DE4141970C2

DE4141970C2 - Combination vaccine against AIDS, schistosomiasis and tuberculosis and process for its preparation

Info

Publication number: DE4141970C2
Application number: DE4141970A
Authority: DE
Inventors: Andras Dr Varga; Stephan Dr Kiesig; Adam Dr Zureck; Lutz Franke
Original assignee: Charite Universitaetsmedizin Berlin
Current assignee: Varga Andras Dr 10437 Berlin De Kiessig Stef
Priority date: 1991-12-16
Filing date: 1991-12-16
Publication date: 1998-02-19
Anticipated expiration: 2011-12-17
Also published as: DE4141970A1

Description

Die Erfindung betrifft einen Kombinationsimpfstoff gegen den viralen Erreger von AIDS (überwiegend HIV-1), gegen den parasitären Erreger von Bilharziose (Plattwurm Schistosoma) und gegen den bakteriellen Erreger der Tuberkulose (Tuberkelbakterien) und Verfahren zur Herstellung des Impfstoffes. Das neue Mittel führt zu einer verstärkten humoralen und zellulären Immunantwort gegenüber den genannten Erregern und kann präventiv und teilweise nach der Infektion protektiv wirken.The invention relates to a combination vaccine against the viral pathogen of AIDS (mainly HIV-1), against the parasitic pathogen of schistosomiasis (flatworm Schistosoma) and against the bacterial pathogen of tuberculosis (tubercle bacteria) and methods for Production of the vaccine. The new agent leads to an enhanced humoral and cellular Immune response to the pathogens mentioned and can be preventive and sometimes after Infection has a protective effect.

Eine derartige Vakzine existiert noch nicht. Die Tatsache, daß die Menschen in Afrika, die mit HIV-1 infiziert sind, nicht bilharziosekrank und Bilharziosekranke nicht aidskrank werden, ist seit einigen Jahren bekannt [Biggar, R. J. et al.: Im. J. Cancer 35. 763-767 (1985); Finzer, A. und Jensen, E.: PdN-B. 7/40. 9-14 (1991)]. Es gab auch experimentelle Hinweise dafür, daß der Virion Infectivity Factor von HIV-1 und ein 170-kD Oberflächen-Antigen von Schistosoma mansoni gemeinsame Epitope besitzen [Khalife, J. et ab.: J. Exp. Med. 172. 1001-1004 (1990)].Such a vaccine does not yet exist. The fact that the people of Africa who are infected with HIV-1, do not get schistosomiasis and do not get AIDS, has been known for several years [Biggar, R.J. et al .: Im. J. Cancer 35, 763-767 (1985); Finzer, A. and Jensen, E .: PdN-B. 7/40. 9-14 (1991)]. There was also experimental evidence that the Virion Infectivity Factor from HIV-1 and a 170 kD surface antigen from Schistosoma mansoni have common epitopes [Khalife, J. et ab .: J. Exp. Med. 172, 1001-1004 (1990)].

In der gleichen Arbeit wurde nachgewiesen, daß ein monoklonaler Antikörper gegen ein synthetisches Peptid des HIV-1 Virion Infectivity Factors (VIF) im Western Blot zwei Proteinbanden der Schistosoma mansoni Antigene bei 170-kD und 65-kD nachweist und in vivo einen partiellen Schutz für Ratten gegenüber dem genannten Parasiten bietet. Der Impfstoff gegen Tuberkulose (BCG, Bacille de Calmette Guerin) wird seit 70 Jahren bei Menschen angewendet und ist daher sehr gut charakterisiert.In the same work it was demonstrated that a monoclonal antibody against a synthetic peptide of the HIV-1 virion infectivity factor (VIF) in western blot two Detects protein bands of the Schistosoma mansoni antigens at 170-kD and 65-kD and in vivo provides partial protection for rats against the parasite mentioned. The vaccine Against tuberculosis (BCG, Bacille de Calmette Guerin) has been used in humans for 70 years applied and is therefore very well characterized.

Die unspezifische Immunstimulation - und dadurch die erhöhte Abwehrbereitschaft gegenüber anderen Infektionskrankheiten und auch bestimmten Tumoren, wie zum Beispiel Harnblasenkarzinom oder Leukämie - ist vielfach beschrieben worden [(Howard, J. G. et al.: Brit. J. Exp. Path. 40 281-190 (1959); Adolps, H. D. und Bastian, H. P.: Urologe A 25 51-55 (1986); Kubica, O. P. und Wayne, L. G.: The Mycobacteria Part B New York und Basel pp 863- 902 (1984)].The unspecific immune stimulation - and thus the increased resistance to defense against other infectious diseases and also certain tumors, such as Bladder cancer or leukemia - has been widely described [(Howard, J.G. et al .: Brit. J. Exp. Path. 40 281-190 (1959); Adolps, H.D. and Bastian, H.P .: Urologist A 25 51-55 (1986); Kubica, O.P. and Wayne, L.G .: The Mycobacteria Part B New York and Basel pp 863- 902 (1984)].

Die Impfstämme (BCO) sind INH-sensibel (INH = Isonicotinsäurehydrazid), so daß eine zufällige Impftuberkulose chemotherapeutisch vollständig geheilt werden kann.The vaccine strains (BCO) are sensitive to INH (INH = isonicotinic acid hydrazide), so that a accidental vaccine tuberculosis can be completely cured chemotherapeutically.

Es ist das Ziel der Erfindung, einen kombinierten neuen Impfstoff zur Verfügung zu stellen, der die Abwehrbereitschaft des Organismus unspezifisch stark erhöht und spezifisch die zelluläre und humorale Immunantwort gegenüber dem Erreger der Tuberkulose, der Bilharziose und von AIDS verstärkt.The aim of the invention is to provide a combined new vaccine, which increases the willingness to defend the organism non-specifically and specifically increases the cellular and humoral immune response to the causative agent of tuberculosis, schistosomiasis and amplified by AIDS.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, Impfstoffe gegen die gemeinsamen Antigene der Erreger der Bilharziose und des AIDS mit gleichzeitiger Wirksamkeit gegen Tuberkulose sowie Verfahren zu ihrer Herstellung zu entwickeln. Erfindungsgefaß wurde die Aufgabe dadurch gelöst, daß partiell oxidiertes Polysaccharid (überwiegend Dextran) an die Oberfläche von BCG gebunden und die derart beladenen Bakterien mit definierten Epitopen oder Proteinen der Schistosoma mansoni und HIV-1 überzogen werden. Die derart modifizierten attenuierten Bakterien (BCG) werden ggf. mit Zusatzstoffen versehen, z. B. 3-7%-iger Dextran- /Lactoselösung zur Stabilisierung. Als Polysaccharide eignen sich Dextrane, Amylose, Amylopectin oder Glycogen, aber auch andere Polysaccharide, wie z. B. Pectin, Glucomannan, Chitosan oder Lipopolysaccharide.The invention has for its object to vaccines against the common antigens Pathogen of schistosomiasis and AIDS with simultaneous effectiveness against tuberculosis as well To develop processes for their production. The task became inventiveness solved that partially oxidized polysaccharide (mainly dextran) to the surface of BCG bound and the bacteria loaded with defined epitopes or proteins of the Schistosoma mansoni and HIV-1 are coated. The attenuated so modified Bacteria (BCG) may be provided with additives, e.g. B. 3-7% dextran / Lactose solution for stabilization. Suitable polysaccharides are dextrans, amylose, Amylopectin or glycogen, but also other polysaccharides, such as. B. pectin, glucomannan, Chitosan or lipopolysaccharides.

BCG kommen sowohl in vitalem als auch in abgetötetem Zustand in Frage. Die partiell oxidierten Polysaccharide (vorzugsweise Dextran) binden sich kovalent durch die aktiven Aldehydgruppen an die Bakterienoberflächen, indem sie mit vorhandenen Aminogruppen reagieren. Gibt man die partiell oxidierten Polysaccharide im Überschuß zu den attenuierten oder getöteten Bakterien, bleiben noch freie Aldehydgruppen übrig, um die BCG mit fremden antigenen Epitopen zu verkleiden.BCG come in both vital and killed Condition in question. The partially oxidized polysaccharides (preferably dextran) bind covalently through the active aldehyde groups to the bacterial surfaces by using existing amino groups react. If you give the partially oxidized polysaccharides in the Excess to the attenuated or killed bacteria, free aldehyde groups still remain left to disguise the BCG with foreign antigenic epitopes.

Die partielle Oxidation des Polysaccharids kann mit einem geeigneten Oxidationsmittel, wie z. B. Perjodsäure, durchgeführt werden. Dabei ist auf die stöchiometrischen Verhältnisse besonders zu achten. Um die Vitalität der attenuierten Bakterien zu erhalten, sollte in der Regel ein 12%-iger Oxidationsgrad nicht überschritten werden. Nach der Oxidation der Polysaccharide muß das Oxidationsmittel schonend entfernt werden.The partial oxidation of the polysaccharide can be carried out with a suitable oxidizing agent, such as e.g. B. periodic acid. It is on the stoichiometric ratios to pay special attention to. To maintain the vitality of the attenuated bacteria, as a rule a 12% degree of oxidation should not be exceeded. After the oxidation of the polysaccharides the oxidizing agent must be carefully removed.

Die Bakterien (BCG) werden in der partiell oxidierten Polysaccharidlösung suspendiert und über Nacht bei Raumtemperatur unter sterilen Bedingungen vorsichtig geschüttelt. Nach dem Ablauf der Bindungsreaktionen muß der Überschuß der oxidierten Polysaccharide durch Waschvorgänge entfernt werden.The bacteria (BCG) are suspended in the partially oxidized polysaccharide solution and Gently shaken overnight at room temperature under sterile conditions. After this The excess of the oxidized polysaccharides must pass through the binding reactions Washing operations are removed.

Als Waschflüssigkeit ist die nichtoxidierte Polysaccharidlösung geeignet. Bei der Durchführung der Reaktion müssen der pH-Wert leicht acid eingestellt oder die Bindungsreaktionszeiten verlängert werden.The non-oxidized polysaccharide solution is suitable as the washing liquid. In the To carry out the reaction, the pH must be adjusted slightly or the acidity Binding reaction times can be extended.

Die Antigenbindung wird immunchemisch, z. B. durch Immunfluoresenzmikroskopie, mittels spezifischer Antikörper geprüft. Sämtliche Lösungen werden vor der Verwendung sterilisiert. Bei attenuierten Bakterien muß ein Vitalitätstest durchgeführt werden. Eine große Zahl von gemeinsamen Epitopen als Gemisch können auf den attenuierten Bakterienoberflächen vorteilhaft konzentriert werden (1 mg Feucht-BCG-Oberfläche entspricht ca. 50 cm²).The antigen binding is immunochemical, e.g. B. by immunofluorescence microscopy, by means of specific antibody tested. All solutions are sterilized before use. A vitality test must be carried out on attenuated bacteria. A large number of Common epitopes as a mixture can be found on the attenuated bacterial surfaces be advantageously concentrated (1 mg wet BCG surface corresponds to approx. 50 cm²).

Die verkleideten Bakterien lassen sich ampullieren und als Impfstoff ohne Adjuvanszusatz verwenden. Die antigenen Epitope viralen und parasitären Ursprungs können mit den partiell oxidierten Polysacchariden gesondert in einer Lösung reagieren und als Sekundärimpfstoff zusammen oder getrennt mit dem Primärimpfstoff (mit Epitopen verkleidete BCG) verwendet werden.The coated bacteria can be ampouled and as a vaccine without the addition of adjuvants use. The antigenic epitopes of viral and parasitic origin can be partially Oxidized polysaccharides react separately in a solution and as a secondary vaccine used together or separately with the primary vaccine (epitope-clad BCG) will.

Der erfindungsgemäße Kombinationsimpfstoff ist zur Verhinderung der Tuberkulose- und HIV-Infektion, der Tuberkulose- und Schistosomainfektion sowie nur der Schistosoma- bzw. HIV-Infektion geeignet.The combination vaccine according to the invention is for the prevention of tuberculosis and HIV infection, tuberculosis and schistosome infection as well as only the schistosoma or HIV infection suitable.

Embodiments Production of a combination vaccine against the common epitopes of HIV-1, Schistosoma masoni and the causative agent of tuberculosis

50 ml (20 g/l) Dextran-35-Lösung wurden mit 40 ml 45 mM HIO4 bei pH=4,5 unter Kühlung langsam oxidiert. Man erreicht einen Oxidationsgrad von 12% (2 × 12 Aldehydgruppen auf 100 Glucoseeinheiten).50 ml (20 g / l) of dextran 35 solution were mixed with 40 ml of 45 mM HIO4 at pH = 4.5 with cooling slowly oxidized. An oxidation degree of 12% is achieved (2 × 12 aldehyde groups per 100 Glucose units).

Durch 2-malige Fällung mit 60%- bzw. 96%-igem Ethanol wurde die partiell oxidierte Dextranlösung gereinigt und bei Raumtemperatur lichtgeschützt unter Vakuum getrocknet.The mixture was partially oxidized by precipitation twice with 60% or 96% ethanol Dextran solution cleaned and dried at room temperature protected from light under vacuum.

Vor der Anwendung bringt man das partiell oxidierte Dextran in eine wäßrige Lösung und filtriert sie anschließend steril.Before use, the partially oxidized dextran is placed in an aqueous solution and then filter them sterile.

Bazille de Calmette Guerin (BCG) Jena-S-4, die für die unspezifische Immunisierung von Tumorpatienten verwendet wird, wurde mit 2%-iger partiell oxidierter Dextranlösung in schwach saurem Milieu beschichtet: In 100 ml partiell oxidierter Dextranlösung wurden 6.000 mg in 15%iger Lactoselösung stabilisierte BCG suspendiert und über Nacht bei Raumtemperatur leicht geschüttelt. Bazille de Calmette Guerin (BCG) Jena-S-4 responsible for the non-specific immunization of Tumor patients used were in with 2% partially oxidized dextran solution slightly acidic environment coated: 6,000 in 100 ml of partially oxidized dextran solution mg BCG stabilized in 15% lactose solution and overnight at room temperature gently shaken.

Nach Ablauf der Bindungsreaktion wurde die Suspension dreimal mit einer apyrogenen 2%-igen Dextran-35-Lösung gewaschen. Die Suspension wurde in einer Lösung, die aus 100 ml 2%-igem Dextran-35 und 100 ml 15%-igem Lactose besteht, aufgenommen und 60 mg/2 ml-weise portioniert. Die lebendige Keimzahl wurde bestimmt und die Ampullen mit sterilen Durchstichstopfen verschlossen. Dieser Grundimpfstoff wird mit antigenen Epitopen verschiedenen Ursprungs überzogen, indem die freien Aldehydgruppen mit den freien Aminogruppen des Antigens reagieren.After the binding reaction had ended, the suspension was washed three times with an apyrogenic Washed 2% dextran 35 solution. The suspension was in a solution consisting of 100 ml 2% Dextran-35 and 100 ml of 15% lactose, added and 60 mg / 2 ml-wise portioned. The living bacterial count was determined and the ampoules with sterile Puncture plug closed. This basic vaccine comes with antigenic epitopes of different origin coated by the free aldehyde groups with the free Amino groups of the antigen react.

example 1

100 mg synthetisches Epitop TPKKIKPPLPSVTK des Virion Infectivity Factors des HIV-1 (Vif 155-168) - (Aminosäuresequenz mit Schistosoma-Epitop) - wird in 1000 ml wäßrigem (leicht acid oder alkalisch) Puffer aufgenommen und vorsichtig unter sterilen Bedingungen durch den Durchstichstopfen in die Ampulle gespritzt. Die Ampullen werden 60 min. bei Zimmertemperatur leicht geschüttelt. Nach der Bindungsreaktion steht der Impfstoff zur Verfügung. Die Antigenbindung kann immunochemisch bestätigt werden.100 mg synthetic epitope TPKKIKPPLPSVTK of the Virion Infectivity Factor of HIV-1 (Vif 155-168) - (amino acid sequence with Schistosoma epitope) - is in 1000 ml aqueous (slightly acidic or alkaline) buffer absorbed and carefully under sterile conditions injected into the ampoule. The ampoules are 60 min. at Room temperature shaken gently. After the binding reaction, the vaccine is available Available. Antigen binding can be confirmed immunochemically.

Example 2

Wie Beispiel 1, unter Verwendung des Peptids SGKARGWFVRHHVESPHRR.As example 1, using the peptide SGKARGWFVRHHVESPHRR.

Example 3

Wie Beispiel 1, unter Verwendung des Peptids VSIEWRKKRYSTPVDPELAD.As Example 1, using the VSIEWRKKRYSTPVDPELAD peptide.

Example 4

Wie Beispiel 1, unter Verwendung des Peptids ELAVIA.As example 1, using the peptide ELAVIA.

Example 5

Wie Beispiel 1, unter Verwendung eines Gemisches der genannten Epitope von Beispiel 1 bis 4.As example 1, using a mixture of the epitopes mentioned in example 1 to 4.

Claims

1. Combination vaccine against the pathogens of AIDS, schistosomiasis and tuberculosis, containing coated bacteria, characterized in that it contains bacteria of the BCG species, on the surface of which partially oxidized polysaccharides are bound, which with common antigens from Schistosoma mansoni and HIV-1 or their synthetic epitopes are coated.

2. Combination vaccine according to claim 1, characterized in that it is an epitope synthetic epitope TPKKIKPPLPSVTK of the Viron Infectivity Factor of HIV-1, which Contains amino acid sequence with Schistosoma epitope.

3. Combination vaccine according to claim 1, characterized in that it contains the peptides Contains SGKARGWFVRHHVESPHRR or VSIEWRKRYSTPVDPELAD.

4. Combination vaccine according to claim 1, characterized in that it is a mixture of Contains epitopes according to claims 2 to 3.

5. Combination vaccine according to claims 1 to 4, obtainable by

a) coating BCG with partially oxidized polysaccharides and coating the bacteria thus modified with common antigens from Schistosoma mansoni and HIV-1, or
b) Mixture of BCG with the product obtained from the reaction between partially oxidized polysaccharides and Schistosoma mansoni and HIV-1.

6. Combination vaccine according to claim 1, characterized in that the polysaccharide enveloped bacteria with epitopes of various origins of the pathogen of schistosomiasis and AIDS are covered.

7. A method for producing a combination vaccine against the pathogens of AIDS, schistosomiasis and tuberculosis according to claim 1, characterized in that

a) partially oxidized polysaccharide is bound to the surface of BCG strains and the bacteria thus modified are coated with common antigen from Schistosoma mansoni and HIV-1 and / or their synthetic epitopes, or
b) partially oxidized polysaccharide is reacted with common antigen from Schistosoma mansoni and HIV-1 or their synthetic epitopes and BCG is mixed with the product thus formed

and thus coated bacteria are formed as an effective component.

8. The method according to claim 7, characterized in that as an epitope synthetic epitope TPKKIKPPLPSVTK of the virion infectivity factor of HIV-1, the peptides SGKARGWFVRHHVESPHRR or VSIEWRKKRYSTPVDPELAD or a mixture of these Epitopes are used.