DE3872999T2

DE3872999T2 - Verknuepfung von verbindungen mit polymeren teilchen unter verwendung von carbamoyloniumvebindungen.

Info

Publication number: DE3872999T2
Application number: DE19883872999
Authority: DE
Inventors: C O Eastman Kodak Co Bagchi; C O Eastman Kodak Co Danielson; C O Eastman Kodak Co Sutton
Original assignee: Eastman Kodak Co
Current assignee: Ortho Clinical Diagnostics Inc
Priority date: 1987-09-18
Filing date: 1988-09-16
Publication date: 1993-03-11
Anticipated expiration: 2008-09-17
Also published as: EP0308235B1; DE3872999D1; EP0308235A2; JP2565548B2; EP0308235A3; JPH01127958A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von polymeren Teilchen, an die Verbindungen gebunden sind. Ganz speziell betrifft die Erfindung die Herstellung von solchen Materialien durch Bindung von reaktiven Amin oder Sulfhydryl enthaltendenden Verbindungen an polymere Teilchen unter Verwendung von Carbamoyloniumverbindungen.
Biologisch aktive Polypeptide oder Proteine, die an unlösliche Trägermaterialien gebunden sind, beispielsweise polymere Teilchen, sind auf vielerlei Weise verwendet worden. Beispielsweise wird die Diagnose von pathologischen oder anderen Zuständen beim Menschen und beim Tier oftmals durchgeführt unter Anwendung von immunologischen reaktiven Stoffen, z. B. Antikörpern oder einem Antigen in den Körperflüssigkeiten eines Menschen oder eines Tieres. Ein Antigen ist im allgemeinen bekannt als eine Fremdsubstanz, beispielsweise eine Arzneimittel, Hapten, Toxin, Lectin, Polypeptid oder Protein, das nach Einführung in den Körper die Erzeugung von bestimmten löslichen Proteinen bewirkt, die als Antikörper bekannt sind.
Andere Proteine und Amin enthaltende Verbindungen, z. B. Enzyme, Avidin, Biotin oder Polysaccharide, sind kovalent an verschiedene Trägermaterialien gebunden worden, um sie in der Affinitätschromatographie, bei enzymatischen Reaktionen, spezifischen Bindungsreaktionen und Immunoassays zu verwenden. Zu den geeigneten Trägermaterialien gehören Erythrocyte vom Schaf und Menschen, Bakterienzellen, Latexteilchen, Harzteilchen und feinteilige diazotierte Aminocellulose. Beispielsweise sind Trägerpartikel, hergestellt aus wenig wasserlöslichen Monomeren (z. B. Epoxygruppen enthaltenden Monomeren) in Abwesenheit von Emulgatoren, bekannt geworden. Andere Verbindungen, wie beispielsweise Diamine, Dihydrazide, Mercaptoalkylamine und Dimercaptane sind an Trägermaterialien als Bindungsreste für eine spätere Bindung von Arzneimitteln, Enzymen oder anderen reaktiven Stoffen gebunden worden.
Carboxylierte Latexpartikel sind ebenfalls verwendet worden, um diagnostische Reagenzien zu erzeugen, wie es beispielsweise in der US-PS 4 181 636 beschrieben wird. Wie in der Patentschrift beschrieben, beruht das Verfahren der kovalenten Bindung eines immunologisch reaktiven Stoffes an die Partikel mit Oberflächen-Carboxylgruppen auf der Verwendung eines in Wasser löslichen Carbodiimides. Obgleich geeignete Reagenzien geschaffen werden, neigt dieses Verfahren doch zur Aktivierung der exponierten reaktiven Gruppen der reaktiven Stoffe wie auch der Carboxylgruppen. Das Ergebnis ist eine intramolekulare und intermolekulare Quervernetzung oder Polymerisation der immunologisch reaktiven Stoffe, wobei ein beträchtlicher Anteil der Stoffe bezüglich einer Komplexbildung mit einem Rezeptormolekül beeinträchtigt wird. Da die reaktiven Stoffe, beispielsweise ein Antikörper, gewöhnlich sehr kostspielig sind, stellt dieses Problem einen schwerwiegenden ökonomischen Nachteil dar. Es ist ebenfalls offensichtlich, daß die Verwendung von Carbodiimiden zur Bindung von Proteinen an Trägerteilchen nicht so wirksam ist, wie es bei bestimmten Proteinkonzentrationen erwünscht ist.
Es ist infolgedessen wünschenswert, wenn ein schnelles Verfahren zur Bindung einer reaktives Amin enthaltenden Verbindung an carboxylierte polymere Partikel in wirksamer Weise ohne nachteilige Beeinflussung der gebundenen Verbindung bereitgestellt werden könnte.
Die oben erwähnten Probleme werden mit einem Verfahren zur Bindung einer reaktive Amin- oder Sulfhydrylgruppen enthaltenden Verbindung an polymere Partikel mit abstehenden Carboxylgruppen gelöst, das dadurch gekennzeichnet ist, daß es umfaßt:
A. Kontaktieren von (1) einer wäßrigen Suspension von polymeren Teilchen oder Partikeln mit Carboxylgruppen an der Oberfläche und hergestellt aus einem oder mehreren ethylenisch ungesättigten polymerisierbaren Monomeren, von denen mindestens eines abstehende Carboxylgruppen aufweist, mit (2) einer Carbamoyloniumverbindung unter Erzeugung reaktionsfähiger Zwischen-Polymerpartikel mit abstehenden reaktionsfähigen Zwischengruppen und
B. Kontaktieren der reaktionsfähigen Zwischen-Polymerpartikel, die in der Stufe A erhalten wurden, mit einer eine reaktionsfähige Amin- oder Sulfhydrylgruppe enthaltenden Verbindung, die mit den reaktionsfähigen Zwischengruppen unter Bildung einer kovalenten Bindung zwischen den Teilchen oder Partikeln und der reaktionsfähigen Verbindung reagiert. Die vorliegende Erfindung stellt Mittel für die rasche Bindung einer reaktiven Amingruppen oder Sulfhydrylgruppen enthaltenden Verbindung, beispielsweise eines biologisch aktiven Polypeptides oder Proteins an unlösliche polymere Partikel bereit unter Erzeugung geeigneter Materialien für die Durchführung von Immunoassays, diagnostischen Untersuchungen, für die Affinitätschromatographie, enzymatische Reaktionen und andere biologische und chemische Verfahren. Die Bindung wird dabei erreicht ohne nachteilige Beeinflussung der reaktiven Verbindung, die gebunden wird. Dies bedeutet, daß nur eine minimale Quervernetzung oder Deaktivierung der reaktiven Amino- oder Sulfhydrylgruppen in der reaktiven Verbindung erfolgt, die an der Bildung einer kovalenten Bindung mit den abstehenden Carboxylgruppen der Partikel teilnimmt.
Erreicht werden diese Vorteile durch Verwendung einer besonderen Klasse von Bindungsmitteln. Diese Mittel sind Carbamoyloniumverbindungen, die bisher für diesen Zweck nicht verwendet wurden. Vielmehr war zunächst zu erwarten, daß solche Verbindungen wie die üblichen Carbodiimide, die reaktiven Amin- oder Sulfhydrylgruppen der reaktiven Verbindungen in nachteiliger Weise deaktivieren würden. Unerwarteterweise wurde jedoch gefunden, daß dies nicht-der Fall ist, so daß gefunden wurde, daß diese Verbindungen eine sehr geeignete und wirksame Bindungsmethode ermöglichen, die hier beschrieben und beansprucht wird.
Die Materialien, die nach dem Verfahren der vorliegenden Erfindung hergestellt werden, können in vielen verschiedenen chemischen und biologischen Verfahren eingesetzt werden. Beispielsweise lassen sie sich verwenden in der Affinitätschromatographie, im Falle von Reaktionen, die durch Enzyme katalysiert werden, bei der Wasserreinigung, im Falle von Immunoassays, in welchem Falle der Analyt eine immunologisch reaktive Verbindung oder Stoffist, die bzw. der eine spezifische Bindungsaffinität für ein gebundenes Polypeptid oder Protein aufweist, sowie andere Verfahren, die dem Fachmann bekannt sind. In einigen Fällen läßt sich die vorliegende Erfindung dazu verwenden, um Zwischen- Bindungsreste zu binden, die weiterhin mit Verbindungen von biologischem Interesse umgesetzt werden können, wie beispielsweise Arzneimitteln, Hormonen, Enzymen, Antikörpern oder anderen Proteinen oder Polysacchariden.
Eine Anwendungsart der Materialien, die nach der vorliegenden Erfindung hergestellt werden, besteht in der Verwendung eines immunochemischen Agglutinationsreagenses im Rahmen eines Agglutinationsassays, wobei der Analyt oder das Material, das ermittelt werden soll, ein immunologisch reaktiver Stoff ist, der sich in physiologischen Flüssigkeiten, Zellen oder Gewebeextrakten eines Menschen oder eines Tieres findet, für den eine immunologische Gegenkomponente (oder Rezeptor) zur Verfügung steht oder erzeugt werden kann. Zu typischen immunologisch reaktiven Stoffen, für die das Reagens eingesetzt werden kann, um sie zu bestimmen, gehören u. a. Mikroorganismen (Bakterien, Protozon, Pilze, Viren sowie Rickettsia), Gewebeantigene, einschließlich organspezifische Antigene, Hormone, Enzyme, Blutzellen-Antigene oder andere Substanzen, die sich im Blut finden, Plasmaproteine, Milchproteine, Salivaproteine, Urinproteine, pathalogische Proteine, Antikörper einschließlich Autoantikörper und Arzneimittel. In derartigen Fällen ist die reaktive Amingruppen oder Sulfhydrylgruppen enthaltende Verbindung, die beim Verfahren dieser Erfindung angewandt wird, eine immunologische Verbindung, die einen Rezeptor für den festzustellenden Analyten darstellt, beispielsweise für ein Antigen oder ein Antikörper.
Im Falle anderer Ausführungsformen kann das hier beschriebene Material ein Enzym aufweisen, das an die Partikel gebunden ist. Zu den Enzymen, die in dieser Weise gebunden werden können, gehören solche mit reaktiven Amin- oder Sulfhydrylgruppen, die gemäß der vorliegenden Erfindung mit den aktiven abstehenden Gruppen an den Partikeln umgesetzt werden können, ohne daß die enzymatische Aktivität verlorengeht.
Gemäß anderer Ausführungsformen kann das nach dieser Erfindung hergestellte Material im Rahmen kompetitiver Bindungsassays eingesetzt werden, und zwar entweder in Lösung oder in einem trockenen Material (d. h. einem trockenen analytischen Element) oder im Rahmen von Verfahren, die als immunometrische Assays bekannt geworden sind, beispielsweise "Sandwich" Assays.
Das Verfahren dieser Erfindung ist ein Zweistufenverfahren, bei dem eine reaktive ein Amin oder ein Sulfhydryl enthaltende Verbindung mit einer reaktiven Amin- oder Sulfhydrylgruppe an polymere Partikel gebunden wird, die reaktive Carboxylgruppen aufweisen, unter Verwendung einer Carbamoyloniumverbindung.
Die polymeren Partikel, die für das Verfahren dieser Erfindung geeignet sind, sind im allgemeinen in Wasser unlösliche Latexpartikel mit einer Partikelgröße im Bereich von 0,01 bis 5 Micrometern und vorzugsweise von 0,1 bis 3 Micrometern. Sie können homogene polymere Partikel sein, was bedeutet, daß sie ganz aus dem gleichen Polymer aufgebaut sind, oder aber sie können Partikel sein, die aus mehr als nur einem Polymeren aufgebaut sind, beispielsweise Pfropf- Copolymeren, wie sie beispielsweise beschrieben werden in der US-PS 3 700 609, und es kann sich bei ihnen ferner um Kern-Hüllenpolymere handeln, wie sie beispielsweise in der US-PS 4 401 765 beschrieben werden. Kritisch ist, daß die polymeren Partikel auf ihrer Oberfläche Carboxylgruppen aufweisen, die für eine Bindung der reaktiven Amingruppen oder Sulfhydrylgruppen enthaltenden Verbindung geeignet sind. Derartige Gruppen können in die Partikel eingeführt werden durch Einführung von Monomeren, die solche Gruppen enthalten, in die Polymeren (z. B. Acrylsäure, Methacrylsäure, Itaconsäure) oder durch weitere chemische Umsetzung eines Polymeren mit anderen reaktiven Gruppen, die in Carboxylgruppen überführt werden können (beispielsweise durch Hydrolyse von Anhydriden, beispielsweise Maleinsäureanhydrid, oder durch Oxidation von auf der Oberfläche vorliegenden Methylol- oder Aldehydendgruppen).
Die polymeren Partikel können unter Verwendung jeder geeigneten Polymerisationstechnik hergestellt werden, einschließlich den Methoden der Emulsionspolymerisation (einschließlich einer chargenweisen, halbkontinuierlichen oder kontinuierlichen Verfahrensweise) und den Methoden der Suspensionspolymerisation, der Pfropf-Copolymerisation und andere bekannten Methoden, die in der Polymerchemie bekannt sind. Die Emulsionspolymerisation wird bevorzugt, da sie dazu verwendet werden kann, um im allgemeinen kleinere Teilchen bereitzustellen, ohne Anwendung von oberflächenaktiven Mitteln oder Emulgatoren, wie es beispielsweise beschrieben wird in der US-PS 4 415 700 (wie oben erwähnt) und der Literaturstelle Research Disclosure Publikation 15963 (Juli 1977). Eine kontinuierliche Emulsionspolymerisation ist die am meisten bevorzugte Methode, wie es in der erwähnten Research Disclosure-Publikation beschrieben wird.
Geeignete carboxylierte Partikel werden hergestellt aus carboxyliertem Styrol und seinen Derivaten, carboxylierten Styrol-Butadien-Copolymeren, Acrylsäure- und Methacrylsäurepolymeren und anderen Materialien, von denen viele im Handel erhältlich sind.
Vorzugsweise sind die polymeren Partikel aufgebaut aus einem Polymer, das sich durch die folgende Strukturformel wiedergeben läßt:
worin A wiederkehrende Einheiten darstellt, die sich von einem oder mehreren ethylenisch ungesättigten polymerisierbaren Monomeren ableiten, die Carboxylsäuregruppen enthalten oder Salze oder Vorläufergruppen von diesen Gruppen und worin B für wiederkehrende Einheiten steht, die sich von einem oder mehreren ethylenisch ungesättigten polymerisierbaren Monomeren ableiten.
Zu Monomeren, von denen sich A ableitet gehören, ohne hierdurch eine Beschränkung zu bewirken, Acryl- und Methacrylsäuren, Itaconsäure, Aconitsäure, Fumarsäure, Maleinsäure, β-Carboxyethylacrylat, β-Carboxyethylmethacrylat, m&p-Carboxymethylstyrol, Methacrylamidohexanoesäure und N-(2-Carboxy-1,1-dimethylethyl)acrylamid oder ein Salz oder eine Anhydrid-Vorläuferverbindung hiervon. Acryl- und Methacrylsäuren, Itaconsäure, Aconitsäure, Fumarsäure, Maleinsäure, β-Carboxyethylacrylat, β-Carboxyethylmethacrylat oder ein Salz oder eine Anhydrid-Vorläuferverbindung hiervon sind die bevorzugten Verbindungen im Rahmen dieser Erfindung. Zu Monomeren, von denen sich B ableitet, gehören, ohne sich beschränken zu wollen, Styrol und Styrolderivate (z. B. Vinyltoluol, 4-t-Butylstyrol, Divinylbenzol und 2- Chloromethylstyrol), Acrylsäure- und Methacrylsäureester (z. B. Methylacrylat, Ethylmethacrylat, n-Butylacrylat, 2- Ethylhexylmethacrylat, Methylmethacrylat, 2-Hydroxyethylmethacrylat, Methacrylamid, Ethylendimethacrylat und 2- Hydroxyethylacrylat), 2-Acrylamido-2-methylpropansulfonat, Natriumsalz, 3-Acryloyloxypropansulfonat, Natriumsalz, p- Styrolsulfonat oder Acrylonitril. Vorzugsweise leitet sich B ab von Styrol oder einem Styrolderivat oder einem Acrylsäure- oder Methacrylsäureester.
Für beide der A- und B-Monomeren ist wichtig, daß die speziellen Monomeren, die verwendet werden und ihre Verhältnisse so gewählt werden, daß die Partikel wasserunlöslich werden.
In der oben angegebenen Strukturformel steht X für 0,1 bis 70 und vorzugsweise für 1 bis 20 Mol-%.
Typische Polymere, aus denen die polymeren Partikel aufgebaut sein können, sind beispielsweise Poly(styrol-covinylbenzylchlorid-co-acrylsäure) (Molverhältnis 85 : 10 : 5), Poly(styrol-co-acrylsäure) (Molverhältnis 99 : 1), Poly(styrol-co-methacrylsäure) (Molverhältnis 90 : 10), Poly(styrol-co-acrylsäure-co-m&p-divinylbenzol) (Molverhältnis 89 : 10 : 1), Poly(styrol-co-2-carboxyethylacrylat) (Molverhältnis 90 : 10) und Poly(methylmethacrylatco-acrylsäure) (Molverhältnis 70 : 30).
Im Falle einer Ausführungsform sind die Partikel Kern- Hüllen-Partikel, wobei der Kern aus einem ersten Polymer aufgebaut ist und die Hülle aus einem zweiten Polymeren. Das zweite Polymer muß reaktive Carboxylgruppen oder Gruppen aufweisen, die in Carboxylgruppen überführt werden können, bevor die Bindung des Polypeptides oder Proteins erfolgt. Ein typisches Beispiel für polymere Partikel aus einem Kern und einer Hülle findet sich in dem später folgenden Beispiel 2.
Carbamoyloniumsalze werden für die kovalente Bindung der reaktiven Amin- oder Sulfhydrylgruppen enthaltenden Verbindung an die polymeren Partikel im Rahmen dieser Erfindung verwendet. Diese Salze werden im Detail in der US-PS 4 421 847 beschrieben. Sie lassen sich im allgemeinen durch die folgende Strukturformel:
darstellen.
In der Formel (I) steht Z für die Atome, die zur Vervollständigung eines 5- oder 6-gliedrigen heterocyclischen aromatischen Ringes erforderlich sind. Vorzugsweise steht Z für die Atome, die zur Vervollständigung eines substituierten 6-gliedrigen heterocyclischen aromatischen Ringes erforderlich sind.
Weiterhin stehen m und n unabhängig voneinander für 0 oder 1,
R¹ und R² stehen unabhängig voneinander für Alkyl oder Aryl. Bevorzugte Alkylgruppen weisen 1 bis 6 Kohlenstoffatome auf und bestehen beispielsweise aus Methyl, Ethyl und Isopropyl. Bevorzugte Arylgruppen weisen 6 bis 10 Kohlenstoffatome auf und bestehen beispielsweise aus Phenyl und Naphthyl.
Alternativ stehen R¹ und R² gemeinsam für die Atome, die erforderlich sind, um einen Piperidin-, Piperazin- oder Morpholinring zu vervollständigen.
R³ ist ein Wasserstoffatom, Alkyl oder die Gruppe
worin A steht für die polymerisierte Vinylkette eines Homo- oder Copolymeren, gebildet aus einem oder mehreren ethylenisch ungesättigten polymerisierbaren Verbindungen, derart, daß das Molekulargewicht des Homo- oder Copolymeren größer als 1000 ist. Geeignete ethylenisch ungesättigte polymerisierbare Verbindungen sind dem Fachmann auf dem Gebiet der Polymerchemie bekannt.
R&sup4; ist ein Wasserstoffatom, Alkyl, oder wenn Z für die Atome steht, die zur Vervollständigung eines Pyridiniumringes erforderlich sind und n gleich 0 ist, so kann R&sup4; aus den folgenden Gruppen ausgewählt sein:
(a) -NR&sup6;-CO-R&sup7;, worin R&sup6; für Wasserstoff oder Alkyl (vorzugsweise mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, z. B. Methyl, Ethyl, n-Butyl steht) und R&sup7; steht für Wasserstoff, Alkyl oder -NR&sup8;R&sup9;, worin R&sup8; und R&sup9; unabhängig voneinander jeweils für Wasserstoff oder Alkyl stehen;
(b) -(CH&sub2;)q-NR¹&sup0;R¹¹ worin R¹&sup0; steht für -CO-R¹², R¹¹ Wasserstoff oder Alkyl darstellt, R¹² für Wasserstoff oder Alkyl steht oder -NR¹³R¹&sup4;, worin R¹³ Alkyl oder Aryl bedeutet, worin R¹&sup4; für Wasserstoff, Alkyl oder Aryl steht und g gleich 1 bis 3 ist,
(c) -(CH&sub2;)r-CONR¹&sup5;R¹&sup6;, worin R¹&sup5; für Wasserstoff, Alkyl oder Aryl steht, R¹&sup6; Wasserstoff oder Alkyl bedeutet oder R¹&sup5; und R¹&sup6; gemeinsam die Atome darstellen, die zur Vervollständigung eines 5- oder 6-gliedrigen aliphatischen Ringes erforderlich sind und R gleich 0 bis 3 ist,
worin R¹&sup7; für Wasserstoff oder Alkyl steht, Y gleich Oxy- oder -NR¹&sup9;- ist, R¹&sup8; für Wasserstoff, Alkyl, -CO-R²&sup0; oder - CO-NR²¹, worin R¹&sup9;, R²&sup0; und R²¹ unabhängig voneinander jeweils für Wasserstoff oder Alkyl stehen und t gleich 2 oder 3 ist, und
(e) -R²¹X'R, worin R²¹ steht für Alkylen mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen (z. B. Methylen, Trimethylen oder Isopropylen) und X'R eine kovalent gebundene anionische Gruppe ist; z. B. Sulfonat oder Carboxylat, unter Bildung einer inneren Salzgruppe mit dem Pyridiniumkern.
R&sup5; steht für Alkyl oder Aryl, wobei gilt, daß m gleich 0 ist, wenn das Stickstoffatom, an das R&sup5; gebunden ist, an den Rest des Ringes durch eine Doppelbindung gebunden ist.
XR ist ein Anion, z. B. ein Halogenid, Tetrafluoroborat, Nitrat, Sulfat, p-Toluolsulfonat, Perchlorat, Methosulfat oder Hydroxid und v ist gleich 0 oder 1, wobei gilt, daß v nur 0 ist, wenn R&sup4; gleich R²¹X'R ist.
Vorzugsweise wird die in der Praxis dieser Erfindung verwendete Carbamoyloniumverbindung durch die angegebene Strukturformel repräsentiert, wobei R¹ und R² gemeinsam die Atome darstellen, die zur Vervollständigung eines Morpholinringes erforderlich sind, Z für die Atome steht, die zur Vervollständigung eines Pyridiniumringes erforderlich sind und worin R&sup4; für -R²¹X'R steht (z. B. -CH&sub2;CH&sub2;SO&sub3;&supmin;), und worin m, n und v jeweils gleich 0 sind.
Zu repräsentativen Carbamoyloniumverbindungen gehören 1-(4- Morpholinocarbonyl)-4-(2-sulfoethyl)-pyridiniumhydroxid, inneres Salz und 1-(4-Morpholinocarbonyl)pyridiniumchlorid.
Besonders bevorzugt ist 1-(4-Morpholinocarbonyl)-4-(2- sulfoethyl)pyridiniumhydroxid, inneres Salz.
Jede reaktive Amingruppen oder Sulfhydrylgruppen enthaltende Verbindung kann an die polymeren Partikel nach der vorliegenden Erfindung gebunden werden, solange die Verbindung eine reaktive Amin- bzw. Sulfhydrylgruppe enthält, die mit der Zwischenverbindung zu reagieren vermag, die bei Umsetzung der Carbamoyloniumverbindung mit Carboxylgruppen der Partikel erzeugt wird. Zu solchen Verbindungen gehören, ohne daß die folgende Aufzählung beschränkend zu verstehen ist, Monoamine, Monohydrazide, Diamine, Dihydrazide, Enzyme, Biotin oder Derivate hiervon, Avidin oder Derivate hiervon, Aminosäuren, Peptide, Polypeptide, Proteine, Polysaccharide und andere Verbindungen, die für den Fachmann offensichtlich sind. Im Falle bestimmter Ausführungsformen ist die reaktive Amingruppen oder Sulfhydrylgruppen enthaltende Verbindung ein Polypeptid oder Protein, das biologisch aktiv ist. Der Ausdruck "biologisch aktiv" betrifft dabei die Kapazität der Verbindung für eine Reaktion mit einer anderen Komponente, die in physiologischen Flüssigkeiten auftreten kann. Eine solche Reaktion kann eine katalytische Aktivität in dem Falle sein, in dem das Material ein Enzym ist. Weiterhin kann die Reaktion aus einer Komplexbildung bestehen, die auftritt zwischen Materialien, die eine Affinität füreinander aufweisen, wie z. B. Avidin mit Biotin oder wie im Falle von Antikörpern mit Antigenen. Im Falle anderer Ausführungsformen ist die reaktive Amingruppen oder Sulfhydrylgruppen enthaltende Verbindung ein Diamin, Polysaccharid, eine Aminosäure, ein Peptid oder Protein, die bzw. das ein Bindeglied bilden kann, für die Bindung einer zweiten Verbindung an das Partikel. Zu derartigen zweiten Verbindungen gehören, ohne daß die folgende Aufzählung beschränkend sein soll, Enzyme, Antikörper, Antigene, Arzneimittel und Drogen, Biotin oder Derivate hiervon und andere Verbindungen, die für den Fachmann offensichtlich sind.
Vorzugsweise besteht die reaktive Amingruppen oder Sulfhydrylgruppen enthaltende Verbindung aus einer immunologisch reaktiven Verbindung, zu denen, ohne begrenzend zu sein, die biologischen und chemischen Verbindungen, die oben angegeben wurden, gehören. In besonders vorteilhafter Weise ist sie ein Antikörper, z. B. ein Antikörper, ausgerichtet auf ein Arzneimittel oder eine Droge, ein Hormon, Streptococcus A-Antigen, ein Chlamydial- Antigen, ein Gonococcen-Antigen, menschliches chorionisches Gonadotropin, menschliches Luteinisierungshormon oder ein Herpes-Virus. Alternativ kann die immunologisch reaktive Verbindung ein Antigen sein, z. B. ein Antigen von HTLV-I oder HIV-I.
Im Falle bestimmter Ausführungsformen können die nach der Methode dieser Erfindung herstellbaren Materialien einen assoziierten Tracer aufweisen. Ein Tracer ist ein ermittelbarer Stoff, der es ermöglicht, das Reagens zu erkennen. Zu geeigneten Tracern gehören Radioisotopen, kolorimetrische oder fluorometrische Verbindungen, Enzyme, chemilumineszierende Verbindungen, phosphoreszierende Verbindungen und andere Stoffe, die dem Fachmann bekannt sind. Der Tracer kann mit dem Reagens in jeder geeigneten Weise assoziiert sein. Beispielsweise kann der Tracer mit dem biologisch aktiven Polypeptid oder Protein assoziiert sein (beispielsweise kovalent oder ionisch gebunden sein).
Alternativ und vorzugsweise ist der Tracer mit den polymeren Partikeln assoziiert, beispielsweise an ihre äußere Oberfläche gebunden (kovalent oder absorbiert) oder intern über einen Teil oder das Gesamtvolumen verteilt, oder beides.
Gemäß einer Ausführungsform ist der Tracer in den Polymerpartikeln verteilt, und zwar entweder über die gesamten Partikeln oder auf ihren Oberflächen, mittels farbiger Reste oder Farbkupplerreste. Farbige Reste sind an die Kette der Polymeren, aus denen die Partikel bestehen, gebunden. Farbkupplerreste eignen sich zu einer oxidativen Kupplung mit einer Farbentwicklerverbindung unter Erzeugung eines Farbstoffes. Diese Reste sind ebenfalls an die Polymerkette gebunden und werden bereitgestellt durch Umsetzung von ethylenisch ungesättigten polymerisierbaren Monomeren, an die die Reste gebunden sind.
Beispiele von solchen Monomeren werden in der Europäischen Publikation 227 173 beschrieben. Besonders geeignete Monomere werden durch die Formel:
CH&sub2; = CR - CONH - COUP
dargestellt, worin R für Wasserstoff, Halogen oder kurzkettiges Alkyl steht und COUP ein Farbkupplerrest ist, wovon viele bekannt sind. Zwei repräsentative Monomere sind:
Zu Polymeren, die aus solchen Monomeren hergestellt werden können, gehören Poly[styrol-co-butylacrylat-co-N-3,5- dichloro-4-ethyl-2-hydroxyphenyl)acrylamid)-co-methacrylsäure] (Gewichtsverhältnis 50 : 20 : 20 : 10), Poly[butylacrylatco-N-3,5-dichloro-4-ethyl-2-hydroxyphenyl)acrylamid-cochloromethylstyrol-co-methacrylsäure] (Gewichtsverhältnis 20 : 20 : 40 : 20) und Poly[butylacrylat-co-N-[1-(2,4,6- trichlorophenyl]-1,2,4-triazolin-5-on-2-yl]acrylamid-cochloromethylstyrol-co-methacrylsäure] (Gewichtsverhältnis 20 : 20 : 40 : 20).
Das Verfahren der vorliegenden Erfindung wird in zwei Stufen durchgeführt, wobei in der ersten Stufe eine wäßrige Suspension der polymeren Partikel, wie oben beschrieben, mit einer Carbamoyloniumverbindung, wie oben beschrieben, in Kontakt gebracht wird, um reaktive Zwischenpolymerpartikel zu erzeugen, die reaktive Zwischengruppen anstelle der Carboxylgruppen aufweisen. Diese Stufe wird bei einem geeigneten pH durchgeführt unter Verwendung geeigneter Säuren oder Puffer, um den gewünschten pH aufrechtzuerhalten. Im allgemeinen liegt der pH bei weniger als 6, jedoch ist dieser Wert nicht kritisch, solange nur die Reaktion fortschreitet. Zweckmäßig liegt der pH zwischen 3,5 und 6. Das molare Verhältnis von Carbamoyloniumverbindung zu dem gemessenen Gesamt-Carboxylsäurespiegel in den Polymerpartikeln liegt bei 1 : 100 bis 10 : 1 und vorzugsweise bei 1 : 10 bis 2 : 1.
In der zweiten Stufe des Verfahrens wird die reaktive Zwischenverbindung, die in der ersten Stufe erzeugt worden ist, mit einer reaktiven Amin oder Sulfhydryl enthaltenden Verbindung mit einer reaktiven Amin- bzw. Sulfhydrylgruppe in Kontakt gebracht, die mit der reaktiven Zwischengruppe der reaktiven Zwischenverbindung reagiert. Dabei wird zwischen den Partikeln und der reaktiven Verbindung eine kovalente Bindung erzeugt. Das Gewichtsverhältnis der reaktiven Verbindung zu den polymeren Partikeln liegt im allgemeinen bei 1 : 1000 bis 1 : 1, und vorzugsweise bei 1 : 100 bis 1 : 10.
Diese zweite Stufe kann bei einem geeigneten pH durchgeführt werden, derart, daß die gewünschte Reaktion erfolgt, ohne daß eine frühzeitige Agglutination erfolgt. Der pH kann variiert werden, je nach dem eingesetzten Reaktionskomponenten und ihren Konzentrationen im Reaktionsmedium. Für viele Proteine und Polypeptide ist der pH größer als 6.
Das Verfahren der Erfindung wird im allgemeinen bei einer Temperatur von 10 bis 16ºC und vorzugsweise von 15 bis 30ºC durchgeführt. Die Temperatur kann in den beiden Stufen des Verfahrens gleich oder verschieden sein.
Weitere Details bezüglich des Verfahrens dieser Erfindung ergeben sich für den Durchschnittsfachmann aus den folgenden repräsentativen Beispielen.

Beispiel 1:

Bindung eines Proteins an Poly(styrol-co-vinylbenzylchlorid-co-acrylsäure)-Partikel

Eine Lösung von 5,29 g (0,00932 Mol) der Carbamoyloniumverbindung 1-(Morpholinocarbonyl)-4-(2-sulfoethyl)pyridiniumhydroxid, inneres Salz, in 45,71 g destilliertem Wasser wurde zu 50 ml einer 4%igen Suspension (pH 3,6) von Poly(styrol-co-vinylbenzylchlorid-co-acrylsäure)-Partikeln (Molverhältnis 85 : 10 : 5) (durchschnittliche Größe etwa 0,66 Micrometer) zugesetzt. Die erhaltene Mischung hatte einen pH von 5,6.
Ein Teil des aktivierten Latex mit 100 mg Polymer (Trockengewicht) wurde bei Raumtemperatur (etwa 22ºC) 1 h inkubiert, während eine zweite Probe von gleicher Größe 3 h lang inkubiert wurde. Jede Probe wurde mit 5 mg von markiertem (mit Tritium behandeltem) Rinder-Gamma-Globulin (³H BGG) behandelt und auf ein Endvolumen von 30 ml mit 0,1 molarer Kaliumphosphatlösung (pH 7,0) in 50 ml fassenden Zentrifugenröhrchen gebracht. Die Reaktionen erfolgten während 5 h bei Raumtemperatur bei einer end-over-end Rotation bei 30-35 U/min unter Anbringung auf eine rotierende Platte, die in einem Winkel von 45º montiert war.
Eine Vergleichsmischung (Vergleich 1) wurde in entsprechender Weise hergestellt durch Inkubieren der gleichen Menge eines Ansatzes von Poly(styrol-co-vinylbenzylchloridco-acrylsäure)-Partikeln (Molverhältnis 85 : 10 : 5), genau wie oben beschrieben, mit der Ausnahme jedoch, daß keine Aktivierung mit der Carbamoyloniumverbindung erfolgte, um sie für eine nichtspezifische Bindung (Adsorption) zu testen. Es ist von vorangegangenen Experimenten bekannt, daß bei niedrigen Temperaturen eine geringe, falls überhaupt, kovalente Bindung des Rinder-Gamma-Globulinproteins an die Polymerpartikel über die andere Reaktion der Amingruppen am Protein mit den aktiven Chloromethylgruppen des Polymeren erfolgt. Diese letztere Reaktion erfordert Wärme und ausgedehnte Reaktionszeiten, damit sie wirksam ablaufen kann.
Eine zweite Vergleichsmischung (Vergleich 2) wurde hergestellt durch Behandlung von 100 mg (Trockengewicht) des Latex, der nicht mit der Carbamoyloniumverbindung aktiviert worden war, mit 5 mg mit Tritium behandeltem Rinder-Gamma- Globulin in 30 ml eines 0,1 molaren Natriumboratpuffers (pH 8,5) bei Anwendung einer end-over-end Rotation, wie oben beschrieben, über 24 h bei 37ºC.
Am Ende der angegebenen Inkubationszeiten wurden die Reaktionsmischungen abgeschreckt durch Zusatz von überschüssigem Rinder-Serumalbumin (100 mg, 20 mg/ml in dem geeigneten Puffer). Die Proben wurden weitere 4 bis 18 h lang nach Zusatz des Albumins inkubiert.
Die Gesamtmenge an Protein, das an die Partikel gebunden war, wurde bestimmt durch Messung von: a) dem gesamten cpm- Wert (Counts pro Minute) in einer 1 ml Probe der Reaktionsmischung, b) dem cpm-Wert, der in der überstehenden Flüssigkeit nach der Zentrifugation eines 1 ml Anteiles der Reaktionsmischung verblieben war und c) dem cpm-Wert des Latexreagens nach wiederholtem Waschen des Pellets, das in b) erhalten wurde. Die Fraktion des Proteins, das kovalent an die Partikel gebunden war, wurde nach der Inkubation der Reagenzien in Gegenwart von 1% eines oberflächenaktiven Mittels aus Natriumdodecylsulfat bei 37ºC über etwa 24 h mit einer end-over-end Rotation bestimmt. Das gleiche Verfahren, das oben für die Bestimmung der Gesamtmenge an gebundenem Protein angewandt wurde, wurde zur Bestimmung der Menge von kovalent gebundenem Protein angewandt. Die Ergebnisse sind in den folgenden Tabellen I und II zusammengestellt. TABELLE I Probe Carbamoylonium Reaktionsdauer % Bindung mg Protein/g Polymer Stunde (Vergleich 1) keine TABELLE II Nach Behandlung mit oberflächenaktivem Mittel Probe % Bindung mg Protein/g Polymer (Vergleich 2)
Dieses Beispiel zeigt, daß Rinder-Gamma-Globulin kovalent an carboxylierte Teilchen gebunden werden kann unter Umgebungs- Reaktionsbedingungen mit schnellen Reaktionszeiten im Vergleich zu den alternativen Reaktionsschemen der Vergleiche 1 und 2 unter Erzielung einer besseren Bindungswirksamkeit.

Beispiel 2:

Herstellung und Verwendung von Reagens

Zwei monoclonale Antitheophyllin-Antikörper wurden umgesetzt mit sowohl carboxylierten polymeren Partikeln, die aktiviert wurden mit der Carbamoyloniumverbindung, die in Beispiel l verwendet wurde und mit Partikeln, die funktionelle Chloromethylstyrolgruppen enthielten. Die verwendeten Antikörper bestanden aus (1) monoclonalen Antikörpern für Theophyllin, erhältlich durch Kallested Laboratories, Inc. (Katalog-Nr. 046, Lot-Nr. W0729, Fill-Nr. W0854, Clone-Nummer 9-49-7A, A8), und (2) monoclonale Antikörper, spezifisch für Theophyllin, hergestellt durch Fusion von SP2/0-Ag14 Myeloma- Zellen mit Milz-Lymphocyten von weiblichen Balb/C-Mäusen, immunisiert mit Theophyllin-Rinder-Serumalbumin und vom τ&sub2;b, kappa Isotyp mit einem Ka-Wert von ungefähr 5·10&sup7; M&supmin;¹ in einer mit Phosphat abgepufferten Salzlösung bei Raumtemperatur. Die Menge an Antikörper, die an die Partikel gebunden wurde, wurde bestimmt in einem parallelen Experiment, bei dem ³H-Rinder-Gamma-Globulin anstelle des Antitheophyllin-Antikörpers verwendet wurde. Die Menge an aktivem Antikörper, der an die Partikel gebunden wurde, wurde in dem Enzym-Markierungs-Bindungsexperiment, das im folgenden beschrieben wird, ermittelt.
Carboxylierte Latex-Poly(styrol-co-acrylsäure)-Partikel (Molverhältnis 99 : 1) wurden mit der Carbamoyloniumverbindung aktiviert, durch Suspendieren eines Latex mit 500 mg Polymer (Trockengewicht) und 250 mg Carbamoyloniumverbindung, gelöst in 10 ml deionisiertem, destilliertem Wasser in 50 ml destilliertem Wasser bei einem pH 5. Der Latex wurde 30 min lang bei Raumtemperatur gerührt und zentrifugiert. Die überstehende Flüssigkeit wurde verworfen und der Latex wurde in etwa 10 ml destilliertem Wasser re-suspendiert. Separate Proben des erhaltenen Reagens (100 mg Polymer, Trockengewicht) wurden jeweils mit einer 3,16 mg Probe von einem der zwei Typen von Antikörpern, wie oben beschrieben, in 30 ml eines Puffers (0,05 molares Kaliumphosphat, pH 7,0) vermischt. Die Reaktionsmischungen wurden inkubiert mit einer end-over-end Rotation bei Raumtemperatur nach etwa 24 h. Die Reaktionen wurden dann durch Zusatz von Rinder- Serumalbumin (100 mg, 20 mg/ml) beendet und die Inkubation wurde für etwa 4 h fortgesetzt. Die Reaktionsmischungen wurden dann zentrifugiert, worauf die überstehenden Flüssigkeiten verworfen wurden und die Latices in 10 ml einer mit Phosphat abgepufferten Salzlösung (pH 7,4) mit 1% TRITON X- 100®, einem nichtionogenen oberflächenaktiven Mittel (einem Octylphenoxypolyethoxyethanol, Hersteller Rohm und Haas, Co.) re-suspendiert wurden. Die Inkubationen wurden etwa 18 h lang bei 37ºC fortgesetzt. Die Latices wurden dann zentrifugiert, die überstehenden Flüssigkeiten verworfen und die erhaltenen Pellets wurden zweimal mit einer mit Phosphat abgepufferten Salzlösung gewaschen und in ihr resuspendiert.
Zwei Proben eines Latex auf Basis von Chloromethylstyrol [einem Kern-Hüllen-Copolymeren mit einem Kern aus Poly(styrol-co-divinylbenzol) (Molverhältnis 99,2 : 0,8) und mit einer Hülle aus Poly(vinylbenzylchlorid-co-divinylbenzol (Molverhältnis 98,8 : 1,2] (100 mg Trockenpolymer in jeder Probe) wurden inkubiert mit einer 3,16 mg Probe von einem der oben beschriebenen Antikörper in 30 ml eines 0,1 molaren Natriumboratpuffers bei pH 8,5. Die Reaktionen wurden, wie oben für den carboxylierten Latex beschrieben, durchgeführt, mit der Ausnahme, daß die anfängliche Inkubation bei 37ºC anstatt bei Raumtemperatur durchgeführt wurden.
Die Menge an Antikörper, die an jede Latexbereitung gebunden war, wurde bestimmt durch Ermittlung der Anzahl von Counts im Falle von Proben, die parallel zueinander untersucht wurden, mit ³H-Rinder-Gamma-Globulin, gebunden an Kern- Hüllenpartikel mit einem Kern aus Poly(styrol-co-divinylbenzol) und einer Hülle aus Poly(vinylbenzylchlorid-codivinylbenzol) und Partikeln aus Poly(styrol-co-acrylsäure) nach exakt dem gleichen Verfahren und bei Anwendung der gleichen Mengen wie oben angegeben. Die relative Menge an aktivem Antikörper in jeder Zubereitung wurde bestimmt im Rahmen einer Untersuchung, bei der eine Reihe von Verdünnungen des Latex (3,16·10&supmin;¹&sup0; molare bis 1·10&supmin;&sup6; molare theoretische Theophyllin-Bindungszentren, bezogen auf die Masse des gebundenen Antikörpers) vermischt wurden mit einer fixierten Konzentration einer Theophyllin-Glukoseoxidase- Markierung (5·10&supmin;¹&sup0; molar). Die Latex-Verdünnungen und Markierungen wurden etwa 1 h lang unter konstanter Bewegung bei Raumtemperatur in einer mit Phosphat abgepufferten Salzlösung, die 1% Rinder-Serumalbumin enthielt, inkubiert. Die Menge an Theophyllin-Glukoseoxidasemarkierung, die in der Lösung nach der Zentrifugation noch vorhanden war, wurde bestimmt, und ebenfalls bestimmt wurde die Konzentration der Theophyllin-Bindungszentren, die erforderlich war, um 50% der Enzymmarkierung zu binden. Die Ergebnisse sind im folgenden zusammengestellt: Massen-Bindungsexperiment: % Bindung mg ³H Rinder-Gamma-Globulin/g Latex Kern-Hüllen-Copolymer-Latex Poly(styrol-co-acrylsäure) (Molverhältnis 99:1) Latex-Enzym-Markierungs-Titration: Latex Antikörper n-molare theoretische Theophyllin-Bindungs-Zentren, an die 50% der Markierung gebunden waren Kern-Hüllen-Copolymer Poly(styrol-co-acrylsäure) (Molverhältnis 99:1)
Dieses Beispiel veranschaulicht, daß ein Antikörper kovalent an carboxylierte Teilchen oder Kügelchen gebunden werden kann unter Verwendung von Umgebungs-Reaktionsbedingungen gemäß der vorliegenden Erfindung bei praktisch der gleichen Wirksamkeit mit der der Antikörper an Teilchen oder Kügelchen über aktive Halogengruppen bei erhöhten Temperaturen gebunden werden kann. Weiterhin wird gezeigt, daß der Antikörper an aktivierte carboxylierte Teilchen oder Kügelchen gebunden werden kann unter dem gleichen Grad der Beibehaltung der Antikörperaktivität als im Falle des alternativen Protokolles der direkten Bindung der Antikörper an das Polymerkügelchen oder Polymerteilchen über aktive Halogengruppen. In verschiedenen vorausgehenden Experimenten konnte gezeigt werden, daß mehr als 50% der Masse der Antikörper, die an aktive Halogenteilchen nach dem hier beschriebenen Verfahren gebunden worden waren, aktiv gegenüber mit Tritium behandeltem Theophyllin blieben. Infolgedessen ist zu erwarten, daß das gleiche Ergebnis im Falle des Antikörpers zu beobachten ist, der an aktivierte Carboxylteilchen oder Kügelchen gebunden ist.

Beispiel 3:

Vergleich mit Carbodiimid-Bindung

Dieses Beispiel vergleicht die Methode der vorliegenden Erfindung mit einer Methode der Bindung eines Proteins an ein Partikel unter Verwendung der bekannten Carbodiimidchemie und vergleicht die Verwendung der erhaltenen Reagenzien in einer Bestimmung für Phenobarbital.
Ein monoclonaler Antikörper für Phenobarbital wurde bei der Eastman Kodak Co. durch Immunisierung von Balb/c Mäusen mit einem Konjugat von Phenobarbital-Menschen-Serumalbumin hergestellt. Die Milz von immunisierten Mäusen wurde mit Myelema-Zellen (SP2/0-Ag 14) unter Erzeugung des Hybridomas verschmolzen. Dabei wurde eine bekannte Herstellungsweise angewandt.
Der auf diese Weise hergestellte Antikörper wurde kovalent an polymere Partikel gebunden, die auf ihrer äußeren Oberfläche abstehende Carboxylgruppen aufwiesen. Die Partikel bestanden aus Poly(styrol-co-Methacrylsäure) (Molverhältnis 90 : 10). Die Antikörpermasse, die an die Partikel gebunden wurde, wurde in einem parallelen Experiment bestimmt, indem mit Tritium behandeltes Rinder-Gamma-Globulin anstelle des Antiphenobarbital-Antikörpers verwendet wurde. Die Menge an aktivem Protein, das an die Partikel gebunden wurde, wurde in dem Enzym-Markierungs-Bindungsexperiment, wie in Beispiel 2 oben beschrieben, bestimmt.
Eine Probe der polymeren Partikel, wie oben beschrieben (30 mg Trockengewicht), wurde mit 1-(4-Morpholinocarbonyl)-4-(2- sulfoethyl)pyridiniumhydroxid, inneres Salz (16 mg, 1,5 mmol/g Kügelchen) in 10 ml einer 0,1 molaren 2-(N- morpholino)ethansulfonsäurepufferlösung (pH 6) 10 min lang vermischt, worauf der Zusatz des Antiphenobarbital-Antikörpers (0,3 mg) erfolgte. Eine zweite Probe des polymeren Latex wurde mit dem gleichen inneren Salz vermischt, worauf 1,5 mg des Antiphenobarbital-Antikörpers zugesetzt wurden.
Eine dritte Probe des gleichen Latex wurde mit 1-Cyclohexyl- 3-(2-morpholinoethyl)carbodiimid-metho-p-toluolsulfonat (19,1 mg, 1,5 mmol/g Kügelchen) 10 min lang vermischt, worauf der Zusatz von 0,3 mg des Antiphenobarbital-Antikörpers erfolgte. Eine vierte Probe der Latexpartikel wurde mit dem Carbodiimid vermischt, worauf sich die Zugabe von 1,5 mg des Antikörpers anschloß. Diese Proben sind in den Tabellen III und IV unten als Vergleiche 1 und 2 bezeichnet.
Die Bindungsreaktionen erfolgten durch Inkubation der Mischungen in 24 h mit einer end-over-end Rotation bei Raumtemperatur. Die Reaktionen wurden durch Zugabe von Rinder- Serumalbumin (30 mg, 30 mg/ml) beendet, worauf die Inkubierung für weitere 4 h fortgesetzt wurde. Die Reaktionsmischungen wurden zentrifugiert, worauf die überstehende Flüssigkeit verworfen wurde. Die erhaltenen Pellets wurden einmal mit einer mit Phosphat gepufferten Salzlösung (pH 7,4) gewaschen und dann in der Salzlösung resuspendiert. Die Antikörpermasse, die an jede Latexzubereitung gebunden war, wurde durch Ermittlung der Anzahl von radioaktiven Zählern bei parallel behandelten Proben, die mit Tritium behandeltes Rinder-Gamma-Globulin enthielten, das an die Partikel, wie in Beispiel 1 beschrieben, gebunden war. Das Verhältnis von kovalenten zu den gesamten Bindungen wurde nach der Inkubation mit Natriumdodecylsulfat als oberflächenaktive Mittel, wie in Beispiel 1 beschrieben, errechnet. Die Ergebnisse des Massen-Bindungsexperimentes sind in den Tabellen III und IV unten zusammengestellt.
Die relative Menge an aktivem Antikörper in jeder Zubereitung wurde mittels eines Enzym-Markierungs-Bindungsexperimentes bestimmt, ähnlich demjenigen, das in Beispiel 2 beschrieben wird. Das vorliegenden Beispiel zeigt, daß der Antiphenobarbital-Antikörper kovalent an die polymeren Partikel unter Verwendung der Carbamoyloniumverbindung mit sehr hoher Wirksamkeit gebunden werden kann. Das Beispiel zeigt ferner, daß der Antikörper unter Bildung eines geeigneten immunologischen Reagenses gebunden werden kann. Bei dem niedrigen Antikörper/Polymerkügelchenverhältnis war eine viermal geringere Konzentration an immobilisiertem Antikörperreagens gemäß der vorliegenden Erfindung erforderlich, um 50% des markierten Antigens zu binden, als im Falle des Vergleichsreagenses (vgl. 86 n molare theoretische Phenobarbital-Bindungszentren im Falle des Vergleichs mit 19 nmolaren Bindungszentren im Falle der Erfindung bei einem Zusatz von 0,3 mg Protein). Dies zeigt eine viermal größere Beibehaltung der Antikörperaktivität im Falle des Verfahrens der vorliegenden Erfindung im Vergleich zu der Carbodiimid-Chemie des Standes der Technik. TABELLE III (Massen-Bindungs-Experiment) Bindungs-Methode Verwendetes markiertes Protein (mg) % Bindung mg ³H Protein/g Polymer Verhältnis kovalent/insgesamt Beispiel Vergleich TABELLE IV (Latex-Enzym-Markierungstitration) Bindungs-Methode Verwendetes markiertes Protein (mg) Theoretische Phenobarbital-Bindungszentren, um 50% der Markierung zu binden (n-molar) Beispiel Vergleich

Beispiel 4:

Bindung von Diamin an polymere Partikel

Dies Beispiel veranschaulicht die Praxis der vorliegenden Erfindung bei der Bindung von Diaminen an carboxylierte polymere Partikel unter Verwendung einer Carbamoyloniumverbindung. Die Bedeutung dieses Merkmales der Erfindung beruht auf der Tatsache, daß es schwierig ist, Partikel herzustellen, die reaktive Aminreste an der äußeren Oberfläche aufweisen, wenn bekannte Polymerisationsmethoden von Amin enthaltenden Monomeren angewandt werden.
Ein Anteil (3 g Trockengewicht) von Poly(styrol-co-acrylsäure) (Molverhältnis 90 : 10) suspendiert in deionisiertem, destilliertem Wasser (100 ml) wurde mit 1,5 g von 1-(4- Morpholinocarbonyl)-4-(2-sulfoethyl)pyridiniumhydroxid, inneres Salz, gelöst in deionisiertem, destilliertem Wasser (60 ml) vereinigt, worauf das Volumen mit destilliertem Wasser auf 300 ml gebracht wurde. Die Reaktionsmischung wurde bei Raumtemperatur 30 min lang gerührt und dann bei 10ºC und 6000 U/min 30 min lang zentrifugiert. Die überstehende Flüssigkeit wurde verworfen und die Kügelchen wurden in 90 ml deionisiertem, destilliertem Wasser resuspendiert. Der Latex, der die aktivierten polymeren Teilchen enthielt, wurde in drei Anteile aufgeteilt, worauf jeder Anteil mit einem Überschuß an einem der drei unten beschriebenen Diamine umgesetzt wurde.

Reaktion A:

Diamin A, Hexandiamin (567 mg) wurde in 30 ml einer 0,1 molaren Natriumborat-Pufferlösung (pH 8) gelöst und der pH wurde auf 8 eingestellt. Diese Lösung wurde zu 30 ml des aktivierten Latex zugegeben, worauf das Volumen auf 100 ml durch Zusatz von Boratpuffer gebracht wurde.

Reaktion B:

Diamin B, L-lysin·1HCl (548 mg) wurde, wie für Reaktion A beschrieben, gelöst und umgesetzt.

Reaktion C:

Diamin C, L-lysyl-L-lysin·2HCl (260 mg) wurde ebenfalls, wie für Reaktion A beschrieben, gelöst und umgesetzt.
Die drei oben beschriebenen Reaktionen wurden über einen Zeitraum von 4 h bei Raumtemperatur fortgesetzt und einer end-over-end Rotation unterworfen. Jede Reaktionsmischung wurde dann in ein Dialysegefäß gebracht und 24 h lang gegen deionisiertes, destilliertes Wasser dialysiert. Die Reaktionsmischungen wurden dann 30 min lang bei 6000 U/min zentrifugiert, worauf die überstehende Flüssigkeit verworfen wurde. Jedes Reaktionsprodukt wurde dann in 100 ml deionisiertem, destilliertem Wasser re-suspendiert, worauf der Zentrifugations- und re-Suspensionsprozeß zweimal wiederholt wurde. Die erhaltenen Reaktionsprodukte enthielten die entsprechenden Diamine kovalent an die Latexpartikel gebunden.
Jedes Reaktionsprodukt, hergestellt, wie oben beschrieben, wurde mit einem IgG-Protein mit oxidierten Aldehydgruppen in folgender Weise umgesetzt:
Das IgG wurde zunächst in einen Natriumphosphatpuffer (0,01 molar, pH 6) mit Natriumchlorid (0,15 molar) dialysiert. Das IgG-Protein, das verwendet wurde, bestand aus mit Tritium behandeltem Rinder-Gamma-Globulin (³H BGG). Das Carbohydrat des Proteins wurde mit NaIO&sub4; bei einer Anfangskonzentration von 30 mmolar 1 h bei Raumtemperatur oxidiert. Dann wurde Glycerin bis zu einer Endkonzentration, die 100 mmolar war, zugegeben, um die Reaktion zu stoppen, worauf überschüssige Reagenzien entfernt wurden, indem das Reaktionsgemisch durch eine im Handel erhältliche pharmazeutische PD-10-Entsalzungskolonne geführt wurde, wobei die Instruktionen des Herstellers angewandt wurden.
Ein Anteil (30 mg Trockengewicht) eines jeden der drei oben beschriebenen Reaktionsprodukte wurde mit 1,5 mg des oxidierten Proteins kombiniert, worauf die Mischung auf ein Endvolumen von 9 ml durch Zusatz eines 0,01 molaren Natriumphosphatpuffers (pH 6) gebracht wurde, der 0,15 molar bezüglich Natriumchlorid war, wozu ein 15 ml fassendes Zentrifugenröhrchen benutzt wurde. Die erhaltenen Reaktionen wurden 5 h bei Raumtemperatur fortgesetzt unter Anwendung einer end-over-end Rotation. Eine 1 ml Lösung von NaBH&sub3;CN (100 mmolar) wurde zu jeder Reaktion zugesetzt, worauf die Rotation für weitere 16 h bei Raumtemperatur fortgesetzt wurde.
Ein Vergleichsmaterial (Vergleich 1) wurde in entsprechender Weise hergestellt durch Ersatz eines Teiles des carboxylierten Originallatex durch den Latex mit Diaminresten. Drei zusätzliche Vergleiche (2-4) wurden in entsprechender Weise hergestellt, indem nichtoxidiertes, mit Tritium behandeltes Rinder-Gamma-Globulin anstelle des oxidierten Proteins in den Reaktionen mit jedem Diaminlatex eingesetzt wurde. Nichtoxidiertes, mit Tritium behandeltes Rinder-Gamma- Globulin wurde ferner dem ursprünglichen carboxylierten Latex in Vergleich 5 zugegeben.
Am Ende der beschriebenen Reaktionen wurde jede Reaktion durch Zugabe von überschüssigem Rinder-Serumalbumin (30 mg, 30 mg/ml Puffer) abgeschreckt. Die Proben wurden dann weitere 4 h lang nach Zugabe des Abschreckproteins inkubiert
Die Gesamtmenge an Antikörper, die an die Latexpartikel gebunden war, wurde nach dem in Beispiel 2 oben beschriebenen Verfahren ermittelt. Die Fraktion des ³H BGG, die kovalent an die Partikel gebunden war, wurde nach der Inkubation in Gegenwart von 1% Natriumdodecylsulfat, wie in Beispiel 2 oben beschrieben, ermittelt. Die Ergebnisse sind in Tabelle V unten zusammengestellt. TABELLE V Polymeres Reaktionsprodukt IgG Bindungen insges. Kovalente Bindungen (mg BGG/g Polymer) Verhältnis von kovalenten Bindungen/Gesamtbindungen Erfindung: Diamin Oxidiert Vergleich: (kein Diamin) nicht-oxidiert
Diese Ergebnisse mit Diaminen A bis C zeigen, daß die Diamine mit den Carboxylgruppen der polymeren Partikel reagierten, nachdem eine Aktivierung durch die Carbamoyloniumverbindung nach der vorliegenden Erfindung erfolgte. Die erhaltenen Aminreste an den Partikeln reagierten dann mit den oxidierten Aldehydgruppen des mit Tritium behandelten IgG. Wie die Daten zeigen, müssen Aldehydgruppen am Protein vorhanden sein, um eine wesentliche Bindung an die Aminreste der Partikel zu gewährleisten. Wo die Gruppen nicht oxidiert waren, (Vergleiche 2-5), war nur eine kleine Fraktion des Proteins kovalent an die Partikel gebunden. Weiterhin müssen ausreichende Aminreste an den Partikeln vorhanden sein, um eine ins Gewicht fallende kovalente Bindung zu erreichen. Eine geringe kovalente Bindung ist im Falle der carboxylierten Partikel allein (Vergleich 1) erkennbar.

Beispiel V:

Bindung von Protein an Partikel, hergestellt aus monomeren Farbkupplern

Polymere Partikel aus Poly[styrol-co-butylacrylat-co-N-(3,5- dichloro-4-ethyl-2-hydroxyphenyl)acrylamid-co-methacrylsäure) Gewichtsverhältnis 50 : 20 : 20 : 10) wurden in folgender Weise hergestellt:
Mit Stickstoff gespültes destilliertes Wasser (1000 g) wurde in einen Kolben gegeben, der ausgerüstet war mit einem Rührer, Kühler und einer Stickstoffeinleitung. Der Kolben wurde in ein auf 60ºC erhitztes Wasserbad gebracht. Styrol (50 g) n-Butylacrylat (20 g) und N-(3,5-Dichloro-4-ethyl-2- hydroxyphenyl)acrylamid (20 g) und Aceton (200 ml) wurden miteinander vermischt und in den Kolben gegeben. In den Kolben wurde dann eine Initiator-Kombination aus K&sub2;S&sub2;O&sub8; (2 g) und K&sub2;S&sub2;O&sub5; (1 g) gegeben, worauf 15 min lang reagieren gelassen wurde. Methacrylsäure (20 g) wurde dann zugesetzt, worauf 18 h lang reagieren gelassen wurde unter Erzeugung eines Latex von polymeren Partikeln.
Zur Entwicklung der Farbkupplerreste der polymeren Partikel wurde eine Farbentwicklerzusammensetzung aus den folgenden Komponenten zugegeben, zusammen mit 200 ml einer 10%igen K&sub2;S&sub2;O&sub8;-Lösung:
Triethanolamin (11 ml), Benzylalkohol (14,2 ml), Lithiumchlorid (2,1 g), Kaliumbromid (0,6 g), Hydroxylaminsulfat (3,2 g), Kaliumsulfit (45%ige Lösung, 2,8 ml), 1-Hydroxyethylen-1,1-di-phosporsäure (60%, 0,8 mmol), 4-Amino-3- methyl-N-ethyl-N-(β-methansulfonamidoethyl (anilinsulfathydrat (4,35 g), Kaliumcarbonat (wasserfrei 28 g), Stilben- Aufhellmittel (0,6 g), oberflächenaktives Mittel (1 ml) und Wasser zur Auffüllung auf 1 l (pH 10,8). Die erhaltenen farbigen Kügelchen oder Teilchen wurden 24 h lang in einem kontinuierlich arbeitenden Dialysebad gegen destilliertes Wasser dialysiert, worauf restliche Monomere in einem Rotationsverdampfer bei 80ºC entfernt wurden.
Die Carbamoyloniumverbindung 1-(4-Morpholinocarbonyl)-4-(2- sulfoethyl)pyridiniumhydroxid, inneres Salz (0,15 mmolar) wurde zu 100 mg der entwickelten Partikel, wie oben beschrieben, in 30 ml einer 0,1 molaren 2-(4-Morpholin)ethansulfonsäure (pH 6) in einem 50 ml fassenden Polypropylen-Zentrifugenröhrchen gebracht. Diese Suspension wurde 10 min lang bei 30 bis 35 U/min rotieren gelassen nach Aufbringung auf eine Rotationsplatte in einem Winkel von 45º. Mit Tritium behandeltes Rinder-Gamma-Globulin (1 mg) wurde der Reaktionsmischung zugesetzt, worauf die Rotation weitere 24 h lang fortgesetzt wurde. Die Reaktionsmischung wurde dann durch Zusatz von überschüssigem Rinder-Serumalbumin (100 mg, 50 mg/ml in dem Puffer) abgeschreckt, worauf die Probe weitere 24 h lang inkubiert wurde.
Die Gesamtmenge an Antikörper, der an die Partikel gebunden war, wurde bestimmt durch Messungen der Zähler pro Minute des Radioisotops, das in der überstehenden Flüssigkeit nach der Zentrifugierung einer 1 ml Probe der Reaktion zurückgeblieben war und Subtraktion dieser Menge von den theoretischen Gesamtzählern pro Minute Eingabe in jede Reaktion. Es wurde festgestellt, daß 93% des Proteins an die Partikel gebunden waren (9,3 mg gebundenes Protein pro g Polymer).

Claims

1. Verfahren zum Verknüpfen einer eine reaktionsfähige Amin- oder Sulfhydrylgruppe enthaltenden Verbindung mit polymeren Teilchen über abstehende Carboxylgruppen, dadurch gekennzeichnet, daß das Verfahren umfaßt:

A. Kontaktieren von (1) einer wäßrigen Suspension-von polymeren Teilchen mit Carboxylgruppen an der Oberfläche und hergestellt aus einem oder mehreren ethylenisch ungesättigten polymerisierbaren Monomeren, von denen mindestens eines abstehende Carboxylgruppen aufweist, mit (2) einer Carbamoyloniumverbindung unter Erzeugung reaktionsfähiger Zwischen-Polymerteilchen mit abstehenden reaktionsfähigen Zwischengruppen, und

B. Kontaktieren der reaktionsfähigen Zwischen-Polymerteilchen, die in der Stufe A erhalten wurden, mit einer eine reaktionsfähige Amin- oder Sulfhydryigruppe enthaltenden Verbindung, die mit den reaktionsfähigen Zwischengruppen unter Bildung einer covalenten Bindung zwischen den Teilchen und der reaktionsfähigen Verbindung reagiert, wobei

die Carbamoyloniumverbindung der folgenden Strukturformel entspricht:

in der bedeuten:

Z die zur Vervollständigung eines 5- oder 6-gliedrigen heterocyclischen aromatischen Ringes erforderlichen Atome,

m und n unabhängig voneinander 0 oder 1,

R¹ und R² unabhängig voneinander Alkyl oder Aryl oder R¹ und R² gemeinsam die Atome, die zur Vervollständigung eines Piperidin-, Piperazin- oder Morpholinringes erforderlich sind;

R³ ein Wasserstoffatom, Alkyl oder die Gruppe:

in der A die polymerisierte Vinylkette eines Homo- oder Copolymeren darstellt, das hergestellt ist aus einem oder mehreren ethylenisch ungesättigten polymerisierbaren Verbindungen, derart, daß das Molekulargewicht des Homo- oder Copolymeren größer als 1000 ist,

R&sup4; ein Wasserstoffatom, Alkyl, oder falls Z für die Atome steht, die zur Vervollständigung eines Pyridiniumringes erforderlich sind und n gleich 0 ist, steht R&sup4; für eine Gruppe, ausgewählt aus den folgenden Gruppen:

(a) -NR&sup6;-CO-R&sup7;, worin R&sup6; für Wasserstoff oder Alkyl steht, und worin R&sup7; Wasserstoff, Alkyl oder -NR&sup8;R&sup9; ist, worin R&sup8; und R&sup9; unabhängig voneinander für Wasserstoff oder Alkyl stehen,

(b) -(CH&sub2;)q-NR¹&sup0;R¹¹, worin R¹&sup0; für -CO-R¹² steht, R¹¹ gleich Wasserstoff oder Alkyl ist, R¹² die Bedeutung von Wasserstoff, Alkyl oder -NR¹³R¹&sup4; hat, worin R¹³ gleich Alkyl oder Aryl ist, R¹&sup4; für Wasserstoff, Alkyl oder Aryl steht und q gleich 1 bis 3 ist,

(c) (CH&sub2;)r-CONR¹&sup5;R¹&sup6;, worin R¹&sup5; gleich Wasserstoff, Alkyl oder Aryl ist, R¹&sup6; für Wasserstoff oder Alkyl steht oder R¹&sup5; und R¹&sup6; gemeinsam für die Atome stehen, die zur Vervollständigung eines 5- oder 6-gliedrigen aliphatischen Ringes erforderlich sind, und r gleich O bis 3 ist,

worin R¹&sup7; gleich Wasserstoff oder Alkyl ist, Y für Oxy oder -NR¹&sup9;- steht, R¹&sup8; Wasserstoff, Alkyl, -CO-R²&sup0; oder -CONHR²¹ darstellt, worin R¹&sup9;, R²&sup0; und R²¹ unabhängig voneinander Wasserstoff oder Alkyl darstellen und t gleich 2 oder 3 ist, und

(e) -R²¹X'R, worin R²¹ für Alkylen steht und X'R eine covalent gebundene anionische Gruppe darstellt, unter Bildung einer inneren salzgruppe mit dem Pyridiniumring,

R&sup5; gleich Alkyl oder Aryl, vorausgesetzt, daß m gleich 0 ist, wenn das Stickstoffatom, an das R&sup5; gebunden ist, an den Rest des Ringes durch eine Doppelbindung gebunden ist, und

X'R ein Anion, und v gleich O oder l, wobei gilt, daß v nur 0 ist, wenn R&sup4; für die Gruppe der Formel R²¹X'R steht.

2. Verfahren nach Anspruch 1, in dem entweder die in der Stufe A verwendeten Polymerteilchen oder die in Stufe B verwendete reaktionsfähige Verbindung mit Amin- oder Sulfhydrylgruppen eine ermittelbare Spurenverbindung aufweist, die mit den Teilchen oder der reaktionsfähigen Verbindung verbunden ist.

3. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2, in dem als reaktionsfähige Verbindung mit Amin- oder Sulfhydrylgruppen ein Polypeptid oder Protein verwendet wird.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, in dem die Carbamoyloniumverbindung in einem Molverhältnis zur gesamten Carboxylsäuremenge in den Polymerteilchen von 1 : 100 bis 10 : 1 vorliegt.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß es bei einer Temperatur von 10ºC bis 60ºC durchgeführt wird.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, in dem die Carbamoyloniumverbindung die angegebene Struktur hat, in der R¹ und R² gemeinsam die Atome darstellen, die zur Vervollständigung eines Piperidin-, Piperazin- oder Morpholinringes erforderlich sind.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, in dem die Carbamoyloniumverbindung der angegebenen Formel entspricht, in der R¹ und R² gemeinsam für die Atome stehen, die zur Vervollständigung eines Pyridiniumringes erforderlich sind, R&sup4; gleich -R²¹X'O ist und m, n und v gleich 0 sind.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, in dem die Carbamoyloniumverbindung ein inneres Salz von 1-(4-Morpholinocarbonyl)-4-(2-sulfoethyl)pyridiniumhydroxid oder 1-(4-Morpholinocarbonyl)pyridiniumchlorid ist.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, in dem die reaktionsfähige Verbindung mit den Amin- oder Sulfhydrylgruppen einer immunologisch reaktionsfähigen Gattung angehört.

10. Verfahren nach Anspruch 9, in dem die immunologisch reaktionsfähige Gattung ein Antikörper für ein beliebiges Streptococcus A Antigen ist, ein Chlamydien-Antigen, ein gonococciales Antigen, ein menschliches chlorionisches Gonadotropin, ein menschliches leutinisierendes Hormon, ein Herpes-Virus, ein Arzneimittel oder Hormon oder ein HTLV- oder HIV-Antigen.