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BEREICH DER ERFINDUNG
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Die
vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von modifizierten
Peptiden, welche Inhibitoren von viraler Aktivität bzw. Wirkung sind und antifusogene
Eigenschaften zeigen. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung
die Verwendung von modifizierten Peptid-Inhibitoren gegen das humane
Immundefizienz-Virus (HIV),
das humane Atmungssyncytial-Virus (RSV), das humane Parainfluenza-Virus
(HPV), das Masern-Virus (MeV) und das Affen-Immundefizienz-Virus
(SIV) mit langer Wirkungsdauer für
die Behandlung der jeweiligen viralen Infektionen.
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HINTERGRUND DER ERFINDUNG
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Membranfusionsvorkommen,
obwohl sie in normalen zellbiologischen Prozessen herkömmlich sind, sind
auch in eine Vielfalt von Krankheitszuständen verwickelt, einschließlich beispielsweise
das Eintreten von eingehüllten
Viren in Zellen. Es sind Peptide bekannt, welche mit Membranfusion
verbundene Vorkommnisse inhibieren oder anders unterbrechen, einschließlich beispielsweise
die Inhibierung retroviraler Übertragung
auf uninfizierte Zellen. Als ein Beispiel sind die synthetischen
Peptide DP-107 und DP-178, abgeleitet aus separaten Bereichen innerhalb
des humanen Immundefizienz-Virus Typ 1 (”HIV-1”)-Transmembran-(”TM”)-Glycoproteins
gp41, potente Inhibitoren gegen HIV-1-Infektion und eine HIV-induzierte
Zell-Zell-Fusion.
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Lambert
et al., ”Peptides
from Conserved Regions of Paramyxovirus Fusion (F) Proteins are
Potent Inhibitors of Viral Fusion”, Proc. Natl. Acad. Science
USA, 5. März
1996, Bd. 93 (5), Seiten 2186–2191,
offenbart, dass die synthetischen Peptide DP-107 und DP-178 (T-20),
abgeleitet aus separaten Bereichen innerhalb des humanen Immundefizienz-Virus
Typ 1 (HIV-1)-Transmembran-(TM)-Proteins
gp41, potente Inhibitoren gegen HIV-1-Infektion und -Fusion sind.
Unter Verwendung einer computergestützten Untersuchungsstrategie (computergestützte Antivirus-Untersuchungstechnologie
(C. A. S. T.), basierend auf der vorhergesagten Sekundärstruktur
von DP-107 und DP-178 (T-20), identifizierten Lambert et al. konservierte
Heptad-Wiederholungsbereiche, welche analog zu den DP-107- und DP-178-Bereichen
von HIV-1 gp41 innerhalb der Glycoproteine anderer fusogener Viren
sind. Antivirale Peptide, abgeleitet von drei repräsentativen
Paramyxoviren, Atmungssyncytial-Virus (RSV), humanes Parainfluenza-Virus-Typ 3 (HPIV-3) und
Masern-Virus (MV) blockierten homologe, Virus-vermittelte Syncytia-Bildung
und zeigten EC50-Werte im Bereich von 0,015–0,250 μM. Darüber hinaus
sind diese Peptide auf das Ursprungsvirus hoch selektiv.
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Die
US-PSen 6,013,263 ,
6,017,536 und
6,020,459 , welche hier vollständig eingebracht
sind, offenbaren ebenfalls, dass das 36-Aminosäuren-Peptid DP178, entsprechend
den Aminosäuren
638 bis 673 von gp41 aus dem HIV-1-Isolat LAI (HIV-1
LAI),
und das 38-Aminosäuren-Peptid
DP107, entsprechend den Aminosäuren 558–595 von
gp41 aus HIV-1
LAI, beide eine potente Anti-HIV-1-Wirkung zeigen.
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Während viele
antivirale oder antifusogene Peptide, die im Stand der Technik beschrieben
sind, eine potente antivirale und/oder antifusogene Wirkung zeigen,
leiden diese Peptide an einer kurzen in vivo Plasma-Halbwertszeit,
hauptsächlich
infolge rascher Serum-Clearance und Peptidase- und Protease-Aktivität. Das wiederum
reduziert stark die wirksame antivirale Aktivität der Peptide. Es besteht daher
ein Bedürfnis
für ein Verfahren
zur Verlängerung
der Halbwertszeit existierender antiviraler und antifusogener Peptide
und zur Bereitstellung einer längeren
Wirkungsdauer dieser Peptide in vivo.
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ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
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Die
vorliegende Erfindung erfüllt
diese und weitere Bedürfnisse
und ist auf die Verwendung modifizierter Peptide mit antiviraler
Aktivität
und antifusogener Aktivität
gerichtet. Diese modifizierten Peptide liefern eine erhöhte Stabilität in vivo
und eine verminderte Anfälligkeit
auf Peptidase- oder Protease-Abbau.
Diese modifizierten Peptide minimieren dadurch zum Beispiel die
Notwendigkeit für
häufigere
oder sogar kontinuierliche Verabreichung der Peptide. Die Produkte
verschiedener Ausführungsformen
der vorliegenden Erfindung können
verwendet werden, beispielsweise als Prophylaxe gegen und/oder Behandlung
von Infektionen einer Anzahl von Viren, einschließlich des
Human-Immundefizienz-Virus (HIV), des humanen Atmungssyncytial-Virus (RSV), des
humanen Parainfluenza-Virus (HPV), des Masern-Virus (MeV) und des Affen-Immundefizienz-Virus
(SIV). Eine Modifizierung anderer Peptide, welche in viraler Transfektion
involviert sind (z. B., Hepatitis, Epstein Barr und weitere verwandte
Viren), liegt ebenfalls innerhalb im Umfang der Erfindung.
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Die
vorliegende Erfindung betrifft chemisch wirksame Modifikationen
von Peptiden, welche antivirale und antifusogene Wirkung zeigen,
so dass die modifizierten Peptide mit verfügbaren Funktionalitäten an Blutkomponenten
unter Ausbildung stabiler kovalenter Bindungen reagieren. Die reaktive
Gruppe ist ein Maleimid, das mit einer Thiolgruppe an einem mobilen
Blutprotein, Albumin, reagieren kann. Dementsprechend liefert die Erfindung
die Verwendung eines modifizierten antiviralen und antifusogenen
Peptids zur Herstellung eines Medikamentes zur Vorbeugung und/oder
Behandlung viraler Injektionen, wobei das modifizierte Peptid umfasst: ein
Peptid, das antivirale und antifusogene Aktivität zeigt und eine Maleimidgruppe,
welche mit einer Thiolgruppe an Serumalbumin unter Ausbildung einer
stabilen kovalenten Bindung reagiert, wobei die Maleimidgruppe mit
dem Peptid entweder ohne Verwendung einer Kopplungsgruppe oder über eine
Kopplungsgruppe verbunden wird, welche (2-Amino)ethoxyessigsäure (AEA)
oder [2-(2-Amino)ethoxy]ethoxyessigsäure (AEEA) ist, wobei das modifizierte
Peptid in vivo ein antifusogenes Peptid-Maleimid-Albumin-Konjugat
bildet.
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Insbesondere
betrifft die Erfindung solche chemisch reaktiven Modifikationen
von DP107- und DP178-Peptiden und Analogen davon einschließlich Peptiden,
bestehend aus Aminosäuresequenzen
von anderen (nicht-HIV) Viren, welche dem gp41-Bereich von HIV entsprechen,
von dem DP107 und DP178 abgeleitet sind und welche eine antivirale
oder antifusogene Wirkung zeigen. Ganz besonders zeigen diese Peptide antivirale
Wirkung gegen, unter anderem, humanes Immuninsuffizienz-Virus, humanes
Immuninsuffizienz-Virus, humanes Atmungssyncytial-Virus (RSV), humanes
Parainfluenza-Virus (HPV), Masern-Virus (MeV) und Affen-Immuninsuffizienz-Virus
(SIV). Die Erfindung betrifft auch die Verwendung solcher chemisch
reaktiven Modifikationen der Peptide der Sequenzen SEQ ID NR 1 bis
SEQ ID NR 86. Insbesondere Peptide ausgewählt aus der Gruppe bestehend
aus SEQ ID NR. 1 bis SEQ ID NR. 9, SEQ ID NR. 10 bis SEQ ID NR.
30, SEQ ID NR. 31 bis SEQ ID NR. 62, SEQ ID NR. 63 bis SEQ ID NR.
73 oder SEQ ID NR. 74 bis SEQ ID NR. 86.
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Die
Erfindung betrifft auch die Verwendung von Zusammensetzungen zur
Herstellung eines Medikamentes zur Prävention und/oder Behandlung
viraler Infektion, wobei die Zusammensetzung das Peptid, das antivirale
Aktivität
zeigt, modifiziert mit einer wie beschriebenen reaktiven Gruppe,
umfasst. Insbesondere betrifft die Erfindung die Verwendung solcher
Zusammensetzungen zur Herstellung eines Medikaments zur Prävention
und/oder Behandlung von AIDS, humanem Atmungssyncytial-Virus (RSV),
humanem Parainfluenza-Virus (HPV), Masern-Virus (MeV) und Affen-Immundefizienz-Virus
(SIV).
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KURZE BESCHREIBUNG DER TABELLEN
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Die
Erfindung wird unter Bezugnahme auf die Tabellen besser verstanden
werden, worin:
Tabelle 1 die herkömmlich vorkommenden Aminosäuren zusammen
mit ihren Abkürzungen
aus einem und aus drei Buchstaben und übliche Schutzgruppen auflistet.
Tabelle
2 Carboxyschnitte von DP178 zeigt.
Tabelle 3 Aminoschnitte
von DP178 zeigt.
Tabelle 4 Carboxyschnitte DP107 zeigt.
Tabelle
5 Aminoschnitte von DP107 zeigt.
Tabelle 6 Carboxyschnitte
des Analogon von HIV-2NIHZ-DP178 zeigt.
Tabelle
7 Aminoschnitte des Analogon von HIV-2NIHZ-DP178
zeigt.
Tabelle 8 Carboxyschnitte des RSV F2-Bereichs des Analogon
von DP107 zeigt.
Tabelle 9 Aminoschnitte des RSV F2-Bereichs
des DP107-Analogon
zeigt.
Tabelle 10 Carboxyschnitte des RSV F1-Bereichs des DP178-Analogon zeigt.
Tabelle
11 Aminoschnitte des RSV F1-Bereichs des DP178-Analogon zeigt.
Tabelle 12 Carboxyschnitte
des HPV3 F1-Bereichs des DP178-Analogon
zeigt.
Tabelle 13 Aminoschnitte des HPV3 F1-Bereichs des DP178-Analogon zeigt.
Tabelle
14 Carboxyschnitte des HPV3 F1-Bereichs des DP107-Analogon zeigt.
Tabelle
15 Aminoschnitte des PV3 F1-Bereichs des DP107-Analogon zeigt.
Tabelle 16 repräsentative
Anti-RSV-Peptide zeigt.
Tabelle 17 repräsentative Anti-HPV3-Peptide
zeigt.
Tabelle 18 repräsentative
Anti-SIV-Peptide zeigt.
Tabelle 19 repräsentative Anti-MeV-Peptide
zeigt.
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KURZE BESCHREIBUNG DER SEQUENZLISTEN
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Die
Erfindung wird unter Bezugnahme auf die Sequenzlisten bes ser verstanden
werden, worin:
SEQ ID NR 1 die Peptidsequenz von DP178 zeigt.
SEQ
ID NR 2 die Peptidsequenz von DP107 zeigt.
SEQ ID NR 3–9 Peptidsequenzen
von bestimmten DP178-Analoga
zeigt.
SEQ ID NR 10–30
die Peptidsequenzen von RSV F1-Bereich und F2-Bereich, entsprechend
DP178 und DP107, und repräsentative
Anti-RSV-Peptide zeigen.
SEQ ID NR 31–62 die Peptidsequenzen von
HPIV3 F1-Bereich, entsprechend DP178 und DP107, und repräsentative
Anti-HPIV3-Peptide zeigen.
SEQ ID NR 63–73 Peptidsequenzen von SIV,
entsprechend DP178, und repräsentative
Anti-SIV-Peptide zeigen, und
SEQ ID NR 74–78 Peptidsequenzen von MeV,
entsprechend DP178, und repräsentative
Anti-MeV-Peptide zeigen.
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GENAUE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
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Um
ein vollständiges
Verständnis
der Erfindung sicherzustellen, werden die folgenden Definitionen
angegeben:
Antivirale Peptide: Wie hier verwendet, sollen sich
antivirale Peptide auf Peptide beziehen, welche eine virale Infektion
von Zellen inhibieren, durch beispielsweise Inhibierung von Zell-Zell-Fusion oder
freier Virusinfektion. Der Weg der Infektion kann eine Membranfusion
beinhalten, wie sie im Falle von eingehüllten Viren auftritt oder irgendein
anderes Fusionsvorkommnis, das virale und zelluläre Strukturen involviert. Peptide,
welche virale Infektion durch einen bestimmten Virus inhibieren,
können
unter Bezugnahme auf diesen bestimmten Virus bezeichnet werden,
zum Beispiel Anti-HIV-Peptid, Anti-RSV-Peptid, etc.
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Antifusogene
Peptide: Antifusogene Peptide sind Peptide, welche eine Fähigkeit
zeigen, das Level der Membranfusionsvorkommnisse zwischen zwei oder
mehr Einheiten zu inhibieren oder zu reduzieren, zum Beispiel Virus-Zelle
oder Zelle-Zelle, relativ zu dem Level der Membranfusion, welche
in Abwesenheit des Peptides auftritt.
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HIV-
und Anti-HIV-Peptide: Das humane Immundefizienz-Virus (HIV), das
für das
erworbene Immundefizienz-Syndrom (AIDS) verantwortlich ist, ist
ein Mitglied der Lentivirusfamilie von Retroviren. Es gibt zwei vorherrschende
Typen von HIV, HIV-1 und HIV-2 mit verschiedenen Stämmen, welche
jeweils identifiziert worden sind. HIV zielt CD-4+-Zellen an und
ein viraler Eintritt hängt
von der Bindung des HIV-Proteins gp41 an CD-4+-Zelloberflächenrezeptoren ab. Anti-HIV-Peptide
beziehen sich auf Peptide, welche antivirale Wirkung gegen HIV zeigen,
einschließlich
einer Inhibierung von CD-4+-Zellinfektion durch freie Viren und/oder
Inhibierung von HIV-induzierter Syncytia-Bildung zwischen infizierten und nicht-infizierten
CD-4+-Zellen.
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SIV-
und Anti-SIV-Peptide: (Simian)Affen-Immundefizienz-Viren (SIV) sind
Lentiviren, welche Krankheiten, die ähnlich zum erworbenen Immundefizienz-Syndrom
(AIDS) sind, in anfälligen
Affen verursachen. Anti-SIV-Peptide sind Peptide, welche eine antivirale
Aktivität
gegen SIV zeigen, einschließlich
der Inhibierung der Zellinfektion durch den SIV-Virus und eine Syncytia-Bildung
zwischen infizierten und nicht-infizierten Zellen.
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RSV-
und Anti-RSV-Peptide: (Respiratory) Atmungssyncytial-Virus (RSV)
ist ein respiratorisches Pathogen, das insbesondere gefährlich bei
Säuglingen
und Kleinkindern ist, wo sie Bronchiolitis (Entzündung der kleinen Luftwege)
und Lungenentzündung
hervorrufen können.
RSV sind ”negativ-sense”, einsträngige RNA-Viren und Mitglieder
der Paramyxoviridae-Familie von Viren. Der Infektionsweg von RSV
verläuft
typischerweise durch die Schleimhautmembranen durch den Atmungstrakt,
das heißt
Nase, Hals, Luftröhre
und Bronchien und Bronchiolen. Anti-RSV-Peptide sind Peptide, welche
eine antivirale Wirkung gegen RSV zeigen, einschließlich einer
Inhibierung der Schleimhaut-Zellinfektion durch freies RSV-Virus
und Syncytia-Bildung zwischen infizierten und nicht-infizierten
Zellen.
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HPV-
und Anti-HPV-Peptide: Humanes Parainfluenza-Virus (HPIV oder HPV)
ist, wie RSV, eine weitere leitende Ursache für Atmungswegeerkrankungen und,
wie RSV-Viren, sind sie negativ-sense,
einsträngige RNA-Viren,
welche Mitglieder der Paramyxoviridae-Familie von Viren sind. Es
gibt vier anerkannte Serotypen von HPIV,- HPIV-1, HPIV-2, HPIV-3
und HPIV-4-. HPIV-1 ist die wesentliche Ursache von Kinder-Krupp
und sowohl HPIV-1 als auch HPIV-2 verursachen Erkrankungen der oberen
und unteren Atmungswege. HPIV-3 ist häufiger mit Bronchiolitis und
Lungenentzündung
verbunden. Anti-HPV-Peptide sind Peptide, welche eine antivirale
Aktivität
gegen HPV zeigen, einschließlich
einer Inhibierung der Infektion durch freie HPV-Viren und einer
Syncytia-Bildung zwischen infizierten und nicht-infizierten Zellen.
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MeV-
und Anti-MeV-Peptide: Das Masern-Virus (VM oder MeV) ist ein eingehüllter, negativer,
einsträngiger
RNA-Virus aus der Paramyxoviridae-Familie von Viren. Wie RSV und
HPV verursacht MeV Atemwegserkrankung und erzeugt auch eine Immunsuppression,
welche für
zusätzliche,
opportune Infektionen verantwortlich ist. In einigen Fällen kann
MeV eine Infektion des Gehirns etablieren, was zu ernsthaften neurologischen Komplikationen
führt.
Anti-MeV-Peptide sind Peptide, welche eine antivirale Wirkung gegen
MeV zeigen, einschließlich
der Inhibierung durch Infektion durch freie MeV-Viren und Syncytia-Bildung
zwischen infizierten und nicht-infizierten Zellen.
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DP-178
und DP178-Analoga: Wenn nicht anders erläutert oder sich aus dem Zusammenhang
ergebend, bedeutet DP-178 das 36-Aminosäuren-DP-178-Peptid,
entsprechend Aminosäureresten
638–673
des gp41-Glycoproteins des HIV-1-Isolates LAI (HIVLAI)
mit der folgenden Sequenz:
YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF
(SEQ ID NR 1)
sowie Schnitte, Deletionen und/oder Insertionen
davon. Schnitte des DP178-Peptids können Peptide von zwischen 3–36 Aminosäuren umfassen.
Deletionen bestehen aus der Entfernung eines oder mehrerer Aminosäurereste
aus dem DP178-Peptid und können
die Entfernung eines einzigen fortlaufenden Abschnittes der Peptidsequenz
oder mehrfache Bereiche umfassen. Insertionen bzw. Einfügungen können einzelne
Aminosäurereste
oder Stränge
von Resten umfassen und können
am Carboxyl- oder Aminoende des DP178-Peptids oder an einer Stelle innerhalb
des Peptides durchgeführt
werden.
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DP178-Peptidanaloga
sind Peptide, deren Aminosäuresequenzen
aus Aminosäuresequenzen
von Peptidbereichen von Viren zusammengesetzt sind, die verschieden
von HIV-1
LAI sind, welche dem gp41-Bereich, aus welchem
DP178 abgeleitet ist, entsprechen sowie aus einem Schnitt, einer
Deletion oder Insertion davon. Solche anderen Viren können umfassen,
sind aber nicht beschränkt
auf andere HIV-Isolate, wie HIV-2
NIHZ, Atmungssyncytial-Virus
(RSV), humanes Parainfluenza-Virus (HPV), Affen-Immundefizienz-Virus (SIV) und Masern-Virus
(MeV). DP178-Analoga beziehen sich auch auf solche Peptidsequenzen,
welche durch ALLMOTI5-, 107 × 178 × 4- und
PLZIP-Suchmotive, wie sie in den
US-PSen
6,013,263 ,
6,017,536 und
6,020,459 beschrieben und
hier eingebracht sind, identifiziert und erkannt werden, welche
eine strukturelle und/oder Aminosäuren-Ähnlichkeit zu DP178 aufweisen.
DP178-Analoga beziehen sich des Weiteren auf Peptide, welche als ”DP178-ähnlich” beschrieben
sind, wie dieser Begriff in den
US-PSen
6,013,263 ,
6,017,536 und
6,020,459 definiert worden
ist.
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DP-107
und DP107-Analoga: Wenn nicht anders ausdrücklich oder im Zusammenhang
angezeigt wird, bedeutet DP-107 das 38-Aminosäuren-DP-107-Peptid entsprechend
Aminosäureresten
558–595
des gp41-Proteins vom HIV-1-Isolat LAI (HIVLAI)
mit folgender Sequenz:
NNLLRAIEAQQHLLQLTVWQIKQLQARILAVERYLKDQ
(SEQ ID NR 2)
sowie Schnitte, Deletionen und/oder Insertionen
davon. Schnitte des DP107-Peptids können Peptide zwischen 3–38 Aminosäuren umfassen.
Deletionen bestehen aus der Entfernung eines oder mehrerer Aminosäureresten
aus dem DP107-Peptid und können
die Entfernung eines einzelnen fortlaufenden Abschnitts der Peptidsequenz
oder eines mehrfachen Bereichs entsprechen. Insertionen können einzelne
Aminosäurereste
oder Stränge
von Resten umfassen und können
am Carboxyl- oder Aminoende des DP107-Peptides oder einer Stelle
innerhalb des Peptides erzeugt werden.
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DP107-Peptidanaloga
sind Peptide, deren Aminosäuresequenzen
aus Aminosäuresequenzen
von Peptidbereichen von Viren zusammengesetzt sind, welche verschieden
von HIV-1
LAI sind, welche der gp41-Region
entsprechen, von der DP107 abgeleitet wurde, sowie Schnitte, Deletionen
und/oder Insertionen davon. Solche anderen Viren können umfassen,
sind jedoch nicht beschränkt
auf weitere HIV-Isolate, wie HIV-2
NIHZ-Atmungssyncytial-Virus
(RSV), humanen Parainfluenza-Virus (HPV), Affen-Immundefizienz-Virus (SIV)
und Masernvirus (MeV). DP107-Analoga beziehen sich auch auf jene
Peptidsequenzen, welche durch ALLMOTI5-, 107 × 178 × 4- und PLZIP Suchmotive,
beschrieben in den
US-PSen 6,013,263 ,
6,017,536 und
6,020,459 identifiziert und erkannt
worden sind, mit strukturellen und/oder Aminosäuremotiven, die ähnlich zu DP107
sind. DP107-Analoga beziehen sich des Weiteren auf Peptide, welche
als ”DP107-ähnlich” beschrieben
sind, wie dieser Begriff in den
US-PSen
6,013,263 ,
6,017,536 und
6,020,459 definiert ist.
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Reaktive
Gruppen: Reaktive Gruppen sind chemische Gruppen, welche eine kovalente
Bindung ausbilden können.
Solche reaktive Gruppen sind an DP-107 oder DP-178-Peptide oder
Analoga davon oder andere antivirale oder antifusogene Peptide von
Interesse gekoppelt oder gebunden. Reaktive Gruppen werden im Allgemeinen
in einem wässrigen
Umfeld stabil sein, und werden Maleimid sein, wodurch sie zur Ausbildung einer
kovalenten Bindung mit einer Funktionalität, die eine Thiolgruppe ist,
an der Targetstelle von mobilen Blutkomponenten fähig sind.
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Funktionalitäten: Funktionalitäten sind
Gruppen an Blutkomponenten, an welche reaktive Gruppen an modifizierten,
antiviralen Peptiden unter Ausbildung von kovalenten Bindungen reagieren.
Funktionalitäten
beinhalten Thiolgruppen zur Bindung an Maleimide.
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Blutkomponenten:
Blutkomponenten sind mobil. Mobile Blutkomponenten sind Blutkomponenten,
welche keine festgelegte Stelle über
jeglichen längeren
Zeitraum aufweisen, im Allgemeinen nicht mehr als 5, üblicher
nicht eine Minute überschreitend.
Diese Blutkomponenten sind nicht membranverbunden und sind im Blut
für längere Zeiten
und in einer Minimalkonzentration von wenigstens 0,1 μg/ml vorhanden.
Die mobile Blutkomponente ist Serumalbumin. Die Halbwertszeit von
mobilen Blutkomponenten beträgt
wenigstens 12 Stunden.
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Schutzgruppen:
Schutzgruppen sind chemische Einheiten, welche dazu verwendet werden,
Peptidderivate von eigener Umsetzung zu schützen. Verschiedene Schutzgruppen
sind hier und in der
US-PS 5,493,007 offenbart,
welche unter Bezugnahme darauf hier einverleibt ist. Solche Schutzgruppen
umfassen Acetyl-, Fluorenylmethyloxycarbonyl(Fmoc)-, t-Butyloxycarbonyl(Boc)-,
Benzyloxycarbonyl(CBZ)-Gruppen und dergleichen. Die speziellen geschützten Aminosäuren sind
in Tabelle 1 dargestellt.
TABELLE
1 |
Natürliche Aminosäuren und
ihre Abkürzungen |
Name | 3-Buchstaben-Abkürzung | 1-Buchstaben-Abkürzung | Modifizierte
Aminosäuren |
Alanin | Ala | A | Fmoc-Ala-OH |
Arginin | Arg | R | Fmoc-Arg(Pbf)-OH |
Asparagin | Asn | N | Fmoc-Asn(Trt)-OH |
Asparginsäure | Asp | D | Asp(tBu)-OH |
Cystein | Cys | C | Fmoc--Cys(Trt) |
Glutaminsäure | Glu | E | Fmoc-Glu(tBu)-OH |
Glutamin | Gln | Q | Fmoc-Gln(Trt)-OH |
Glycin | Gly | G | Fmoc-Gly-OH |
Histidin | His | H | Fmoc-His(Trt)-OH |
Isoleucin | Ile | I | Fmoc-Ile-OH |
Leucin | Leu | L | Fmoc-Leu-OH |
Lysin | Lys | Z | Boc-Lys(Aloc)-OH |
Lysin | Lys | X | Fmoc-Lys(Aloc)-OH |
Lysin | Lys | K | Fmoc-Lys(Mtt)-OH |
Methionin | Met | M | Fmoc-Met-OH |
Phenylalanin | Phe | F | Fmoc-Phe-OH |
Prolin | Pro | P | Fmoc-Pro-OH |
Serin | Ser | S | Fmoc-Ser(tBu)-OH |
Threonin | Thr | T | Fmoc-Thr(tBu)-OH |
Tryptophan | Trp | W | Fmoc-Trp(Boc)-OH |
Tyrosin | Tyr | Y | Boc-Tyr(tBu)-OH |
Valin | Val | V | Fmoc-Val-OH |
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Linkergruppen:
Linker(Abstands-)gruppen sind chemische Einheiten, welche reaktive
Einheiten mit antiviralen und antifusogenen Peptiden verbinden.
Linkergruppen können
die Polyethoxyaminosäuren
AEA ((2-Amino)ethoxyessigsäure)
oder vorzugsweise eine Linkergruppe AEEA ([2-(2-Amino)ethoxy)]ethoxyessigsäure) sein.
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Empfindliche
funktionelle Gruppen: Eine empfindliche funktionelle Gruppe ist
eine Gruppe von Atomen, welche eine potentielle Reaktionsstelle
auf einem antiviralen und antifusogenen Peptid darstellt. Falls vorhanden,
kann eine empfindliche funktionelle Gruppe als Bindungspunkt für die Bindungsreaktivgruppen-Modifizierung ausgewählt sein.
Empfindliche funktionelle Grup pen umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf,
Carboxyl-, Amine-, Thiol- und Hydroxylgruppen.
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Modifizierte
Peptide: Ein modifiziertes Peptid ist ein antivirales und antifusogenes
Peptid, welches durch Anbindung einer reaktiven Gruppe modifiziert
worden ist. Die reaktive Gruppe kann an das Peptids entweder durch
eine Bindungs- bzw. Linkergruppe oder wahlweise ohne eine Linkergruppe
angebunden sein. Es wird auch in Betracht gezogen, dass eine oder
mehrere Aminosäuren
an das Peptid angebunden sind, um die Anbindung der reaktiven Einheit
zu erleichtern. Modifizierte Peptide können in vivo verabreicht werden,
so dass eine Konjugation mit Blutkomponenten in vivo auftritt oder
sie können
zuerst mit den Blutkomponenten in vitro konjugiert werden und das
resultierende konjugierte Peptid (wie unten definiert) wird in vivo
verabreicht.
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Konjugierte
Peptide: Ein konjugiertes Peptid ist ein modifiziertes Peptid, das
mit einer Blutkomponente über
eine kovalente Bindung, welche zwischen der reaktiven Gruppe des
modifizierten Peptides und den Funktionalitäten der Blutkomponenten, mit
oder ohne eine Linkergruppe, ausgebildet worden ist. Wie bei dieser
Anmeldung verwendet wurde, kann der Begriff ”konjugiertes Peptid” spezifischer
gemacht werden, um auf besondere konjugierte Peptide hinzuweisen,
beispielsweise ”konjugiertes
DP178” oder ”konjugiertes
DP107”.
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In
Anbetracht dieser Definitionen zieht die vorliegende Erfindung Nutzen
aus den Eigenschaften existierender antiviraler und antifusogener
Peptide. Die Viren, welche durch die Peptide inhibiert werden können, umfassen,
sind jedoch nicht beschränkt
auf alle Stämme
von Viren, welche beispielsweise in den
US-PSen 6,013,263 ,
6,017,536 und
6,020,459 in den Tabellen V–VII und
IX–XIV
aufgelistet sind. Diese Viren umfassen beispielsweise humane Retroviren,
umfassend HIV-1, HIV-2, und humane T-Lymphocyten-Viren (HTLV-I und HTLV-II),
und nicht-humane Retroviren, umfassend Rinderleukose-Virus, felines
Sarcoma-Virus, felinen Leukämie-Virus,
Affen-Immundefizienz-Virus (SIV), Affen-Sarcoma-Virus, Affen-Leukämie und
das fortschreitenden Lungenentzündungsvirus
vom Schaf. Nicht-retrovirale Viren können ebenfalls durch die Peptide
der vorliegenden Erfindung inhibiert werden, einschließlich des
humanen Atmungssyncytial-Virus (RSV), Kaninchen-Distempervirus,
Newcastle-Disease-Virus, des humanen Parainfluenza-Virus (HPIV),
Influenza-Viren, Masern-Viren
(MeV), Epstein-Barr-Viren, Hepatitis-B-Viren und Affen-Mason-Pfizer-Viren.
Nicht-eingehüllte Viren
können
ebenfalls durch die Peptide der vorliegenden Erfindung inhibiert
werden und umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, Picornaviren, wie
Polioviren, Hepatitis-A-Virus, Enteroviren, Echoviren, Coxsackie-Viren, Papovaviren,
wie Papilloma-Virus, Parvoviren, Adenoviren und Reoviren.
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Als
ein Beispiel wurde der Wirkungsmechanismus von HIV-Fusionspeptiden beschrieben,
wie in dem Abschnitt ”Hintergrund
der Erfindung” dieser
Anmeldung diskutiert, und antivirale und antifusogene Eigenschaften
dieser Peptide wurden gut nachgewiesen. Ein synthetisches Peptid,
das der Carboxyl-ständigen
Ectobereich-Sequenz entspricht (beispielsweise Aminosäurereste
643–678
von HIV-1-Klasse B des LAI-Stamms oder Reste 638–673 vom gleichen Stamm sowie
Reste 558–595)
zeigte eine Virus-vermittelte
Zell-Zell-Fusion vollständig
bei niedriger Konzentration. Das Fusionspeptid kompetitiert mit
dem Leucin-Zipperbereich
des nativen viralen gp41, was in der Störung bzw. Interferenz der Fusion/Infektion
des Virus in die Zelle resultiert.
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Ziel
der vorliegenden Erfindung ist es, ein ausgewähltes antivirales und antifusogenes
Peptid mit der DAC (Drug Activity Complex)-Technologie zu modifizieren,
um diesem Peptid eine verbesserte Bioverfügbarkeit, verlängerte Halbwertszeit
und bessere Verteilung durch selektive Konjugation des Peptids mit
einem Proteinträger
zu verleihen, jedoch ohne die antiviralen Eigenschaften des Peptides
zu modifizieren. Der Träger der
Wahl für
diese Erfindung wäre
Albumin, das über
sein freies Thiol durch ein antivirales und antifusogenes mit einer
Maleimid-Einheit
modifiziertes Peptid konjugiert ist.
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Verschiedene
Peptidsequenzen sind in der Literatur als hochpotent für die Prävention
von HIV-1-Fusion/Infektion beschrieben worden. Beispielsweise bindet
das Peptid DP178 an eine Konformation von gp41, welche relevant
für die
Fusion ist. Daher werden bei einer Ausführungsform der vorliegenden
Erfindung DP178 und DP178-ähnliche
Peptide modifiziert.
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Gleichermaßen umfassen
weitere Ausführungsformen
der vorliegenden Erfindung Modifikationen von DP107 und von DP107-ähnlichem
Peptid zur Verwendung gegen HIV, sowie Peptide, die zu DP107 und DP178
analog sind, welche in RSV, HPV, MeV und SIV-Viren gefunden werden.
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1. DP178 und DP107
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A. DP178-Peptide
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Das
DP178-Peptid entspricht Aminosäureresten
638 bis 673 des Transmembran-Proteins gp41 aus dem HIV-1LAI-Isolat und weist die 36 Aminosäuren umfassende
Sequenz auf (gelesen vom Aminozum Carboxylende):
NH2-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-COOH
(SEQ ID NR 1)
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Zusätzlich zu
dem 36-mer voller Länge
von DP178 umfassen die Peptide der vorliegenden Erfindungen Schnitte
bzw. Trunkationen des DP178-Peptids, umfassend Peptide von zwischen
3 und 36 Aminosäureresten
(d. h. Peptiden, welche in der Größe zwischen einem Tripeptid
und einem 36-mer-Polypeptid reichen). Diese geschnittenen Peptide
sind in den Tabellen 2 und 3 gezeigt.
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Darüber hinaus
liegen Aminosäuresubstitutionen
des DP178-Peptids
ebenfalls im Umfang der Erfindung. HIV-1- und HIV-2-Hüllenproteine sind strukturell
verschieden, es besteht jedoch eine auffallende Aminosäurekonservierung
innerhalb den DP178 entsprechenden Regionen von HIV-1 und HIV-2.
Die Aminosäurekonservierung
ist von einer periodischen Natur, was einige Konserverierung der
Struktur und/oder Funktion annehmen lässt. Daher würde eine
mögliche
Klasse von Aminosäuresubstitutionen
jene Aminosäureänderungen umfassen,
von denen angenommen wird, dass sie die Struktur der DP178-Peptide
der Erfindung stabilisieren. Unter Verwendung der DP178- und DP178-Analogsequenzen,
welche hier beschrieben sind, kann ein Fachmann rasch DP178-Konsensussequenzen
kombinieren bzw. übersetzen
und aus diesen konservierte Aminosäurereste bestimmen, welche
bevorzugte Aminosäuresubstitutionen
darstellen würden.
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Die
Aminosäuresubstitutionen
können
konservierter oder nicht-konservierter
Natur sein. Konservierte Aminosäuresubstitutionen
bestehen im Ersatz einer oder mehrerer Aminosäuren der DP178-Peptidsequenz mit
Aminosäuren ähnlicher
Ladungs-, Größen- und/oder Hydrophobie-Eigenschaften,
wie beispielsweise eine Glutaminsäure (E)- in Asparginsäure (D)-Aminosäuresubstitution.
Nicht-konservierte bzw. nicht-konservierende Substitutionen bestehen
im Ersatz einer oder mehrerer Aminosäuren der DP178-Peptidsequenz mit
Aminosäuren,
welche ungleiche Ladungs-, Größen- und/oder
Hydrophobie-Eigenschaften besitzen, wie beispielsweise die Substitution
einer Glutaminsäure
(E) durch Valin (V).
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Aminosäureinsertionen
von DP178 können
aus einzelnen Aminosäureresten
oder Zügen
von Resten bestehen. Die Insertionen bzw. Einfügungen können am Carboxyl- oder Aminoende
der trunkierten DP178 oder DP178-Peptide durchgeführt werden
sowie an einer Stelle innerhalb des Peptides.
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Solche
Insertionen werden im Allgemeinen 2 bis 15 Aminosäuren in
der Länge
aufweisen. Es wird in Betracht gezogen, dass Insertionen, welche
entweder am Carboxyl- oder Aminoende des Peptides von Interesse
durchgeführt
werden, einen breiteren Größenbereich
darstellen können,
wobei etwa 2 bis etwa 50 Amino säuren
bevorzugt werden. Eine oder mehrere solcher Insertionen können in
DP178- oder DP178-Schnitte eingeführt werden, solange solche
Insertionen in Peptiden resultieren, welche noch durch die 107 × 178 × 4-, ALLMOTI5-
oder PLZIP-Suchmotive, welche oben beschrieben sind, erkannt werden
können.
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Bevorzugte
amino- oder carboxylendständige
Insertionen sind Peptide, die von etwa 2 bis etwa 50 Aminosäuren in
der Länge
reichen, entsprechend den gp41-Proteinbereichen, entweder amino-
oder carboxylständig
zu der tatsächlichen
DP178 gp41-Aminosäuresequenz.
Demzufolge würde
eine bevorzugte aminoendständige
oder carboxylendständige
Aminosäureinsertion
gp41-Aminosäuresequenzen
enthalten, welche unmittelbar aminoendständig oder carboxylendständig zu
dem DP178-Bereich des gp41-Proteins gefunden werden.
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Deletionen
von DP178- oder DP178-Schnitten liegen auch im Umfang der vorliegenden
Erfindung. Solche Deletionen bestehen in der Entfernung einer oder
mehrerer Aminosäuren
aus der DP178- oder DP178-ähnlichen
Peptidsequenz, wobei die untere Grenzlänge der resultierenden Peptidsequenz
4 bis 6 Aminosäuren
beträgt.
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Solche
Deletionen können
eine einzelne nahe oder größer als
ein diskreter Abschnitt der Peptidsequenze beinhalten. Eine oder
mehrere solcher Deletionen können
in die DP178- oder DP178-Schnitte
eingeführt
werden, solange die Deletionen in Peptiden resultieren, welche noch
durch die 107 × 178 × 4-, ALLMOTI5-
oder PLZIP-Suchmotive, wie sie oben beschrieben sind, erkannt werden
können.
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B. DP107-Peptide
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DP107
ist ein 38 Aminosäuren
umfassendes Peptid, das eine potente antivirale Aktivität zeigt
und den Resten 558 bis 595 des HIV-1LAI-Isolat-Transmembran(TM)-gp41-Glycoproteins
entspricht, wie es hier gezeigt ist:
NH2-NNLLRAIEAQQHLLQLTVWQIKQLQARILAVERYLKDQ-COOH
(SEQ ID NR 2)
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Zusätzlich zu
dem DP107 38-mer voller Länge
beinhalten die DP107-Peptidschnitte des DP107-Peptids, umfassend
Peptide von zwischen 3 und 38 Aminosäureresten (d. h. Peptiden,
welche in der Größe von einem
Tripeptid bis zu einem 38-mer-Polypeptid reichen). Diese Peptide
sind in den Tabelle 4 und 5 unten gezeigt.
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Zusätzlich liegen
Aminosäuresubstitutionen
des DP178-Peptids ebenfalls im Umfang der Erfindung. Wie bei DP178
liegt eine auffallende Aminosäurekonservierung
in den DP107 entsprechenden Bereichen von HIV-1 und HIV-2 vor, wieder
von periodischer Natur, was eine Konservierung der Struktur und/oder
Funktion nahelegt. Daher umfasst eine mögliche Klasse von Aminosäuresubstitutionen
jene Aminosäureänderungen, von
denen angenommen wird, dass sie die Struktur der DP107-Peptide der
vorliegenden Erfindung stabilisieren. Unter Verwendung der DP107-
und DP107-Analog-Sequenzen,
welche hier beschrieben sind, kann der Fachmann rasch DP107-Konsenssequenzen
kombinieren bzw. übersetzen
und aus diesen konservierte Aminosäurereste bestimmen, welche
bevorzugte Aminosäuresubstitutionen
darstellen würden.
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Die
Aminosäuresubstitutionen
können
von einer konservierten bzw. konservierenden oder nicht-konservierten
bzw. nicht-konservierenden
Natur sein. Konservierte Aminosäuresubstitutionen
bestehen im Ersatz einer oder mehrerer Aminosäuren der DP107-Peptidsequenz
mit Aminosäuren ähnlicher
Ladungs-, Größen- und/oder Hydrophobie-Eigenschaften,
wie beispielsweise eine Aminosäuresubstitution
von Glutaminsäure
(E) durch Asparginsäu re
(D). Nicht-konservierende Substitutionen bestehen im Ersatz einer
oder mehrerer Aminosäuren
der DP107-Peptidsequenz mit Aminosäuren, welche ungleiche Ladungs-,
Größen- und/oder
Hydrophobie-Eigenschaften besitzen, beispielsweise die Substitution
einer Glutaminsäure
(E) durch Valin (V).
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Aminosäureinsertionen
können
aus einzelnen Aminosäureresten
oder Zügen
von Resten bestehen. Die Insertionen können am Carboxyl- oder Aminoende
des DP107- oder DP107-geschnittenen Peptides durchgeführt werden,
sowie an einer Position im Innern des Peptids.
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Solche
Insertionen werden im Allgemeinen von 2 bis 15 Aminosäuren in
der Länge
reichen. Es wird in Betracht gezogen, dass die Insertionen, welche
entweder am Carboxyl- oder Aminoende des Peptides von Interesse
durchgeführt
werden, in einem breiteren Größenbereich
liegen, wobei etwa 2 bis etwa 50 Aminosäuren bevorzugt werden. Eine
oder mehrere solcher Insertionen können in DP107 oder DP107-Schnitte
eingeführt werden,
solange solche Insertionen in Peptiden resultieren, welche noch
durch die 107 × 178 × 4-, ALLMOTI5- oder
PLZIP-Suchmotive, die oben beschrieben sind, erkannt werden.
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Bevorzugte
amino- oder carboxylendständige
Insertionen sind Peptide, welche von etwa 2 bis etwa 50 Aminosäureresten
in der Länge
reichen, entsprechend gp41-Proteinbereichen, entweder amino- oder
carboxylständig
zur tatsächlichen
DP107-gp41-Aminosäuresequenz.
Demzufolge würde
eine bevorzugte aminoendständige
oder carboxylendständige
Aminosäureinsertion
gp41-Aminosäuresequenzen
enthalten, welche unmittelbar amino- oder carboxylständig zum DP107-Bereich des
gp41-Proteins gefunden werden.
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Deletionen
von DP107 oder DP107-Schnitten liegen ebenfalls im Umfang der vorliegenden
Erfindung. Solche Deletionen bestehen in der Entfernung einer oder
mehrerer Aminosäuren
aus der DP107- oder DP107-ähnlichen
Peptidsequenz, wobei die untere Grenzlänge der resultierenden Peptidsequenz
4 bis 6 Aminosäuren
beträgt.
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Solche
Deletionen können
einen einzelnen engen oder größeren als
einen diskreten Abschnitt der Peptidsequenzen beinhalten. Eine oder
mehrere solche Deletionen können
in DP107 oder DP107-Schnitte eingeführt werden,
solange solche Deletionen in Peptiden resultieren, welche noch durch
die 107 × 178 × 4-, ALLMOTI5- oder PLZIP-Suchmotive
erkannt werden.
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DP107
und DP107-Schnitte sind vollständiger
in der
US-PS 5,656,480 beschrieben,
welche hier vollständig
unter Bezugnahme darauf inverleibt ist.
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2. DP107- und DP178-Analoga
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Peptide,
welche Analogen von DP178-, DP178-Schnitt-, DP107- und DP107-Schnitt-Sequenzen
der vorliegenden Erfindung entsprechen, welche oben beschrieben
sind, können
in weiteren Viren gefunden werden, einschließlich beispielsweise nicht-HIV-1-Hüllviren,
nicht-Hüllviren
und anderen nicht-viralen Organismen.
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Solche
DP178- und DP107-Analoga können
beispielsweise Peptidsequenzen entsprechen, welche in Transmembran(”TM”)-Proteinen
von Hüllviren
vorliegen und können
Peptidsequenzen entsprechen, welche in nicht-eingehüllten und
nicht-viralen Organismen vorliegen. Solche Peptide können eine
antifusogene, antivirale und insbesondere antivirale Aktivität zeigen,
welche spezifisch für
den Virus ist, in welchem ihre native Sequenzen gefunden werden,
oder können
eine Fähigkeit
zeigen, intrazelluläre
Prozesse, welche gewundene, Windungspeptidstrukturen beinhalten,
modulieren.
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A. DP178-Analoga
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DP178-Analoga
sind Peptide, deren Aminosäuresequenzen
aus den Aminosäuresequenzen
von Peptidbereichen von beispielsweise an deren (d. h. anderen als
HIV-1) Viren bestehen, umfassen, welche dem gp41-Peptidbereich entsprechen,
aus dem DP178 abgeleitet wurde. Solche Viren können weitere HIV-1-Isolate
und HIV-2-Isolate
beinhalten, sind aber nicht darauf beschränkt.
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DP178-Analoga,
abgeleitet aus dem entsprechenden gp41-Peptidbereich von anderen (d. h. nicht-HIV-1LAI)
HIV-1-Isolaten, können
beispielsweise Peptidsequenzen beinhalten, welche unten gezeigt sind.
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Die
Peptide von SEQ ID NR 3, SEQ ID NR 4 und SEQ ID NR 5 sind aus HIV-1SF2, HIV-1RF bzw.
HIV-1MN abgeleitet. Weitere DP178-Analoga umfassen
jene, welche aus HIV-2 abgeleitet sind, einschließlich der
Peptide von SEQ ID NR 6 und SEQ ID NR 7, welche aus HIV-2ROD bzw. HIV-2NIHZ abgeleitet
sind. Noch weitere nützliche
Analoga umfassen die Peptide der SEQ ID NR 8 und SEQ ID NR 9, welche
eine antivirale Aktivität zeigen.
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Bei
der vorliegenden Erfindung wird bevorzugt, dass die DP178-Analoga Peptide repräsentieren,
deren Aminosäuresequenzen
dem DP178-Bereich des gp41-Proteins entsprechen, es wird auch in
Betracht gezogen, dass die hier offenbarten Peptide des Weiteren
Aminosäuresequenzen
umfassen, welche von etwa 2 bis etwa 50 Aminosäureresten in der Länge beinhalten,
entsprechend gp41-Proteinbereichen
entweder in Amino- oder Carboxylendstellung zu der tatsächlichen
DP178-Aminosäuresequenz.
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Die
Tabellen 6 und 7 zeigen mögliche
Schnitte bzw. Trunkationen des HIV-2NIHZ-DP178-Analogs,
das Peptide von zwischen 3 bis 36 Aminosäureresten umfassen kann (d.
h. Peptiden, welche in der Größe von einem
Tripeptid bis zu einem 36-mer-Polypeptid reichen). Peptidsequenzen
in diesen Tabellen sind vom Aminoende (links) zum Carboxylende (rechts)
aufgelistet.
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B. Zusätzliche
DP178-Analoga und DP107-Analoga
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DP178-
und DP107-Analoga werden beispielsweise unter Verwendung einer oder
mehrerer der 107 × 178 × 4-, ALLMOTI5-
oder PLZIP-computergestützten Suchstrategien,
welche oben beschrieben sind, erkannt oder identifiziert. Die Suchstrategie
identifiziert zusätzliche
Peptidregionen, von denen angenommen wird, dass sie strukturelle
und/oder Aminosäuresequenzmerkmale
aufweisen, welche ähnlich
zu jenen von DP107 und/oder DP178 sind.
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Die
Suchstrategien sind vollständig
in dem Beispiel beschrieben, das in Abschnitt 9 der
US-PSen 6,013,263 ,
6,017,536 und
6,020,459 dargestellt ist. Während diese
Suchstrategie teilweise auf einem primären Aminosäuremotiv, abgeleitet aus DP107
und DP178, basiert, ist sie nicht nur auf der Suche nach Primäraminosäuresequenzhomologen
basiert, da solche Proteinsequenzhomologen innerhalb aber nicht
zwischen Gruppen von Viren existieren. Beispielsweise ist die Primäraminosäuresequenzhomologie
innerhalb des TM-Proteins von verschiedenen Stämmen von HIV-1 oder innerhalb
des TM-Proteins von verschiedenen Isolaten des Affen-Immundefizienz-Virus
(SIV) verschieden.
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Die
computergestützte
Suchstrategie, welche in den
US-PSen
6,013,263 ,
6,017,536 und
6,020,459 beschrieben ist,
identifizierte erfolgreich Bereiche von Proteinen, welche ähnlich zu
DP107 oder DP178 sind. Diese Suchstrategie wurde zur Verwendung
mit einer handelsüblich
verfügbaren
Sequenzdatenbank, vorzugsweise PC/Gen, entworfen.
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In
den
US-PSen 6,013,263 ,
6,017,536 und
6,020,459 wurden eine Reihe von Suchmotiven,
die 107 × 178 × 4-, ALLMOTI5-
und PLZIP-Motive,
entworfen und entwickelt, um in der Stringenz von genau bis breit
zu reichen, wobei 107 × 178 × 4 bevorzugt
wird. Die durch solche Suchmotive identifizierten Sequenzen, solche, die
in den Tabellen V–XIV
der
US-PSen 6,013,263 ,
6,017,536 und
6,020,459 aufgelistet sind und in
dieser Anmeldung unter Bezugnahme einverleibt sind, zeigen potentiell
antifusogene Eigenschaften, wie antivirale Aktivität, können zusätzlich zur
Identifizierung von antifusogenen, wie antiviralen, Verbindungen
nützlich
sein.
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3. Weitere antivirale Peptide
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A. Anti-RSV-Peptide
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Anti-RSV-Peptide
beinhalten DP178 und/oder DP107-Analoga, welche aus entsprechenden
Peptidsequenzen in RSV identifiziert wurden, und für welche
festgestellt wurde, dass sie eine Virusinfektion durch RSV inhibieren.
Solche Peptide von Interesse beinhalten die Peptide der Tabelle
16 und Peptide von SEQ ID NR 10 bis SEQ ID NR 30. Von besonderem
Interesse sind die folgenden Peptide:
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Das
Peptid SEQ ID NR 10 ist aus dem F2-Bereich von RSV abgeleitet und
wurde in den
US-PSen 6,103,236 und
6,020,459 unter Verwendung
der Suchmotive identifiziert, welche als entsprechend zu DP107- und
DP178-Peptiden (d. h. ”DP107/178-ähnlich”) beschrieben
sind. Die Peptide SEQ ID NR 14 bis SEQ ID NR 16 weisen jeweils Aminosäuresequenzen
auf, welche in dem Peptid SEQ ID NR 10 enthalten sind und jedes zeigt
Anti-RSV-Wirkung, insbesondere eine Inhibierung der Fusion und Syncytia-Bildung
zwischen RSV-infizierten und nicht-infizierten Hep-2-Zellen in Konzentrationen
von weniger als 50 μg/ml.
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Das
Peptid SEQ ID NR 11 ist aus dem F1-Bereich von RSV abgeleitet und
wurde in den
US-PSen 6,103,236 und
6,020,459 unter Verwendung
von Suchmotiven identifiziert, welche als entsprechend zu DP107 (d.
h. ”DP107-ähnlich”) beschrieben
sind. Das Peptid SEQ ID NR 29 enthält Aminosäuresequenzen, welche in dem
Peptid SEQ ID NR 10 enthalten sind und zeigt ebenfalls Anti-RSV- Aktivität, insbesondere
eine Inhibierung der Fusion und Syncytia-Bildung zwischen RSV-infizierten
und nicht-infizierten Hep-2-Zellen
in Konzentrationen von weniger als 50 μg/ml.
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B. Anti-HPIV-Peptide
-
Anti-HPIV-Peptide
beinhalten DP178- und/oder DP107-Analoga, welche aus entsprechenden
Peptidsequenzen in HPIV identifiziert wurden und für welche
des Weiteren gezeigt wurde, dass sie eine Virusinfektion durch HIPV
inhibieren. Solche Peptide von Interesse beinhalten die Peptide
der Tabelle 17 und die Sequenzen SEQ ID NR 31 bis SEQ ID NR 62.
Von besonderem Interesse sind die folgenden Peptide:
-
Das
Peptid SEQ ID NR 31 ist aus dem F1-Bereich von HPIV-3 abgeleitet
und wurde in den
US-PSen 6,103,236 und
6,020,459 unter Verwendung
der Suchmotive identifiziert, welche als entsprechend zu DP107 (d.
h. ”DP107-ähnlich”) beschrieben
sind. Die Peptide SEQ ID NR 52 und SEQ ID NR 58 besitzen alle Aminosäuresequenzen,
welche in dem Peptid SEQ ID NR 30 enthalten sind, und jedes zeigt
Anti-HPIV-3-Aktivität, insbesondere
eine Inhibierung der Fusion und Syncytia-Bildung zwischen HPIV-3-infizierten Hep2-Zellen
und nicht-infizierten CV-1W-Zellen in Konzentrationen von weniger
als 1 μg/ml.
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Das
Peptid SEQ ID NR 32 ist ebenfalls aus dem F1-Bereich von HPIV-3
abgeleitet und wurde in den
US-PSen
6,103,236 und
6,020,459 unter
Verwendung der Suchmotive identifiziert, welche als entsprechend zu
DP178 (d. h. ”DP178-ähnlich”) beschrieben
sind. Die Peptide SEQ ID NR 35 und SEQ ID NR 38 bis SEQ ID NR 42
besitzen jeweils Aminosäuresequenzen,
welche in dem Peptid SEQ ID NR 32 enthalten sind und jedes zeigte
auch Anti-HPIV-3-Aktivität, insbesondere
eine Inhibierung der Fusion und Syncytia-Bildung zwischen HPIV-3-infizierten
Hep2-Zellen und nicht-infizierten
CV-1W-Zellen in Konzentrationen von weniger als 1 μg/ml.
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C. Anti-MeV-Peptide
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Anti-MeV-Peptide
sind DP178- und/oder DP107-Analoga, welche aus entsprechenden Peptidsequenzen
in Masernviren (MeV) identifiziert wurden, und für welche des Weiteren festgestellt
wurde, dass sie eine Virusinfektion durch Masernviren inhibieren.
Solche Peptide von besonderem Interesse beinhalten die Peptide von
Tabelle 19 und Peptide der Sequenzen SEQ ID NR 74 bis SEQ ID NR
86. Von besonderem Interesse sind die unten aufgelisteten Peptide.
-
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Aus
Masernviren abgeleitete Sequenzen wurden in den
US-PSen 6,103,236 und
6,020,459 unter Verwendung der Suchmotive
identifiziert, welche als entsprechend zu DP178 (d. h. ”DP178-ähnlich”) beschrieben sind. Die Peptide
SEQ ID NR 77, SEQ ID NR 79, SEQ ID NR 81 und SEQ ID NR 83 besitzen
jedes so identifizierte Aminosäuresequenzen
und zeigen auch Anti-MeV-Aktivität,
insbesondere eine Inhibierung der Fusion und Syncytia-Bildung zwischen
MeV-infizierten Hep2 und nicht-infizierten Vero-Zellen in Konzentrationen
von weniger als 1 μg/ml.
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D. Anti-SIV-Peptide
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Anti-SIV-Peptide
sind DP178- und/oder DP107-Analoga, welche aus entsprechenden Peptidsequenzen
in SIV identifiziert wurden, und welche des Weiteren zeigten, dass
sie eine Virusinfektion durch SIV inhibieren. Solche Peptide von
Interesse beinhalten die Peptide der Tabelle 18 und Peptide der
Sequenzen SEQ ID NR 63 bis SEQ ID NR 73. Von besonderem Interesse
sind die folgenden Peptide:
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Aus
SIV-Transmembranfusionsprotein abgeleitete Sequenzen wurden in den
US-PSen 6,103,236 und
6,020,459 unter Verwendung
der Suchmotive identifiziert, welche als entsprechend zu DP178 (d.
h. ”DP178-ähnlich”) beschrieben
sind. Die Peptide der Sequenzen SEQ ID NR 64 bis SEQ ID NR 73 besitzen jeweils
so identifizierte Aminosäuresequenzen
und jedes zeigt potente Anti-SIV-Aktivität als Rohpeptide.
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4. Modifikation von antiviralen
und antifusogenen Peptiden
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Die
Erfindung zieht eine Modifizierung von Peptiden in Betracht, welche
antivirale und antifusogene Aktivität zeigen, einschließlich solcher
Modifikationen von DP-107 und DP-178 und Analogen davon. Solche modifizierten
Peptide können
mit verfügbaren
reaktiven Funktionalitäten
an Blutkomponenten über
kovalente Bindungen reagieren. Die Erfindung betrifft auch die Verwendung
solcher modifizierter Peptide. Das Verfahren zur Ver wendung der
modifizierten Peptide beinhaltet die Verlängerung der wirksamen therapeutischen
Lebenszeit der konjugierten antiviralen Peptidderivate im Vergleich
zur Verabreichung der nicht-konjugierten Peptide. Die modifizierten
Peptide sind von einer Art, welche als DAC (Drug Affinity Complex)
bezeichnet wird, welche das antivirale Peptidmolekül und eine
Bindungsgruppe zusammen mit einer chemisch reaktiven Gruppe umfasst,
die fähig
zur Reaktion mit einer reaktiven Funktionalität eines mobilen Blutproteins
ist. Durch Reaktion bzw. Umsetzung mit der Blutkomponente oder dem
Protein kann das modifizierte Peptid, oder DAC, über das Blut an geeignete Stellen
oder Rezeptoren geliefert werden.
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Die
Funktionalität
am Protein wird eine Thiolgruppe sein und die reaktive Gruppe wird
eine Maleimid enthaltende Gruppe sein, wie γ-Maleimidbutyralamid (GMBA)
oder Maleimidpropionsäure
(MPA). Die Erfindung liefert daher die Verwendung eines DAC, worind
die Maleimidgruppe über
eine Kopplungsgruppe an das Peptid gebunden ist.
-
Primäre Amine
sind die hauptsächlichen
Ziele bzw. Targets für
NHS-Ester. Zugängliche α-Aminogruppen
am N-terminalen Ende von Proteinen reagieren mit NHS-Estern. Jedoch
können α-Aminogruppen an einem
Protein für
die NHS-Kopplung nicht erwünscht
oder verfügbar
sein. Während
fünf Aminosäuren Stickstoff in
ihren Seitenketten besitzen, reagiert nur das ε-Amin von Lysin deutlich mit
NHS-Estern. Wenn die NHS-Ester-Konjugationsreaktion
mit primären
Aminen unter Freisetzung von N-Hydroxysuccinimid, wie unten im Schema
verdeutlicht, reagiert, wird eine Amidbindung ausgebildet.
-
-
Die
funktionelle Gruppe an diesem Protein wird eine Thiolgruppe sein
und die chemisch reaktive Gruppe wird eine Maleimid enthaltende
Gruppe, wie MPA oder GMBA (γ-Maleimidbutyralamid)
sein. Die Maleimidgruppe ist äußerst selektiv
für Sulfhydrylgruppen
an Peptiden, wenn der pH-Wert des Reaktionsgemisches zwischen 6,5
und 7,4 gehalten wird. Bei einem pH-Wert von 7,0 ist die Umsetzungsgeschwindigkeit
von Maleimidgruppen mit Sulfhydrylen 1000-fach schneller als mit
Aminen. Zwischen der Maleimidgruppe und dem Sulfhydryl wird eine
stabile Thioetherbindung ausgebildet, welche unter physiologischen
Bedingungen nicht gespalten werden kann, wie in dem nachfolgenden
Schema dargestellt ist.
-
-
A. Spezifische Kennzeichnung
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Die
verwendeten modifizierten Peptide der vorliegenden Erfindung sind
so gestaltet, dass sie mit Thiolgruppen an mobilen Blutproteinen
spezifisch reagieren. Eine solche Umsetzung wird durch kovalente
Bindung des Peptides aufgebaut, das mit einem Maleimidlinker (zum
Beispiel hergestellt aus GMBS, MPA oder anderen Maleimiden) an eine
Thiolgruppe an einem mobilen Blutprotein, Serum Albumin, modifiziert
ist.
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Unter
bestimmten Umständen
bietet eine spezifische Markierung bzw. Kennzeichnung (im Folgenden Markierung)
mit Maleimid verschiedene Vorteile im Gegensatz zu nicht-spezifischer
Markierung von mobilen Proteinen mit Gruppen, wie NHS oder Sulf-NHS.
Thiolgruppen sind in vivo weniger häufig als Aminogruppen. Daher
werden die gemäß der vorliegenden
Erfindung verwendeten Maleimid-modifizierten Peptide, das heißt die Maleimidpeptide,
mit weniger Proteinen kovalent binden. Beispielsweise existiert
in Albumin (dem häufigsten
Blutprotein) nur eine einzige Thiolgruppe. Daher werden Peptid-Maleimid-Albumin-Konjugate
dazu neigen, etwa ein 1:1-Molverhältnis von Peptid zu Albumin
zu umfassen. Zusätzlich
zu Albumin weisen IgG-Moleküle (Klasse
II) ebenfalls freie Thiolgruppen auf. Da IgG-Moleküle und Serumalbumin
die Hauptmenge des löslichen
Proteins im Blut ausmachen, machen sie auch die Hauptmenge der freien
Thiolgruppen im Blut aus, welche verfügbar sind, um kovalent an Maleimidmodifizierte
Peptide zu binden.
-
Des
Weiteren führt
sogar unter freie Thiolgruppen enthaltenden Blutproteinen, einschließlich IgGs, eine
spezifische Markierung mit Maleimiden zur bevorzugten Bildung von
Peptid-Maleimid-Albumin-Konjugaten,
infolge der einzigartigen Eigenschaften von Albumin selbst. Die
einzelne freie Thiolgruppe von Albumin, hochkonserviert unter Spezien,
ist am Aminosäurerest
34 (Cys34) lokalisiert. Es wurde kürzlich gezeigt,
dass das Cys34 von Albumin eine erhöhte Reaktivität relativ
zu freien Thiolen an anderen freies Thiol enthaltenden Proteinen
besitzt. Das ist teilweise eine Folge des sehr niedrigen pK-Wertes
von 5,5 des Cys34 von Albumin. Dieser ist
viel niedriger als typische pK-Werte
für Cysteinreste
im Allgemeinen, welche typischerweise etwa 8 betragen. Infolge dieses
niedrigen pK-Wertes liegt unter normalen physiologischen Bedingungen
Cys34 von Albumin hauptsächlich in ionisierter Form
vor, was seine Reaktivität
dramatisch erhöht.
Zusätzlich
zu dem niedrigen pK-Wert von Cys34 ist ein
weiterer Faktor, welcher die Reaktivität von Cys34 erhöht, seine
Stellung bzw. Position, die eine Spalte nahe der Oberfläche einer
Schleife der Region V von Albumin ist. Diese Position macht Cys34 für
Liganden aller Art sehr verfügbar
und ist ein wesentlicher Faktor in der biologischen Rolle von Cys34 als Falle für freie Radikale und Fänger von
freiem Thiol. Diese Eigenschaften machen Cys34 hochreaktiv mit
Maleimid-Peptiden und die Umsetzungsgeschwindigkeitserhöhung kann
das 1000-fache relativ zur Umsetzungsgeschwindigkeit von Maleimidpeptiden
mit anderen freies Thiol enthaltenden Proteinen betragen.
-
Ein
weiterer Vorteil von Peptid-Maleimid-Albumin-Konjugaten ist die
Reproduzierbarkeit, welche mit der 1:1-Ladung von Peptid zu Albumin
spezifisch an Cys34 verbunden ist. Anderen
Techniken, wie Glutaraldehyd, DCC, EDC und weitere chemische Aktivierungen
von, beispielsweise freien Aminen, mangelt es an dieser Selektivität. Beispielsweise
enthält
Albumin 52 Lysinreste, wovon 25 bis 30 auf der Oberfläche von
Albumin lokalisiert sind und daher zur Konjugation verfügbar sind.
Eine Aktivierung dieser Lysinreste oder alternativ dazu eine Modifizierung
von Peptiden, um mit diesen Lysinresten zu koppeln, resultiert in
einer heterogenen Population von Konjugaten. Sogar wenn 1:1-Molverhältnisse
von Peptid zu Albumin verwendet werden, wird die Ausbeute aus vielfachen
Konjugatprodukten bestehen, wovon einige 0, 1, 2 oder mehr Peptide
pro Albumin enthalten und jedes Peptide aufweist, welche an einem
oder mehreren der 25 bis 30 verfügbaren
Lysin-Stellen regellos gekoppelt sind. Bei den zahlreichen möglichen
Kombinationen wird eine Charakterisierung der genauen Zusammensetzung
und Natur jeder Konjugat-Partie bzw. -Charge schwierig und eine
Partie-zu-Partie-Reproduzierbarkeit
ist völlig
unmöglich,
was solche Konjugate weniger erwünscht
als Therapeutikum macht. Während
es scheinen mag, dass eine Konjugation durch Lysinreste von Albumin
wenigstens den Vorteil aufweist, mehr Wirkstoff pro Albuminmolekül zu liefern,
haben Studien darüber
hinaus gezeigt, dass ein 1:1-Verhältnis von
Therapeutikum zu Albumin bevorzugt ist. In einem Artikel von Stehle
et al., ”The
Loading Rate Determines Tumor Targeting properties of Methotrexate-Albumin
Conjugates in Rats”,
Anti-Cancer Drugs, Bd. 8, S. 677–685 (1988), welcher hier vollständig einverleibt
ist, berichten die Autoren, dass ein 1:1-Verhältnis von Antikrebs-Methotrexat
zu Albumin, konju giert über
Glutaraldehyd, die meistversprechenden Resultate ergab. Diese Konjugate
wurden vorzugsweise durch Tumorzellen aufgenommen, wohingegen Konjugate
mit 5:1 bis 20:1 Methotrexat-Molekülen geänderte HPLC-Profile
aufwiesen und in vivo rasch durch die Leber aufgenommen wurden.
Es wurde postuliert, dass bei diesen höheren Verhältnissen konformative Änderungen
am Albumin seine Wirksamkeit als Arzneimittelträger verringern.
-
Durch
kontrollierte Verabreichung von Maleimid-Peptiden in vivo kann man
die spezifische Markierung von Albumin und IgG in vivo kontrollieren.
In typischen Verabreichungen werden 80 bis 90% der verabreichten Maleimid-Peptide
Albumin markieren bzw. indizieren und weniger als 5% IgG. Eine Spurenindizierung
bzw. -markierung von freien Thiolen, wie Glutathion, wird ebenfalls
auftreten. Eine solche spezifische Indizierung wird für in vivo
Verwendung bevorzugt, da sie eine genaue Berechnung der geschätzten Halbwertszeit
des verabreichten Mittels erlaubt.
-
Zusätzlich zur
Lieferung einer kontrollierten, spezifischen in vivo Indizierung
können
Maleimid-Peptide eine spezifische Indizierung von Serumalbumin und
IgG ex vivo liefern. Eine solche ex vivo Indizierung beinhaltet
die Beimengung von Maleimid-Peptiden
zu Blut, Serum oder Salzlösung,
welche Serumalbumin und/oder IgG enthält. Sobald eine Konjugation
ex vivo mit den Maleimid-Peptiden aufgetreten ist, kann das Blut,
das Serum oder die Salzlösung
dem Patientenblut zur in vivo Behandlung erneut verabreicht werden.
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Im
Gegensatz zu NHS-Peptiden sind Maleimid-Peptide im Allgemeinen in
Gegenwart wässriger
Lösungen
und in Gegenwart freier Amine sehr stabil. Da Maleimid-Peptide nur
mit freien Thiolen reagieren werden, sind Schutzgruppen im Allgemeinen
nicht erforderlich, um zu verhindern, dass die Maleimid-Peptide
mit sich selbst reagieren. Darüber
hinaus erlaubt die erhöhte
Stabilität
des modifizierten Peptids die Verwendung weiterer Reinigungsschritte,
wie HPLC, um hochgereinigte Produkte herzustellen, welche für eine in
vivo Anwendung geeignet sind.
-
Letztendlich
liefert die erhöhte
chemische Stabilität
ein Produkt mit einer längeren
Lagerbeständigkeit.
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5. Synthese von modifizierten antiviralen
und antifusogenen Peptiden
-
A. Peptidsynthese
-
Antivirale
und antifusogene Peptide gemäß der vorliegenden
Erfindung können
durch Standardverfahren der Festphasen-Peptidchemie, die dem Fachmann
bekannt sind, hergestellt werden. Beispielsweise können Peptide
durch Festphasen-Chemietechniken gemäß den Verfahren synthetisiert
werden, die von Steward und Young (Steward, J. M. und Young, J.
D., Solid Phase Peptide Synthesis, 2. Aufl., Pierce Chemical Company,
Rockford, Ill. (1984) unter Verwendung eines Applied Biosystem Synthesizers
beschrieben sind. Gleichermaßen
können
mehrteilige Peptidfragmente synthetisiert werden und dann miteinander
unter Ausbildung großer
Peptide verbunden werden. Diese synthetischen Peptide können auch
unter Aminosäuresubstitutionen an
spezifischen Stellen durchgeführt
werden.
-
Für Festphasen-Peptidsynthesen
kann eine Zusammenfassung vieler Techniken in J. M. Stewart und J.
D. Young, Solid Phase Peptide Synthesis, W. H. Freeman Co. (San
Francisco), 1963 und J. Meienhofer, Hormonal Proteins and Peptides,
Bd. 2, S. 46, Academic Press (New York), 1973 gefunden werden. Für klassische Lösungssynthesen
wird auf G. Schroder und K. Lupke, The Peptides, Bd. 1, Academic
Press (New York) hingewiesen. Im Allgemeinen umfassen diese Verfahren
die aufeinander folgende Zugabe einer oder mehrerer Aminosäuren oder
geeignet geschützter
Aminosäuren
zu einer wachsenden Peptidkette. Normalerweise ist entweder die
Amino- oder Carboxylgruppe der ersten Aminosäure durch eine geeignete Schutzgruppe
geschützt.
Die geschützte
oder derivatisierte Aminosäure
wird dann an einen inerten Feststoffträger angebunden oder in Lösung unter
Zugabe der nächsten
Aminosäure
in der Sequenz verwendet, welche die komplementäre (Amino- oder Carboxyl)-Gruppe
aufweist, welche geeignet geschützt
ist und unter Bedingungen, welche zur Ausbildung der Amidbindung
geeignet sind. Die Schutzgruppe wird dann von diesem neu zugegebenen
Aminosäurerest
entfernt und die nächste
Aminosäure
(geeignet geschützt)
wird zugegeben und so weiter.
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Nachdem
alle gewünschten
Aminosäuren
in der richtigen Sequenz (Reihenfolge) verbunden sind, werden jegliche
verbliebenen Schutzgruppen (und jeglicher Feststoffträger) aufeinander
folgend oder gleichzeitig entfernt, um das Endpolypeptid zu liefern.
Durch einfache Modifikation dieses allgemeinen Verfahrens ist es
möglich,
mehr als eine Aminosäure
gleichzeitig zu einer wachsenden Kette zuzugeben, beispielsweise indem
(unter Bedingungen, welche chirale Zentren nicht racemisieren) ein
geschütztes
Tripeptid mit einem geeignet geschützten Dipeptid gekuppelt wird,
um nach dem Entfernen der Schutzgruppe(n) ein Pentapeptid zu bilden.
-
Ein
besonders bevorzugtes Verfahren zur Herstellung von Verbindungen
gemäß der vorliegenden
Erfindung umfasst eine Festphasen-Peptidsynthese, worin die Aminosäure α-N-endständig durch
eine Säure- oder
Basen-empfindliche Gruppe geschützt
ist. Solche Schutzgruppen sollten die Eigenschaften aufweisen, unter
den Bedingungen der Peptidbindungsbildung stabil zu sein, wohingegen
sie rasch, ohne Zerstörung
der wachsenden Peptidkette oder ohne Racemisierung eines jeden der
chiralen Zentren, die darin enthalten sind, entfernbar sind. Geeignete
Schutzgruppen sind 9-Fluorenylmethyloxycarbonyl (Fmoc), t-Butyloxycarbonyl (Boc),
Benzyloxycarbonyl (Cbz), Biphenylisopropyloxycarbonyl, t-Amyloxycarbonyl,
Isobornyloxycarbonyl, α-α-Dimethyl-3,5-dimethoxybenzyloxycarbonyl,
o-Nitrophenylsulfenyl, 2-Cyano-t-butyloxycarbonyl,
und dergleichen. Die 9-Fluorenylmethyloxycarbonyl-Schutzgruppe (Fmoc)
wird für
die Synthese der Peptide der vorliegenden Erfindung besonders bevorzugt.
Weitere bevorzugte Seitenkettenschutzgruppen sind für Seitenkettenaminogruppen,
wie Lysin und Arginin, 2,2,5,7,8-Pentamethylchroman-6-sulfonyl (pro), Nitro,
p-Toluolsulfonyl, 4-Methoxybenzolsulfonyl, Cbz, Boc und Adamantyloxycarbonyl;
für Tyrosin
Ben zyl, o-Brombenzyloxycarbonyl, 2,6-Dichlorbenzyl, Isopropyl, t-Butyl (t-Bu), Cyclohexyl,
Cyclophenyl und Acetyl (Ac); für
Serin t-Butyl, Benzyl und Tetrahydropyranyl; für Histidin Trityl, Benzyl,
Cbz, p-Toluolsulfonyl und 2,4-Dinitrophenyl; für Tryptophan Formyl; für Aspartinsäure und
Glutaminsäure
Benzyl und t-Butyl und für
Cystein Triphenylmethyl (trityl).
-
Bei
der Festphasen-Peptidsynthese wird die α-C-terminale Aminosäure an einen
geeigneten Feststoffträger
oder ein Harz gebunden. Geeignete Feststoffträger, welche für die obige
Synthese verwendet werden, sind jene Materialien, welche den Reagenzien
und Reaktionsbedingungen der stufenweisen Kondensation/Entschützen-Reaktionen
gegenüber
inert sowie unlöslich
im verwendeten Medium sind. Der bevorzugte Feststoffträger zur
Synthese eines α-C-terminalen
Carboxy-Peptides ist 4-Hydroxymethylphenoxymethyl-Copoly(Styrol-1%-Divinylbenzol).
Der bevorzugte Feststoffträger
für α-C-terminale
Amidpeptide ist 4-(2'‚4'-Dimethoxyphenyl-Fmoc-aminomethyl)phenoxyacetamidoethyl-Harz,
erhältlich
von Applied Biosystems (Foster City, Calif.). Die α-C-terminale
Aminosäure
wird an das Harz mittels N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid
(DCC), N,N'-Diisopropylcarbodiimid
(DIC) oder O-Benztriazol-1-yl-N,N,N',N'-tetramethyluroniumhexafluorophosphat
(HBTU) mit oder ohne 4-Dimethylaminopyridin (DMAP), 1-Hydroxybenztriazol
(HOBT), Benztriazol-1-yloxy-tris(dimethylamino)phosphonium-hexafluorophosphat
(BOP) oder Bis(2-oxo-3-oxazolidinyl)phosphinchlorid (BOPCl)-unterstützten Gruppen
während
von etwa 1 bis etwa 24 Stunden bei einer Temperatur von zwischen 10°C und 50°C in einem
Lösungsmittel,
wie Dichlormethan oder DMF, angebunden.
-
Ist
der Feststoffträger
4-(2',4'-Dimethoxyphenyl-Fmoc-aminomethyl)phenoxyacetamidethyl-Harz,
wird die Fmoc-Gruppe mit einem sekundären Amin abgespalten, vorzugsweise
Piperidin, bevor, wie oben beschrieben, mit der α-C-terminalen Aminosäure gekuppelt
wird. Das bevorzugte Verfahren zur Kupplung mit dem entschützten 4-(2'‚4'-Dimethoxyphenyl-Fmoc-aminomethyl)phenoxyacetamidethyl-Harz
ist O-Benztriazol-1-yl-N,N,N',N'-tetra methyluroniumhexafluorophosphat
(HBTU, 1 Äqu.)
und 1-Hydroxybenztriazol (HOBT, 1 Äqu.) in DMF. Die Kupplung nachfolgender
geschützter
Aminosäuren
kann in einem automatischen Polypeptid-Synthesizer, wie im Stand der Technik
bekannt ist, durchgeführt
werden. Bei einer bevorzugten Ausführungsform werden die α-N-terminalen Aminosäuren der
wachsenden Peptidkette mit Fmoc geschützt. Die Entfernung der Fmoc-Schutzgruppe
von der α-N-terminalen Seite
des wachsenden Peptids wird durch Behandeln mit einem sekundären Amin,
vorzugsweise Piperidin, erreicht. Jede geschützte Aminosäure wird dann in einen etwa
dreifach molaren Überschuss
eingeführt
und die Kupplung wird vorzugsweise in DMF durchgeführt. Das Kupplungsmittel
ist normalerweise O-Benztriazol-1-yl-N,N,N',N'-tetramethyluroniumhexafluorophosphat (HBTU,
1 Äqu.)
und 1-Hydroxybenztriazol (HOBT, 1 Äqu.).
-
Am
Ende der Festphasensynthese wird das Peptid vom Harz entfernt und
entschützt,
entweder in einem aufeinander folgenden oder einem einzigen Verfahren.
Die Entfernung des Polypeptids und das Entschützen kann in einem einzigen
Schritt durch Behandeln des Harz-gebundenen Polypeptids mit einem
Spaltreagens erreicht werden, umfassend Thioanisol, Wasser, Ethandithiol
und Trifluoressigsäure.
In Fällen,
in denen das α-C-terminale
Ende des Polypeptids ein Alkylamid ist, wird das Harz durch Aminolyse
mit einem Alkylamin abgespalten. Alternativ dazu kann das Peptid
durch Umesterung, z. B. mit Methanol, und nachfolgender Aminolyse
oder durch direkte Transamidierung entfernt werden. Das geschützte Peptid
kann an diesem Punkt gereinigt werden oder direkt in die nächste Stufe
eingesetzt werden. Die Entfernung der Seitenketten-Schutzgruppen
wird unter Verwendung des oben beschriebenen Spaltcocktails erreicht.
Das vollständig
entschützte Peptid
wird durch eine Sequenz von Chromatographiestufen gereinigt, welche
einige oder alle der folgenden Typen verwendet: Innenaustausch an
einem schwach basischen Harz (Acetatform); hydrophobe Adsorptionschromatographie
an nicht-derivatisiertem Polystyrol-Divinylbenzol (beispielsweise
Amberlit XAD); Silicagel-Adsorptionschromatographie; Ionenaustauschchromatographie
an Carboxymethylcellulose; Vertei lungs-chromatographie, z. B. an
Sephadex G-25, LH-20 oder Gegenstromchromatographie; Hochleistungsflüssigkeitschromatographie
(HPLC), insbesondere Umkehrphasen-HPLC an Octyl- oder Octadecylsilyl-Silica-Bindungsphasen-Säulenpackung.
-
Molekulargewichte
dieser ITPs werden unter Verwendung von FAB-Massenspektroskopie bestimmt.
-
(1) N-terminale Schutzgruppen
-
Wie
oben diskutiert worden ist, bezieht sich der Begriff ”N-Schutzgruppe” auf jene
Gruppen, welche das α-N-terminale
Ende einer Aminosäure
oder eines Peptids schützen
sollen oder anders die Aminogruppe einer Aminosäure oder eines Peptids gegen
unerwünschte
Reaktionen während
des Syntheseverfahrens schützen
soll. Üblicherweise
verwendete N-Schutzgruppen sind in Greene, ”Protective Groups In Organic
Synthesis” (John
Wiley & Sons,
New York (1981)) offenbart, was hier unter Bezugnahme darauf einverleibt
ist. Darüber
hinaus können
Schutzgruppen als Pro-Arzneimittel
verwendet werden, welche in vivo rasch gespalten werden, beispielsweise
durch enzymatische Hydrolyse, um den biologisch wirksamen Grundstoff
freizusetzen. α-N-Schutzgruppen umfassen
Niederalkanoylgruppen, wie Formyl, Acetyl (”Ac”), Propionyl, Pivaloyl, t-Butylacetyl
und dergleichen; weitere Acylgruppen beinhalten 2-Chloracetyl, 2-Bromacetyl,
Trifluoracetyl, Trichloracetyl, Phthalyl, o-Nitrophenoxyacetyl,
-Chlorbutyryl, Benzoyl, 4-Chlorbenzoyl, 4-Brombenzoyl, 4-Nitrobenzoyl und
dergleichen; Sulfonylgruppen, wie Benzolsulfonyl, p-Toluolsulfonyl
und dergleichen; Carbamat bildende Gruppen, wie Benzyloxycarbonyl,
p-Chlorbenzyloxycarbonyl, p-Methoxybenzyloxycarbonyl,
p-Nitrobenzyloxycarbonyl, 2-Nitrobenzyloxycarbonyl, p-Brombenzyloxycarbonyl,
3,4-Dimethoxybenzyloxycarbonyl, 3,5-Dimethoxybenzyloxycarbonyl,
2,4-Dimethoxybenzyloxycarbonyl, 4-Ethoxybenzyloxycarbonyl, 2-Nitro-4,5-dimethoxybenzyloxycarbonyl,
3,4,5-Trimethoxybenzyloxycarbonyl, 1-(p-Biphenylyl)-1-methylethoxycarbonyl, α,α-Dimethyl-3,5-Dimethoxybenzyloxycarbonyl,
Benzhydryloxycarbonyl, t-Butyloxy carbonyl (Boc), Diisopropylmethoxycarbonyl,
Isopropyloxycarbonyl, Ethoxycarbonyl, Methoxycarbonyl, Allyloxycarbonyl,
2,2,2-Trichlorethoxycarbonyl,
Phenoxycarbonyl, 4-Nitrophenoxycarbonyl, Fluorenyl-9-methoxycarbonyl,
Cyclopentyloxycarbonyl, Adamantyloxycarbonyl, Cyclohexyloxycarbonyl,
Phenylthiocarbonyl und dergleichen; Arylalkylgruppen, wie Benzyl,
Triphenylmethyl, Benzyloxymethyl, 9-Fluorenylmethyloxycarbonyl (Fmoc)
und dergleichen, und Silylgruppen, wie Trimethylsilyl und dergleichen.
-
(2) Carboxyl-Schutzgruppen
-
Wie
oben diskutiert worden ist, bezieht sich der Begriff ”Carboxyl-Schutzgruppe” auf eine
Carbonsäure-schützende Ester-
oder Amidgruppe, welche verwendet wird, um die Carbonsäure-Funktionalität zu blockieren
oder zu schützen,
während
die Umsetzungen, welche andere Funktionsstellen der Verbindung involvieren, durchgeführt werden.
Carboxyl-Schutzgruppen sind in Greene, ”Protective Groups in Organic
Synthesis”,
S. 152–186
(1981) offenbart, was hier unter Bezugnahme darauf einverleibt ist.
Darüber
hinaus kann eine Carboxyl-Schutzgruppe als Pro-Arzneimittel verwendet werden, wobei
die Carboxyl-Schutzgruppe in vivo rasch abgespalten werden kann,
beispielsweise durch enzymatische Hydrolyse, um den biologisch wirksamen
Grundstoff freizusetzen. Solche Carboxyl-Schutzgruppen sind dem
Fachmann gut bekannt und wurden zum Schutz von Carboxylgruppen im
Penicillin- und Cephalosporin-Bereich extensiv benutzt, wie in den
US-PSen 3,840,556 und
3,719,667 beschrieben ist,
deren Offenbarung hier unter Bezugnahme darauf einverleibt ist. Repräsentative
Carboxyl-Schutzgruppen sind C
1-C
8-Niederalkylgruppen (z. B. Methyl, Ethyl
oder t-Butyl und dergleichen); Arylalkylgruppen, wie Phenethyl oder
Benzyl und substituierte Derivate davon, wie Alkoxybenzyl oder Nitrobenzylgruppen
und dergleichen; Arylalkenylgruppen, wie Phenylethenyl und dergleichen;
Arylgruppen und substituierte Derivate davon, wie 5-Indanyl und
dergleichen; Dialkylaminoalkylgruppen, wie Dimethylaminoethyl und
dergleichen; Alkanoyloxyalkylgruppen, wie Acetoxymethyl, Butyryloxymethyl,
Valeryloxymethyl, Isobutyryloxymethyl, Isovaleryloxy methyl, 1-(Propionyloxy)-1-ethyl,
1-(Pivaloyloxyl)-1-ethyl, 1-Methyl-1-(propionyloxy)-1-ethyl,
Pivaloyloxymethyl, Propionyloxymethyl und dergleichen; Cycloalkanoyloxyalkylgruppen,
wie Cyclopropylcarbonyloxymethyl, Cyclobutylcarbonyloxymethyl, Cyclopentylcarbonyloxymethyl, Cyclohexylcarbonyloxymethyl
und dergleichen; Aroyloxyalkylgruppen, wie Benzoyloxymethyl, Benzoyloxyethyl
und dergleichen; Arylalkylcarbonyloxyalkylgruppen, wie Benzylcarbonyloxymethyl,
2-Benzylcarbonyloxyethyl und dergleichen; Alkoxycarbonylalkyl- oder
Cycloalkyloxycarbonylalkylgruppen, wie Methoxycarbonylmethyl, Cyclohexyloxycarbonylmethyl,
1-Methoxycarbonyl-1-ethyl
und dergleichen; Alkoxycarbonyloxyalkyl- oder Cycloalkyloxycarbonyloxyalkylgruppen,
wie Methoxycarbonyloxymethyl, t-Butyloxycarbonyloxymethyl, 1-Ethoxycarbonyloxy-1-ethyl,
1-Cyclohexyloxycarbonyloxy-1-ethyl und dergleichen; Aryloxycarbonyloxyalkylgruppen,
wie 2-(Phenoxycarbonyloxy)ethyl,
2-(5-Indanyloxycarbonyloxy)ethyl und dergleichen; Alkoxyalkylcarbonyloxyalkylgruppen,
wie 2-(1-Methoxy-2-methylpropan-2-oyloxy)ethyl
und dergleichen; Arylalkyloxycarbonyloxyalkylgruppen, wie 2-(Benzyloxycarbonyloxy)ethyl
und dergleichen; Arylalkenyloxycarbonyloxyalkylgruppen, wie 2-(3-Phenylpropen-2-yloxycarbonyloxy)ethyl
und dergleichen; Alkoxycarbonylaminoalkylgruppen, wie t-Butyloxycarbonylaminomethyl
und dergleichen; Alkylaminocarbonylaminoalkylgruppen, wie Methylaminocarbonylaminomethyl
und dergleichen; Alkanoylaminoalkylgruppen, wie Acetylaminomethyl
und dergleichen; heterocyclische Carbonyloxyalkylgruppen, wie 4-Methylpiperazinylcarbonyloxymethyl
und dergleichen; Dialkylaminocarbonylalkylgruppen, wie Dimethylaminocarbonylmethyl,
Diethylaminocarbonylmethyl und dergleichen; (5-(Niederalkyl)-2-oxo-1,3-dioxolen-4-yl)alkylgruppen,
wie (5-t-Butyl-2-oxo-1,3-dioxolen-4-yl)methyl und
dergleichen und (5-Phenyl-2-oxo-1,3-dioxolen-4-yl)alkylgruppen, wie (5-Phenyl-2-oxo-1,3-dioxolen-4-yl)methyl und dergleichen.
-
Repräsentative
Amid-Carboxyl-Schutzgruppen sind Aminocarbonyl- und Niederalkylaminocarbonylgruppen.
-
Bevorzugte
Carboxyl-geschützte
Verbindungen der vorliegenden Erfindung sind Verbindungen, worin die
geschützte
Carboxylgruppe ein Niederalkyl-, Cycloalkyl- oder Arylalkylester
ist, beispielsweise Methylester, Ethylester, Propylester, Isopropylester,
Butylester, sec-Butylester, Isobutylester, Amylester, Isoamylester,
Octylester, Cyclohexylester, Phenylethylester und dergleichen oder
ein Alkanoyloxyalkyl-, Cycloalkanoyloxyalkyl-, Aroyloxyalkyl- oder
ein Arylalkylcarbonyloxyalkylester. Bevorzugte Amid-Carboxyl-Schutzgruppen
sind Niederalkyl-Alkylaminocarbonylgruppen. Beispielsweise kann
Asparginsäure
am α-C-terminalen Ende durch eine
säurelabile
Gruppe (z. B. t-Butyl) geschützt
werden und am β-C-terminalen
Ende durch eine hydrierungslabile Gruppe (z. b. Benzyl) und dann
während
der Synthese selektiv entschützt
werden.
-
B. Peptidmodifikation
-
Die
Art und Weise zur Herstellung der erfindungsgemäß verwendeten modifizierten
Peptide wird in weitem Rahmen variieren, abhängig von der Natur der verschiedenen
Elemente, welche das Peptid umfassen. Das synthetische Verfahren
wird dahingehend ausgewählt
werden, dass es einfach ist, hohe Ausbeuten liefert und ein hochgereinigtes
stabiles Produkt ermöglicht.
Normalerweise wird die chemisch reaktive Gruppe in der letzten Stufe
der Synthese erzeugt werden, beispielsweise mit einer Carboxylgruppe
die Veresterung, unter Ausbildung eines aktiven Esters. Spezielle
Verfahren zur Erzeugung der modifizierten Peptide der vorliegenden
Erfindung werden unten beschrieben werden.
-
Insbesondere
wird das ausgewählte
Peptid zunächst
auf antivirale Aktivität
untersucht und dann mit der Linker- bzw. Bindungsgruppe entweder
nur am N-terminalen oder C-terminalen Ende oder innerhalb des Peptides
modifiziert. Dann wird die antivirale Aktivität dieser modifizierten Peptid-Linkergruppe
untersucht. Ist die antivirale Aktivität nicht dramatisch reduziert
(d. h. um weniger als das 10-fache reduziert), wird die Stabilität der modifizierten
Peptid-Linkergruppe durch ihre in vivo-Lebenszeit gemessen. Ist
die Stabilität
nicht auf ein gewünschtes
Maß verbessert,
wird das Peptid an einer alternativen Stelle modifiziert und das
Verfahren wird wiederholt, bis ein gewünschtes Maß an antiviraler Aktivität und Stabilität erreicht
ist.
-
Insbesondere
wird jedes Peptid, das zur Modifikation mit einem Linker und einer
reaktiven Wirkungsgruppe ausgewählt
wird, gemäß den folgenden
Kriterien modifiziert: Ist eine endständige Carboxylgruppe am Peptid
verfügbar,
welche nicht kritisch für
die Retention antiviraler Aktivität ist, und ist keine weitere
empfindliche funktionelle Gruppe am Peptid vorhanden, dann wird
die Carbonsäure
als Anbindungspunkt für
die Linker-reaktive Gruppenmodifikation ausgewählt. Ist die endständige Carboxylgruppe
in eine antivirale Aktivität verwickelt
oder sind keine Carbonsäuregruppen
vorhanden, dann wird jede andere empfindliche funktionelle Gruppe,
welche nicht kritisch für
die Retention antiviraler Aktivität ist, als Anbindungspunkt
für die
Modifikation der Linker-reaktiven Einheit ausgewählt. Sind verschiedene empfindliche
funktionelle Gruppen am Peptid verfügbar, wird eine Kombination
von Schutzgruppen in der Art und Weise verwendet werden, dass nach
Zugabe der Linker/Reaktiv-Einheit
und nach Entschützen
aller geschützten
empfindlichen funktionellen Gruppen eine Retention von antiviraler
Aktivität
erhalten wird. Ist keine empfindliche funktionelle Gruppe am Peptid
verfügbar oder
ist ein einfacherer Modifikationsweg erwünscht, werden es synthetische
Bemühungen
erlauben, eine Modifikation des ursprünglichen Peptids in der Weise
zu ermöglichen,
dass eine Retention antiviraler Aktivität aufrechterhalten bleibt.
In diesem Fall wird die Modifikation am gegenüber liegenden Ende des Peptides
auftreten.
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Ein
Maleimid-Derivat kann ebenfalls aus einem Peptid synthetisiert werden,
das eine freie Aminogruppe und eine freie Carbonsäure enthält. Um ein
Maleimid-Derivat aus einem Aminoderivatisierten Molekül zu erzeugen,
kann man N[γ-Maleimidbutyryloxy]succinimidester
(GMBS) und Triethylamin in DMF ver wenden. Der Succinimidester wird
mit der freien Aminogruppe reagieren und das Maleimid-Derivat wird
aus dem Reaktionsgemisch durch Kristallisieren oder durch Chromatographie
an Silica oder durch HPLC gereinigt.
-
Letztendlich
kann ein Maleimid-Derivat aus einem Peptid synthetisiert werden,
das mehrere weitere empfindliche funktionelle Gruppen und keine
freie Carbonsäure
enthält.
Enthält
das ausgewählte
Molekül
keine Carbonsäure,
kann eine Reihe bifunktioneller Vernetzungsreagenzien verwendet
werden, um das Molekül in
ein reaktives NHS-Derivat umzuwandeln. Beispielsweise kann Maleimidpropionsäure (MPA)
an das freie Amin gekuppelt werden, um ein Maleimid-Derivat durch
Umsetzung des freien Amins mit der Carboxylgruppe von MPA unter
Verwendung von HBTU/HOBt/DIEA-Aktivierung
in DMF zu erzeugen.
-
Erforderlichenfalls
können
viele weitere kommerziell verfügbare
heterobifunktionelle Vernetzungsmittel alternativ dazu verwendet
werden. Eine große
Anzahl bifunktioneller Verbindungen sind zur Anbindung an Einheiten
verfügbar.
Beispielhafte Reagenzien umfassen: Azidobenzoylhydrazid, N-[4-(p-Azidosalicylamino)butyl]-3'-[2'-pyridyldithio)propionamid),
Bis-sulfosuccinimidylsuberat, Dimethyladipimidat, Disuccinimidyltartrat,
N-γ-Maleirnidbutyryloxysuccinimidester,
N-Hydroxysulfosuccinimidyl-4-azidobenzoat, N-Succinimidyl-[4-azidophenyl]-1,3'-dithiopropionat, N-Succinimidyl-[4-iodacetyl]aminobenzoat,
Glutaraldehyd und Succinimidyl-4-[N-maleimidmethyl]cyclohexan-1-carboxylat.
-
6. Verwendungen von modifizierten
antiviralen Peptiden
-
Modifizierte
antivirale Peptide der Erfindung können als therapeutisches Mittel
zur Behandlung von Patienten verwendet werden, welche an Virusinfektionen
leiden, und können
den Patienten gemäß unten
beschriebenen Verfahren und weiteren im Stand der Technik bekannten
Verfahren verabreicht werden. Wirksame therapeutische Dosen der
modifizierten Peptide werden durch dem Fachmann gut bekannte Verfahren
bestimmt werden und es werden auch Belange hinsichtlich potentieller
Toxizität
des Peptides in Betracht ziehen.
-
Die
modifizierten Peptide können
auch prophylaktisch an nicht-infizierte
Individuen verabreicht werden. Das kann vorteilhaft in den Fällen sein,
in denen ein Individuum einem hohen Risiko unterworfen war, einem
Virus ausgesetzt zu sein, wie es auftreten kann, wenn ein Individuum
in Kontakt mit einem infizierten Individuum war, bei dem ein hohes
Risiko der Virusübertragung
besteht. Das kann insbesondere von Vorteil in solchen Fällen sein,
wo eine Heilung des Virusbefalls bekannt ist, wie durch den HIV-Virus.
Beispielsweise würde
eine prophylaktische Verabreichung eines modifizierten Anti-HIV-Peptides
in einer Situation vorteilhaft sein, in welcher eine gesunde Pflegeperson
dem Blut eines HIV-infizierten Individuums ausgesetzt wurde oder in
Situationen, in denen ein Individuum, das in Hochrisiko-Aktivitäten verwickelt
ist, welche dieses Individuum potentiell dem HIV-Virus aussetzen.
-
7. Verabreichung modifizierter
antiviraler und antifusogener Peptide
-
Im
Allgemeinen werden die modifizierten Peptide in einem physiologisch
annehmbaren Medium verabreicht werden, zum Beispiel entionisiertem
Wasser, Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS), Salzlösung, wässrigem
Ethanol oder anderem Alkohol, Plasma, Eiweißlösungen, Mannitol, wässrige Glucose,
Alkohol, Pflanzenöl
oder dergleichen. Weitere Additive, welche enthalten sein können, umfassen
Puffer, wobei die Medien im Allgemeinen auf einen pH-Wert im Bereich
von etwa 5 bis 10 gepuffert werden, und der Puffer im Allgemeinen
in Konzentrationsbereichen von etwa 50 bis 250 mM Salz vorliegt,
wobei die Konzentration von Salz im Allgemeinen von etwa 5 bis 500
mM reichen wird, physiologisch annehmbare Stabilisatoren und dergleichen.
Die Zusammensetzungen können
für eine
geeignete Lagerung und einen geeigneten Transport lyophilisiert
werden.
-
Die
in Rede stehenden modifizierten Peptide werden hauptsächlich parenteral
verabreicht werden, wie intravenös
(IV), intraarteriell (IA), intramuskulär (IM), subkutan (SC) oder
dergleichen. Die Verabreichung kann unter geeigneten Situationen
durch eine Transfusion erfolgen. In einigen Fällen, in denen eine Reaktion
der funktionellen Gruppe relativ langsam ist, kann die Verabreichung
oral, nasal, rektal, transdermal oder als Aerosol erfolgen, wenn
die Natur des Konjugats die Übertragung
in das Gefäßsystem
gestattet. Gewöhnlich
wird eine einzelne Injektion verwendet werden, obwohl mehr als eine
Injektion gegebenenfalls verwendet werden kann. Die modifizierten
Peptide können
durch alle geeigneten Mittel, einschließlich Spritze, Trokar, Katheter, oder
dergleichen verabreicht werden.
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Die
besondere Art und Weise der Verabreichung wird abhängig von
der zu verabreichenden Menge variieren, entweder als einzelner Bolus
oder als kontinuierliche Verabreichung, oder dergleichen. Vorzugsweise
wird die Verabreichung intravaskulär erfolgen, wobei die Stelle
der Einführung
für die
Erfindung nicht kritisch ist, vorzugsweise an einer Stelle, wo ein
rascher Blutstrom vorliegt, zum Beispiel intravenös, in die
Peripher- oder Zentralvene. Weitere Wege können Verwendung finden, wo
die Verabreichung mit langsamen Freisetzungstechniken oder einer
Schutzmatrix verbunden ist. Es ist die Absicht, dass das modifizierte
Peptid im Blut wirksam verteilt wird, um in der Lage zu sein, mit
den Blutkomponenten zu reagieren. Die Konzentration des Konjugates
wird in weitem Bereich variieren, im Allgemeinen von etwa 1 pg/ml
bis 50 mg/ml reichen. Die Gesamtverabreichung wird intravaskulär im Allgemeinen
im Bereich von etwa 0,1 mg/ml bis etwa 10 mg/ml, gewöhnlicher
etwa 1 mg/ml bis etwa 5 mg/ml liegen.
-
Durch
Bindung an langlebige Komponenten des Blutes, Serumalbumin, wird
sich eine Anzahl von Vorteilen ergeben. Die Wirksamkeit des Peptides
ist für
Tage bis Wochen verlängert.
Nur eine Verabreichung muss während
dieser Zeitdauer erfolgen. Es kann eine größere Spezifität erreicht
werden, da die wirksame Verbindung hauptsächlich an große Moleküle gebunden
werden wird, wobei es weniger wahrscheinlich ist, intrazellulär aufgenommen
zu werden, um mit anderen physiologischen Prozessen zu interferieren.
-
8. Überwachung
der Anwesenheit modifizierter Peptide
-
Das
Blut des Säugetierwirts
kann auf die Anwesenheit der modifizierten Peptidverbindung ein-
oder mehrmals überwacht
werden. Durch Abnahme eines Teils oder einer Probe des Blutes des
Wirtes kann man bestimmen, ob das Peptid an die langlebigen Blutkomponenten
in ausreichender Menge gebunden worden ist, um therapeutisch wirksam
zu sein, und danach die Menge der Peptidverbindung im Blut. Falls
erforderlich kann man bestimmen, an welche der Blutkomponenten das
Peptid gebunden ist. Das ist besonders wichtig, wenn nicht-spezifische
modifizierte Peptide verwendet werden. Für spezifische Maleimid-modifizierte
Peptide ist es viel einfacher, die Halbwertszeit von Serumalbumin
und IgG zu berechnen.
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A. Immunoassays
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Es
werden Verfahren zur Bestimmung der Konzentration der antiviralen
Peptide und/oder Analoga oder ihrer Derivate und Konjugate in biologischen
Proben (wie Blut), unter Verwendung von Antikörpern, welche für die Peptide,
Peptidanaloga und ihre Derivate und Konjugate spezifisch sind und
die Verwendung solcher Antikörper
zur Behandlung von Toxizität,
welche potentiell mit solchen Peptiden, Analoga und/oder ihren Derivaten
oder Konjugaten verbunden ist, beschrieben. Das ist vorteilhaft,
weil die erhöhte
Stabilität
und Lebensdauer der Peptide in vivo im Patienten zu neuen Problemen
während
der Behandlung führen
könnte,
einschließlich
einer erhöhten
Wahrscheinlichkeit für
Toxizität.
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Die
Verwendung von Anti-Wirkstoffantikörpern, entweder monoklonale
oder polyklonale, mit einer Spezifität für ein besonderes Peptid, Peptidanalog
oder Derivat davon, kann die Übertragung
solcher Probleme unterstützen.
Der Antikörper
kann von einem mit dem besonderen Peptid, Analog oder Derivat davon
oder mit einem immunogenen Fragment des Mittels oder einem synthetisierten
Immunogen, entsprechend einer antigenen Determinante des Mittels
immunisierten Wirt erzeugt oder abgeleitet werden. Bevorzugte Antikörper werden
eine hohe Spezifität
und Affinität
für native,
modifizierte und konjugierte Formen des Peptids, Peptidanalogs oder
Derivats besitzen. Solche Antikörper
können
auch mit Enzymen, Fluorochromen oder Radiomarkern indiziert sein.
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Für modifizierte
Peptide spezifische Antikörper
können
unter Verwendung gereinigter Peptide für die Induzierung Peptidspezifischer
Antikörper
erzeugt werden. Durch Induzierung von Antikörpern wird nicht nur die Stimulierung
einer Immunantwort durch Injektion in Tiere beabsichtigt, sondern
analoge Schritte in der Herstellung synthetischer Antikörper oder
anderer spezifischer Bindungsmoleküle, wie das Screenen von rekombinanten
Immunoglobulin-Bibliotheken. Sowohl monoklonale als auch polyklonale
Antikörper
können
durch im Stand der Technik bekannte Verfahren erzeugt werden.
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Die
Antipeptidantikörper
können
zur Behandlung von Toxizität
verwendet werden, die durch Verabreichung des modifizierten Peptids,
Analogs oder Derivats davon induziert wird, und können ex
vivo oder in vivo verwendet werden. Ex vivo Verfahren würden eine
Immundialysebehandlung auf Toxizität umfassen, unter Verwendung
von Antiwirkstoffantikörpern,
die an Feststoffträger
gebunden sind. In vivo Verfahren umfassen eine Verabreichung von
Antiwirkstoffantikörpern
in Mengen, welche wirksam sind, um eine Nullstellung (Clearance)
von Antikörper-Wirkstoff-Komplexen zu induzieren.
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Die
Antikörper
können
zur Entfernung der modifizierten Peptide, Analoga oder Derivate
davon und Konjugaten davon aus dem Blut eines Patienten ex vivo
durch Kontaktieren des Blutes mit den Antikörpern unter sterilen Bedingungen
entfernt werden. Beispielsweise können die Antikörper an
einer Säulenmatrix
gebunden oder anders immobilisiert werden und das Patientenblut
kann dem Patienten abgenommen werden und über die Matrix laufengelassen
werden. Das modifizierte Peptid, Peptidanaloga, Derivate und Konjugate werden
an die Antikörper
binden und das Blut, das eine niedrige Konzentration an Peptid,
Analog, Derivat oder Konjugat enthält, kann in den Blutkreislauf
des Patienten zurückgeführt werden.
Die Menge an entfernter Peptidverbindung kann durch Einstellung
des Druckes und der Fließrate
kontrolliert bzw. gesteuert werden.
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Eine
empfohlene bzw. vorzuziehende Entfernung von Peptiden, Analoga,
Derivaten und Konjugaten aus der Plasmakomponente eines Patientenblutes
kann beispielsweise durch Verwendung einer halbdurchlässigen Membran
bewirkt werden oder durch zunächst
Abtrennen der Plasmakomponente von der Zellkomponente auf im Stand
der Technik bekanntem Wege, um die Plasmakomponente über eine
Matrix zu leiten, welche Anti-Wirkstoffantikörper enthält. Alternativ dazu kann die
bevorzugte Entfernung von Peptidkonjugierten Blutzellen, einschließlich roten
Blutzellen, durch Sammeln und Konzentrieren der Blutzellen im Patientenblut
und Kontaktieren dieser Zellen mit Anti-Wirkstoffantikörpern bewirkt
werden bis zum Ausschluss der Serumkomponente des Blutes des Patienten.
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Die
Antiwirkstoffantikörper
können
in vivo, parenteral, an einen Patienten verabreicht werden, der
das Peptid, Analoga, Derivate oder Konjugate zur Behandlung erhalten
hat. Die Antikörper
werden an Peptidverbindungen und -konjugate binden. Sobald die Bindung
stattgefunden hat, wird die Peptidaktivität behindert, wenn nicht vollständig blockiert,
wodurch die biologisch wirksame Konzentration der Peptidverbindung
im Patientenblutstrom reduziert wird und schädliche Nebenwirkungen minimiert
werden. Darüber
hinaus wird der gebundene Antikörper-Peptid-Komplex die Clearance
der Peptidverbindungen und -konjugate aus dem Patientenblutstrom
erleichtern.
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Während die
vorliegende Erfindung vollständig
beschrieben wurde, kann sie weiter aufgewertet und unter Bezugnahme
auf die folgenden nicht-beschränkenden
Beispiele verstanden werden.
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BEISPIEL 1
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Herstellung eines modifizierten DP178 – Synthese
von YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWFK(MPA)-NH2
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In
diesem Beispiel wird DP178 (SEQ ID NR 1) gemäß dem folgenden Syntheseschema
synthetisiert und modifiziert, um einen Linker und eine Maleimidgruppe
zu enthalten. Wie in den
US-PSen
6,013,236 und
6,020,459 berichtet
wurde, ist DP 178 ein potenter Inhibitor von HIV-1 und inhibiert
sowohl Zell-induzierte Syncytia-Bildung zwischen HIV-1 infizierten
und nicht-infizierten
Zellen und eine Infektion nicht-infizierter Zellen durch zellfreien
HIV-1-Virus.
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Eine
Festphasen-Peptidsynthese des modifizierten Peptids wird in einem
100 μmol-Maßstab unter Verwendung
einer manuellen Festphasen-Synthese, eines Symphony Peptide Synthesizers
und von Fmoc-geschütztem
Rinkamid-MBHA durchgeführt.
Die folgenden geschützten
Aminosäuren
werden nacheinander dem Harz zugefügt: Fmoc-Lys(Aloc)-OH, Fmoc-Phe-OH,
Fmoc-Trp(Boc)-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Trp(Boc)-OH,
Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Trp(Boc)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH,
Fmoc-Asp(tBu)-OH,
Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH,
Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Met-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH,
Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH,
Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH; Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH,
Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Ser(tBu)OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH,
Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-His(Boc)-OH, Fmoc-Ile-OH,
Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Tyr(tBu)-OH. Sie werden in
N,N-Dimethylformamid (DMF) gelöst
und gemäß der Sequenz
unter Verwendung von O-Benztriazol-1-yl-N,N,N',N'-tetramethyluroniumhexafluorophosphat
(HBTU) und Diisopropyl ethylamin (DIEA) aktiviert. Die Entfernung
der Fmoc-Schutzgruppe
wird unter Verwendung einer Lösung
von 20% (V/V) Piperidin in N,N-Dimethylformamid (DMF) für 20 Minuten
(Stufe 1) erreicht. Am Ende der Synthese wird das selektive Entschützen der
Lys(Aloc)-Gruppe manuell durchgeführt und durch Behandlung des
Harzes mit einer Lösung
von 3 Äqu.
Pd(PPh3)4, aufgelöst in 5
ml CHCl3:NMM:HOAc (18:1:0,5), für 2 Stunden
(Stufe 2) erreicht. Das Harz wird dann mit CHCl3 (6 × 5 ml),
20% HOAc in DCM (6 × 5
ml), DCM (6 × 5
ml) und DMF (6 × 5
ml) gewaschen. Die Synthese wird dann für die Zugabe der 3-Maleimidpropionsäure (Stufe
3) re-automatisiert. Zwischen jeder Kupplung wird das Harz dreimal
mit N,N-Dimethylformamid (DMF) und dreimal mit Isopropanol gewaschen. Das
Peptid wird vom Harz unter Verwendung von 85% TFA/5% TIS/5% Thioanisol
und 5% Phenol abgespalten, mit trockeneiskaltem Et2O
(Stufe 4) ausgefällt.
Das Produkt wird durch präparative
Umkehrphasen-HPLC, unter Verwendung eines Varian(Rainin) präparativen,
binären
HPLC-Systems gereinigt: Gradienteneluierung von 30–55% B (0,045%
TFA in H2O (A) und 0,045% TFA in CH3CN (B)) über
180 Minuten bei 9,5 ml/min unter Verwendung einer Phenomenex Luna-Säule (10 μ Phenyl-Hexyl,
21 mm × 25
cm) und eines UV-Detektors (Varian Dynamax UVD II) bei λ214 und 254
nm, um das gewünschte
modifizierte Peptid (d. h. DAC) in einer Reinheit von > 95%, bestimmt durch
RP-HPLC, zu ergeben.
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BEISPIEL 2
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Herstellung eines modifizierten DP107 – Synthese
von NNLLRAIEAQQHLLQLTVWQIKQLQARILAVERYLKDQK(MPA)-NH2
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In
diesem Beispiel wird DP107 (SEQ ID NR 2) gemäß dem folgenden Syntheseschema
synthetisiert und modifiziert, um einen Linker und eine Maleimidgruppe
zu enthalten. Wie in den
US-PSen
6,013,236 und
6,020,459 berichtet
wurde, zeigt DP107 eine potente antivirale Aktivität gegen
HIV.
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Die
Festphasen-Peptidsynthese des modifizierten Peptids in einem 100 μmol-Maßstab wird
unter Verwendung einer manuellen Festphasen-Synthese, eines Symphony
Peptide Synthesizers und von Fmoc-geschütztem Rinkamid-MBHA durchgeführt. Die
folgenden geschützten
Aminosäuren
werden nacheinander dem Harz zugefügt: Fmoc-Lys(Aloc)-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH,
Fmoc-Asp(tBu)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Leu-OH,
Fmoc-Tyr(tBu)-OH, Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Val-OH,
Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Ile-OH,
Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH,
Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Trp(Boc)-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH,
Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-His(Boc)-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH,
Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Arg(Pbf)-OH,
Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH. Sie
werden in N,N-Dimethylformamid (DMF) gelöst und gemäß der Sequenz unter Verwendung
von O-Benztriazol-1-yl-N,N,N',N'-tetramethyluroniumhexafluorophosphat
(HBTU) und Diisopropylethylamin (DIEA) aktiviert. Die Entfernung
der Fmoc-Schutzgruppe
wird unter Verwendung einer Lösung
von 20% (V/V) Piperidin in N,N-Dimethylformamid (DMF) für 20 Minuten
(Stufe 1) erreicht. Am Ende der Synthese wird die selektive Entschützung der
Lys(Aloc)-Gruppe manuell durchgeführt und durch Behandlung des
Harzes mit einer Lösung von
3 Äqu.
Pd(PPh3)4, gelöst in 5
ml CHCl3:NMM:HOAc (18:1:0,5), für 2 Stunden
(Stufe 2) erreicht. Das Harz wird dann mit CHCl3 (6 × 5 ml),
20% HOAc in DCM (6 × 5
ml), DCM (6 × 5
ml) und DMF (6 × 5
ml) gewaschen. Die Synthese wird dann zur Zugabe von 3-Maleimidpropionsäure (Stufe
3) re-automatisiert. Zwischen jeder Kupplung wird das Harz dreimal
mit N,N-Dimethylformamid (DMF) und dreimal mit Isopropanol gewaschen. Das
Peptid wird vom Harz unter Verwendung von 85% TFA/5% TIS/5% Thioanisol
und 5% Phenol abgespalten und danach mit trockeneiskaltem Et2O (Stufe 4) ausgefällt. Das Produkt wird durch
präparative
Umkehrphasen-HPLC, unter Verwendung eines Varian(Rainin) präparativen,
binären
HPLC-Systems gereinigt: Gradienteneluierung von 30–55% B (0,045%
TFA in H2O (A) und 0,045% TFA in CH3CN (B)) über
180 Minuten bei 9,5 ml/min unter Verwendung einer Phenomenex Luna-Säule (10 μ Phenyl-Hexyl, 21 mm × 25 cm)
und eines UV-Detektors (Varian Dynamax UVD II) bei λ214 und 254
nm, um das gewünschte
modifizierte Peptid (d. h. DAC) in einer Reinheit von > 95%, wie durch RP-HPLC
bestimmt, zu erhalten.
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BEISPIEL 3
-
Herstellung eines modifizierten Anti-RSV-Peptids
(C-terminal)
-
In
diesem Beispiel wird
VITIELSNIKENKCNGAKVKLIKQELDKYKNAV (SEQ
ID NR 16) gemäß dem un ten
dargestellten Syntheseschema modifiziert, um einen Linker und eine
Maleimidgruppe zu enthalten. Wie in den
US-PSen 6,013,236 und
6,020,459 berichtet wurde, inhibiert
die native Sequenz (SEQ ID NR) virale Infektionen von Atmungssyncytial-Virus (RSV), einschließlich einer
Inhibierung der Fusion und Syncytia-Bildung zwischen RSV-infizierten und
nicht-infizierten Hep-2-Zellen.
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Die
Festphasen-Peptidsynthese in einem 100 μmol-Maßstab wird unter Verwendung
einer manuellen Festphasen-Synthese, eines Symphony Peptide Synthesizers
und von Fmoc-geschütztem
Rinkamid-MBHA durchgeführt.
Die folgenden geschützten
Aminosäuren
werden nacheinander dem Harz zugefügt: Fmoc-Lys(Aloc)-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Ala-OH,
Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Tyr(tBu)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Asp(tBu)-OH,
Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH,
Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Leu-OH,
Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH,
Fmoc-Cys(Trt)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH,
Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH,
Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Ile-OH,
Fmoc-Val-OH. Sie werden in N,N-Dimethylformamid (DMF) gelöst und gemäß der Sequenz
unter Verwendung von O-Benztriazol-1-yl-N,N,N',N'-tetramethyluroniumhexafluorophosphat
(HBTU) und Diisopropylethylamin (DIEA) aktiviert. Die Entfernung
der Fmoc-Schutzgruppe wird unter Verwendung einer Lösung von
20% (V/V) Piperidin in N,N-Dimethylformamid (DMF) für 20 Minuten
(Stufe 1) erreicht. Die selektive Entschützung der Lys(Aloc)-Gruppe
wird manuell durchgeführt
und durch Behandlung des Harzes mit einer Lösung von 3 Äqu. Pd(PPh3)4, gelöst
in 5 ml CHCl3:NMM:HOAc (18:1:0,5), für 2 Stunden
(Stufe 2) erreicht. Das Harz wird dann mit CHCl3 (6 × 5 ml),
20% HOAc in DCM (6 × 5
ml), DCM (6 × 5
ml) und DMF (6 × 5
ml) gewaschen. Die Synthese wird zur Zugabe der 3-Maleimidpropionsäure (Stufe
3) re-automatisiert.
Zwischen jeder Kupplung wird das Harz dreimal mit N,N-Dimethylformamid
(DMF) und dreimal mit Isopropanol gewaschen. Das Peptid wird vom
Harz unter Verwendung von 85% TFA/5% TIS/5% Thioanisol und 5% Phenol
abgespalten und danach mit trockeneiskaltem Et2O
(Stufe 4) ausgefällt.
Das Produkt wird durch präparative
Umkehrphasen-HPLC, unter Verwendung eines Varian(Rainin) präparativen,
binären
HPLC-Systems gereinigt: Gradienteneluierung von 30–55% B (0,045%
TFA in H2O (A) und 0,045% TFA in CH3CN (B)) über
180 Minuten bei 9,5 ml/min unter Verwendung einer Phenomenex Luna-Säule (10 μ Phenyl-Hexyl,
21 mm × 25
cm) und eines UV-Detektors (Varian Dynamax UVD II) bei λ214 und 254
nm, um das gewünschte
modifizierte Peptid (d. h. DAC) in einer Reinheit von > 95%, wie durch RP-HPLC bestimmt, zu
erhalten.
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BEISPIEL 4
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Herstellung eines modifizierten Anti-RSV-Peptids
(T-N-terminal)
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In
diesem Beispiel wurde das Peptid VITIELSNIKENKCNGAKVKLIKQELDKYKNAV
(SEQ ID NR 17), das dem Peptid der SEQ ID NR 16 entspricht, in dem
jedoch ein Cystein(C)-gegen
den Methionin(M)-Rest substituiert wurde, gemäß dem unten dargestellten Syntheseschema
hergestellt und modifiziert, um einen Linker und eine Maleimidgruppe
zu enthalten. Wie in den
US-PSen
6,013,236 und
6,020,459 berichtet
wurde, inhibiert die native Sequenz (SEQ ID NR 16) eine virale Infektion
von Atmungssyncytial-Virus (RSV), einschließlich einer Inhibierung der
Fusion und Syncytia-Bildung zwischen RSV-infizierten und nicht-infizierten
Hep-2-Zellen.
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Die
Festphasen-Peptidsynthese des modifizierten Peptids in einem 100 μmol-Maßstab wird
unter Verwendung einer manuellen Festphasen-Synthese, eines Symphony
Peptide Synthesizers und von Fmoc-geschütztem Rinkamid-MBHA durchgeführt. Die
folgenden geschützten
Aminosäuren
werden nacheinander dem Harz zugefügt: Fmoc-Val-OH, Fmoc-Ala-OH,
Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Tyr(tBu)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH,
Fmoc-Asp(tBu)-OH, Fmoc-Leu-OH,
Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Leu-OH,
Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Gly-OH,
Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Met-OH,
Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH,
Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Ile-OH,
Fmoc-Thr(tBu)-OH,
Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Val-OH. Sie werden in N,N-Dimethylformamid (DMF)
gelöst
und gemäß der Sequenz
unter Verwendung von O-Benztriazol-1-yl-N,N,N',N'-tetramethyluroniumhexafluorophosphat
(HBTU) und Diisopropylethylamin (DIEA) aktiviert. Die Entfernung
der Fmoc-Schutzgruppe wird unter Verwendung einer Lösung von
20% (V/V) Piperidin in N,N-Dimethylformamid (DMF) für 20 Minuten
(Stufe 1) erreicht. Die Synthese wird dann zur Zugabe der 3-Maleimidpropionsäure (Stufe
3) re-automatisiert. Zwischen jeder Kupplung wird das Harz dreimal
mit N,N-Dimethylformamid (DMF) und dreimal mit Isopropanol gewaschen.
Das Peptid wird vom Harz unter Verwendung von 85% TFA/5% TIS/5%
Thioanisol und 5% Phenol abgespalten und danach mit trockeneiskaltem
Et2O (Stufe 4) ausgefällt. Das Produkt wird durch
präparative
Umkehrphasen-HPLC, unter Verwendung eines Varian(Rainin) präparativen,
binären
HPLC-Systems gereinigt: Gradienteneluierung von 30–55% B (0,045%
TFA in H2O (A) und 0,045% TFA in CH3CN (B)) über
180 Minuten bei 9,5 ml/min unter Verwendung einer Phenomenex Luna-Säule (10 μ Phenyl-Hexyl,
21 mm × 25
cm) und eines UV-Detektors (Varian Dynamax UVD II) bei λ214 und 254
nm gereinigt, um das gewünschte
modifizierte Peptid (d. h. DAC) in einer Reinheit von > 95%, wie durch RP-HPLC
bestimmt, zu erhalten.
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BEISPIEL 5
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Herstellung eines modifizierten Anti-RSV-Peptids
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Bei
diesem Beispiel wird das Peptid SEQ ID NR 14 gemäß dem un ten angegebenen Syntheseschema synthetisiert
und modifiziert, um einen Linker und eine Maleimidgruppe zu enthalten.
Wie in den
US-PSen 6,013,236 und
6,020,459 berichtet wird,
inhibiert SEQ ID NR 14 eine virale Infektion von Atmungssyncytial-Virus
(RSV), einschließlich
einer Inhibierung der Fusion und Syncytia-Bildung zwischen RSV-infizierten
und nicht-infizierten Hep-2-Zellen.
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Die
Festphasen-Peptidsynthese des modifizierten Peptids in einem 100 μmol-Maßstab wird
unter Verwendung einer manuellen Festphasen-Synthese, eines Symphony
Peptide Synthesizers und Fmoc-geschütztem Rink-Amid MBHA durchgeführt. Die
folgenden geschützten
Aminosäuren
werden nacheinander dem Harz zugegeben: Fmoc-Lys(Aloc)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH,
Fmoc-Tyr(tBu)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Asp(tBu)-OH,
Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Ile-OH,
Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Gly-OH,
Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Cys(Trt)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH,
Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Ile-OH,
Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Ile-OH,
Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH,
Fmoc-Tyr(tBu)-OH. Sie werden in N,N-Dimethylformamid (DMF) gelöst und gemäß der Sequenz
unter Verwendung von O-Benztriazol-1-yl-N,N,N',N'-tetramethyluroniumhexafluorophosphat
(HBTU) und Diisopropylethylamin (DIEA) aktiviert. Die Entfernung
der Fmoc-Schutzgruppe wird unter Verwendung einer Lösung von
20% (V/V) Piperidin in N,N-Dimethylformamid (DMF) für 20 Minuten
(Stufe 1) erreicht. Die selektive Entschützung der Lys(Aloc)-Gruppe
wird manuell durchgeführt
und durch Behandlung des Harzes mit einer Lösung von 3 Äqu. Pd(PPh3)4, gelöst
in 5 ml CHCl3:NMM:HOAc (18:1:0,5), für 2 Stunden
(Stufe 2) erreicht. Das Harz wird dann mit CHCl3 (6 × 5 ml),
20% HOAc in DCM (6 × 5
ml), DCM (6 × 5
ml) und DMF (6 × 5
ml) gewaschen. Die Synthese wird dann zur Zugabe der 3-Maleimidpropionsäure (Stufe 3)
re-automatisiert. Zwischen jeder Kupplung wird das Harz dreimal
mit N,N-Dimethylformamid
(DMF) und dreimal mit Isopropanol gewaschen.
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Das
Peptid wird vom Harz unter Verwendung von 85% TFA/5% TIS/5% Thioanisol
und 5% Phenol abgespalten und nachfolgend durch trockeneiskaltes
Et2O (Stufe 4) ausgefällt. Das Produkt wird durch
präparative
Umkehrphasen-HPLC, unter Verwendung eines Varian(Rainin) präparativen,
binären
HPLC-Systems gereinigt: Gradienteneluierung von 30–55% B (0,045%
TFA in H2O (A) und 0,045% TFA in CH3CN (B)) über
180 Minuten bei 9,5 ml/min unter Verwendung einer Phenomenex Luna-Säule (10 μ Phenyl-Hexyl,
21 mm × 25
cm) und eines UV-Detektors (Varian Dynamax UVD II) bei 214 und 254
nm, um das gewünschte
modifizierte Peptid (d. h. DAC) in einer Reinheit von > 95%, wie durch RP-HPLC bestimmt, zu
erhalten.
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BEISPIEL 6 (T-143)
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Herstellung eines modifizierten Anti-RSV-Peptids
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In
diesem Beispiel wird das Peptid SEQ ID NR 15 gemäß dem unten angegebenen Syntheseschema synthetisiert
und modifiziert, um einen Linker und eine Maleimidgruppe zu enthalten.
Wie in den
US-PSen 6,013,236 und
6,020,459 berichtet ist,
inhibiert SEQ ID NR 15 eine virale Infektion von Atmungssyncytial-Virus (RSV),
einschließlich
einer Inhibierung der Fusion und Syncytia-Bildung zwischen RSV-infizierten und
nicht-infizierten Hep-2-Zellen.
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Die
Festphasen-Peptidsynthese des modifizierten Peptidanalogs in einem
100 μmol-Maßstab wird
unter Verwendung einer manuellen Festphasen-Synthese, eines Symphony
Peptide Synthesizers und Fmoc-geschütztem Rinkamid-MBHA durchgeführt. Die
folgenden geschützten
Aminosäuren
werden nacheinander dem Harz zugegeben: Fmoc-Lys(Aloc)-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH,
Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Tyr(tBu)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH,
Fmoc-Asp(tBu)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH,
Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Leu-OH,
Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH,
Fmoc-Cys(Trt)-OH,
Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Ile-OH,
Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH,
Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH,
Fmoc-Thr(tBu)-OH. Sie werden in N,N-Dimethylformamid (DMF) gelöst und gemäß der Sequenz
unter Verwendung von O-Benztriazol-1-yl-N,N,N',N'-tetramethyluroniumhexafluorophosphat
(HBTU) und Diisopropylethylamin (DIEA) aktiviert. Die Entfernung
der Fmoc-Schutzgruppe wird unter Verwendung einer Lösung von
20% (V/V) Piperidin in N,N-Dimethylformamid (DMF) für 20 Minuten
(Stufe 1) erreicht. Die selektive Entschützung der Lys(Aloc)-Gruppe
wird manuell durchgeführt
und durch Behandlung des Harzes mit einer Lösung von 3 Äqu. Pd(PPh3)4, gelöst
in 5 ml CHCl3:NMM:HOAc (18:1:0,5), für 2 Stunden (Stufe
2) erreicht. Das Harz wird dann mit CHCl3 (6 × 5 ml),
20% HOAc in DCM (6 × 5
ml), DCM (6 × 5
ml) und DMF (6 × 5
ml) gewaschen. Die Synthese wird dann zur Zugabe der 3-Maleimidpropionsäure (Stufe
3) re-automatisiert. Zwischen jeder Kupplung wird das Harz dreimal
mit N,N-Dimethylformamid
(DMF) und dreimal mit Isopropanol gewaschen.
-
Das
Peptid wird vom Harz unter Verwendung von 85% TFA/5% TIS/5% Thioanisol
und 5% Phenol abgespalten und nachfolgend durch trockeneiskaltes
Et2O (Stufe 4) ausgefällt. Das Produkt wird durch
präparative
Umkehrphasen-HPLC, unter Verwendung eines Varian(Rainin) präparativen,
binären
HPLC-Systems gereinigt: Gradienteneluierung von 30–55% B (0,045%
TFA in H2O (A) und 0,045% TFA in CH3CN (B)) über
180 Minuten bei 9,5 ml/min unter Verwendung einer Phenomenex Luna-Säule (10 μ Phenyl-Hexyl,
21 mm × 25
cm) und eines UV-Detektors (Varian Dynamax UVD II) bei λ214 und 254
nm, um das gewünschte
modifizierte Peptid (d. h. DAC) in einer Reinheit von > 95%, wie durch RP-HPLC bestimmt, zu
ergeben.
-
-
BEISPIEL 7
-
Herstellung eines modifizierten Anti-RSV-Peptids
(C-terminal)
-
In
diesem Beispiel wird das Peptid SEQ ID NR 17, das SEQ ID NR 16 entspricht,
worin ein Cystein (C) gegen Methionin (M) substituiert ist, gemäß dem unten
angegebenen Syntheseschema synthetisiert und modifiziert, um einen
Linker und eine Maleimidgruppe zu enthalten. Wie in den
US-PSen 6,013,236 und
6,020,459 berichtet ist,
inhibiert die native Sequenz SEQ ID NR 16 die virale Infektion von
Atmungssyncytial-Virus (RSV), einschließlich einer Inhibierung der
Fusion und Syncytia-Bildung zwischen RSV-infizierten und nicht-infizierten Hep-2-Zellen.
-
Die
Festphasen-Peptidsynthese des modifizierten Peptids in einem 100 μmol-Maßstab wird
unter Verwendung einer manuellen Festphasen-Synthese, eines Symphony
Peptide Synthesizers und Fmoc-geschütztem Rinkamid-MBHA durchgeführt. Die
folgenden geschützten
Aminosäuren
werden nacheinander dem Harz zugegeben: Fmoc-Lys(Aloc)-OH, Fmoc-Val-OH,
Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Tyr(tBu)-OH,
Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Asp(tBu)-OH,
Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH,
Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH,
Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH,
Fmoc-Met-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH,
Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH,
Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH,
Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Val-OH. Sie werden in N,N-Dimethylformamid (DMF)
gelöst
und gemäß der Sequenz
unter Verwendung von O-Benztriazol-1-yl-N,N,N',N'-tetramethyluroniumhexafluorophosphat
(HBTU) und Diisopropylethylamin (DIEA) aktiviert. Die Entfernung
der Fmoc-Schutzgruppe wird unter Verwendung einer Lösung von
20% (V/V) Piperidin in N,N-Dimethylformamid (DMF) für 20 Minuten
(Stufe 1) erreicht. Das selektive Entschützen der Lys(Aloc)-Gruppe wird
manuell durchgeführt
und durch Behandlung des Harzes mit einer Lösung von 3 Äqu. Pd(PPh3)4, gelöst
in 5 ml CHCl3:NMM:HOAc (18:1:0,5), für 2 Stunden
(Stufe 2) erreicht. Das Harz wird dann mit CHCl3 (6 × 5 ml),
20% HOAc in DCM (6 × 5
ml), DCM (6 × 5
ml) und DMF (6 × 5
ml) gewaschen. Die Synthese wird dann zur Zugabe der 3-Maleimidpropionsäure (Stufe
3) re-automatisiert. Zwischen jeder Kupplung wird das Harz dreimal
mit N,N-Dimethylformamid (DMF) und dreimal mit Isopropanol gewaschen.
Das Peptid wird vom Harz unter Verwendung von 85% TFA/5% TIS/5%
Thioanisol und 5% Phenol abgespalten und danach durch trockeneiskaltes
Et2O (Stufe 4) ausgefällt. Das Produkt wird durch
präparative
Umkehrphasen-HPLC, unter Verwendung eines Varian(Rainin)-präparativen,
binären
HPLC-Systems gereinigt: Gradienteneluierung von 30–55% B (0,045%
TFA in H2O (A) und 0,045% TFA in CH3CN (B)) über
180 Minuten bei 9,5 ml/min unter Verwendung einer Phenomenex Luna-Säule (10 μ Phenyl-Hexyl,
21 mm × 25
cm) und eines UV-Detektors
(Varian Dynamax UVD II) bei λ214
und 254 nm, um das gewünschte
modifizierte Peptid (d. h. DAC) in einer Reinheit von > 95%, wie durch RP-HPLC
bestimmt, zu ergeben.
-
-
BEISPIEL 8
-
Herstellung eines modifizierten Anti-RSV-Peptids
-
In
diesem Beispiel wird das Peptid SEQ ID NR 29 gemäß dem unten angegebenen Syntheseschema synthetisiert
und modifiziert, um einen Linker und eine Maleimidgruppe zu enthalten.
Wie in den
US-PSen 6,013,236 und
6,020,459 berichtet ist,
inhibiert SEQ ID NR 29 die virale Infektion von Atmungssyncytial-Virus (RSV),
einschließlich
einer Inhibierung der Fusion und Syncytia-Bildung zwischen RSV-infizierten und
nicht-infizierten Hep-2-Zellen.
-
Die
Festphasen-Peptidsynthese des modifizierten Peptids in einem 100 μmol-Maßstab wird
unter Verwendung einer manuellen Festphasen-Synthese, eines Symphony
Peptide Synthesizers und Fmoc-geschütztem Rinkamid-MBHA durchgeführt. Die
folgenden geschützten
Aminosäuren
werden nacheinander dem Harz zugegeben: Fmoc-Lys(Aloc)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH,
Fmoc-Asp(tBu)-OH, Fmoc-Ile-OH,
Fmoc-Tyr(tBu)-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Leu-OH,
Fmoc-Asp(tBu)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH,
Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Gly-OH,
Fmoc-Asn(Trt)-OH,
Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Val-OH,
Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH,
Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Ile-OH. Sie werden in
N,N-Dimethylformamid
(DMF) gelöst
und gemäß der Sequenz
unter Verwendung von O-Benztriazol-1-yl-N,N,N',N'-tetramethyluroniumhexafluorophosphat
(HBTU) und Diisopropylethylamin (DIEA) aktiviert. Die Entfernung
der Fmoc-Schutzgruppe wird unter Verwendung einer Lösung von
20% (V/V) Piperidin in N,N-Dimethylformamid (DMF) für 20 Minuten
(Stufe 1) erreicht. Das selektive Entschützen der Lys(Aloc)-Gruppe wird
manuell durchgeführt
und durch Behandlung des Harzes mit einer Lösung von 3 Äqu. Pd(PPh3)4, gelöst in
5 ml CHCl3:NMM:HOAc (18:1:0,5), für 2 Stunden
(Stufe 2) erreicht. Das Harz wird dann mit CHCl3 (6 × 5 ml), 20%
HOAc in DCM (6 × 5
ml), DCM (6 × 5
ml) und DMF (6 × 5
ml) gewaschen. Die Synthese wird dann zur Zugabe der 3-Maleimidpropionsäure (Stufe
3) re-automatisiert. Zwischen jeder Kupplung wird das Harz dreimal
mit N,N-Dimethylformamid (DMF) und dreimal mit Isopropanol gewaschen.
Das Peptid wird vom Harz unter Verwendung von 85% TFA/5% TIS/5%
Thioanisol und 5% Phenol abgespalten, danach durch trockeneiskaltes
Et2O (Stufe 4) ausgefällt. Das Produkt wird durch
präparative
Umkehrphasen-HPLC,
unter Verwendung eines Varian(Rainin) präparativen, binären HPLC-Systems
gereinigt: Gradienteneluierung von 30–55% B (0,045% TFA in H2O (A) und 0,045% TFA in CH3CN
(B)) über
180 Minuten bei 9,5 ml/min unter Verwendung einer Phenomenex Luna-Säule (10 μ Phenyl-Hexyl, 21 mm × 25 cm)
und eines UV-Detektors (Varian Dynamax UVD II) bei λ214 und 254
nm, um das gewünschte
modifizierte Peptid (d. h. DAC) in einer Reinheit von > 95%, wie durch RP-HPLC
bestimmt, zu ergeben.
-
-
BEISPIEL 9 (T-173)
-
Herstellung eines modifizierten Anti-HPIV-Peptids
-
In
diesem Beispiel wird das Peptid SEQ ID NR 52 gemäß dem unten angegebenen Syntheseschema synthetisiert
und modifiziert, um einen Linker und eine Maleimidgruppe zu enthalten.
Wie in den
US-PSen 6,013,236 und
6,020,459 berichtet ist,
inhibiert SEQ ID NR 52 die virale Infektion von humanem Parainfluenza-Virus
3 (HPIV3), einschließlich
einer Inhibierung der Fusion und Syncy tia-Bildung zwischen HPIV3-infizierten
Hep2-Zellen und nicht-infizierten
CV-1W-Zellen.
-
Die
Festphasen-Peptidsynthese des modifizierten Peptids in einem 100 μmol-Maßstab wird
unter Verwendung manueller Festphasen-Synthese, eines Symphony Peptide
Synthesizers und Fmoc-geschütztem Rinkamid-MBHA
durchgeführt.
Die folgenden geschützten
Aminosäuren
werden nacheinander dem Harz zugegeben: Fmoc-Lys(Aloc)-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Leu-OH,
Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Gly-OH,
Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Val-OH,
Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH,
Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Asp(tBu)-OH, Fmoc-Arg(Pbf)-OH,
Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Ala-OH,
Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH,
Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Asp(tBu)-OH,
Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH,
Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH,
Fmoc-Val-OH. Sie werden in N,N-Dimethylformamid (DMF) gelöst und gemäß der Sequenz
unter Verwendung von O-Benztriazol-1-yl-N,N,N',N'-tetramethyluroniumhexafluorophosphat
(HBTU) und Diisopropylethylamin (DIEA) aktiviert. Die Entfernung
der Fmoc-Schutzgruppe
wird unter Verwendung einer Lösung
von 20% (V/V) Piperidin in N,N-Dimethylformamid (DMF) für 20 Minuten
(Stufe 1) erreicht. Das selektive Entschützen der Lys(Aloc)-Gruppe wird
manuell durchgeführt
und durch Behandlung des Harzes mit einer Lösung von 3 Äqu. Pd(PPh3)4, gelöst
in 5 ml CHCl3:NMM:HOAc (18:1:0,5), für 2 Stunden
(Stufe 2) erreicht. Das Harz wird dann mit CHCl3 (6 × 5 ml),
20% HOAc in DCM (6 × 5
ml), DCM (6 × 5
ml) und DMF (6 × 5
ml) gewaschen. Die Synthese wird dann zur Zugabe der 3-Maleimidpropionsäure (Stufe
3) re-automatisiert. Zwischen jeder Kupplung wird das Harz dreimal
mit N,N-Dimethylformamid (DMF) und dreimal mit Isopropanol gewaschen.
Das Peptid wird vom Harz unter Verwendung von 85% TFA/5% TIS/5%
Thioanisol und 5% Phenol abgespalten und dann durch trockeneiskaltes
Et2O (Stufe 4) ausgefällt. Das Produkt wird durch
präparative
Umkehrphasen-HPLC, unter Verwendung eines Varian(Rainin) präparativen,
binären
HPLC-Systems gerei nigt: Gradienteneluierung von 30–55% B (0,045%
TFA in H2O (A) und 0,045% TFA in CH3CN (B)) über
180 Minuten bei 9,5 ml/min unter Verwendung einer Phenomenex Luna-Säule (10 μ Phenyl-Hexyl,
21 mm × 25
cm) und eines UV-Detektors (Varian Dynamax UVD II) bei λ214 und 254
nm, um das gewünschte
modifizierte Peptid (d. h. DAC) in einer Reinheit von > 95%, wie durch RP-HPLC bestimmt, zu
ergeben.
-
-
BEISPIEL 10
-
Herstellung eines modifizierten Anti-HPIV-Peptids
-
In
diesem Beispiel wird das Peptid SEQ ID NR 58 gemäß dem unten angegebenen Syntheseschema synthetisiert
und modifiziert, um einen Linker und eine Maleimidgruppe zu enthalten.
Wie in den
US-PSen 6,013,236 und
6,020,459 berichtet ist,
inhibiert SEQ ID NR 58 virale Infektion von humanem Parainfluenza-Virus
3 (HPIV3), einschließlich
einer Inhibierung der Fusion und Syncytia-Bildung zwischen HPIV3-infizierten Hep2-Zellen
und nicht-infizierten
CV-1W-Zellen.
-
Die
Festphasen-Peptidsynthese des modifizierten Peptids in einem 100 μmol-Maßstab wird
unter Verwendung manueller Festphasen-Synthese, eines Symphony Peptide
Synthesizers und Fmoc-geschütztem Rinkamid-MBHA
durchgeführt.
Die folgenden geschützten
Aminosäuren
werden nacheinander dem Harz zugegeben: Fmoc-Lys(Aloc)-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH,
Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Ile-OH,
Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH,
Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH,
Fmoc-Val-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH,
Fmoc-Val-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH,
Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Asp(tBu)-OH, Fmoc-Arg(Pbf)-OH,
Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH,
Fmoc-Glu(tBu)-OH,
Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Asp(tBu)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Arg(Pbf)-OH.
Sie werden in N,N-Dimethylformamid (DMF) gelöst und gemäß der Sequenz unter Verwendung
von O-Benztriazol-1-yl-N,N,N',N'-tetramethyluroniumhexafluorophosphat
(HBTU) und Diisopropylethylamin (DIEA) aktiviert. Die Entfernung
der Fmoc-Schutzgruppe
wird unter Verwendung einer Lösung
von 20% (V/V) Piperidin in N,N-Dimethylformamid (DMF) für 20 Minuten
(Stufe 1) erreicht. Das selektive Entschützen der Lys(Aloc)-Gruppe wird
manuell durchgeführt
und durch Behandlung des Harzes mit einer Lösung von 3 Äqu. Pd(PPh3)4, gelöst
in 5 ml CHCl3:NMM:HOAc (18:1:0,5), für 2 Stunden
(Stufe 2) erreicht. Das Harz wird dann mit CHCl3 (6 × 5 ml),
20% HOAc in DCM (6 × 5
ml), DCM (6 × 5
ml) und DMF (6 × 5
ml) gewaschen. Die Synthese wird dann zur Zugabe der 3-Maleimidpropionsäure (Stufe 3)
re-automatisiert. Zwischen jeder Kupplung wird das Harz dreimal
mit N,N-Dimethylformamid (DMF) und dreimal mit Isopropanol gewaschen.
Das Peptid wird vom Harz unter Verwendung von 85% TFA/5% TIS/5% Thioanisol
und 5% Phenol abgespalten und dann durch trockeneiskaltes Et2O (Stufe 4) ausgefällt. Das Produkt wird durch
präparative
Umkehrphasen-HPLC, unter Verwendung eines Varian(Rainin) präparativen,
binären HPLC-Systems
gereinigt: Gradienteneluierung von 30–55% B (0,045% TFA in H2O (A) und 0,045% TFA in CH3CN
(B)) über
180 Minuten bei 9,5 ml/min unter Verwendung einer Phenomenex Luna-Säule (10 μ Phenyl-Hexyl,
21 mm × 25
cm) und eines UV-Detektors (Varian Dynamax UVD II) bei λ214 und 254
nm, um das gewünschte
modifizierte Peptid (d. h. DAC) in einer Reinheit von > 95%, wie durch RP-HPLC bestimmt, zu
ergeben.
-
-
BEISPIEL 11
-
Herstellung eines modifizierten Anti-HPIV-Peptids
-
In
diesem Beispiel wird das Peptid SEQ ID NR 35 gemäß dem unten angegebenen Syntheseschema synthetisiert
und modifiziert, um einen Linker und eine Maleimidgruppe zu enthalten.
Wie in den
US-PSen 6,013,236 und
6,020,459 berichtet ist,
inhibiert SEQ ID NR 35 virale Infektion von humanem Parainfluenza-Virus
3 (HPIV3), einschließlich
einer Inhibierung der Fusion und Syncytia-Bildung zwischen HPIV3-infizierten Hep2-Zellen
und nicht-infizierten
CV-1W-Zellen.
-
Die
Festphasen-Peptidsynthese des modifizierten Peptids in einem 100 μmol-Maßstab wird
unter Verwendung manueller Festphasen-Synthese, eines Symphony Peptide
Synthesizers und Fmoc-geschütztem Rinkamid-MBHA
durchgeführt.
Die folgenden geschützten
Aminosäuren
werden nacheinander dem Harz zugegeben: Fmoc-Lys(Aloc)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH,
Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Arg(Pbf)-OH,
Fmoc-Arg(Pbf)-OH,
Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Trp(Boc)-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH,
Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Asp(tBu)-OH,
Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH,
Fmoc-Asn(Trt)-OH,
Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Ile-OH,
Fmoc-Asp(tBu)-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Asp(tBu)-OH, Fmoc-Leu-OH,
Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH.
Sie werden in N,N-Dimethylformamid (DMF) gelöst und gemäß der Sequenz unter Verwendung
von O-Benztriazol-1-yl-N,N,N',N'-tetramethyluroniumhexafluorophosphat
(HBTU) und Diisopropylethylamin (DIEA) aktiviert. Die Entfernung
der Fmoc-Schutzgruppe wird unter Verwendung einer Lösung von
20% (V/V) Piperidin in N,N-Dimethylformamid (DMF) für 20 Minuten
(Stufe 1) erreicht. Das selektive Entschützen der Lys(Aloc)-Gruppe wird
manuell durchgeführt
und durch Behandlung des Harzes mit einer Lösung von 3 Äqu. Pd(PPh3)4, gelöst in
5 ml CHCl3:NMM:HOAc (18:1:0,5), für 2 Stunden
(Stufe 2) erreicht. Das Harz wird dann mit CHCl3 (6 × 5 ml), 20%
HOAc in DCM (6 × 5
ml), DCM (6 × 5
ml) und DMF (6 × 5
ml) gewaschen. Die Synthese wird dann zur Zugabe der 3-Maleimidpropionsäure (Stufe
3) re-automatisiert. Zwischen jeder Kupplung wird das Harz dreimal
mit N,N-Dimethylformamid (DMF) und dreimal mit Isopropanol gewaschen.
Das Peptid wird vom Harz unter Verwendung von 85% TFA/5% TIS/5%
Thioanisol und 5% Phenol abgespalten und dann durch trockeneiskaltes
Et2O (Stufe 4) ausgefällt. Das Produkt wird durch
präparative
Umkehrphasen-HPLC,
unter Verwendung eines Varian(Rainin) präparativen, binären HPLC-Systems
gereinigt: Gradienteneluierung von 30–55% B (0,045% TFA in H2O (A) und 0,045% TFA in CH3CN
(B)) über
180 Minuten bei 9,5 ml/min unter Verwendung einer Phenomenex Luna-Säule (10 μ Phenyl-Hexyl, 21 mm × 25 cm)
und eines UV-Detektors (Varian Dynamax UVD II) bei λ214 und 254
nm, um das gewünschte
modifizierte Peptid (d. h. DAC) in einer Reinheit von > 95%, wie durch RP-HPLC
bestimmt, zu ergeben.
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BEISPIEL 12
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Herstellung eines modifizierten Anti-HPIV-Peptids
-
In
diesem Beispiel wird das Peptid SEQ ID NR 38 gemäß dem unten angegebenen Syntheseschema synthetisiert
und modifiziert, um einen Linker und eine Maleimidgruppe zu enthalten.
Wie in den
US-PSen 6,013,236 und
6,020,459 berichtet ist,
inhibiert SEQ ID NR 38 virale Infektion von humanem Parainfluenza-Virus
3 (HPIV3), einschließlich
einer Inhibierung der Fusion und Syncytia-Bildung zwischen HPIV3-infizierten Hep2-Zellen
und nicht-infizierten
CV-1W-Zellen.
-
Die
Festphasen-Peptidsynthese des modifizierten Peptidanalogs in einem
100 μmol-Maßstab wird
unter Verwendung manueller Festphasen-Synthese, eines Symphony Peptide
Synthesizers und Fmoc-geschütztem Rinkamid-MBHA
durchgeführt.
Die folgenden geschützten
Aminosäuren
werden nacheinander dem Harz zugegeben: Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Asp(tBu)-OH,
Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH,
Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH,
Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Trp(Boc)-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH,
Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH,
Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Asp(tBu)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH,
Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Ile-OH,
Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Asp(tBu)-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Asp(tBu)-OH,
Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Ala-OH, Boc-Lys(Aloc)-OH. Sie werden in N,N-Dimethylformamid
(DMF) gelöst
und gemäß der Sequenz
unter Verwendung von O-Benztriazol-1-yl-N,N,N',N'-tetramethyluroniumhexafluorophosphat
(HBTU) und Diisopropylethylamin (DIEA) aktiviert. Die Entfernung
der Fmoc-Schutzgruppe wird unter Verwendung einer Lösung von
20% (V/V) Piperidin in N,N-Dimethylformamid (DMF) für 20 Minuten
(Stufe 1) erreicht. Das selektive Entschützen der Lys(Aloc)-Gruppe wird
manuell durchgeführt
und durch Behandlung des Harzes mit einer Lösung von 3 Äqu. Pd(PPh3)4, gelöst in
5 ml CHCl3:NMM:HOAc (18:1:0,5), für 2 Stunden
(Stufe 2) erreicht. Das Harz wird dann mit CHCl3 (6 × 5 ml), 20%
HOAc in DCM (6 × 5
ml), DCM (6 × 5
ml) und DMF (6 × 5
ml) gewaschen. Die Synthese wird dann zur Zugabe der 3-Maleimidpropionsäure (Stufe
3) re-automatisiert. Zwischen jeder Kupplung wird das Harz dreimal
mit N,N-Dimethylformamid (DMF) und dreimal mit Isopropanol gewaschen.
Das Peptid wird vom Harz unter Verwendung von 85% TFA/5% TIS/5%
Thioanisol und 5% Phenol abgespalten und dann durch trockeneiskaltes
Et2O (Stufe 4) ausgefällt. Das Produkt wird durch
präparative
Umkehrphasen-HPLC,
unter Verwendung eines Varian(Rainin) präparativen, binären HPLC-Systems
gereinigt: Gradienteneluierung von 30–55% B (0,045% TFA in H2O (A) und 0,045% TFA in CH3CN
(B)) über
180 Minuten bei 9,5 ml/min unter Verwendung einer Phenomenex Luna-Säule (10 μ Phenyl-Hexyl, 21 mm × 25 cm)
und eines UV-Detektors (Varian Dynamax UVD II) bei λ214 und 254
nm, um das gewünschte
modifizierte Peptid (d. h. DAC) in einer Reinheit von > 95%, wie durch RP-HPLC
bestimmt, zu ergeben.
-
-
BEISPIEL 13
-
Herstellung eines modifizierten Anti-HPIV-Peptids
-
In
diesem Beispiel wird das Peptid SEQ ID NR 39 gemäß dem unten angegebenen Syntheseschema synthetisiert
und modifiziert, um einen Linker und eine Maleimidgruppe zu enthalten.
Wie in den
US-PSen 6,013,236 und
6,020,459 berichtet ist,
inhibiert SEQ ID NR 39 virale Infektion von humanem Parainfluenza-Virus
3 (HPIV3), einschließlich
der Inhibierung der Fusion und Syncytia-Bildung zwischen HPIV3-infizierten Hep2-Zellen
und nicht-infizierten
CV-1W-Zellen.
-
Die
Festphasen-Peptidsynthese des modifizierten Peptids in einem 100 μmol-Maßstab wird
unter Verwendung manueller Festphasen-Synthese, eines Symphony Peptide
Synthesizers und Fmoc-geschütztem Rinkamid-MBHA
durchgeführt.
Die folgenden geschützten
Aminosäuren
werden nacheinander dem Harz zugegeben: Fmoc-Lys(Aloc)-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Ile-OH,
Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Asp(tBu)-OH, Fmoc-Leu-OH,
Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Arg(Pbf)-OH,
Fmoc-Arg(Pbf)-OH,
Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Trp(Boc)-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH,
Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH,
Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Asp(tBu)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Ala-OH,
Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH,
Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Asp(tBu)-OH, Fmoc-Ile-OH,
Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Asp(tBu)-OH,
Fmoc-Leu-OH. Sie werden in N,N-Dimethylformamid (DMF) gelöst und gemäß der Sequenz
unter Verwendung von O-Benztriazol-1-yl-N,N,N',N'-tetramethyluroniumhexafluorophosphat
(HBTU) und Diisopropylethylamin (DIEA) aktiviert. Die Entfernung
der Fmoc-Schutzgruppe wird unter Verwendung einer Lösung von
20% (V/V) Piperidin in N,N-Dimethylformamid (DMF) für 20 Minuten
(Stufe 1) erreicht. Das selektive Entschützen der Lys(Aloc)-Gruppe wird
manuell durchgeführt
und durch Behandlung des Harzes mit einer Lösung von 3 Äqu. Pd(PPh3)4, gelöst in
5 ml CHCl3:NMM:HOAc (18:1:0,5), für 2 Stunden
(Stufe 2) erreicht. Das Harz wird dann mit CHCl3 (6 × 5 ml), 20%
HOAc in DCM (6 × 5
ml), DCM (6 × 5
ml) und DMF (6 × 5
ml) gewaschen. Die Synthese wird dann zur Zugabe der 3-Maleimidpropionsäure (Stufe
3) re-automatisiert. Zwischen jeder Kupplung wird das Harz dreimal
mit N,N-Dimethylformamid (DMF) und dreimal mit Isopropanol gewaschen.
Das Peptid wird vom Harz unter Verwendung von 85% TFA/5% TIS/5%
Thioanisol und 5% Phenol abgespalten, dann durch trockeneiskaltes
Et2O (Stufe 4) ausgefällt. Das Produkt wird durch
präparative
Umkehrphasen-HPLC, unter Verwendung eines Varian(Rainin) präparativen,
binären
HPLC-Systems gereinigt: Gradienteneluierung von 30–55% B (0,045%
TFA in H2O (A) und 0,045% TFA in CH3CN (B)) über
180 Minuten bei 9,5 ml/min unter Verwendung einer Phenomenex Luna-Säule (10 μ Phenyl-Hexyl,
21 mm × 25
cm) und eines UV-Detektors (Varian Dynamax UVD II) bei λ214 und 254
nm, um das gewünschte
modifizierte Peptid (d. h. DAC) in einer Reinheit von > 95%, wie durch RP-HPLC bestimmt, zu
ergeben.
-
-
BEISPIEL 14
-
Herstellung eines modifizierten Anti-HPIV-Peptids
-
In
diesem Beispiel wird das Peptid SEQ ID NR 40 gemäß dem unten angegebenen Syntheseschema synthetisiert
und modifiziert, um einen Linker und eine Maleimidgruppe zu enthalten.
Wie in den
US-PSen 6,013,236 und
6,020,459 berichtet ist,
inhibiert SEQ ID NR 40 virale Infektion von humanem Parainfluenza-Virus
3 (HPIV3), einschließlich
der Inhibierung der Fusion und Syncytia-Bildung zwischen HPIV3-infizierten Hep2-Zellen
und nicht-infizierten
CV-1W-Zellen.
-
Die
Festphasen-Peptidsynthese des modifizierten Peptids in einem 100 μmol-Maßstab wird
unter Verwendung manueller Festphasen-Synthese, eines Symphony Peptide
Synthesizers und Fmoc-geschütztem Rinkamid-MBHA
durchgeführt.
Die folgenden geschützten
Aminosäuren
werden nacheinander dem Harz zugegeben: Fmoc-Lys(Aloc)-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Gly-OH,
Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Asp(tBu)-OH,
Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH,
Fmoc-Arg(Pbf)-OH,
Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Trp(Boc)-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH,
Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH,
Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Asp(tBu)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH,
Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH,
Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Asp(tBu)-OH, Fmoc-Ile-OH,
Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Asp(tBu)-OH. Sie werden in N,N-Dimethylformamid
(DMF) gelöst
und gemäß der Sequenz
unter Verwendung von O-Benztriazol-1-yl-N,N,N',N'-tetramethyluroniumhexafluorophosphat
(HBTU) und Diisopropylethylamin (DIEA) aktiviert. Die Entfernung
der Fmoc-Schutzgruppe wird unter Verwendung einer Lösung von
20% (V/V) Piperidin in N,N-Dimethylformamid (DMF) für 20 Minuten
(Stufe 1) erreicht. Das selektive Entschützen der Lys(Aloc)-Gruppe wird
manuell durchgeführt
und durch Behandlung des Harzes mit einer Lösung von 3 Äqu. Pd(PPh3)4, gelöst in
5 ml CHCl3:NMM:HOAc (18:1:0,5), für 2 Stunden
(Stufe 2) erreicht. Das Harz wird dann mit CHCl3 (6 × 5 ml), 20%
HOAc in DCM (6 × 5
ml), DCM (6 × 5
ml) und DMF (6 × 5
ml) gewaschen. Die Synthese wird dann zur Zugabe der 3-Maleimidpropionsäure (Stufe
3) re-automatisiert. Zwischen jeder Kupplung wird das Harz dreimal
mit N,N-Dimethylformamid (DMF) und dreimal mit Isopropanol gewaschen.
Das Peptid wird vom Harz unter Verwendung von 85% TFA/5% TIS/5%
Thioanisol und 5% Phenol abgespalten und dann durch trockeneiskaltes
Et2O (Stufe 4) ausge fällt. Das Produkt wird durch
präparative
Umkehrphasen-HPLC, unter Verwendung eines Varian(Rainin) präparativen,
binären
HPLC-Systems gereinigt: Gradienteneluierung von 30–55% B (0,045%
TFA in H2O (A) und 0,045% TFA in CH3CN (B)) über
180 Minuten bei 9,5 ml/min unter Verwendung einer Phenomenex Luna-Säule (10 μ Phenyl-Hexyl, 21 mm × 25 cm)
und eines UV-Detektors (Varian Dynamax UVD II) bei λ214 und 254
nm, um das gewünschte
modifizierte Peptid (d. h. DAC) in einer Reinheit von > 95%, wie durch RP-HPLC
bestimmt, zu ergeben.
-
-
BEISPIEL 15
-
Herstellung eines modifizierten Anti-HPIV-Peptids
-
In
diesem Beispiel wird das Peptid SEQ ID NR 41 gemäß dem unten angegebenen Syntheseschema synthetisiert
und modifiziert, um einen Linker und eine Maleimidgruppe zu enthalten.
Wie in den
US-PSen 6,013,236 und
6,020,459 berichtet ist,
inhibiert SEQ ID NR 41 virale Infektion von humanem Parainfluenza-Virus
3 (HPIV3), einschließlich
der Inhibierung der Fusion und Syncytia-Bildung zwischen HPIV3-infizierten Hep2-Zellen
und nicht-infizierten
CV-1W-Zellen.
-
Die
Festphasen-Peptidsynthese des modifizierten Peptids in einem 100 μmol-Maßstab wird
unter Verwendung manueller Festphasen-Synthese, eines Symphony Peptide
Synthesizers und Fmoc-geschütztem Rinkamid-MBHA
durchgeführt.
Die folgenden geschützten
Aminosäuren
werden nacheinander dem Harz zugegeben: Fmoc-Trp(Boc)-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Gly-OH,
Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Asp(tBu)-OH,
Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH,
Fmoc-Arg(Pbf)-OH,
Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Trp(BOC)-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH,
Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH,
Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Asp(tBu)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH,
Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH,
Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Asp(tBu)-OH, Fmoc-Ile-OH,
Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Lys(Aloc)-OH. Sie werden in N,N-Dimethylformamid
(DMF) gelöst
und gemäß der Sequenz
unter Verwendung von O-Benztriazol-1-yl-N,N,N',N'-tetramethyluroniumhexafluorophosphat
(HBTU) und Diisopropylethylamin (DIEA) aktiviert. Die Entfernung
der Fmoc-Schutzgruppe wird unter Verwendung einer Lösung von
20% (V/V) Piperidin in N,N-Dimethylformamid (DMF) für 20 Minuten
(Stufe 1) erreicht. Das selektive Entschützen der Lys(Aloc)-Gruppe wird
manuell durchgeführt
und durch Behandlung des Harzes mit einer Lösung von 3 Äqu. Pd(PPh3)4, gelöst in
5 ml CHCl3:NMM:HOAc (18:1:0,5), für 2 Stunden
(Stufe 2) erreicht. Das Harz wird dann mit CHCl3 (6 × 5 ml), 20%
HOAc in DCM (6 × 5
ml), DCM (6 × 5
ml) und DMF (6 × 5
ml) gewaschen. Die Synthese wird dann zur Zugabe der 3-Maleimidpropionsäure (Stufe
3) re-automatisiert. Zwischen jeder Kupplung wird das Harz dreimal
mit N,N-Dimethylformamid (DMF) und dreimal mit Isopropanol gewaschen.
Das Peptid wird vom Harz unter Verwendung von 85% TFA/5% TIS/5%
Thioanisol und 5% Phenol abgespalten und dann durch trockeneiskaltes
Et2O (Stufe 4) ausgefällt. Das Produkt wird durch
präparative
Umkehrphasen-HPLC, unter Verwendung eines Varian(Rainin) präparativen,
binären
HPLC-Systems gereinigt: Gradienteneluierung von 30–55% B (0,045%
TFA in H2O (A) und 0,045% TFA in CH3CN (B)) über
180 Minuten bei 9,5 ml/min unter Verwendung einer Phenomenex Luna-Säule (10 μ Phenyl-Hexyl, 21 mm × 25 cm)
und eines UV-Detektors (Varian Dynamax UVD II) bei λ214 und 254
nm, um das gewünschte
modifizierte Peptid (d. h. DAC) in einer Reinheit von > 95%, wie durch RP-HPLC
bestimmt, zu ergeben.
-
-
BEISPIEL 16
-
Herstellung eines modifizierten Anti-HPIV-Peptids
-
In
diesem Beispiel wird das Peptid SEQ ID NR 42 gemäß dem unten angegebenen Syntheseschema synthetisiert
und modifiziert, um einen Linker und eine Maleimidgruppe zu enthalten.
Wie die
US-PSen 6,013,236 und
6,020,459 berichten, inhibiert
SEQ ID NR 42 virale Infektion von humanem Parainfluenza-Virus 3
(HPIV3), einschließlich
der Inhibierung der Fusion und Syncytia-Bildung zwischen HPIV3-infizierten Hep2-Zellen
und nicht-infizierten CV-1W-Zellen.
-
Die
Festphasen-Peptidsynthese des modifizierten Peptids in einem 100 μmol-Maßstab wird
unter Verwendung manueller Festpha sen-Synthese, eines Symphony Peptide
Synthesizers und Fmoc-geschütztem Rinkamid-MBHA
durchgeführt.
Die folgenden geschützten
Aminosäuren
werden nacheinander dem Harz zugegeben: Fmoc-Lys(Aloc)-OH, Fmoc-His(Boc)-OH, Fmoc-Trp(Boc)-OH,
Fmoc-Asn(Trt)-OH,
Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Asp(tBu)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH,
Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH,
Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Trp(Boc)-OH,
Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH,
Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Leu-OH,
Fmoc-Asp(tBu)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH,
Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH,
Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Asp(tBu)-OH, Fmoc-Ile-OH. Sie werden in N,N-Dimethylformamid (DMF)
gelöst
und gemäß der Sequenz
unter Verwendung von O-Benztriazol-1-yl-N,N,N',N'-tetramethyluroniumhexafluorophosphat
(HBTU) und Diisopropylethylamin (DIEA) aktiviert. Die Entfernung
der Fmoc-Schutzgruppe wird unter Verwendung einer Lösung von
20% (V/V) Piperidin in N,N-Dimethylformamid (DMF) für 20 Minuten
(Stufe 1) erreicht. Das selektive Entschützen der Lys(Aloc)-Gruppe wird
manuell durchgeführt
und durch Behandlung des Harzes mit einer Lösung von 3 Äqu. Pd(PPh3)4, gelöst
in 5 ml CHCl3:NMM:HOAc (18:1:0,5), für 2 Stunden
(Stufe 2) erreicht. Das Harz wird dann mit CHCl3 (6 × 5 ml),
20% HOAc in DCM (6 × 5
ml), DCM (6 × 5
ml) und DMF (6 × 5
ml) gewaschen. Die Synthese wird dann zur Zugabe der 3-Maleimidpropionsäure (Stufe
3) re-automatisiert. Zwischen jeder Kupplung wird das Harz dreimal
mit N,N-Dimethylformamid (DMF) und dreimal mit Isopropanol gewaschen.
Das Peptid wird vom Harz unter Verwendung von 85% TFA/5% TIS/5%
Thioanisol und 5% Phenol abgespalten und dann durch trockeneiskaltes
Et2O (Stufe 4) ausgefällt. Das Produkt wird durch
präparative
Umkehrphasen-HPLC,
unter Verwendung eines Varian(Rainin) präparativen, binären HPLC-Systems
gereinigt: Gradienten-eluierung von 30–55% B (0,045% TFA in H2O (A) und 0,045% TFA in CH3CN
(B)) über
180 Minuten bei 9,5 ml/min unter Verwendung einer Phenomenex Luna-Säule (10 μ Phenyl-Hexyl,
21 mm × 25
cm) und eines UV-Detektors
(Varian Dynamax UVD II) bei λ214
und 254 nm, um das gewünschte
modifizierte Peptid (d. h. DAC) in einer Reinheit von > 95%, wie durch RP-HPLC
bestimmt, zu ergeben.
-
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BEISPIEL 17
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Herstellung eines modifizierten Anti-MeV-Peptids
-
In
diesem Beispiel wird das Peptid SEQ ID NR 77 gemäß dem unten angegebenen Syntheseschema synthetisiert
und modifiziert, um einen Linker und eine Maleimidgruppe zu enthalten.
Wie die
US-PSen 6,013,236 und
6,020,459 berichten, inhibiert
SEQ ID NR 77 virale Infektion von Masernviren (MeV), einschließlich der
Inhibierung der Fusion und Syncytia-Bildung zwischen MeV- infizierten und nicht-infizierten
Vero-Zellen.
-
Die
Festphasen-Peptidsynthese des modifizierten Peptids in einem 100 μmol-Maßstab wird
unter Verwendung manueller Festphasen-Synthese, eines Symphony Peptide
Synthesizers und Fmoc-geschütztem Rinkamid-MBHA
durchgeführt.
Die folgenden geschützten
Aminosäuren
werden nacheinander dem Harz zugegeben: Fmoc-Lys(Aloc)-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Leu-OH,
Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH,
Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Ile-OH,
Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH,
Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH,
Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Asp(tBu)-OH,
Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH,
Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Gly-OH,
Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Asp(tBu)-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-His(Boc)-OH.
Sie werden in N,N-Dimethylformamid
(DMF) gelöst
und gemäß der Sequenz
unter Verwendung von O-Benztriazol-1-yl-N,N,N',N'-tetramethyluroniumhexafluorophosphat
(HBTU) und Diisopropylethylamin (DIEA) aktiviert. Die Entfernung
der Fmoc-Schutzgruppe wird unter Verwendung einer Lösung von
20% (V/V) Piperidin in N,N-Dimethylformamid (DMF) für 20 Minuten
(Stufe 1) erreicht. Das selektive Entschützen der Lys(Aloc)-Gruppe wird
manuell durchgeführt
und durch Behandlung des Harzes mit einer Lösung von 3 Äqu. Pd(PPh3)4, gelöst in
5 ml CHCl3:NMM:HOAc (18:1:0,5), für 2 Stunden
(Stufe 2) erreicht. Das Harz wird dann mit CHCl3 (6 × 5 ml), 20%
HOAc in DCM (6 × 5
ml), DCM (6 × 5
ml) und DMF (6 × 5
ml) gewaschen. Die Synthese wird dann zur Zugabe der 3-Maleimidpropionsäure (Stufe
3) re-automatisiert. Zwischen jeder Kupplung wird das Harz dreimal
mit N,N-Dimethylformamid (DMF) und dreimal mit Isopropanol gewaschen.
Das Peptid wird vom Harz unter Verwendung von 85% TFA/5% TIS/5%
Thioanisol und 5% Phenol abgespalten und dann durch trockeneiskaltes
Et2O (Stufe 4) ausgefällt. Das Produkt wird durch
präparative
Umkehrphasen-HPLC,
unter Verwendung eines Varian(Rainin) präparativen, binären HPLC-Systems
gereinigt: Gradienteneluierung von 30–55% B (0,045% TFA in H2O (A) und 0,045% TFA in CH3CN
(B)) über
180 Minuten bei 9,5 ml/min unter Verwendung einer Phenomenex Luna-Säule (10 μ Phenyl-Hexyl, 21 mm × 25 cm)
und eines UV-Detektors (Varian Dynamax UVD II) bei λ214 und 254
nm, um das gewünschte
modifizierte Peptid (d. h. DAC) in einer Reinheit von > 95%, wie durch RP-HPLC
bestimmt, zu ergeben.
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BEISPIEL 18
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Herstellung eines modifizierten Anti-MeV-Peptids
-
In
diesem Beispiel wird das Peptid SEQ ID NR 79 gemäß dem unten angegebenen Syntheseschema synthetisiert
und modifiziert, um einen Linker und eine Maleimidgruppe zu enthalten.
Wie die
US-PSen 6,013,236 und
6,020,459 berichten, inhibiert
SEQ ID NR 79 virale Infektion von Masernvirus (MeV), einschließlich der
Inhibierung der Fusion und Syncytia-Bildung zwischen MeV-infizierten und nicht-infizierten
Vero-Zellen.
-
Die
Festphasen-Peptidsynthese des modifizierten Peptids in einem 100 μmol-Maßstab wird
unter Verwendung manueller Festphasen-Synthese, eines Symphony Peptide
Synthesizers und Fmoc-geschütztem Rinkamid-MBHA
durchgeführt.
Die folgenden geschützten
Aminosäuren
werden nacheinander dem Harz zugegeben: Fmoc-Lys(Aloc)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH,
Fmoc-Glu(tBu)-OH,
Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH,
Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH,
Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Leu-OH,
Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH,
Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Asp(tBu)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH,
Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH,
Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Asp(tBu)-OH, Fmoc-Ile-OH.
Sie werden in N,N-Dimethylformamid (DMF) gelöst und gemäß der Sequenz unter Verwendung
von O-Benztriazol-1-yl-N,N,N',N'-tetramethyluroniumhexafluorophosphat
(HBTU) und Diisopropylethylamin (DIEA) aktiviert. Die Entfernung
der Fmoc-Schutzgruppe wird unter Verwendung einer Lösung von
20% (V/V) Piperidin in N,N-Dimethylformamid (DMF) für 20 Minuten
(Stufe 1) erreicht. Das selektive Entschützen der Lys(Aloc)-Gruppe wird
manuell durchgeführt
und durch Behandlung des Harzes mit einer Lösung von 3 Äqu. Pd(PPh3)4, gelöst in
5 ml CHCl3:NMM:HOAc (18:1:0,5), für 2 Stunden
(Stufe 2) erreicht. Das Harz wird dann mit CHCl3 (6 × 5 ml), 20%
HOAc in DCM (6 × 5
ml), DCM (6 × 5
ml) und DMF (6 × 5
ml) gewaschen. Die Synthese wird dann zur Zugabe der 3-Maleimidpropionsäure (Stufe
3) re-automatisiert. Zwischen jeder Kupplung wird das Harz dreimal
mit N,N-Dimethylformamid (DMF) und dreimal mit Isopropanol gewaschen.
Das Peptid wird vom Harz unter Verwendung von 85% TFA/5% TIS/5%
Thioanisol und 5% Phenol abgespalten und dann durch trockeneiskaltes
Et2O (Stufe 4) ausgefällt. Das Produkt wird durch
präparative
Umkehrphasen-HPLC,
unter Verwendung eines Varian(Rainin) präparativen, binä ren HPLC-Systems
gereinigt: Gradienteneluierung von 30–55% B (0,045% TFA in H2O (A) und 0,045% TFA in CH3CN
(B)) über
180 Minuten bei 9,5 ml/min unter Verwendung einer Phenomenex Luna-Säule (10 μ Phenyl-Hexyl, 21 mm × 25 cm)
und eines UV-Detektors (Varian Dynamax UVD II) bei λ214 und 254
nm, um das gewünschte
modifizierte Peptid (d. h. DAC) in einer Reinheit von > 95%, wie durch RP-HPLC
bestimmt, zu ergeben.
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BEISPIEL 19
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Herstellung eines modifizierten Anti-MeV-Peptids
-
In
diesem Beispiel wird das Peptid SEQ ID NR 81 gemäß dem unten angegebenen Syntheseschema synthetisiert
und modifiziert, um einen Linker und eine Maleimidgruppe zu enthalten.
Wie die
US-PSen 6,013,236 und
6,020,459 berichten, inhibiert
SEQ ID NR 79 virale Infektion von Masernviren (MeV), einschließlich der
Inhibierung der Fusion und Syncytia-Bildung zwischen MeV-infizierten und nicht-infizierten
Vero-Zellen.
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Die
Festphasen-Peptidsynthese des modifizierten Peptids in einem 100 μmol-Maßstab wird
unter Verwendung manueller Festphasen-Synthese, eines Symphony Peptide
Synthesizers und Fmoc-geschütztem Rinkamid-MBHA
durchgeführt.
Die folgenden geschützten
Aminosäuren
werden nacheinander dem Harz zugegeben: Fmoc-Lys(Aloc)-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Asp(tBu)-OH,
Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH,
Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH,
Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Ile-OH,
Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH,
Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Val-OH,
Fmoc-Asp(tBu)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Leu-OH,
Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Leu-OH.
Sie werden in N,N-Dimethylformamid (DMF) gelöst und gemäß der Sequenz unter Verwendung
von O-Benztriazol-1-yl-N,N,N',N'-tetramethyluroniumhexafluorophosphat
(HBTU) und Diisopropylethylamin (DIEA) aktiviert. Die Entfernung
der Fmoc-Schutzgruppe wird unter Verwendung einer Lösung von
20% (V/V) Piperidin in N,N-Dimethylformamid (DMF) für 20 Minuten
(Stufe 1) erreicht. Das selektive Entschützen der Lys(Aloc)-Gruppe wird
manuell durchgeführt
und durch Behandlung des Harzes mit einer Lösung von 3 Äqu. Pd(PPh3)4, gelöst
in 5 ml CHCl3:NMM:HOAc (18:1:0,5), für 2 Stunden
(Stufe 2) erreicht. Das Harz wird dann mit CHCl3 (6 × 5 ml),
20% HOAc in DCM (6 × 5
ml), DCM (6 × 5
ml) und DMF (6 × 5
ml) gewaschen. Die Synthese wird dann zur Zugabe der 3-Maleimidpropionsäure (Stufe
3) re-automatisiert. Zwischen jeder Kupplung wird das Harz dreimal
mit N,N-Dimethylformamid (DMF) und dreimal mit Isopropanol gewaschen.
Das Peptid wird vom Harz unter Verwendung von 85% TFA/5% TIS/5%
Thioanisol und 5% Phenol abgespalten und dann durch trockeneiskaltes
Et2O (Stufe 4) ausgefällt. Das Produkt wird durch
präparative
Umkehrphasen-HPLC,
unter Verwendung eines Varian(Rainin) präparativen, binären HPLC-Systems
gereinigt: Gradienteneluierung von 30–55% B (0,045% TFA in H2O (A) und 0,045% TFA in CH3CN
(B)) über
180 Minuten bei 9,5 ml/min unter Verwendung einer Phenomenex Luna-Säule (10 μ Phenyl-Hexyl, 21 mm × 25 cm)
und eines UV-Detektors (Varian Dynamax UVD II) bei λ214 und 254
nm, um das gewünschte
modifizierte Peptid (d. h. DAC) in einer Reinheit von > 95%, wie durch RP-HPLC
bestimmt, zu ergeben.
-
-
BEISPIEL 20
-
Herstellung eines modifizierten Anti-MeV-Peptids
-
In
diesem Beispiel wird das Peptid SEQ ID NR 84 gemäß dem unten angegebenen Syntheseschema synthetisiert
und modifiziert, um einen Linker und eine Maleimidgruppe zu enthalten.
Wie die
US-PSen 6,013,236 und
6,020,459 berichten, inhibiert
SEQ ID NR 84 virale Infektion von Masernvirus (MeV), einschließlich der
Inhibierung der Fusion und Syncytia-Bildung zwischen MeV-infizierten und nicht-infizierten
Vero-Zellen.
-
Die
Festphasen-Peptidsynthese des modifizierten Peptids wird in einem
100 μmol-Maßstab unter
Verwendung manueller Festphasen-Synthese,
eines Symphony Peptide Synthesizers und Fmoc-geschütztem Rinkamid-MBHA durchgeführt. Die
folgenden geschützten
Aminosäuren
werden nacheinander dem Harz zugegeben: Fmoc-Lys(Aloc)-OH, Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Leu-OH,
Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Asp(tBu)-OH,
Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH,
Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH,
Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Ile-OH,
Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH,
Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Asp(tBu)-OH, Fmoc-Leu-OH,
Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH,
Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Pro-OH. Sie werden in N,N-Dimethylformamid (DMF) gelöst und gemäß der Sequenz
unter Verwendung von O-Benztriazol-1-yl-N,N,N',N'-tetramethyluroniumhexafluorophosphat
(HBTU) und Diisopropylethylamin (DIEA) aktiviert. Die Entfernung
der Fmoc-Schutzgruppe wird unter Verwendung einer Lösung von
20% (V/V) Piperidin in N,N-Dimethylformamid (DMF) für 20 Minuten
(Stufe 1) erreicht. Das selektive Entschützen der Lys(Aloc)-Gruppe wird
manuell durchgeführt
und durch Behandlung des Harzes mit einer Lösung von 3 Äqu. Pd(PPh3)4, gelöst
in 5 ml CHCl3:NMM:HOAc (18:1:0,5), für 2 Stunden
(Stufe 2) erreicht. Das Harz wird dann mit CHCl3 (6 × 5 ml),
20% HOAc in DCM (6 × 5
ml), DCM (6 × 5
ml) und DMF (6 × 5
ml) gewaschen. Die Synthese wird dann zur Zugabe der 3- Maleimidpropionsäure (Stufe
3) re-automatisiert. Zwischen jeder Kupplung wird das Harz dreimal
mit N,N-Dimethylformamid (DMF) und dreimal mit Isopropanol gewaschen.
Das Peptid wird vom Harz unter Verwendung von 85% TFA/5% TIS/5%
Thioanisol und 5% Phenol abgespalten und dann durch trockeneiskaltes
Et2O (Stufe 4) ausgefällt. Das Produkt wird durch
präparative
Umkehrphasen-HPLC, unter
Verwendung eines Varian(Rainin) präparativen, binären HPLC-Systems
gereinigt: Gradienteneluierung von 30–55% B (0,045% TFA in H2O (A) und 0,045% TFA in CH3CN
(B)) über
180 Minuten bei 9,5 ml/min unter Verwendung einer Phenomenex Luna-Säule (10 μ Phenyl-Hexyl, 21 mm × 25 cm)
und eines UV-Detektors (Varian Dynamax UVD II) bei λ214 und 254
nm, um das gewünschte
modifizierte Peptid (d. h. DAC) in einer Reinheit von > 95%, wie durch RP-HPLC
bestimmt, zu ergeben.
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BEISPIEL 21
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Herstellung eines modifizierten Anti-SIV-Peptids
-
In
diesem Beispiel wird das Peptid SEQ ID NR 64 gemäß dem unten angegebenen Syntheseschema synthetisiert
und modifiziert, um einen Linker und eine Maleimidgruppe zu enthalten.
Wie die
US-PSen 6,013,236 und
6,020,459 berichten, zeigt
SEQ ID NR 64 eine potente antivirale Aktivität als rohes Peptid gegen Simian(Affen)-Immundefizienz-Virus
(SIV).
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Die
Festphasen-Peptidsynthese des modifizierten Peptids wird in einem
100 μmol-Maßstab unter
Verwendung manueller Festphasen-Synthese,
eines Symphony Peptide Synthesizers und Fmoc-geschütztem Rinkamid-MBHA durchgeführt. Die
folgenden geschützten
Aminosäuren
werden nacheinander dem Harz zugegeben: Fmoc-Lys(Aloc)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH,
Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Tyr(tBu)-OH, Fmoc-Met-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH,
Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH,
Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH,
Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Ala-OH,
Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH,
Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Asp(tBu)-OH,
Fmoc-Val-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Trp(Boc)-OH,
Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH,
Fmoc-Trp(Boc)-OH. Sie werden in N,N-Dimethylformamid (DMF) gelöst und gemäß der Sequenz
unter Verwendung von O-Benztriazol-1-yl-N,N,N',N'-tetramethyluroniumhexafluorophosphat
(HBTU) und Diisopropylethylamin (DIEA) aktiviert. Die Entfernung
der Fmoc-Schutzgruppe wird unter Verwendung einer Lösung von
20% (V/V) Piperidin in N,N-Dimethylformamid (DMF) für 20 Minuten
(Stufe 1) erreicht. Das selektive Entschützen der Lys(Aloc)-Gruppe wird
manuell durchgeführt
und durch Behandlung des Harzes mit einer Lösung von 3 Äqu. Pd(PPh3)4, gelöst
in 5 ml CHCl3:NMM:HOAc (18:1:0,5), für 2 Stunden
(Stufe 2) erreicht. Das Harz wird dann mit CHCl3 (6 × 5 ml),
20% HOAc in DCM (6 × 5
ml), DCM (6 × 5
ml) und DMF (6 × 5
ml) gewaschen. Die Synthese wird dann zur Zugabe der 3-Maleimidpropionsäure (Stufe
3) re-automatisiert. Zwischen jeder Kupplung wird das Harz dreimal
mit N,N-Dimethylformamid (DMF) und dreimal mit Isopropanol gewaschen.
Das Peptid wird vom Harz unter Verwendung von 85% TFA/5% TIS/5%
Thioanisol und 5% Phenol abgespalten und dann durch trockeneiskaltes Et2O (Stufe 4) ausgefällt. Das Produkt wird durch
präparative
Umkehrphasen-HPLC, unter Verwendung eines Varian(Rainin) präparativen,
binären
HPLC-Systems gereinigt: Gradienteneluierung von 30–55% B (0,045% TFA
in H2O (A) und 0,045% TFA in CH3CN
(B)) über
180 Minuten bei 9,5 ml/min unter Verwendung einer Phenomenex Luna-Säule (10 μ Phenyl-Hexyl, 21 mm × 25 cm)
und eines UV-Detektors (Varian Dynamax UVD II) bei λ214 und 254
nm, um das gewünschte
modifizierte Peptid (d. h. DAC) in einer Reinheit von > 95%, wie durch RP-HPLC
bestimmt, zu ergeben.
-
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BEISPIEL 22
-
Herstellung eines modifizierten Anti-SIV-Peptids
-
In
diesem Beispiel wird das Peptid SEQ ID NR 65 gemäß dem unten angegebenen Syntheseschema synthetisiert
und modifiziert, um einen Linker und eine Maleimidgruppe zu enthalten.
Wie die
US-PSen 6,013,236 und
6,020,459 berichten, zeigt
SEQ ID NR 65 eine potente antivirale Aktivität als rohes Peptid gegen Affen-Immundefizienz-Virus
(SIV).
-
Die
Festphasen-Peptidsynthese des modifizierten Peptids wird in einem
100 μmol-Maßstab unter
Verwendung manueller Festphasen-Synthese,
eines Symphony Peptide Synthesizers und Fmoc-geschütztem Rinkamid-MBHA durchgeführt. Die
folgenden geschützten
Aminosäuren
werden nacheinander dem Harz zugegeben: Fmoc-Lys(Aloc)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH,
Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Tyr(tBu)-OH,
Fmoc-Met-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH,
Fmoc-Gln(Trt)-OH,
Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH,
Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Ile-OH,
Fmoc-Asn(Trt)-OH,
Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Asp(tBu)-OH,
Fmoc-Val-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Trp(Boc)-OH,
Fmoc-Glu(tBu)-OH,
Fmoc-Gln(Trt)-OH. Sie werden in N,N-Dimethylformamid (DMF) gelöst und gemäß der Sequenz
unter Verwendung von O-Benztriazol-1-yl-N,N,N',N'-tetramethyluroniumhexafluorophosphat
(HBTU) und Diisopropylethylamin (DIEA) aktiviert. Die Entfernung
der Fmoc-Schutzgruppe wird unter Verwendung einer Lösung von
20% (V/V) Piperidin in N,N-Dimethylformamid (DMF) für 20 Minuten
(Stufe 1) erreicht. Das selektive Entschützen der Lys(Aloc)-Gruppe wird
manuell durchgeführt
und durch Behandlung des Harzes mit einer Lösung von 3 Äqu. Pd(PPh3)4, gelöst
in 5 ml CHCl3:NMM:HOAc (18:1:0,5), für 2 Stunden
(Stufe 2) erreicht. Das Harz wird dann mit CHCl3 (6 × 5 ml),
20% HOAc in DCM (6 × 5
ml), DCM (6 × 5
ml) und DMF (6 × 5
ml) gewaschen. Die Synthese wird dann zur Zugabe der 3-Maleimidpropionsäure (Stufe 3)
re-automatisiert. Zwischen jeder Kupplung wird das Harz dreimal
mit N,N-Dimethylformamid (DMF) und dreimal mit Isopropanol gewaschen.
Das Peptid wird vom Harz unter Verwendung von 85% TFA/5% TIS/5% Thioanisol
und 5% Phenol abgespalten und dann durch trockeneiskaltes Et2O (Stufe 4) ausgefällt. Das Produkt wird durch
präparative
Umkehrphasen-HPLC, unter Verwendung eines Varian(Rainin) präparativen,
binären HPLC-Systems
gereinigt: Gradienteneluierung von 30–55% B (0,045% TFA in H2O (A) und 0,045% TFA in CH3CN
(B)) über
180 Minuten bei 9,5 ml/min unter Verwendung einer Phenomenex Luna-Säule (10 μ Phenyl-Hexyl, 21 mm × 25 cm)
und eines UV-Detektors (Varian Dynamax UVD II) bei λ214 und 254
nm, um das gewünschte
modifizierte Peptid (d. h. DAC) in einer Reinheit von > 95%, wie durch RP-HPLC
bestimmt, zu ergeben.
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BEISPIEL 23
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Herstellung eines modifizierten Anti-SIV-Peptids
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In
diesem Beispiel wird das Peptid SEQ ID NR 66 gemäß dem unten angegebenen Syntheseschema synthetisiert
und modifiziert, um einen Linker und eine Maleimidgruppe zu enthalten.
Wie die
US-PSen 6,013,236 und
6,020,459 berichten, zeigt
SEQ ID NR 66 eine potente antivirale Aktivität als rohes Peptid gegen Affen-Immundefizienz-Virus
(SIV).
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Die
Festphasen-Peptidsynthese des modifizierten Peptids wird in einem
100 μmol-Maßstab unter
Verwendung manueller Festphasen-Synthese,
eines Symphony Peptide Synthesizers und Fmoc-geschütztem Rinkamid-MBHA durchgeführt. Die
folgenden geschützten
Aminosäuren
werden nacheinander dem Harz zugegeben: Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH,
Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Tyr(tBu)-OH,
Fmoc-Met-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH,
Fmoc-Gln(Trt)-OH,
Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH,
Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Ile-OH,
Fmoc-Asn(Trt)-OH,
Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Asp(tBu)-OH,
Fmoc-Val-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Trp(Boc)-OH,
Fmoc-Glu(tBu)-OH,
Fmoc-Lys(Aloc)-OH. Sie werden in N,N-Dimethylformamid (DMF) gelöst und gemäß der Sequenz
unter Verwendung von O-Benztriazol-1-yl-N,N,N',N'-tetramethyluroniumhexafluorophosphat
(HBTU) und Diisopropylethylamin (DIEA) aktiviert. Die Entfernung
der Fmoc-Schutzgruppe wird unter Verwendung einer Lösung von
20% (V/V) Piperidin in N,N-Dimethylformamid (DMF) für 20 Minuten
(Stufe 1) erreicht. Das selektive Entschützen der Lys(Aloc)-Gruppe wird
manuell durchgeführt
und durch Behandlung des Harzes mit einer Lösung von 3 Äqu. Pd(PPh3)4, gelöst
in 5 ml CHCl3:NMM:HOAc (18:1:0,5), für 2 Stunden
(Stufe 2) erreicht. Das Harz wird dann mit CHCl3 (6 × 5 ml),
20% HOAc in DCM (6 × 5
ml), DCM (6 × 5
ml) und DMF (6 × 5
ml) gewaschen. Die Synthese wird dann zur Zugabe der 3-Maleimidpropionsäure (Stufe 3)
re-automatisiert. Zwischen jeder Kupplung wird das Harz dreimal
mit N,N-Dimethylformamid (DMF) und dreimal mit Isopropanol gewaschen.
Das Peptid wird vom Harz unter Verwendung von 85% TFA/5% TIS/5% Thioanisol
und 5% Phenol abgespalten und dann durch trockeneiskaltes Et2O (Stufe 4) ausgefällt. Das Produkt wird durch
präparative
Umkehrphasen-HPLC, unter Verwendung eines Varian(Rainin) präparativen,
binären HPLC-Systems
gereinigt: Gradienteneluierung von 30–55% B (0,045% TFA in H2O (A) und 0,045% TFA in CH3CN
(B)) über
180 Minuten bei 9,5 ml/min unter Verwendung einer Phenomenex Luna-Säule (10 μ Phenyl-Hexyl, 21 mm × 25 cm)
und eines UV-Detektors (Varian Dynamax UVD II) bei λ214 und 254
nm, um das gewünschte
modifizierte Peptid (d. h. DAC) in einer Reinheit von > 95%, wie durch RP-HPLC
bestimmt, zu ergeben.
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BEISPIEL 24
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Herstellung eines modifizierten Anti-SIV-Peptids
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In
diesem Beispiel wird das Peptid SEQ ID NR 67 gemäß dem unten angegebenen Syntheseschema synthetisiert
und modifiziert, um einen Linker und eine Maleimidgruppe zu enthalten.
Wie die
US-PSen 6,013,236 und
6,020,459 berichten, zeigt
SEQ ID NR 67 eine potente antivirale Aktivität als rohes Peptid gegen Affen-Immundefizienz-Virus
(SIV).
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Die
Festphasen-Peptidsynthese des modifizierten Peptids wird in einem
100 μmol-Maßstab unter
Verwendung manueller Festphasen-Synthese,
eines Symphony Peptide Synthesizers und Fmoc-geschütztem Rinkamid-MBHA durchgeführt. Die
folgenden geschützten
Aminosäuren
werden nacheinander dem Harz zugegeben: Fmoc-Lys(Aloc)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH,
Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Tyr(tBu)-OH,
Fmoc-Met-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH,
Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Ile-OH,
Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Leu-OH,
Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH,
Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Asp(tBu)-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Arg(Pbf)-OH,
Fmoc-Glu(tBu)-OH,
Fmoc-Trp(Boc)-OH. Sie werden in N,N-Dimethylformamid (DMF) gelöst und gemäß der Sequenz
unter Verwendung von O-Benztriazol-1-yl-N,N,N',N'-tetramethyluroniumhexafluorophosphat
(HBTU) und Diisopropylethylamin (DIEA) aktiviert. Die Entfernung
der Fmoc-Schutzgruppe wird unter Verwendung einer Lösung von
20% (V/V) Piperidin in N,N-Dimethylformamid (DMF) für 20 Minuten
(Stufe 1) erreicht. Das selektive Entschützen der Lys(Aloc)-Gruppe wird
manuell durchgeführt
und durch Behandlung des Harzes mit einer Lösung von 3 Äqu. Pd(PPh3)4, gelöst
in 5 ml CHCl3:NMM:HOAc (18:1:0,5), für 2 Stunden
(Stufe 2) erreicht. Das Harz wird dann mit CHCl3 (6 × 5 ml),
20% HOAc in DCM (6 × 5
ml), DCM (6 × 5
ml) und DMF (6 × 5
ml) gewaschen. Die Synthese wird dann zur Zugabe der 3-Maleimidpropionsäure (Stufe 3)
re-automatisiert. Zwischen jeder Kupplung wird das Harz dreimal
mit N,N-Dimethylformamid (DMF) und dreimal mit Isopropanol gewaschen.
Das Peptid wird vom Harz unter Verwendung von 85% TFA/5% TIS/5% Thioanisol
und 5% Phenol abgespalten und dann durch trockeneiskaltes Et2O (Stufe 4) ausgefällt. Das Produkt wird durch
präparative
Umkehrphasen-HPLC, unter Verwendung eines Varian(Rainin) präparativen,
binären HPLC-Systems
gereinigt: Gradienteneluierung von 30–55% B (0,045% TFA in H2O (A) und 0,045% TFA in CH3CN
(B)) über
180 Minuten bei 9,5 ml/min unter Verwendung einer Phenomenex Luna-Säule (10 μ Phenyl-Hexyl, 21 mm × 25 cm)
und eines UV-Detektors (Varian Dynamax UVD II) bei λ214 und 254
nm, um das gewünschte
modifizierte Peptid (d. h. DAC) in einer Reinheit von > 95%, wie durch RP-HPLC
bestimmt, zu ergeben.
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BEISPIEL 25
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Herstellung eines modifizierten Anti-SIV-Peptids
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In
diesem Beispiel wird das Peptid SEQ ID NR 68 gemäß dem unten angegebenen Syntheseschema synthetisiert
und modifiziert, um einen Linker und eine Maleimidgruppe zu enthalten.
Wie die
US-PSen 6,013,236 und
6,020,459 berichten, zeigt
SEQ ID NR 68 eine potente antivirale Aktivität als rohes Peptid gegen Affen-Immundefizienz-Virus
(SIV).
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Die
Festphasen-Peptidsynthese des modifizierten Peptids wird in einem
100 μmol-Maßstab unter
Verwendung manueller Festphasen-Synthese,
eines Symphony Peptide Synthesizers und Fmoc-geschütztem Rinkamid-MBHA durchgeführt. Die
folgenden geschützten
Aminosäuren
werden nacheinander dem Harz zugegeben: Fmoc-Trp(Boc)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH,
Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Tyr(tBu)-OH,
Fmoc-Met-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH,
Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Ile-OH,
Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Leu-OH,
Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH,
Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Asp(tBu)-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Arg(Pbf)-OH,
Fmoc-Glu(tBu)-OH,
Boc-Lys(Aloc)-OH. Sie werden in N,N-Dimethylformamid (DMF) gelöst und gemäß der Sequenz
unter Verwendung von O-Benztriazol-1-yl-N,N,N',N'-tetramethyluroniumhexafluorophosphat
(HBTU) und Diisopropylethylamin (DIEA) aktiviert. Die Entfernung
der Fmoc-Schutzgruppe wird unter Verwendung einer Lösung von
20% (V/V) Piperidin in N,N-Dimethylformamid (DMF) für 20 Minuten
(Stufe 1) erreicht. Das selektive Entschützen der Lys(Aloc)-Gruppe wird
manuell durchgeführt
und durch Behandlung des Harzes mit einer Lösung von 3 Äqu. Pd(PPh3)4, gelöst
in 5 ml CHCl3:NMM:HOAc (18:1:0,5), für 2 Stunden
(Stufe 2) erreicht. Das Harz wird dann mit CHCl3 (6 × 5 ml),
20% HOAc in DCM (6 × 5
ml), DCM (6 × 5
ml) und DMF (6 × 5
ml) gewaschen. Die Synthese wird dann zur Zugabe der 3-Maleimidpropionsäure (Stufe 3)
re-automatisiert. Zwischen jeder Kupplung wird das Harz dreimal
mit N,N-Dimethylformamid (DMF) und dreimal mit Isopropanol gewaschen.
Das Peptid wird vom Harz unter Verwendung von 85% TFA/5% TIS/5% Thioanisol
und 5% Phenol abgespalten und dann durch trockeneiskaltes Et2O (Stufe 4) ausgefällt. Das Produkt wird durch
präparative
Umkehrphasen-HPLC, unter Verwendung eines Varian(Rainin) präparativen,
binären HPLC-Systems
gereinigt: Gradienteneluierung von 30–55% B (0,045% TFA in H2O (A) und 0,045% TFA in CH3CN
(B)) über
180 Minuten bei 9,5 ml/min unter Verwendung einer Phenomenex Luna-Säule (10 μ Phenyl-Hexyl, 21 mm × 25 cm)
und eines UV-Detektors (Varian Dynamax UVD II) bei λ214 und 254
nm, um das gewünschte
modifizierte Peptid (d. h. DAC) in einer Reinheit von > 95%, wie durch RP-HPLC
bestimmt, zu ergeben.
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BEISPIEL 26
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Herstellung eines modifizierten Anti-SIV-Peptids
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In
diesem Beispiel wird das Peptid SEQ ID NR 69 gemäß dem unten angegebenen Syntheseschema synthetisiert
und modifiziert, um einen Linker und eine Maleimidgruppe zu enthalten.
Wie die
US-PSen 6,013,236 und
6,020,459 berichten, zeigt
SEQ ID NR 69 eine potente antivirale Aktivität als rohes Peptid gegen Affen-Immundefizienz-Virus
(SIV).
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Die
Festphasen-Peptidsynthese des modifizierten Peptids wird in einem
100 μmol-Maßstab unter
Verwendung manueller Festphasen-Synthese,
eines Symphony Peptide Synthesizers und Fmoc-geschütztem Rinkamid-MBHA durchgeführt. Die
folgenden geschützten
Aminosäuren
werden nacheinander dem Harz zugegeben: Fmoc-Lys(Aloc)-OH, Fmoc-Asp(tBu)-OH, Fmoc-Trp(Boc)-OH,
Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH,
Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH,
Fmoc-Tyr(tBu)-OH,
Fmoc-Met-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH,
Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH,
Fmoc-Glu(tBu)-OH,
Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Ile-OH,
Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Leu-OH,
Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Asp(tBu)-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Arg(Pbf)-OH.
Sie werden in N,N-Dimethylformamid (DMF) gelöst und gemäß der Sequenz unter Verwendung
von O-Benztriazo1-1-yl-N,N,N',N'-tetramethyluroniumhexafluorophosphat
(HBTU) und Diisopropylethylamin (DIEA) aktiviert. Die Entfernung
der Fmoc-Schutzgruppe wird unter Verwendung einer Lösung von
20% (V/V) Piperidin in N,N-Dimethylformamid (DMF) für 20 Minuten
(Stufe 1) erreicht. Das selektive Entschützen der Lys(Aloc)-Gruppe wird
manuell durchgeführt
und durch Behandlung des Harzes mit einer Lösung von 3 Äqu. Pd(PPh3)4, gelöst
in 5 ml CHCl3:NMM:HOAc (18:1:0,5), für 2 Stunden
(Stufe 2) erreicht. Das Harz wird dann mit CHCl3 (6 × 5 ml),
20% HOAc in DCM (6 × 5
ml), DCM (6 × 5
ml) und DMF (6 × 5
ml) gewaschen. Die Synthese wird dann zur Zugabe der 3-Maleimidpropionsäure (Stufe
3) re-automatisiert. Zwischen jeder Kupplung wird das Harz dreimal
mit N,N-Dimethylformamid (DMF) und dreimal mit Isopropanol gewaschen.
Das Peptid wird vom Harz unter Verwendung von 85% TFA/5% TIS/5%
Thioanisol und 5% Phenol abgespalten und dann durch trockeneiskaltes Et2O (Stufe 4) ausgefällt. Das Produkt wird durch
präparative
Umkehrphasen-HPLC, unter Verwendung eines Varian(Rainin) präparativen,
binären
HPLC-Systems gereinigt: Gradienteneluierung von 30–55% B (0,045% TFA
in H2O (A) und 0,045% TFA in CH3CN
(B)) über
180 Minuten bei 9,5 ml/min unter Verwendung einer Phenomenex Luna-Säule (10 μ Phenyl-Hexyl, 21 mm × 25 cm)
und eines UV-Detektors (Varian Dynamax UVD II) bei λ214 und 254
nm, um das gewünschte
modifizierte Peptid (d. h. DAC) in einer Reinheit von > 95%, wie durch RP-HPLC
bestimmt, zu ergeben.
-
-
BEISPIEL 27
-
Herstellung eines modifizierten Anti-SIV-Peptids
-
In
diesem Beispiel wird das Peptid SEQ ID NR 70 gemäß dem unten angegebenen Syntheseschema synthetisiert
und modifiziert, um einen Linker und eine Maleimidgruppe zu enthalten.
Wie die
US-PSen 6,013,236 und
6,020,459 berichten, zeigt
SEQ ID NR 70 eine potente antivirale Aktivität als rohes Peptid gegen Affen-Immundefizienz-Virus
(SIV).
-
Die
Festphasen-Peptidsynthese des modifizierten Peptids wird in einem
100 μmol-Maßstab unter
Verwendung manueller Festphasen-Synthese,
eines Symphony Peptide Synthesizers und Fmoc-geschütztem Rinkamid-MBHA durchgeführt. Die
folgenden geschützten
Aminosäuren
werden nacheinander dem Harz zugegeben: Fmoc-Val-OH, Fmoc-Asp(tBu)-OH, Fmoc-Trp(Boc)-OH,
Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH,
Fmoc-Gln(Trt)-OH,
Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Tyr(tBu)-OH, Fmoc-Met-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH,
Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Ile-OH,
Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH,
Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH,
Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Asp(tBu)-OH, Fmoc-Val-OH,
Fmoc-Lys(Boc)-OH, Boc-Lys(Aloc)-OH. Sie werden in N,N-Dimethylformamid
(DMF) gelöst
und gemäß der Sequenz
unter Verwendung von O-Benztriazol-1-yl-N,N,N',N'-tetramethyluroniumhexafluorophosphat
(HBTU) und Diisopropylethylamin (DIEA) aktiviert. Die Entfernung
der Fmoc-Schutzgruppe
wird unter Verwendung einer Lösung
von 20% (V/V) Piperidin in N,N-Dimethylformamid (DMF) für 20 Minuten
(Stufe 1) erreicht. Das selektive Entschützen der Lys(Aloc)-Gruppe wird
manuell durchgeführt
und durch Behandlung des Harzes mit einer Lösung von 3 Äqu. Pd(PPh3)4, gelöst
in 5 ml CHCl3:NMM:HOAc (18:1:0,5), für 2 Stunden
(Stufe 2) erreicht. Das Harz wird dann mit CHCl3 (6 × 5 ml),
20% HOAc in DCM (6 × 5
ml), DCM (6 × 5
ml) und DMF (6 × 5
ml) gewaschen. Die Synthese wird dann zur Zugabe der 3-Maleimidpropionsäure (Stufe
3) re-automatisiert. Zwischen jeder Kupplung wird das Harz dreimal
mit N,N-Dimethylformamid (DMF) und dreimal mit Isopropanol gewaschen.
Das Peptid wird vom Harz unter Verwendung von 85% TFA/5% TIS/5%
Thioanisol und 5% Phenol abgespalten und dann durch trockeneiskaltes Et2O (Stufe 4) ausgefällt. Das Produkt wird durch
präparative
Umkehrphasen-HPLC, unter Verwendung eines Varian(Rainin) präparativen,
binären
HPLC-Systems gereinigt: Gradienteneluierung von 30–55% B (0,045% TFA
in H2O (A) und 0,045% TFA in CH3CN
(B)) über
180 Minuten bei 9,5 ml/min unter Verwendung einer Phenomenex Luna-Säule (10 μ Phenyl-Hexyl,
21 mm × 25
cm) und eines UV-Detektors (Varian Dynamax UVD II) bei λ214 und 254
nm, um das gewünschte
modifizierte Peptid (d. h. DAC) in einer Reinheit von > 95%, wie durch RP-HPLC bestimmt, zu
ergeben.
-
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BEISPIEL 28
-
Herstellung eines modifizierten Anti-SIV-Peptids
-
In
diesem Beispiel wird das Peptid SEQ ID NR 71 gemäß dem unten angegebenen Syntheseschema synthetisiert
und modifiziert, um einen Linker und eine Maleimidgruppe zu enthalten.
Wie die
US-PSen 6,013,236 und
6,020,459 berichten, zeigt
SEQ ID NR 71 eine potente antivirale Aktivität als rohes Peptid gegen Affen-Immundefizienz-Virus
(SIV).
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Die
Festphasen-Peptidsynthese des modifizierten Peptids wird in einem
100 μmol-Maßstab unter
Verwendung manueller Festphasen-Synthese,
eines Symphony Peptide Synthesizers und Fmoc-geschütztem Rinkamid-MBHA durchgeführt. Die
folgenden geschützten
Aminosäuren
werden nacheinander dem Harz zugegeben: Fmoc-Lys(Aloc)-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Val-OH,
Fmoc-Asp(tBu)-OH, Fmoc-Trp(Boc)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH,
Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Leu-OH,
Fmoc-Glu(tBu)-OH,
Fmoc-Tyr(tBu)-OH, Fmoc-Met-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH,
Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH,
Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH,
Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Ile-OH,
Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH,
Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Asp(tBu)-OH, Fmoc-Val-OH.
Sie werden in N,N-Dimethylformamid (DMF) gelöst und gemäß der Sequenz unter Verwendung
von O-Benztriazol-1-yl-N,N,N',N'-tetramethyluroniumhexafluorophosphat
(HBTU) und Diisopropylethylamin (DIEA) aktiviert. Die Entfernung
der Fmoc-Schutzgruppe
wird unter Verwendung einer Lösung
von 20% (V/V) Piperidin in N,N-Dimethylformamid (DMF) für 20 Minuten
(Stufe 1) erreicht. Das selektive Entschützen der Lys(Aloc)-Gruppe wird
manuell durchgeführt
und durch Behandlung des Harzes mit einer Lösung von 3 Äqu. Pd(PPh3)4, gelöst
in 5 ml CHCl3:NMM:HOAc (18:1:0,5), für 2 Stunden
(Stufe 2) erreicht. Das Harz wird dann mit CHCl3 (6 × 5 ml),
20% HOAc in DCM (6 × 5
ml), DCM (6 × 5
ml) und DMF (6 × 5
ml) gewaschen. Die Synthese wird dann zur Zugabe der 3-Maleimidpropionsäure (Stufe
3) re-automatisiert. Zwischen jeder Kupplung wird das Harz dreimal
mit N,N-Dimethylformamid (DMF) und dreimal mit Isopropanol gewaschen.
Das Peptid wird vom Harz unter Verwendung von 85% TFA/5% TIS/5%
Thioanisol und 5% Phenol abgespalten und dann durch trockeneiskaltes
Et2O (Stufe 4) ausgefällt. Das Produkt wird durch
präparative
Umkehrphasen-HPLC, unter Verwendung eines Varian(Rainin) präparativen,
binären
HPLC-Systems gereinigt: Gradienteneluierung von 30–55% B (0,045%
TFA in H2O (A) und 0,045% TFA in CH3CN (B)) über
180 Minuten bei 9,5 ml/min unter Verwendung einer Phenomenex Luna-Säule (10 μ Phenyl-Hexyl,
21 mm × 25
cm) und eines UV-Detektors (Varian Dynamax UVD II) bei λ214 und 254
nm, um das gewünschte
modifizierte Peptid (d. h. DAC) in einer Reinheit von > 95%, wie durch RP-HPLC bestimmt, zu
ergeben.
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-
BEISPIEL 29
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Herstellung eines modifizierten Anti-SIV-Peptids
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In
diesem Beispiel wird das Peptid SEQ ID NR 72 gemäß dem unten angegebenen Syntheseschema synthetisiert
und modifiziert, um einen Linker und eine Maleimidgruppe zu enthalten.
Wie die
US-PSen 6,013,236 und
6,020,459 berichten, zeigt
SEQ ID NR 72 eine potente antivirale Aktivität als rohes Peptid gegen Affen-Immundefizienz-Virus
(SIV).
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Die
Festphasen-Peptidsynthese des modifizierten Peptids wird in einem
100 μmol-Maßstab unter
Verwendung manueller Festphasen-Synthese,
eines Symphony Peptide Synthesizers und Fmoc-geschütztem Rinkamid-MBHA durchgeführt. Die
folgenden geschützten
Aminosäuren
werden nacheinander dem Harz zugegeben: Fmoc-Lys(Aloc)-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Phe-OH,
Fmoc-Val-OH, Fmoc-Asp(tBu)-OH, Fmoc-Trp(Boc)-OH,
Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH,
Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH,
Fmoc-Tyr(tBu)-OH, Fmoc-Met-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH,
Fmoc-Gln(Trt)-OH,
Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH,
Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Ile-OH,
Fmoc-Asn(Trt)-OH,
Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Asp(tBu)-OH.
Sie werden in N,N-Dimethylformamid (DMF) gelöst und gemäß der Sequenz unter Verwendung
von O-Benztriazol-1-yl-N,N,N',N'-tetramethyluroniumhexafluorophosphat
(HBTU) und Diisopropylethylamin (DIEA) aktiviert. Die Entfernung
der Fmoc-Schutzgruppe wird unter Verwendung einer Lösung von
20% (V/V) Piperidin in N,N-Dimethylformamid (DMF) für 20 Minuten
(Stufe 1) erreicht. Das selektive Entschützen der Lys(Aloc)-Gruppe wird
manuell durchgeführt
und durch Behandlung des Harzes mit einer Lösung von 3 Äqu. Pd(PPh3)4, gelöst
in 5 ml CHCl3:NMM:HOAc (18:1:0,5), für 2 Stunden
(Stufe 2) erreicht. Das Harz wird dann mit CHCl3 (6 × 5 ml),
20% HOAc in DCM (6 × 5
ml), DCM (6 × 5
ml) und DMF (6 × 5
ml) gewaschen. Die Synthese wird dann zur Zugabe der 3-Maleimidpropionsäure (Stufe
3) re-automatisiert. Zwischen jeder Kupplung wird das Harz dreimal
mit N,N-Dimethylformamid (DMF) und dreimal mit Isopropanol gewaschen.
Das Peptid wird vom Harz unter Verwendung von 85 TFA/5% TIS/5% Thioanisol
und 5% Phenol abgespalten und dann durch trockeneiskaltes Et2O (Stufe 4) ausgefällt. Das Produkt wird durch
präparative
Umkehrphasen-HPLC, unter Verwendung eines Varian(Rainin) präparativen,
binären
HPLC-Systems gereinigt: Gradienteneluierung von 30–55% B (0,045%
TFA in H2O (A) und 0,045% TFA in CH3CN (B)) über
180 Minuten bei 9,5 ml/min unter Verwendung einer Phenomenex Luna-Säule (10 μ Phenyl-Hexyl,
21 mm × 25
cm) und eines UV-Detektors (Varian Dynamax UVD II) bei λ214 und 254
nm, um das gewünschte
modifizierte Peptid (d. h. DAC) in einer Reinheit von > 95%, wie durch RP-HPLC bestimmt, zu
ergeben.
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BEISPIEL 30
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Herstellung eines modifizierten Anti-SIV-Peptids
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In
diesem Beispiel wird das Peptid SEQ ID NR 73 gemäß dem unten angegebenen Syntheseschema synthetisiert
und modifiziert, um einen Linker und eine Maleimidgruppe zu enthalten.
Wie die
US-PSen 6,013,236 und
6,020,459 berichten, zeigt
SEQ ID NR 73 eine potente antivirale Aktivität als rohes Peptid gegen Affen-Immundefizienz-Virus
(SIV).
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Die
Festphasen-Peptidsynthese des modifizierten Peptids wird in einem
100 μmol-Maßstab unter
Verwendung manueller Festphasen-Synthese,
eines Symphony Peptide Synthesizers und Fmoc-geschütztem Rinkamid-MBHA durchgeführt. Die
folgenden geschützten
Aminosäuren
werden nacheinander dem Harz zugegeben: Fmoc-Lys(Aloc)-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Gly-OH,
Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Asp(tBu)-OH,
Fmoc-Trp(Boc)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH,
Fmoc-Gln(Trt)-OH,
Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Tyr(tBu)-OH, Fmoc-Met-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH,
Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Ile-OH,
Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Leu-OH,
Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH,
Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Phe-OH. Sie werden in N,N-Dimethylformamid (DMF)
gelöst
und gemäß der Sequenz
unter Verwendung von O-Benztriazol-1-yl-N,N,N',N'-tetramethyluroniumhexafluorophosphat
(HBTU) und Diisopropylethylamin (DIEA) aktiviert. Die Entfernung
der Fmoc-Schutzgruppe
wird unter Verwendung einer Lösung
von 20% (V/V) Piperidin in N,N-Dimethylformamid (DMF) für 20 Minuten
(Stufe 1) erreicht. Das selektive Entschützen der Lys(Aloc)-Gruppe wird
manuell durchgeführt
und durch Behandlung des Harzes mit einer Lösung von 3 Äqu. Pd(PPh3)4, gelöst
in 5 ml CHCl3:NMM:HOAc (18:1:0,5), für 2 Stunden
(Stufe 2) erreicht. Das Harz wird dann mit CHCl3 (6 × 5 ml),
20% HOAc in DCM (6 × 5
ml), DCM (6 × 5
ml) und DMF (6 × 5
ml) gewaschen. Die Synthese wird dann zur Zugabe der 3-Maleimidpropionsäure (Stufe
3) re-automatisiert. Zwischen jeder Kupplung wird das Harz dreimal
mit N,N-Dimethylformamid (DMF) und dreimal mit Isopropanol gewaschen.
Das Peptid wird vom Harz unter Verwendung von 85% TFA/5% TIS/5%
Thioanisol und 5% Phenol abgespalten und dann durch trockeneiskaltes
Et2O (Stufe 4) ausgefällt. Das Produkt wird durch
präparative
Umkehrphasen-HPLC, unter Verwendung eines Varian(Rainin) präparativen,
binären
HPLC-Systems gereinigt: Gradienteneluierung von 30–55% B (0,045%
TFA in H2O (A) und 0,045% TFA in CH3CN (B)) über
180 Minuten bei 9,5 ml/min unter Verwendung einer Phenomenex Luna-Säule (10 μ Phenyl-Hexyl,
21 mm × 25
cm) und eines UV-Detektors (Varian Dynamax UVD II) bei λ214 und 254
nm, um das gewünschte
modifizierte Peptid (d. h. DAC) in einer Reinheit von > 95%, wie durch RP-HPLC bestimmt, zu
ergeben.
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Während bestimmte
Ausführungsformen
der vorliegenden Erfindung beschrieben worden und beispielhaft angegeben
worden sind, wird ein Fachmann auf dem Gebiet in Betracht ziehen,
dass die Erfindung nicht auf die spezifischen Ausführungsformen
beschränkt
sein sollen, sondern sie wird durch die nachfolgenden Ansprüche definiert. TABELLE
2
-
Es
wurde der Aminosäure-Code
mit einem Buchstaben aus Tabelle 1 verwendet. TABELLE
3
-
Es
wurde der Aminosäure-Code
mit einem Buchstaben aus Tabelle 1 verwendet. TABELLE
4
-
Es
wurde der Aminosäure-Code
mit einem Buchstaben aus Tabelle 1 verwendet. TABELLE
5
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Es
wurde der Aminosäure-Code
mit einem Buchstaben aus Tabelle 1 verwendet. TABELLE
6
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Es
wurde der Aminosäure-Code
mit einem Buchstaben aus Tabelle 1 verwendet. TABELLE
7
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Es
wurde der Aminosäure-Code
mit einem Buchstaben aus Tabelle 1 verwendet. TABELLE
8
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Es
wurde der Aminosäure-Code
mit einem Buchstaben aus Tabelle 1 verwendet. TABELLE
9
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Es
wurde der Aminosäure-Code
mit einem Buchstaben aus Tabelle 1 verwendet. TABELLE
10
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Es
wurde der Aminosäure-Code
mit einem Buchstaben aus Tabelle 1 verwendet. TABELLE
11
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Es
wurde der Aminosäure-Code
mit einem Buchstaben aus Tabelle 1 verwendet. TABELLE
12
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Es
wurde der Aminosäure-Code
mit einem Buchstaben aus Tabelle 1 verwendet. TABELLE
13
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Es
wurde der Aminosäure-Code
mit einem Buchstaben aus Tabelle 1 verwendet. TABELLE
14
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Es
wurde der Aminosäure-Code
mit einem Buchstaben aus Tabelle 1 verwendet. TABELLE
15
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Es
wurde der Aminosäure-Code
mit einem Buchstaben aus Tabelle 1 verwendet. TABELLE
16
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Es
wurde der Aminosäure-Code
mit einem Buchstaben aus Tabelle 1 verwendet. TABELLE
17
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Es
wurde der Aminosäure-Code
mit einem Buchstaben aus Tabelle 1 verwendet. TABELLE
18
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Es
wurde der Aminosäure-Code
mit einem Buchstaben aus Tabelle 1 verwendet. TABELLE
19
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Es
wurde der Aminosäure-Code
mit einem Buchstaben aus Tabelle 1 verwendet.