazugehörigen
Mikrolinsen.
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Vorzugsweise
weist jede Mikrolinse eine geeignete Antireflexbeschichtung auf,
die so ausgewählt
ist, dass sie den Bereich der Anregungs- und Emissionswellenlängen, der
zu der Probe gehört,
berücksichtigt.
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Vorzugsweise
ist jede Mikrolinse aus Material mit niedriger Fluoreszenz und Material
mit geeignetem Brechungsindex aufgebaut.
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Saphir
von hoher Qualität
ist als Mikrolinsenmaterial bevorzugt.
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Die
Erfindung wird nun beispielartig beschrieben, unter Bezugnahme auf
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1a–1c der beigefügten Zeichnungen, auf die bereits
eingegangen wurde,
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2 (entnommen
aus der GB-Patentschrift 2,339,901), die etwas diagrammartig darstellt,
wie eine große
Zahl separater faseroptischer Bündel
angeordnet sein kann, um eine entsprechende Zahl von Probenstellen
in einer Anordnung mit einer Vielzahl von Stellen, z.B. einer Multiloch-Platte
für die Übertragung
von Licht an ausgewählte
Bereiche einer ladungsgekoppelten Einrichtung, zu untersuchen, und
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3,
die die Anpassung eines Faserbündels
gemäß der Erfindung
darstellt, wodurch es ermöglicht
wird, Mikroproben durch die gleichen Faserbündel, wie sie in 2 vorgesehen
sind, abzubilden.
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In 2 ist
eine Lochplatte 10 gezeigt, die über eine Präsentationsplatte 12 angeordnet
ist. Die Zeichnung ist eine perspektivische Explosionszeichnung,
und die in der Zeichnung dargestellten Abstände sind gegenüber den
wirklichen Abständen übertrieben
groß.
In der Praxis ist die Präsentationsplatte 12 sehr
nah an der Unterseite der Lochplatte 10.
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Lochplatten
wurden tendenziell mit entweder 96 Löchern konstruiert, die typischerweise
in 8 Reihen mit 12 Spalten angeordnet waren, aber in den letzten
Jahren wurden Platten mit höherer
Dichte konstruiert, und eine typische Platte mit hoher Dichte kann
beispielsweise 36 Mal so viele Löcher
wie die 96-Loch-Platte aufweisen. Jedoch ist die Fläche der Platte
gleich der Fläche
der Basismatrix. Der einzige Unterschied besteht in diesem Fall
darin, dass die Lochgröße verringert
wurde, was es ermöglicht, sechs
Löcher
in jeder Reihe und sechs Löcher
in jeder Spalte anzuordnen, an Stelle eines einzigen Lochs in der
ursprünglichen
Anordnung. Das bedeutet, dass an Stelle von zwölf Löchern in jeder Reihe nun 72
vorhanden sind und an Stelle von acht Reihen nun 48 Reihen vorhanden
sind.
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Um
diesen Vorteil zu nutzen und um das Weiterrücken einer Präsentationsplatte
mit 96 Öffnungen
zu vereinfachen, ist diese mit Öffnungen
versehen, deren Position derjenigen von jedem der ursprünglichen
96 Löcher
einer 96-Loch-Platte entspricht, deren Größe aber gleich derjenigen der
Löcher
in der 3.456-Loch-Platte ist. Das bedeutet, dass 96 der 3.456 Löcher gleichzeitig
untersucht werden können,
indem die Präsentationsplatte 12 so
ausgerichtet wird, dass die erste der 96 Öffnungen mit dem ersten der
3.456 Löcher
in der Lochplatte übereinstimmt.
Das bedeutet, dass die zweite Öffnung
in der Präsentationsplatte
mit dem siebten Loch in der ersten Reihe fluchtet, usw.
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Eine
Verschiebung der Präsentationsplatte 12 um
einen Abstand, der gleich dem Abstand zwischen aufeinander folgenden
Löchern
in der ersten Reihe ist, bedeutet, dass alle 96 Öffnungen in der Präsentationsplatte 12 nun
mit einem neuen Satz von 96 der Löcher in der Lochplatte 10 fluchten.
Durch Bewegen der Präsentationsplatte
sukzessive in sechs Schritten parallel zu der ersten Reihe, und
bei jedem Schritt um sechs Positionen senkrecht zu der Reihe, wobei
in jedem Fall jede Bewegung dem Abstand zwischen benachbarten Löchern in
der Lochplatte senkrecht zu der ersten Reihe gemessen entspricht,
kann jedes der 3.456 Löcher
durch 36 relative Bewegungen zwischen der Präsentationsplatte und
der Lochplatte untersucht werden.
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In
der Praxis wird die Lochplatte bezüglich der Präsentationsplatte
bewegt.
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Jede
der Öffnungen
in der Präsentationsplatte 12 dient
als Ende für
ein Faserbündel,
das aus 45 Einzelfasern besteht. In der Zeichnung sind die Fasern
nur zum Zweck der Darstellung so gezeigt, dass sie in zwei der Öffnungen
enden, von denen die eine mit 26 und die andere mit 28 bezeichnet
ist.
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Jedes
Bündel
von 45 Fasern besteht aus drei Gruppen von 15, wobei eine Gruppe
wie 30 sich zu einer Erregerlichtquelle erstreckt, eine
Gruppe wie 32 Fluoreszenzlicht von einem Loch, das mit
der Öffnung 26 fluchtet,
zu einer Öffnung 34 in
einer Präsentationsscheibe 36 überträgt. Die
dritte Gruppe aus 15 Fasern 38 erstreckt sich zu einer
anderen Öffnung 40 in
einer zweiten Präsentationsscheibe 42,
um Fluoreszenzlicht zu dieser anderen Öffnung 40 zu leiten.
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Die
drei Gruppen aus 15 Fasern, die das andere dargestellte Bündel bilden,
das zu der Öffnung 28 und
von dieser weg führt,
sind durch die Bezugszeichen 44, 46 bzw. 48 bezeichnet,
und diese erstrecken sich von der Erregerlichtquelle im Fall der
Gruppe 44 und zu zwei anderen Öffnungen 50 bzw. 52 in den
beiden Präsentationsscheiben 36 und 42.
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Jede
der Letztgenannten umfasst 96 Öffnungen,
die regelmäßig über dem
kreisförmigen
Bereich jeder Scheibe angeordnet sind, und ähnliche Scheiben 36' und 42' fluchten mit
den Scheiben 36 und 42. Geeignete optische Filterscheiben 54 und 56 sind sandwichartig
zwischen den Scheiben 36 und 36' sowie den Scheiben 42 und 42' angeordnet.
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Öffnungen
in den beiden Scheiben 36, 36' (42, 42') fluchten auf
einer Eins-zu-eins-Basis
miteinander, und Fasern führen
von jeder der fluchtenden Öffnungen
wie 34' in
der Scheibe 36' zu
eindeutig festgelegten Öffnungen
in zwei Gruppen von 96 Öffnungen,
die in einer geradlinigen Matrix in einer Ausgangsplatte angeordnet
sind, die insgesamt mit 58 bezeichnet ist. Die erste dieser
Matrizen ist mit 60 und die zweite mit 62 bezeichnet,
und die Fasern wie 64 von der Öffnung 34' und 50' führen zu
den Öffnungen 34'' und 50'' in
dem Matrixbereich 60, und die Fasern 68 und 70 von
den Öffnungen 40' und 52' in der Scheibe 42' führen zu Öffnungen
wie 40'' und 52'' in der Matrix 62.
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Die
beiden Matrizen 60 und 62 bilden zusammen einen
insgesamt quadratischen Umriss, der ungefähr mit dem quadratischen Seitenverhältnis eines mit 72 bezeichneten
Eingangsfensters in einer Kammer 74 übereinstimmt.
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Die
Erregerlichtquelle ist mit dem Bezugszeichen 76 bezeichnet,
und zwischen ihr und den 96 Gruppen von 15 Fasern wie 30 und 44 ist
ein Filter 78 angeordnet. 42 ist wie in 2 gezeigt.
Zwei der Öffnungen
sind willkürlich
mit 34 und 36 bezeichnet.
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Zusammenfassend
ist es wichtig festzustellen, dass zwei Beispiele der großen Zahl
von faseroptischen Bündeln
in 2 mit 26 und 28 bezeichnet sind,
und dass die Fasern, die jedes der Bündel bilden, dreigeteilt sind,
wobei einige wie 30 und 44 zu einer Lichtquelle 76 gehen,
um Erregerstrahlung von der Lichtquelle 76 zu den Mikrolöchern oder
anderen Probenstellen in der Platte 10 zu leiten, und die
anderen beiden Teile jedes Bündels,
von denen jedes eine ähnliche
Anzahl Fasern umfasst, aus den zuvor genannten Gründen zu
geeigneten Bereichen, wie 34 und 40 im Fall von 26 und 50 und 52 im
Fall von 28, der Ausgangsenden der Faserbündel geleitet
werden.
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Es
ist ebenfalls festzuhalten, dass das in 1 dargestellte
Erfassungseinrichtungssystem nur als Darstellung eines Typs eines
epifluoreszenten Multikanalsystems dient, bei dem die Erfindung angewandt
werden kann, und den Schutzbereich der Erfindung, wie er hier dargestellt
ist, nicht einschränken
soll.
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3 zeigt
das obere Ende eines Faserbündels,
das insgesamt mit 100 bezeichnet ist und typischerweise 50 oder 100 oder
mehr Fasern enthält, von
denen einige offengelegt am Eingangsende des Bündels 100 mit 102, 104 bezeichnet
dargestellt sind. Die Mittelachse des Bündels, die dem Mittelpunkt
des insgesamt kreisförmigen
Eingangsendes 106 entspricht, fluchtet insgesamt mit dem
Mittelpunkt einer kleinen Probe, die in dem dargestellten Beispiel
mit 108 bezeichnet ist und ein kleines Segment einer Kapillare
oder Mikrokapillare 110 umfasst, das sich über eine
Länge zwischen
einem und einigen mm in einer Multiproben-Platte erstreckt.
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Deckungsgleich
mit dem untersuchten Bereich ist eine Öffnung 112 in einer
Multi-Öffnungs-Platte,
die insgesamt mit 114 bezeichnet ist und die eine regelmäßige Anordnung
von darin angeordneten Öffnungen
aufweist, die den Positionen entlang jeder der Kapillaren 110 entsprechen,
die zum Zweck der Durchführung
des Assays untersucht werden sollen.
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Der
Test umfasst die gleichzeitige Erregung aller Bereiche wie 108 und
die nachfolgende Erfassung der Fluoreszenz, die von Zellen oder
Zellenclustern in dem Probenbereich abgegeben wird, während einer
Untersuchung, die sich über
einen sehr kurzen Zeitraum oder einen längeren Zeitraum erstrecken
kann, je nach Art des Tests, nachdem die Erregungsstrahlung beendet
ist.
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Außerdem muss
der Untersuchungszeitraum nicht sofort beginnen, nachdem die Erregungsstrahlung
von der Probe entfernt wurde, sondern kann nach einem kurzen Zeitintervall
nach dem Ende der Erregungsphase beginnen.
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Um
dabei zu helfen, einen Bezug zwischen 3 und 2 herzustellen,
kann die Probe 108 so gedacht werden, dass sie die Probenstelle
aufweist, die am nächsten
zu der nächsten
rechten Ecke der Platte 10 von 2 liegt,
und die mit Öffnungen
versehene Platte 114 kann so gedacht werden, dass sie der
mit Öffnungen
versehenen Platte 12 ähnlich
ist, abgesehen davon, dass sie, wie in 3 gezeigt,
bezüglich
der Probenplatte 10 so bewegt wurde, dass sie mit der am
nächsten
gelegenen rechten Ecke der in 2 gezeigten
Platte fluchtet. Zu diesem Zweck ist die Kapillare 110 in
einer Präsen tationsplatte
angeordnet, die typischerweise aus einem Kunststoffmaterial gebildet
ist und herkömmlicherweise
als Kunststoff-Fluidpräsentationschip
bezeichnet wird.
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Durch
Bewegen einer Platte 114, die eine kleine Öffnung wie 112 aufweist,
bezüglich
der Platte 116, kann die Öffnung deckungsgleich mit verschiedenen
Bereichen entlang derselben Kapillare sein, von denen jeder als
getrennte Probenstelle betrachtet werden kann, oder ein einzelner
Bereich jeder einer Vielzahl von kürzeren Kapillaren wird untersucht, wenn
die Platte bewegt wird, so dass die Öffnung oder das Fenster 112 mit
dem ausgewählten
Bereich jeder der Kapillaren fluchtet.
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Insgesamt
ist es wichtig, dass die Achse des Bündels 100 mit dem
zentralen Bereich der Probe 108 fluchtet, der typischerweise
im Bereich von 100 × 100 μm liegt;
wenn jedoch die Fensteröffnung 112 groß genug
ist, kann es möglich
sein, die Platte um zwei oder drei Schritte von 100 μm schrittweise
zu bewegen, um unterschiedliche Bereiche der Kapillare dem Bündel 106 zu
präsentieren,
ohne dieses zu bewegen, da Licht sogar dann immer noch von den Enden
der Fasern empfangen wird, wenn die optische Achse des Bündels zu
dem zentralen Bereich der untersuchten Fläche, die zu dem jeweiligen
Zeitpunkt die Probe bildet, fehlausgerichtet ist.
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Insgesamt
wird jedoch davon ausgegangen, dass das Bündel so bewegt wird, dass die
Bündelachse
immer mit dem zentralen Bereich der Probe fluchtet.
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Erfindungsgemäß werden
die Lichtsammeleigenschaften der Endfläche 106 des faseroptischen Bündels deutlich
erhöht,
indem eine Gürtellinse 118 verwendet
wird, die zwischen der Fensteröffnung 112 und
der faseroptischen Endfläche
angeordnet ist. Der Abstand zwischen der konvexen Oberfläche 120 und
der Öffnung 112 ist
so vorgesehen, dass er sehr klein ist, während derjenige zwischen der
konvexen Oberfläche 122 an
dem anderen Ende der Gürtellinse
und der faseroptischen Eingangsfläche 106 deutlich größer ist.
Der Abstand wird von der numerischen Apertur der relevanten Eingangsfläche und durch
Auswählen
einer Mikrogürtellinse
mit sehr hoher numerischer Apertur bestimmt (typischerweise .7,
im Gegensatz zu der niedrigeren numerischen Apertur von vielleicht
.2, die zu der Endfläche 106 des
faseroptischen Bündels
gehört),
so dass ein geringerer Abstand zwischen der konvexen Oberfläche 120 und
der Probe 108/dem Fenster 112 verwendet werden
kann, wodurch die Menge an Licht erhöht wird, die von der Probe
emittiert wird und von der Eingangsfläche 120 der Gürtellinse 118 gesammelt
wird.
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Die
Gürtellinse
ist bevorzugt aus einem Hochqualitäts-Saphir hergestellt.
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Eine
Linse 118 und ein Bündel 100 sind
für jede
der Vielzahl von Stellen für
die gleichzeitige Untersuchung vorgesehen, die die Probe bilden,
und durch Fixieren der Linsen und Bündel bezüglich einander in einer Matrixanordnung
und Bewegen der Präsentationsplatte 116 und
der mit Öffnungen
versehenen Platte 114 relativ dazu können verschiedene Probenstellen,
entweder Mikrolöcher
oder Bereiche von Mikrokapillaren, wie gezeigt, der großen Zahl von
Linsen und Faserbündeln
gleichzeitig präsentiert werden.
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Wie
zuvor erwähnt,
können
alle Stellen oder Löcher
in einer Anordnung mit hoher Dichte untersucht werden, indem die
Anordnung mit hoher Dichte bezüglich
der Matrix und der Linsen und der Faserbündel schrittweise bewegt wird,
so dass, wenn in der Anordnung z.B. 96 vorhanden sind und eine vier Mal
so große
Zahl von Stellen zu untersuchen ist, ein schrittweises Bewegen der
Präsentationsplatte
in 2 × 2
Schritten bezüglich
der Matrixanordnung es ermöglicht,
alle 384 Stellen in vier Gruppen zu 96 zu untersuchen.
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Obgleich
sie in Bezug auf die Multikanal-Anordnung von 2 beschrieben
wurde, kann die in 3 gezeigte Anordnung in ihrer
einfachsten Form eine Einzelkanal-Probenuntersuchungseinrichtung umfassen,
bei der ein einzelnes faseroptisches Bündel 100 und eine
einzelne Gürtellinse 118 unter
einer Platte angeordnet sind, auf der eine Vielzahl von Probenstellen
angeordnet ist, und die Platte wird bezüglich der optischen Instrumente 100/118 oder
umgekehrt weitergerückt,
damit Licht von jeder Probenstelle reihum in die Eingangs-Oberfläche 120 der
Linse 118 projiziert werden kann.
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Obgleich
sie in Bezug auf die Unterseite einer Probenanordnung gezeigt werden,
wird darauf hingewiesen, dass die optischen Elemente 100 und 118 und
die mit Öffnungen
versehene Platte 114 bezüglich der Präsentationsplatte 116 umgedreht
werden können
und jede Probenstelle von oben anstatt von unten untersucht werden
kann.
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In
diesem Fall wird der trapezförmige
Schnitt jeder Kapillare bevorzugt bezüglich dem in 3 gezeigten
umgedreht, so dass die breitere Basis dem Fenster über der
Platte präsentiert
wird. Was Löcher mit
parallelen Seiten betrifft, ist es weniger wichtig, ob sie von oben
oder unten betrachtet werden, vorausgesetzt, dass, wenn die Zellen
oder Zellencluster, die fluoreszentes Licht emittieren, nahe der
Basis des Lochs angeordnet sind, die Abschwächung der Fluoreszenz durch
das flüssige
Medium in dem Loch nach oben nicht so groß ist, dass sie eine geeignete Erfassung
von oben verhindert.