DE4329004A1

DE4329004A1 - Monoclonal antibodies against the Thomsen-Friedenreich antigen, their preparation and their use for tumour detection

Info

Publication number: DE4329004A1
Application number: DE19934329004
Authority: DE
Inventors: Uwe Dr Karsten; Guenter Dr Butschak; Margit Haase; Margot Kiefer
Original assignee: Max Delbrueck Centrum fuer Molekulare in der Helmholtz Gemeinschaft
Current assignee: Max Delbrueck Centrum fuer Molekulare in der Helmholtz Gemeinschaft
Priority date: 1993-08-28
Filing date: 1993-08-28
Publication date: 1995-03-09

Abstract

The invention relates to monoclonal antibodies against the Thomsen-Friedenreich antigen and to their use for the immunological and immunohistological detection of tumours. The antibodies belong to class M and have a high specificity and avidity. The areas of application of the invention are medical diagnosis and the pharmaceutical industry.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft monoklonale Antikörper gegen das Thomsen-Friedenreich-Antigen (TF-Antigen), ein Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Verwendung zum immunologischen und immunhistologischen Tumornachweis. Anwendungsgebiete der Erfindung sind die medizinische Diagnostik und die pharma zeutische Industrie.The present invention relates to monoclonal antibodies against the Thomsen-Friedenreich antigen (TF antigen), a method of their manufacture and their use for immunological and immunohistological tumor detection. Areas of application of the Invention are medical diagnostics and pharma ceutical industry.

Das TF-Antigen ist ein weit verbreitetes menschliches Tumorantigen, das auf normalen Körperzellen nicht vorkommt. Es eignet sich daher zur Unterscheidung von normalen Zellen und Tumorzellen sowie auch zu immuntherapeutischen Ansätzen.The TF antigen is a widely used human Tumor antigen that does not appear on normal body cells. It is therefore suitable for differentiating between normal cells and Tumor cells as well as immunotherapeutic approaches.

Es ist bekannt, daß bereits Antikörper gegen dieses Antigen hergestellt wurden. Die Herstellung monoklonaler Antikörper wurde z. B. von I. Steuden et al, Glycoconjugate J. 2, 203 (1985), beschrieben.It is known that antibodies against this antigen already exist were manufactured. The production of monoclonal antibodies z. B. by I. Steuden et al, Glycoconjugate J. 2, 203 (1985).

Es wurden auch schon Versuche unternommen, Tumornachweise mit Hilfe solcher Antikörper zu entwickeln. Die Schwierigkeit bei diesen Versuchen besteht darin, daß im Serum von Tumorpatienten neben dem TF-Antigen gleichzeitig Anti-TF-Antikörper sowie Antigen-Antikörper-Komplexe vorliegen. Deshalb werden an die Spezifität der einzusetzenden monoklonalen Antikörper hohe Anforderungen gestellt, die von den bisher bekannten Antikörpern nicht erfüllt worden sind.Attempts have also been made to use tumor evidence Help develop such antibodies. The difficulty with These attempts consist in that in the serum of tumor patients in addition to the TF antigen, anti-TF antibodies and Antigen-antibody complexes are present. Therefore, the Specificity of the monoclonal antibodies to be used is high Requirements made by the previously known antibodies have not been met.

Die Erfindung hat das Ziel, den Tumornachweis zu verbessern. Ihr liegt die Aufgabe zugrunde, monoklonale Antikörper gegen das TF- Antigen bereitzustellen, die eine hohe Spezifität aufweisen und in der genannten Zielrichtung verwendet werden können.The aim of the invention is to improve tumor detection. your is based on the task of monoclonal antibodies against the TF To provide antigen that have a high specificity and can be used in the stated direction.

Die Aufgabe der Erfindung wird gemäß den Ansprüchen 1, 7, 12 und 13 gelöst, die Unteransprüche sind Vorzugsvarianten. The object of the invention is according to claims 1, 7, 12 and 13 solved, the subclaims are preferred variants.

Die Hybridzellen werden erfindungsgemäß hergestellt durchAccording to the invention, the hybrid cells are produced by

A. Immunization of laboratory animals, primarily mice, with natural or synthetically produced TF antigen,
B. Isolation of Lymphocytes from Experimental Animals and Immortalization of the lymphocytes by cell fusion with suitable Myeloma cells or another suitable immortalis method,
C. Selection of the approximately 10,000 immortalized obtained thereafter Cell clones,
D. Testing the immortalized cell lines for the production of Antibodies against the TF antigen,
E. Cloning of cells from cultures that have antibodies against produce the TF antigen, replicate these cell clones and Obtaining the specific produced by these cells Antibodies and
F. Determination of the fine specificity of the antibodies.

Zur Immunisierung wird entweder menschliches Glykophorin A, dessen Neuraminsäurereste abgespalten wurden, oder synthetisch hergestelltes und an Serumalbumin chemisch gebundenes TF-Antigen eingesetzt. Als Versuchstiere für die Immunisierung werden Mäuse, in erster Linie BALB/c-Mäuse, benutzt. Die Immortalisierung der aus den Versuchstieren gewonnenen Lymphozyten wird vorzugsweise durch Zellfusion mit Myelomzellen der Linie X63-Ag8.653 unter Zusatz von Polyethylenglykol (PEG) durchgeführt.For immunization either human glycophorin A, whose neuraminic acid residues have been split off, or synthetically TF antigen produced and chemically bound to serum albumin used. Be used as laboratory animals for immunization Mice, primarily BALB / c mice, used. The Immortalization of those obtained from the experimental animals Lymphocytes are preferentially by cell fusion with myeloma cells the line X63-Ag8.653 with the addition of polyethylene glycol (PEG) performed.

Die fusionierten Zellen werden durch ein selektives Kulturmedium isoliert, vorzugsweise durch Azaserin. Die immunologische Auswahl erfolgt aus ca. 10000 insgesamt gewachsenen Klonen, aus denen die Hybridzellklone mit der besten Spezifität gegen TF- Antigen isoliert werden. Im Falle der Immunisierung mit menschlichem Glykophorin A, dessen Neuraminsäurereste abgespalten wurden, wurde als aktivster Zellklon A78-G/A7 erhalten. Im Falle der Immunisierung mit synthetischem und an Serumalbumin chemisch gebundenem TF-Antigen wurde als aktivster Zellklon A68-B/A11 erhalten.The fused cells are passed through a selective culture medium isolated, preferably by azaserine. The immunological Selection is made from approximately 10,000 clones grown in total which the hybrid cell clones with the best specificity against TF- Antigen can be isolated. In case of immunization with human glycophorin A, its neuraminic acid residues were cleaved, was the most active cell clone A78-G / A7 receive. In case of immunization with synthetic and an Serum albumin chemically bound TF antigen was found to be the most active Cell clone A68-B / A11 obtained.

Die Zellklone haben folgende Eigenschaften:The cell clones have the following properties:

A78-G / A7

Spezifität gegen das alpha- und beta-Anomere des TF-Antigens sowie das Gangliosid Asialo- G_ml.Specificity against the alpha and beta anomer of the TF antigen and the ganglioside asialo G _ml .

Ig-Klasse M. Geeignet für Gefrier- und Paraffinschnitte, Enzymimmunoassays und Hämagglutinationstests. Hinsichtlich der Assaybedingungen sehr variabel und daher in vielen Assays einsetzbar, hohe Avidität.Ig class M. Suitable for frozen and paraffin sections, Enzyme immunoassays and hemagglutination tests. With regard to the Assay conditions very variable and therefore in many assays applicable, high avidity.

A68-B / A11

Spezifität vorwiegend gegen das Beta-Anomere des TF-Antigens und TF-verwandte Glykolipide (Asialo-G_ml). Hohe Avidität. Ig-Klasse M. Geeignet vorzugsweise für Gefrierschnitte.Specificity predominantly against the beta anomer of the TF antigen and TF-related glycolipids (Asialo-G _ml ). High avidity. Ig class M. Suitable preferably for frozen sections.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung der erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper als Nachweisreagenzien. Sie können zum immunhistologischen Nachweis von Tumoren vorteilhaft verwendet werden. Dabei wird der Kulturüberstand (konditioniertes Kulturmedium) der betreffenden Hybridomzellinien oder gereinigter Antikörper in geeigneter Verdünnung eingesetzt. Der Test selbst wird nach einer gängigen histologischen Technik an Gefrier- oder Paraffinschnitten durchgeführt, z. B. mittels der sogenannten ABC-Technik. Besonders geeignet für diese Methode sind die von der Hybridzellinie A78-G/A7 produzierten Antikörper.Another object of the present invention is Use of the monoclonal antibodies according to the invention as Detection reagents. They can be used for immunohistological detection can be used advantageously by tumors. The Culture supernatant (conditioned culture medium) of the concerned Hybridoma cell lines or purified antibodies in a suitable Dilution used. The test itself is based on a common histological technique on frozen or paraffin sections performed, e.g. B. using the so-called ABC technique. Those from the are particularly suitable for this method Hybrid cell line A78-G / A7 produced antibodies.

Die erfindungsgemäßen Antikörper können gleichermaßen zum immunologischen Nachweis von Tumoren in Körperflüssigkeiten wie z. B. Blutplasma eingesetzt werden. Dabei ist es notwendig, die gleichzeitige Anwesenheit von Antigen, Antikörpern und Antigen- Antikörper-Komplexen zu berücksichtigen.The antibodies according to the invention can be used for immunological detection of tumors in body fluids such as e.g. B. blood plasma can be used. It is necessary that simultaneous presence of antigen, antibodies and antigen Antibody complexes to consider.

Ein anderes Einsatzgebiet ist der Nachweis von TF-Antigen und verwandten Antigenen auf Glykolipiden. Dieser Nachweis ist vor allem in der medizinisch-biologischen Grundlagenforschung von Bedeutung.Another area of application is the detection of TF antigen and related antigens on glycolipids. This proof is given especially in the basic medical-biological research of Meaning.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung der erfindungsgemäßen Antikörper zur Isolierung und Reinigung von TF-Antigen. Dafür sind vor allem die von der Hybridzellinie A78-G/A7 produzierten Antikörper geeignet.Another object of the invention is the use of Antibodies according to the invention for the isolation and purification of TF antigen. This is mainly due to the hybrid cell line A78-G / A7 suitable antibodies produced.

Durch die Erfindung wird ermöglicht, den Nachweis des TF- Antigens exakter als bisher durchzuführen. Der Einsatz der erfindungsgemäßen Antikörper sichert, daß eine immunologische Reaktion definitiv nur mit einem Epitop des TF-Antigens erfolgt. Dadurch ist eine hohe Spezifität gegeben, und die Ergebnisse mit verschiedenen Proben sind reproduzierbar. Deshalb sind die erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper besonders geeignet für die Früherkennung und den Nachweis verschiedener Tumore sowohl auf immunhistologischem wie auf immunologischem Wege.The invention enables the detection of the TF Antigen more precise than before. The use of the Antibody according to the invention ensures that an immunological The reaction is definitely only with an epitope of the TF antigen. This gives a high level of specificity, and the results with different samples are reproducible. That is why they are monoclonal antibodies according to the invention particularly suitable for the early detection and detection of various tumors both immunohistologically as well as immunologically.

Die Erfindung soll nachfolgend durch Ausführungsbeispiele näher erläutert werden. The invention is intended to be explained in more detail below by means of exemplary embodiments are explained.

Embodiments Example 1 Production of the hybridoma cell line A78-G / A7 and antibodies

Inzuchtmäuse des Stammes Balb/c wurden intraperitoneal mit 100 µg Asialo-Glykophorin (Sigma, Deisenhofen) in PBS, gemischt mit komplettem Freundschem Adjuvans, immunisiert. Nach 24 h wurden 100 mg/kg Körpergewicht Cyclophosphamid in PBS, ebenfalls i. p. verabreicht. Zwei Wochen später (4 Tage vor Entnahme der Milzzellen) wurde mit 100 µg Asialo-Glykophorin ohne Adjuvans nachimmunisiert.Inbred mice of the Balb / c strain were intraperitoneally at 100 µg Asialo-glycophorin (Sigma, Deisenhofen) in PBS mixed with complete Freund's adjuvant, immunized. After 24 hours, 100 mg / kg body weight cyclophosphamide in PBS, also i. p. administered. Two weeks later (4 days before taking the Spleen cells) was treated with 100 µg asialo-glycophorin without adjuvant post-immunized.

Aspetisch präparierte Milzzellen einer wie vorstehend beschrieben immunisierten Maus wurden nach Standardmethoden (Peters, H. H., et al.: "Monoklonale Antikörper, Herstellung und Charakterisierung", Springer, Berlin 1985: Karsten. U., et al. , Methods in Enzymology 220, 228, 1993) mit Hilfe von Polyethylenglykol mit Maus- Myelomzellen der Zellinie X63-AgS. 653 (Kearney, J. F., et al., J. Immunol. 123, 1548, 1979) fusioniert. Die Selektion der Hybridome erfolgte in Mikrotestplatten in einem Selektionsmedium mit Azaserin. das Hybridomwachstum wurde mit Peritoneal- Feederzellen von Balb/c-Mäusen gefördert.Aspetically prepared spleen cells as described above Immunized mice were prepared using standard methods (Peters, H.H., et al .: "Monoclonal Antibodies, Production and Characterization", Springer, Berlin 1985: Karsten. U., et al. , Methods in Enzymology 220, 228, 1993) using polyethylene glycol with mouse Myeloma cells from the X63-AgS cell line. 653 (Kearney, J.F., et al., J. Immunol. 123, 1548, 1979). The selection of the Hybridomas were carried out in microtest plates in a selection medium with azaserine. hybridoma growth was peritoneal Feeder cells promoted by Balb / c mice.

Die Testung der Kulturüberstände auf spezifische Antikörper gegen das TE-Antigen erfolgte in Enzymimmunoassays sowie in der Immunfluoreszenz. Für den Enzymimmunoassay wurden Asialo- Glykophorin (2 µg/ml. 50 µl pro Well) bzw. Glykophorin (als Negativkontrolle: gleiche Konzentration) an die feste Phase von Mikrotestplatten gebunden. Dann wurden je 50 µl des zu prüfenden Kulturüberstandes dazugegeben und inkubiert. Der Nachweis spezifischer Antikörper erfolgte über Peroxidase-markiertes Kaninchen-Anti-Maus-Ig nach üblichen Verfahren. Die Auswertung erfolgte mit einem Testplatten-Photometer (Spektra. SLT Labinstruments, Salzburg). Dabei wurde insbesondere nach Hybridom- Überständen gesucht, die mit Asialo-Glykophorin, nicht aber mit Glykophorin reagierten. Zwei Hybridome (A78-G/A7 und A78-H/C8) erfüllten diese Bedingung. Für den Immunfluoreszenztest wurden Zellen der Mammakarzinom-Zellinie T-47D (Keydar, I., et al., Eur. J. Cancer 15, 659, 1979) auf Multitest-Objektträger als Monolayer-Kultur für 2 Tage aufwachsen gelassen, und zwar in zwei Sublinien (TF⁺ und TF^-). Danach wurde das Kulturmedium abgesaugt, und die Präparate wurden trocknen gelassen. Der Test selbst wurde in üblicher Weise durch Inkubation mit Hybridom-Kulturüberständen und nachfolgend mit FITC-markiertem Ziegen-Anti-Maus-Ig durchgeführt und unter dem Fluoreszenzmikroskop (Jenamed fluorescence, C. Zeiss, Jena) ausgewertet. Im Immunfluoreszenztest wurden alle Kulturüberstände geprüft, die im Enzymimmunoassay positiv waren. Dabei wurde insbesondere nach solchen Überständen gesucht, die mit der TF⁺-Variante, nicht aber mit der TF^--Variante reagierten. Darüber hinaus wurde die zytologische Lokalisation des Antigens registriert und mit der Reaktion von FITC-markiertem Erdnußlektin (PNA: Serva, Heidelberg) verglichen. Von den beiden im Enzymimmunoassay gefundenen Hybridom-Überständen erfüllte einer (A78-G/A7) die Bedingungen des Immunfluoreszenztests. Das Hybridom A78-G/A7 wurde nach üblichen Methoden (Peters, H. H., et al., 1. c.) durch limitierende Verdünnung mehrfach kloniert und für die Langzeitlagerung bei -196°C eingefroren (Karsten, U., in Friemel, H., Hrsg., "Immunologische Arbeitsmethoden", 4. Aufl., S. 311ff., Fischer, Jena, 1991).The culture supernatants were tested for specific antibodies against the TE antigen in enzyme immunoassays and in immunofluorescence. For the enzyme immunoassay, asialoglycophorin (2 µg / ml. 50 µl per well) or glycophorin (as negative control: same concentration) were bound to the solid phase of microtest plates. Then 50 μl of the culture supernatant to be tested were added and incubated. Specific antibodies were detected using peroxidase-labeled rabbit anti-mouse Ig by conventional methods. The evaluation was carried out with a test plate photometer (Spectra. SLT Labinstruments, Salzburg). Hybridoma supernatants that reacted with asialo-glycophorin but not with glycophorin were particularly sought. Two hybridomas (A78-G / A7 and A78-H / C8) met this requirement. For the immunofluorescence test, cells of the breast carcinoma cell line T-47D (Keydar, I., et al., Eur. J. Cancer 15, 659, 1979) were grown on multitest slides as a monolayer culture for 2 days, namely in two sublines (TF⁺ and TF ^- ). The culture medium was then aspirated and the preparations were allowed to dry. The test itself was carried out in a customary manner by incubation with hybridoma culture supernatants and subsequently with FITC-labeled goat anti-mouse Ig and evaluated under the fluorescence microscope (Jenamed fluorescence, C. Zeiss, Jena). All culture supernatants that were positive in the enzyme immunoassay were tested in the immunofluorescence test. In particular, those supernatants were sought which reacted with the TF⁺ variant, but not with the TF ^- variant. In addition, the cytological localization of the antigen was registered and compared with the reaction of FITC-labeled peanut lectin (PNA: Serva, Heidelberg). Of the two hybridoma supernatants found in the enzyme immunoassay, one (A78-G / A7) met the conditions of the immunofluorescence test. The hybridoma A78-G / A7 was cloned several times by limiting dilution by conventional methods (Peters, HH, et al., 1. c.) And frozen for long-term storage at -196 ° C (Karsten, U., in Friemel, H ., Ed., "Immunological Working Methods", 4th ed., P. 311ff., Fischer, Jena, 1991).

Die erfindungsgemäße Produktion des Antikörpers der Hybridomzellinie A78-G/A7 erfolgte in üblichen Flaschenkulturen. Kulturüberstand aus diesen Kulturen wurde in allen folgenden Spezifitätstests und immunzytologischen sowie immunhistologischen Untersuchungen eingesetzt (siehe Beispiele 3-5).The production of the antibody according to the invention Hybridoma cell line A78-G / A7 was carried out in conventional bottle cultures. Culture supernatant from these cultures was used in all of the following Specificity tests and immunocytological as well as immunohistological Investigations used (see Examples 3-5).

Isotypenbestimmung: Der Isotyp des Antikörpers A78-G/A7 wurde mit einem kommerziellen Testkit (Pharmingen, San Diego, USA) als IgM, kappa ermittelt.Isotype determination: The isotype of the antibody A78-G / A7 was determined with a commercial test kit (Pharmingen, San Diego, USA) as IgM, kappa determined.

Example 2 Production of the hybridoma cell line A68-B / A11 and antibodies

Inzuchtmäuse des Stammes Balb/c wurden intraperitoneal mit einer Mischung von TF_β-BSA (synthetischem TF_β, über O-.CETE an BSA gekoppelt: Janssen Biochemica, Beerse, Belgien) in PBS und komplettem Freundschem Adjuvans (Difco Laboratories, Detroit, USA) immunisiert. In Abständen von <1 Mio. wurde dreimal ohne Zusatz von Adjuvans nachimmunisiert. Vier Tage nach der letzten Immunisierung wurden Milzzellen einer dieser Mäuse nach Standardmethoden (Peters, H. H., et al. "Monoklonale Antikörper, Herstellung und Charakterisierung", Springer, Berlin, 1985) mittels Polyethylenglykol mit Maus-Myelomzellen der Zellinie X63- Ag8.653 (Kearney, J. F., et al., J. Immunol. 123, 1548, 1979) fusioniert. Die Selektion der Hybridome erfolgte mittels Azaserin in Mikrotestplatten: das Wachstum wurde durch Peritoneal- Federzellen unterstützt.Inbred mice of the Balb / c strain were coupled intraperitoneally with a mixture of TF _β -BSA (synthetic TF _β , via O-.CETE to BSA: Janssen Biochemica, Beerse, Belgium) in PBS and complete Freund's adjuvant (Difco Laboratories, Detroit, USA) ) immunized. Immunization was carried out three times at intervals of <1 million without the addition of adjuvant. Four days after the last immunization, spleen cells from one of these mice were analyzed using standard methods (Peters, HH, et al. "Monoclonal Antibodies, Production and Characterization", Springer, Berlin, 1985) using polyethylene glycol with mouse myeloma cells from cell line X63-Ag8.653 ( Kearney, JF, et al., J. Immunol. 123, 1548, 1979). The hybridomas were selected using azaserine in microtest plates: growth was supported by peritoneal spring cells.

Das Screening der Hybridom-Kulturüberstände auf spezifische Anti- TF-Antikörper wurde mittels Enzymimmunoassays und Immunfluoreszenztests durchgeführt. Im ersten Fall dienten TF_β-BSA und BSA (Negativkontrolle), an Mikrotestplatten gebunden, als Antigene. Diese wurden mit 50 µl Hybridom-Kulturüberstand pro Well inkubiert. Der Nachweis spezifisch gebundener Antikörper wurde in üblicher Weise mit Peroxidase-konjugiertem Zweitantikörper vorgenommen. Immunfluoreszenztests wurden an Multitest- Objektträgern ausgeführt, die mit einer Zell-Monolayer der Mammakarzinoma-Zellinie MCF-7 (Soule, H. D., et al., J. Nat. Cancer Inst. 51, 1409, 1973) bewachsen waren. Zum Nachweis spezifischer Hybridom-Antikörper diente in diesem Fall FITC-markiertes Antiserum gegen Maus-Ig.The hybridoma culture supernatants were screened for specific anti-TF antibodies by means of enzyme immunoassays and immunofluorescence tests. In the first case, TF _β -BSA and BSA (negative control), bound to microtest plates, served as antigens. These were incubated with 50 ul hybridoma culture supernatant per well. The detection of specifically bound antibodies was carried out in the usual way with peroxidase-conjugated second antibodies. Immunofluorescence tests were carried out on multitest slides which were covered with a cell monolayer of the breast cancer cell line MCF-7 (Soule, HD, et al., J. Nat. Cancer Inst. 51, 1409, 1973). In this case, FITC-labeled antiserum against mouse Ig was used to detect specific hybridoma antibodies.

Bei der Untersuchung der aus dem Experiment hervorgegangenen Hybridome wurden mehrere gefunden, die im Enzymimmunoassay mit TF_β-BSA, nicht aber mit BSA reagierten (A68-B/A11, A68-E/A2, A68- E/E3). Unter diesen Antikörpern zeigte jedoch nur A68-B/A11 eine Reaktion mit MCF-7-ZellenWhen examining the hybridomas resulting from the experiment, several were found which reacted with TF _β -BSA but not with BSA in the enzyme immunoassay (A68-B / A11, A68-E / A2, A68-E / E3). However, of these antibodies, only A68-B / A11 showed a reaction with MCF-7 cells

Das Hybridom A68-B/A11 wurde nach der Methode der limitierenden Verdünnung mehrmals kloniert, zur Langzeitlagerung bei -196°C eingefroren und erfindungsgemäß zur Antikörperproduktion durch Kultivierung oder nach Transplantation herangezogen.The hybridoma A68-B / A11 was based on the limiting method Dilution cloned several times for long-term storage at -196 ° C frozen and according to the invention for antibody production Cultivation or used after transplantation.

Als Isotyp des Antikörpers A68-B/A11 wurde IgM, kappa ermittelt. IgM, kappa was determined as the isotype of the antibody A68-B / A11.

Example 3 Reaction spectrum of the monoclonal antibodies A78-G / A7 and A68-B / A11 3.1 Reaction spectrum in enzyme immunoassays with a number of antigens

Als Methode dienten übliche Enzymimmunoassays in Mikrotestplatten mit an die feste Phase adsorbierten Antigenen. Nach Inkubation mit dem monoklonalen Antikörper in verschiedenen Verdünnungen erfolgte der Nachweis mit Peroxidase-markiertem Anti-Maus-Ig und anschließender Farbreaktion mit o-Phenylendiamin. Die Extinktionen wurden mit einem Testplattenphotometer (Spectra, SLT Labinstruments) gemessen und ausgewertet (Tab. 1).Common enzyme immunoassays in microtest plates served as the method with antigens adsorbed on the solid phase. After incubation with the monoclonal antibody was made in various dilutions detection with peroxidase-labeled anti-mouse Ig and subsequent color reaction with o-phenylenediamine. The extinctions were measured with a test plate photometer (Spectra, SLT Labinstruments) measured and evaluated (Tab. 1).

Tabelle 1 Table 1

Reaktion der monoklonalen Antikörper A78-G/A7 und A68-B/A11 (Spezifität: Thomsen-Friedenreich-Antigen) mit TF⁺- und TF^--Antigenen Reaction of the monoclonal antibodies A78-G / A7 and A68-B / A11 (specificity: Thomsen-Friedenreich antigen) with TF⁺ and TF ^- antigens

3.2 Immunoabsorption profiles of the monoclonal antibodies A78-G / A7 and A68-B / A11

Methode: Antikörperhaltige Kultturüberstände wurden mit trägergebundenen synthetischen Oligosacchariden (Synsorb. Chembiomed, Edmonton, Canada) inkubiert und ihr Titer vor und nach Immunabsorption verglichen.Method: Antibody-containing culture supernatants were also analyzed carrier-bound synthetic oligosaccharides (Synsorb. Chembiomed, Edmonton, Canada) and their titer before and after Compared immune absorption.

Tabelle 2 Table 2

Absorptionsprofile mit synthetischen Immunosorbentien (Synsorb.), Symbole: + = vollständige, (+) = partielle, - = keine oder marginale Absorption Absorption profiles with synthetic immunosorbents (Synsorb.), Symbols: + = complete, (+) = partial, - = no or marginal absorption

Example 4 Characteristics of the antibody A78-G / A7 (anti-TF antigen)

4.1 Temperaturabhängigkeit der Antigen-Antikörperbindung (Abb. 1). Antigen: Asialo-Glykophorin, 2 µg/ml, 50 µl/Well. Abszisse: Verdünnung des Antikörpers: Anfangskonzentration 45 µg/ml.4.1 Temperature dependence of the antigen-antibody binding ( Fig. 1). Antigen: asialo-glycophorin, 2 µg / ml, 50 µl / well. Abscissa: Dilution of the antibody: initial concentration 45 µg / ml.

4.2 pH-Abhängigkeit der Antigen-Antikörperbindung (Abb. 2). Antigen: Asialo-Glykophorin, 2 µg/ml, 50 µl/Well. Abszisse: Verdünnung des Antikörpers; Anfangskonzentration 45 µg/ml.4.2 pH dependence of the antigen-antibody binding ( Fig. 2). Antigen: asialo-glycophorin, 2 µg / ml, 50 µl / well. Abscissa: dilution of the antibody; Initial concentration 45 µg / ml.

Example 5 Immunohistological detection of tumors with the antibody A78-G / A7

5.1 Reaktion von menschlichen Zellinien mit A78-G/A7 (Tab. 3). Methodik: Immunfluoreszenztest an Zellen auf Multitest- Objektträgern5.1 Reaction of human cell lines with A78-G / A7 (Tab. 3). Methodology: Immunofluorescence test on cells on multitest Slides

Tabelle 3 Table 3

Immunzytologie mit dem Antikörper A78-G/A7 (Spezifität: Thomsen-Friedenreich-Antigen) Immunocytology with the antibody A78-G / A7 (specificity: Thomsen-Friedenreich antigen)

5.2 Ergebnisse immunhistologischer Studien an einer Reihe von menschlichen Geweben (Tab. 4).
Methodik: Paraffin-(P) oder Gefrierschnitte (G); Nachweis system ABC Elite-Kit (Vector Laboratories, Burlingame, USA). 5.2 Results of immunohistological studies on a number of human tissues (Tab. 4).
Methodology: paraffin (P) or frozen sections (G); Proof system ABC Elite-Kit (Vector Laboratories, Burlingame, USA).

Tabelle 4 Table 4

Immunhistologie mit dem Antikörper A78-G/A7 (Spezifität: Thomsen-Friedenreich-Antigen) Immunohistology with the antibody A78-G / A7 (specificity: Thomsen-Friedenreich antigen)

Claims

1. Method for producing monoclonal antibodies against the Thomsen-Friedenreich antigen (TF antigen) by means of cloned hybrid cells, which are produced by:

A. immunization of experimental animals, primarily mice, with natural or synthetically produced TF antigen,
B. Isolation of lymphocytes from the experimental animals and immortalization of the lymphocytes by cell fusion with suitable myeloma cells or another suitable immortalization method,
C. selection of the immortalized cell lines,
D. testing the immortalized cell lines for the production of antibodies against the TF antigen,
E. Cloning the cells from the cultures that produce antibodies against the TF antigen, multiplication of these cell clones and recovery of the specific antibodies produced by these cells and
F. Determination of the fine specificity of the antibodies.

2. The method according to claim 1, characterized in that as TF antigen human glycophorin A after cleavage of the Residual neuraminic acid is used.

3. The method according to claim 1, characterized in that as TF antigen synthetically produced and on serum albumin chemically bound TF antigen is used.

4. The method according to one or more of claims 1 to 3, characterized in that as myeloma cells for cell fusion cells of the X63-Ag8.653 line are preferably used.

5. The method according to one or more of claims 1 to 4, characterized in that the cell fusion or efusion using of polyethylene glycol (PEG) is carried out.

6. The method according to one or more of claims 1 to 5, characterized in that the fused cells by a selective culture medium can be isolated.

7. Monoclonal antibodies against the TF antigen by multiplying hybridoma cell clones after one or several of claims 1 to 6 are produced.

8. Monoclonal antibodies according to claim 7 against the alpha Anomers of the TF antigen, as found in the glycophorin after cleavage the neuraminic acid residue occurs.

9. Monoclonal antibodies according to claim 7 with more preferred Reaction against the beta anomer of the TF antigen.

10. Monoclonal antibodies according to claims 7 and 8 by increasing the hybrid cell line A 78-G / A7.

11. Monoclonal antibodies according to claims 7 and 9 by increasing the hybrid cell line A 68-B / A11.

12. Hybrid cell lines produced according to one or more of the Claims 1-6.

13. Use of the monoclonal antibodies according to one or several of claims 7 to 11 as detection reagents.

14. Use of the monoclonal antibodies according to one or several of claims 7 to 11, preferably of A 78-G / A7, for immunohistological detection of tumors.

15. Use of the monoclonal antibodies according to one or several of claims 7 to 11 for the immunological detection of Tumors.

16. Use of the monoclonal antibodies according to one or several of claims 7 to 11 for the preparation of TF antigen.

17. Use of the monoclonal antibodies according to claim 7 and 11 for the detection of TF antigen and related antigens Glycolipids.