DE3853201T2

DE3853201T2 - Schimäre immunkompromittierende Säugetiere und ihre Verwendung.

Info

Publication number: DE3853201T2
Application number: DE3853201T
Authority: DE
Inventors: Joseph Mccune
Original assignee: Leland Stanford Junior University
Current assignee: Leland Stanford Junior University
Priority date: 1987-12-23
Filing date: 1988-12-22
Publication date: 1995-09-14
Anticipated expiration: 2008-12-23
Also published as: JP2801228B2; AU2754888A; JPH0231632A; DE3853201D1; DK720488A; EP0322240A3; ATE119197T1; EP0322240B1; ES2071620T3; IL88779A; DK720488D0; EP0322240A2; IL88779A0

Description

Das Gebiet ist das Wachstum normaler xenogener Zellen in immunokompromittierten nicht-menschlichen Tieren. Insbesondere werden xenogene hämatopoietische Zellen und Organe hergestellt, die mit dem hämatopoietischen System assoziiert sind.
Ein bedeutender Bereich von biologischem Interesse war die Herstellung und Verwendung transgener Tiere, in denen Embryonenzellen modifziert sind, was zum Mosaik-Monogolismus führt, wodurch man Neugeborene mit gegenüber ihren Eltern unterschiedlichen Phenotypen erhält, wobei xenogene Produkte in einem Säugetierfluid, z.B. Milch, hergestellt werden, und wobei die Unterschiede im differenzierten Wirt zur Aufklärung von physiologischen Abläufen, Krankheitsanfälligkeit und -übertragung, Herstellung von Produkten u.dgl. herangezogen werden können.
Der menschliche Wirt ist in vielerlei Hinsicht unter allen Tieren einzigartig. Mord bezieht sich ausschließlich auf das Töten eines Menschen, und die menschliche Aktivitäten betreffenden Gesetze sind um vieles strenger als jene für andere Spezien.
Bei der Untersuchung von Arzneimitteln und anderen therpeutischen Behandlungen werden zunächst Tiere getestet, um zu ermitteln, ob das Arzneimittel oder die Behandlung für Menschen ungefährlich ist. Menschen können für wissenschaftliche Untersuchungen nur selten herangezogen werden, sodaß man die Behandlung in vielen Fällen zuerst an niederen Tieren testen muß, bevor ihr ein Mensch unterzogen werden darf. Daher sind die Entwicklung von Humanprodukten und die Bewertung von für den Menschen eigentümlichen Krankheiten sehr schwierig, da es oft sehr kompliziert ist, ein Humanprodukt außerhalb eines menschlichen Wirts zu erhalten oder ein Tiermodell zu entwickeln, das zuverlässig in Richtung auf die menschliche Erfahrung extrapolierbar ist. In vielen Fällen erwiesen sich die mit Tieren, z.B. Mäusen, Hasen, Ratten oder sogar Primaten, gesammelten Erfahrungen als wenig aufschlußreich, um Erfahrungen mit Menschen vorhersagen zu können.
Daher besteht ein beträchtliches Interesse daran, Systeme entwickeln zu können, mit denen man Humanprodukte, z.B. Humanzellen oder -gewebe, herstellen kann. Die Fähigkeit zur Herstellung solcher Produkte in kommerziell signifikanten Mengen hätte auf die Möglichkeit der Untersuchung sowohl natürlicher als auch durch Krankheit hervorgerufener Vorgänge im Menschen sowie auf die Verwendung von Humanprodukten bei der Diagnose und Behandlung physiologischer Prozesse eine außerordentlich stimulierende Wirkung.

Relevante Literatur

Verweise auf immunoimkompetente Wirte, insbesondere CID oder SCID-Wirte, stammen aus: McGuire et al., Clin. Immunol. and Immunopath. (1975) 3: 555-556; Perryman and Torbeck, J. Am. Vet. Med. Assoc. (1980) 176: 1250-1251; Schultz and Sidman, Genetically-determined Murine Models of Immunodeficiency, The Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME; Bosma et al., Nature (1983) 301: 527-530; Custer et al., Amer. J. Path. (1985) 120: 464-477; Dorshkind et al., J. of Immunol. (1985) 134: 3798- 3801; Kerahtley et al., Lancet, 1.November 1975, 850-853; Touraine, Immunological Rev. (1983) 71: 103-121; und Fulop and Phillyes, J. of Immunology (1986) 136: 4438- 4443.
Verweise auf xenogene Zellen, die innerhalb von lebenden Wirten wachsen, stammen aus: Krueger et al., J. Inv. Dermatol. (1975) 64: 307-312; Krueger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1983) 80: 1650-1654; Krueger and Shelby, J. Inv. Dermatol. (1981) 76: 506-510; Ware et al. J. Immunol. Meth. (1985) 85: 353-361; Ford et al., Nature (1956) 177: 452-454; Dovlsen et al., Nature (1974) 248: 247-249; Mannhardt et al., Thymus (1982) 4: 209-220; Schulte-Wisserman et al., Scand. J. Immunol. (1978) 8: 387-396. Man beachte insbesondere McCune et al., Science (1988) 241: 1632-1639 und der darin enthaltene Kommentar; Yancopoulos und Alt, ebda. (1988) 241: 1581-1583, und die darin angeführten Literaturstellen.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Verfahren, Zusammensetzungen und Organismen zur Vermehrung funktionierender normaler Zellen und Organe in einem lebenden xenogenen nichtmenschlichen Tierwirt werden bereitgestellt. Normale Donor-Säugetierzellen werden in einen immunokompromittierten xenogenen nichtmenschlichen Tierwirt eingesetzt, insbesondere zum Komplementieren eines Defekts, und im chimären Wirt gezüchtet, wodurch die Donorzellen in im wesentlichen normaler Weise im chimären Wirt funktionieren, sich differenzieren, vermehren, wertvolle zum Donorwirten native Produkte erzeugen, unterschiedliche Zellarten analog zu ihrer Verhaltensweise in der Donorquelle in Wechselwirkung treten, und eine Zell- und Produktquelle bereitstellen können, insbesondere zur Forschung oder Verwendung mit der Donor-Säugetierquelle.

BESCHREIBUNG SPEZIFISCHER AUSFÜHRUNGSFORMEN

Verfahren werden bereitgestellt, um es insbesondere undifferenzierten ("Stamm-") Zellen zu ermöglichen, sich in einem xenogenen nichtmenschlichen Tier, normalerweise einem Säugetierwirt, zu differenzieren und fortzupflanzen, worin die Zellnachkommschaft zum Funktionieren im Wirt fähig ist. Die Zellen wachsen und erzeugen zu den Zellen native Produkte, darunter die Zellnachkommenschaft, die in der Forschung, der Bildung von Antikörpern, der Herstellung physiologisch aktiver Produkte als Transplantate und in vielen anderen Anwendungen eingesetzt werden können. Das Verfahren umfaßt das Einbringen der Zellen in eine geeignete Stelle oder Umgebung im Tierwirt, um einen chimären Wirt bereitzustellen. Insbesondere kann mehr als ein Zellentyp in den xenogenen Wirt eingebracht werden, worin die unterschiedlichen Zellen in Wechselwirkung treten können, um für die Reifung, Differenzierung oder Expresson der Zellfunktion zu sorgen.
Im Ausmaß als die vorliegende Erfindung vor allem xenogene Wirte mit einem hochentwickelten Immunsystem betrifft, ist der xenogene Wirt ein nichtmenschlicher Säugetierwirt. Insoferne befaßt sich die folgende Beschreibung mit Säugetierwirten. Man beachte jedoch, daß sich in einigen Fällen andere Tierwirte als Säugetierwirte eignen. Zu solchen anderen Wirten zählen Vögel und Fische, Tiere mit einem weniger hoch entwickelten Immunsystem.
Das vorliegende Verfahren eignet sich zum Einbringen von xenogenen Säugetierzellen, Gewebe und/oder Organen ("Transplantat"), die bzw. das einen Defekt in einem immunkompromittierten Wirt komplementieren können. Günstigerweise umfaßt das Transplantat Stammzellen. Der immunokompromittierte Wirt kann ein xenogenes Immunsystem aufweisen, das zum Transplantat syn- oder allogen ist.
Verschiedene Systeme, die Stammzellen involvieren, können im Tierwirt angewendet werden. Der vorliegende immunkompromittierte Wirt kann als "Gefäß" für eine Vielzahl an xenogenen Zellen und physiologischen Systemen dienen, wodurch eine Umgebung gebildet wird, in der sich Zellen und Systeme differenzieren und funktionieren können.
In vielen Fällen ist es wünschenswert, Kombinationen von Zellen einzubringen, worin die unterschiedlichen Zellen oder Organe in Wechselwirkung treten können. Beispielsweise können hämatopoietische Stammzellen in Verbindung mit embryonischem Dottersack, fötaler Leber, Thymus, Milz, oder Lymphknotengewebe, fötalem oder erwachsenem Knochenmarkgewebe, Bauchspeicheldrüsengewebe, Wurmfortsatzgewebe, Mandelgewebe u.dgl. in den Wirt eingeführt werden. Man kann auch andere Stammzellensysteme verwenden. In anderen als im hämatopoietischen System können Kombinationen Stammzellen zum zentralen oder peripheren Nervensystem, z.B. neuronale oder Matrixzellen des fötalen zentralen Nervensystems, Rückenmarkneuronen und das Rückenmark, Organe des endokrinen Systems, z.B. β- Zellen und andere Zellen der Langerhans-Inseln und der Bauchspeicheldrüse, die Nebenniere, Schilddrüse und die Hypothalamus-Hypophysenachse umfassen. Diese Stammzellen würden in Kombination mit den geeigneten Organen eingeführt werden, in denen jede einzelne dazu gebracht wird, sich zu differenzieren und funktional zu werden.
Ein Beispiel für das Komplementieren eines Defekts ist die Verwendung hämatopoietischer Zellen und Organgewebe, worin die Kombinationen von Stammzellen (Vorläuferzellen für die verschiedenen menschlichen hämatopoietischen Linien) und Zellen, die ein Verarbeitungsorgan bieten, z.B. die Thymusdrüse, in Verbindung mit Knochenmark, der Milz und/oder Lymphknoten in den xenogenen immunkompromittierten Wirt eingeführt werden können, um die verschiedenen differenzierten Zellen herzustellen, z.B. Monocyten, Makrophagen, B-Zellen, T-Zellen, Neutrophilen, Erythrozyten, Eosinophilen, Blutplättchen u.dgl., und sie in den peripheren Blutkreislauf einzubringen. Die differenzierten Zellen werden die peripheren Blutorgane, z.B. die Milz, die Bauchspeicheldrüse, die Lymphknoten, Mandeln usw. bevölkern, insbesondere wenn solche Organe syn- oder allogen sind. Hämoatpoietische Stammzellen in Verbindung mit den geeigneten Verarbeitungsorgan-Geweben können daher die Reifung (Differenzierung) der Stammzellen zu den verschiedenen intermediären und reifen hämatopoietischen Linien bewirken.
In einigen Fällen können die implantierten xenogenen Gewebe/Organe Ziele für Krankheitserreger darstellen, z.B. Gelenksschmieren- und/oder Schilddrüsengewebe zur Untersuchung von Autoimmunerkrankungen, oder Leber- oder Herzgewebe zur Untersuchung von hepatrophen bzw. kardiotrophen Viren.
Immunokompromittierte nichtmenschliche Säugetierwirte mit der erwünschen Immun- Unfähigkeit existieren oder können geschaffen werden. Beispielsweise sind Wirte mit schwerer kombinierter Immundefizienz verfügbar, die als scid/scid-Wirte bekannt sind. Nagetiere, insbesondere Mäuse, und pferdeartige Tiere, insbesondere Pferde, sind derzeit als scid/scid-Wirte verfügbar (nachstehend als SCID-Wirte bezeichnet). Die SCID-Wirte weisen keine funktionierenden B- und/oder T-Zellen auf. In der SCID-Maus scheint der Gendefekt eine nichtfunktionierende Rekombinase zu sein, da die Keimlinien-DNA nicht wiederzusammengefügt wird, um funktionierende Oberflächenimmunoglobin- und T-Zellenrezeptoren zu bilden. Die immunokompromittierten Wirte können auch das Ergebnis einer nichtfunktionierenden Thymusdrüse, von Strahlung, um Stammzellen zu zerstören, der Behandlung mit Stammzellen-spezifischen zytotoxischen Wirkstoffen, zytotoxischen Wirkstoffen, die für sich rasch teilende Zellen spezifisch sind, anti-Asialoglykoprotein-GM-1 o.dgl. sein. Üblicherweise fehlt es einem immunokompromittierten xenogenen Wirt zumindest an funktionierenden B- und T-Zellen, insbesondere als genetischer Defekt in der B- und/oder T-Zellen-Keimlinien-Wiederanordnung. Daher kann der immunokompromittierte Wirt in vielen Fällen funktionierende Organe aufweisen, die mit den Immunsystemen wie Thymus, Milz, Lymphknoten usw. assoziiert sind.
Der immunokompromittierte Wirt kann durch Kreuzen zwischen einem immunokompromittierten Wirt und einem Wirt mit einem anderen interessierenden Phenotyp weitermodifziert werden. Beispielsweise kann der C.B17-scid/scid-Stamm mit geeigneten Mäusestämmen mit niedriger oder keiner NK-Aktivität rückgekreuzt werden. Auf diese Weise kann ein Mäusestamm erzeugt werden, dem T-, B-, und NK-Zellen fehlen. Ein solcher Wirt würde xenogene Gewebe und Zellen voraussichtlich besser akzeptieren und aufrecht halten.
Alternativ dazu kann ein Wirt gepaart werden, um einen Gendefekt in einen Wirt einzubringen, sodaß Untersuchungen von xenogenem Gewebe in einem negativen Hintergrund oder die Auswirkung von xenogenem Gewebe auf den Hintergrunddefekt möglich sind. Beispielsweise können ein Diabeteszug, hämatopoietische Defekte, z.B. β-Thalassämie, Sichelzelle usw. o.dgl. in den Wirt rückeingekreuzt werden, wie dies bereits erwähnt wurde.
Defekte können von Natur aus vorhanden sein oder induziert werden. Zur Bewirkung von Diabetes etwa kann man Immunotoxine für Langerhans-Zellen verwenden. Durch Zerstörung reifer Langerhans-Zellen können xenogene Langerhans-Zellen eingeführt und Bedingungen und Verbindungen hinsichtlich ihrer Auswirkung auf die xenogenen Langerhans-Zellen untersucht werden. Parkinsonismus kann durch Behandlung mit MMTA hervorgerufen werden, wodurch dopaminergene Neuronen im Wirt im wesentlichen zerstört werden. Die Bauchspeicheldrüse kann chirurgisch entfernt und xenogenes Bauchspeicheldrüsengewebe eingesetzt werden. Alternativ dazu kann man chemische Wirkstoffe verwenden, um die P-Zellen der Bauchspeicheldrüsen- Langerhansinseln des Wirts selektiv zu zerstören. Der Wirt kann bestrahlt und xenogenes Knochenmark eingeführt werden.
Somit kann man eine Vielzahl verschiedener Zellen, Gewebe und Organe so wie die Wirkung verschiedener Bedingungen und physiologisch aktiver Verbindungen auf ihre Lebensfähigkeit und Funktionstüchtigkeit in vivo untersuchen. Wenn das transplantierte Immunsystem und transplantierte andere Zellen, Gewebe und Organe in ihrer Ähnlichkeit zumindest allogen sind, ist die Situation zur natürlichen Situation bezüglich transplantierter Zellen, Gewebe und Organe noch ausgeprägter analog.
Xenogene Organe können eingebracht werden, insbesondere als Gewebe, das unter den physiologischen Bedingungen des immunokompromittierten Säugetierwirts Humanprodukte erzeugen kann. Von besonderem Interesse wäre Gewebe, das genetisch für einen Erkrankungsweg prädisponiert ist oder wo eine solche Reaktion induzierbar wäre, z.B. Typ 1-Diabetes; Ziele von menschlichem Immunangriff, z.B. Synovialgewebe; oder Ziele, die tropischen oder Mikroorganismen-Angriffen unterworfen sind, z.B. die Leber mit Hepatitis A, B oder nicht-A, nicht-B, oder Malaria; u.dgl.
Der xenogene Wirt ist ein immunokompromittiertes Tier mit Ausnahme des Menschen, worin die Donorzellen größtenteils Humanzellen sind, obwohl Zellen aus anderen Quellen als den Mitgliedern der gleichen Familie des xenogenen Wirts auch Anwendung finden können. Der immunkompromittierte Wirt kann in unterschiedlicher Weise immunokompromittiert sein, worin das Ergebnis der substantielle Mangel an funktionalen T- und B-Zellen ist. Die xenogenen Wirte können auf verschiedenen Ebenen Defekte aufweisen, was zu einem immunokompromittierten Wirt führt. Der Defekt kann zu einem Verlust der Expression von funktionalen Antikörpern oder unabhängigen Lymphozyten führen, z.B. der natürlichen Killer- (NK) Zellen, der Lymphokin-aktivierten Killer-(LAK) Zellen, der Antikörper-abhängigen zytotoxischen (ADCC) Zellen, der Tumor-infiltrierenden Lymphozyten (TIL), Makrophagen usw.
Jeder beliebige nichtmenschliche Säugetierwirt mit Ausnahme der derzeit verfügbaren Mäuse und Pferde kann verwendet werden, welche Wirte Mitglieder der folgenden Spezien sind: Rinder, Schafe, Ziegen, Hasen, Primaten (mit Ausnahme des Menschen), Schweine, Hunde, Katzen usw., oder Mitglieder anderer warmblütiger Wirbeltierarten sind, z.B. von Vögeln. Von besonderem Interesse sind Labortiere, z.B. Mäuse, Ratten, Meerschweinchen, z.B. Capybara, und Hasen, sowie domestizierte Tiere, wie Primaten mit Ausnahme des Menschen, Kühe, Schafe, Schweine u.dgl. Der xenogene Wirt stammt üblicherweise von einer unterschiedlichen Familie aus der Wirtsquelle der Zellen.
Je nachdem, ob die einzuführenden Zellen ein festes Organ bilden sollen, können verschiedene Stellen zur Einführung der Zellen ausgewählt werden. Diese Stellen variieren in Abhängigkeit davon, ob das einzuführende Gewebe ein festes Organ bilden oder disperse Zellen bereitstellen soll. Einführungsstellen sind u.a. unter der Milzkapsel, die Abdomenwand, Muskeln, unter der Nierenkapsel, das Bauchfell, die Bauchfellauskleidung, das Gehirn, subkutan, das Gefäßsystem, die Milz, das Rückenmark, Blut, die Leber, Membransäcke oder Kapseln verschiedener Gewebe, der retroperitoneale Raum, die Haut, Fortpflanzungsorgane usw. Üblicherweise wird Vorläufergewebe eingebracht, das zu einem funktionierenden Organ heranwächst. Das Einbringen von Gewebe kann durch Injektion, Implantation oder das Verbinden von Blutgefäßen (oder allenfalls anderer Gefäße) des Donors und des Wirts, unter Verwendung intravenöser Katheter, Trokare und/oder durch chirurgischen Einschnitt u.dgl. erfolgen. Die Gewebe oder Zellen von Interesse sind im allgemeinen normale Gewebe oder Zellen (zum Unterschied von neoplastischen oder defekten Geweben oder Zellen) und können mit dem hämatopoietischen System, dem zentralen Nervensystem, dem autonomen Nervensystem, dem Gehirn, der Leber, Knochenmark, Knochen, dem Verdauungssystem, dem Fortpflanzungssystem, der Blase, der Gallenblase, Gelenken, der Bauchspeicheldrüse, der Netzhaut, Nerven, der Milz, der Nebenniere usw. assoziiert sein. Von besonderem Interesse bezüglich der mit dem hämatopoietischen System assoziierten Organe oder Teile sind Lymphknoten, die Leber, die Thymusdrüse, die Milz, Lymphgefäße, Venen, Arterien, Klappen, Kapillargefäße, Knochenmark, die Haut, der Wurmfortsatz, die Mandeln usw. Andere geeignete Organe umfassen Gewebe aus dem Gehirn, z.B. aus dem Großhirn, dem Kleinhirn, der medulla oblongata, der Rinde, der Brücke, dem Balken, dem Kleinhirnstiel, dem Hippocampus, dem Thalamus, den Basalganglien usw., sowie Teile davon. Andere Gewebe sind u.a. Plazenta-, Synovial-, Gefäß-, Speiseröhren-, Membran-, Glattmuskel-, Muskel-, Knochen-, Herz-, Knorpel-, Schleimhautgewebe usw.
In einigen Fällen kann man defekte Gewebe oder Zellen züchten, um die genetische Krankheit zu untersuchen, die Quelle für defekte DNA auszuweiten, die Auswirkung von Arzneimitteln und Therapieschemata u.dgl. zu analysieren. Zu interessierenden Geweben zählen: β-Thalassämie-Zellen, mit der Huntington-Krankheit oder dem Duchenne-Syndrom assoziierte Zellen, Zellen mit fötalen Anomalien wie Trisomie 21, Zellen aus diabetischer Bauchspeicheldrüse, Zellen von Patienten mit Alzheimer- Krankheit oder Myasthenia gravis und anderen Störungen des Zentralnervensystems usw.
Die Gewebequelle kann je nach Beschaffenheit des Gewebes oder Organs von Embryo- Dottersack- bis zu fötalem Gewebe mit einem Schwangerschaftsalter von zumindest etwa 4 Wochen, üblicherweise zumindest etwa 6 Wochen, bis zu erwachsenem Gewebe variieren. Vorzugsweise stammt das Gewebe von einem Kind von weniger als etwa 3 Jahren, vorzugsweise von einem Kind von weniger als etwa 1 Jahr und mit einem Alter von neugeboren oder jünger, wobei fötales Gewebe von etwa 7 bis 24 Wochen vorzuziehen ist.
Für verschiedene Organe kann Gewebe unterschiedlichen Alters vorzuziehen sein. Bei fötalem Gewebe sind menschliche Lymphknoten günstigerweise zumindest etwa 15 Schwangerschaftswochen (g.w.), vorzugsweise 16-20 g.w., alt; bei menschlicher Thymusdrüse von etwa 9 bis 24 g.w., vorzugsweise weniger als etwa 20 g.w.; bei Knochenmarkgewebe von etwa 16 bis 24 g.w.; und bei menschlicher fötaler Leber von etwa 10 bis etwa 24 g.w., vorzugsweise von etwa 13 bis 22 g.w.
Das Gewebe kann frisches Gewebe sein, das innerhalb von 48 Stunden nach dem Tod gewonnen wird, oder frisch eingefrorenes Gewebe sein, das innerhalb von 12 Stunden nach dem Tod eingefroren und bei weniger als etwa -10ºC, üblicherweise bei der Temperatur von flüssigem Stickstoff (-70ºC), über unbestimmte Zeit gelagert wird. Das Gewebe kann aus einem im chimären Wirt implantierten Organ stammen, wobei das Gewebe 2 bis 4 Wochen oder länger nach der Implantierung entfernt werden kann. Auf diese Weise kann das ursprünglich aus der Wirtsquelle gewonnene Gewebe deutlich ausgedehnt werden, wodurch die Gesamtzahl der erhaltenen chimären Wirten beträchtlich gesteigert werden kann. Das aus dem chimären Wirt gewonnene Gewebe kann analog zu dem aus dem ursprünglichen Quellenwirt gewonnenen Gewebe behandelt werden. Das Gewebe kann als Einzelzellen, die von anhängenden Stromalelementen befreit sind, als Dispersion oder als kleine Gewebeschnitte von im allgemeinen etwa 0,5 bis 4 mm, üblichererweise von etwa 1 bis 2 mm, im allgemeinen mit einer Dicke im Bereich von etwa 1 bis 2 mm bestehen, sodaß die Abschnitte leicht in ein zur Implantierung verwendentes Trokar passen, günstigerweise mit einer Nummer von etwa 15 bis 20. Normalerweise werden die Zellen keinem in vitro-Kultivieren über längere Zeiträume, d.h. drei Tage oder mehr, ausgesetzt; für bestimmte Zwecke kann sich eine solche Präimplantations-in vitro-Züchtung jedoch als wünschenswert erweisen. In einigen Fällen können ganze Organtransplantate durch Anastomosieren von Donor- und Wirtblutgefäßen, lymphatischen Gefäßen und anderen Gefäßen wie Harnleiter usw. transplantiert werden.
Im Bedarfsfall kann man disperse Zellen verwenden, wobei die relevanten Organe zerlegt werden, um lebensfähige Zellen in Suspension zu ergeben. Günstigerweise können Suspensionszellen bezüglich der jeweiligen interessierenden Zellen angereichert werden. Bei fötalen Leberzellen beispielweise können die Suspensionszellen bezüblich hämatopoietischer Vorläufer durch Ficoll-Hypaque- Dichtegradient-Zentrifugieren angereichert werden. Zellen können auch durch andere Verfahren angereichert werden, z.B. fluoreszenzaktiviertes Zellsortieren, Auswaschen, Magnetperlentrennung, Elutriation in einem Zentrifugalfeld oder durch das Rosette- Verfahren.
In einigen Fällen kann es wünschenswert sein, Zellen durch Abtöten oder Entfernen anderer Zellen anzureichern. Dies kann man durch die Verwendung von für die unerwünschten Zellen spezifischen monoklonalen Antikörpern in der Gegenwart eines Komplements oder gebunden an einen zytotoxischen Wirkstoff erreichen, wie etwa ein Toxin, z.B. Ricin, Abrin, Diphterietoxin oder eine Radiomarkierung, z.B. ¹³¹I o.dgl. Immunoaffinitätssäulen können verwendet werden, die je nach Beschaffenheit der Mischung eine spezifische Abtrennung entweder der erwünschten oder der unerwünschten Zellen ermöglichen.
Der Empfänger-Säugetierwirt kann eine Vielzahl an Immundefekten aufweisen. Von besonderem Interesse ist der Defekt, der zu nichtfunktionalen T- und B-Zellen führt. Eine solche Dysfunktion kann mit SCID-Tieren erreicht werden (Tieren mit schwerer kombinierter Immundefizienz). Derzeitige scid/scid-Spezien sind z.B. Mäuse und Pferde. In Zukunft könnten beispielsweise unter Verwendung transgener Zellabreicherungsverfahren scid-Tiere anderer Spezien entwickelt werden. Andere Fehlfunktionen sind: nichtfunktionale Stammzellen, der Defekt an Oberflächenmembranproteinen, die mit der T- und B-Zellenfunktion assoziiert sind, inkompetente Rezeptoren, z.B. T-Zellrezeptor- und Oberflächenimmunoglobulin- Rezeptor, eine Defizienz in der T- und B-Zellenreifung, eine Defizienz in der natürlichen Killerzellaktivität, und nichtfunktionales Thymus-, Lymphknoten, Milz- oder Knochenmarkstroma.
Neben der phenotypischen Defizienz kann eine weitere Verringerung der Immunokompetenz durch Bestrahlung des Wirts oder Verwendung immunozytotoxischer Markierungen erzielt werden, wie dies bereits erwähnt wurde; Beispiele hierfür sind Antikörper, die für Zellen der Lymphoid- (einschließlich natürlicher Killerzellen) oder myelomonozytischen Abstammungslinien spezifisch sind. Insbesondere dort, wo die Immunokompetenz durch das in den Wirt eingebrachte Gewebe geschaffen wird, kann native Immunokompetenz über den niedrigen im jeweiligen Phenotyp des Wirts natürlich vorhanden Wert hinaus gesteigert werden.
In geeigneten Situationen können ein oder mehrere Organe für bestimmte Zwecke entfernt werden. Es kann z.B. eine Splenektomie durchgeführt werden, um eine längerfristigere Wiederherstellung roter und anderer hämatopoietischer Zellen im Blutkreislauf zu bewirken. Andere Organe können zur Einführung und Untersuchung eines xenogenen Organs entfernt werden. Knochenmark kann durch selektive Bestrahlung zur Einbringung von xenogenem Knochenmark entfernt oder zerstört werden. Stromale Wirtszellen können zur Bereitstellung xenogener Stromalzellen für eine natürlichere Umgebung für xenogene Stammzellen entfernt werden.
Das Alter des Wirts ist üblicherweise weniger als etwa 25% der normalen Lebensdauer eines immunokompetenten Wirts, üblicherweise etwa 1 bis 20% der normalen Lebensdauer. Im allgemeinen ist der Wirt zumindest etwa 3 Wochen alt und groß genug, um zur Einbringung der Säugetierzellen an der erwünschten Stelle manipuliert zu werden. Beispielsweise verwendet man Mäuse, die eine Lebensdauer von etwa 2-4 Jahren besitzen, mit etwa 3 bis 10, üblicherweise 4 bis 8 Wochen. Das Gewebewachstum innerhalb des Wirts hängt vom Organ ab und entspricht einer Größen- bzw. Volumssteigerung von üblicherweise zumindest dem Fünffachen, üblichererweise zumindest dem Zehnfachen und unter Umständen dem Hundertfachen oder mehr.
In Abhängigkeit von dem in den Wirt eingebrachten Gewebe, der Natur des Wirts und den Kombinationen des verwendeten Gewebes sind verschiedene Ergebnisse möglich. Von besonderem Interesse im hämatopoietischen System ist die Herstellung von Zellsets und -untersets, insbesondere von T- und/oder B-Zellen. Durch Verwendung von fötalen Leberstammzellen in Verbindung mit einer Thymusdrüse derselben Spezies oder desselben Wirten (allogen oder syngen) im immunokompromittierten Wirt können z.B. T-Zellen, B-Zellen und myelomonozytische Zellen gebildet werden, die nativ zum Quellenwirt sind. Die Herstellung von T-Zellen sowie aller anderen Quellenwirtszellen kann durch Einbringung verschiedener Lymphokine, Zytokine und Wachstumsfaktoren aus der Gewebewirtsquelle in den Säugetierwirt gesteigert werden. Auf diese Weise kann man das Wachstum der erwünschten Zellen fördern. Beispiele von Faktoren sind jeder der Interleukine 1-7, insbesondere ll-1, -2 und -3; der M-, G- und GM- koloniestimulierende Faktor, Interferone-α, β und γ, Monokine, Wachstumsfaktoren usw. Die hinzugefügte Menge hängt von der Natur des Säugetierwirts, der Natur der Zelle und des Faktors ab.
Zur Förderung der einzelnen Untersets von T- und/oder B-Zellen kann der Säugetierwirt mit einem interessierenden Antigen immunisiert werden, um die Population an T- und B-Zellen zu erhöhen, die an das jeweilige Antigen binden. Der Säugetierwirt kann zusätzlichen Immunisierungen unterworfen werden, um die erwünschte Population noch mehr zu fördern. Auf diese Weise kann man B-Zellen herstellen, die für das Antigen spezifisch sind und als Splenozyten, Lymphknotenlymphozyten oder andere periphere Blutlymphozyten zur Fusion mit einem geeigneten Verschmelzungspartner zur herkömmlichen Bildung von Hybridomen verwendet oder mit EBV immortalisiert werden können. Es gibt verschiedene Myelomazellen zur Fusion mit Primatenzellen, insbesondere Humanzellen, wie dies in den US PSen Nr. 4.574.116, 4.594.325 und 4.451.570 berichtet wird. Alternativ dazu können T-Zellen immortalisiert werden, um T- Zellen zu bilden, die T-Zellen-Rezeptoren tragen, die zur Stimulierung von B-Zellen, gemischten Lymphozytenreaktionen, zur Bewertung immunodominanter Sequenzen, Affinitätssäulen für B-Zellen, insbesondere assoziiert mit einer immunodominanten Sequenz, oder für Zytotoxizitäts- oder Entzündungsreaktionen gegen relevante (z.B. neoplastische) Zielzellen verwendet werden können. Außerdem können verschiedene Kolonien von Monozyten, Granulozyten, Makrophagen, Eosinophilen, Neutrophilen, Myeloidzellen, Blastenzellen, Vorläuferzellen u.dgl. hergestellt und isoliert werden.
Die Gegenwart des Fremd(Quellenwirt)gewebes in einem immunokompromittierten Wirt kann dazu dienen, die Auswirkung verschiedener Verbindungen auf das Wachstum, die Lebensfähigkeit, Differenzierung, Reifung, Transformation u.dgl. der Fremdzellen in einem lebenden Wirt zu untersuchen. Somit kann man mit dem immunokompromittierten Wirt die Auswirkung einer Variation eines Zustands auf ein Symptom oder das Anzeichen einer Krankheit untersuchen. Unter "Zustand" versteht man hierin eine physikalische oder biologische Eigenschaft, z.B. die Temperatur, das elektrische Potential, die Ionenstärke, Arzneimittel, Transformation usw.
Normalerweise ist das Gewebe vaskularisiert. Somit können dem Wirt verschiedene Arzneimittel verabreicht und die Auswirkung auf ein bestimmtes Gewebe durch invasive und nichtinvasive Techniken bestimmt werden. Zu nichtinvasiven Techniken zählen: NMR, CAT-Scans, Fluoroskopie, Röntgenographie, Radionuklid-Scanning, Ultrasonographie, Elektrokardiographie, Elektroenzephalographie, hervorgerufene Potentiale usw. Zu invasiven Techniken zählen: Biopsie, Autopsie, Laparotomie, Laparoskopie, intermittierende intravenöse Blutabnahme oder intravenöser Katheter usw. Geeigneterweise kann das Setzen bzw. Anbringen verschiedener Vorrichtungen, z.B. von Kathetern, Elektroden usw., zur ständigen Überwachung erfolgen. Somit kann man mit Hilfe des Wirts die Karzinogenität verschiedener Verbindungen gegenüber verschiedenen Fremdgeweben, die Auswirkung verschiedener Fremdgewebe auf Wachstum und Lebensfähigkeit, die Auswirkung von Kombinationen von Verbindungen, z.B. Arzneimittel, u.dgl. bestimmen. Durch das Hervorrufen einer pathogenen Infektion des Fremdgewebes kann außerdem die Wirkung verschiedener Arzneimittel zum Schutz des Wirtsgewebes vor dem Pathogen sowie die Zytotoxität oder Unterdrückung des Pathogens in einer Zellumgebung bestimmt werden.
Der chimäre Wirt kann auch zur Ermittlung der Zytotoxität verschiedener Arzneimittel gegenüber Fremdgewebe, z.B. zum Screenen zum Erforschen neuer Arzneimittelanwendungen dienen. Weiters kann der chimäre Wirt dazu dienen, die Arzneimittel auf ihre Wirksamkeit, Sicherheit und Bio-Verfügbarkeit hin zu untersuchen.
Organe können für die Transplantation wachsen gelassen werden, sodaß Gewebe vom Donorwirt, insbesondere syngenes oder allogenes Gewebe, im Säugetierwirt zu einem Organ wachsen gelassen und dann in einen Empfänger transplantiert werden kann, der von einer Spezies stammt, die das im Säugetierwirt gewachsene Organ akzeptieren kann. Die Zellen können verschiedenen Manipulationen unterzogen werden, z.B. Transfektion zur Einführung eines neuen Phenotyps oder Korrektur eines defekten Phenotyps usw.
Der Säugetierwirt wird in herkömmlicher Weise gezüchtet. Je nach Grad des immunokompromittierten Status des Säugetierwirts kann dieser in variierendem Ausmaß vor Infektion geschützt werden. In einigen Fällen kann daher eine sterile Umgebung oder prophylaktische Antibiose angezeigt sein. Die prophylaktische Antibiose kann bei SCID-Mäusen mit 25-75 mg Trimethoprim und 100-300 mg Sulfamethoxazolin 5 ml Suspension erzielt werden, die jede Woche an 3 Tagen verarbreicht werden. Alternativ dazu kann es ausreichen, die potentiellen xenogenen Wirte von anderen Tieren nach Kaiserschnitt-Gewinnung in keimfreien Umgebungen zu isolieren. Das Ernähren und die Haltung des chimären Wirts folgt größtenteils herkömmlichen Verfahrensweisen.
Die Fremdzellen sind üblicherweise zumindest zwei Wochen lang, üblicherweise zumindest vier Wochen lang, vorhanden und können über Zeiträume von drei Monaten oder mehr ständig vorhanden sein. Meistens können normale Zellen, Gewebe und/oder Organe stabil aufrechterhalten werden; sie funktionieren zumindest 3-6 Monate lang, häufig zumindest 10 Monate lang.
Die Fremdzellen können im immunokompetenten Wirt lebensfähig bleiben und im Quellenwirt und häufig im xenogenen Wirt funktionieren. Neben dem Durchführen von normalen Stoffwechselvorgängen reagieren die Zellen auf Liganden, sie transduzieren Signale, sekretieren geeignete Produkte und erfüllen normale Funktionen, wie sie auch syngene oder kongene Zellen in ihrem Wildtyp-Wirt erfüllen. Bei der Beteiligung von Organen definieren die Zellen eine Gewebemasse mit geeigneter Architektur für die Organfunktion.
Der immunokompromittierte Wirt kann in unterschiedlicher Weise je nach seiner Fähigkeit verwendet werden, eine Umgebung zu schaffen, in der sich Stammzellen vermehren und differenziern können. Somit kann der Wirt dazu dienen, die Gegenwart von Stammzellen in einer zellulären homogenen oder heterogenen Zusammensetzung festzustellen. Eine zelluläre Zusammensetzung, z.B. Knochenmark, kann z.B. unter Verwendung eines fluoreszenzaktivierten Zellsortierers ("FACS") in Fraktionen aufgeteilt werden. Die Fraktionen können dann intravaskulär in den Wirt injiziert werden. Nachdem den Zellen ausreichend Zeit zur Differenzierung gegeben wird, kann Gewebe oder Blut aus dem Wirt entfernt werden, um als Quelle für periphere Blutlymphozyten oder andere hämatopoietische Zellen, z.B. Erythroid- und Myeloidzellen und Blutplättchen, zu dienen. Im Bedarfsfall könnten die Stammzellen MHC-typisiert werden, um sicherzustellen, daß die reifen Zellen aus dem Stammzellen stammen, wobei die Stammzellen andere MHC-Antigene von anderen hämatopoietischen Zellen besitzen, die im Wirt vorhanden sein können. Die Gegenwart reifer Zellen verschiedener hämatopoietischer Abstammungslinien würde ein Anzeichen für Vorläuferzellen sein, während die Gegenwart aller Abstammungslinien ein Anzeichen für Stammzellen sein würde. Wiederum kann man günstigerweise auf FACS zurückgreifen, um die Zellpopulation zu bestimmen.
Als Beispiel der vorliegenden Erfindung werden SCID-Mäuse von etwa 6 bis 8 Wochen verwendet. Human-Thymusgewebe, Milz, Lymphknotengewebe und Lebergewebe werden in die Nierenkapsel eingebracht. Vier Wochen nach dem Implantieren werden fötale Lebergewebezellen intravenös injiziert. Neun Wochen nach dem Implantieren werden die Mäuse mit 2 ml von 10&sup5; Zellen lebender E.coli J5-Organismen in vollständigem Freund'schem Adjuvans immunisiert, wobei das Kernlipid A dieser Organismen aufgrund einer Mutation offenliegt. Elf Wochen nach dem Implantieren wird eine zweite Immunisierung von 10&sup5; Zellen von E.coli J75 in unvollständigem Freund'schem Adjuvans verabreicht. Drei Tage später werden die Mäuse ausgeblutet, die PBL und/oder Lymphknoten- und Milzzellen menschlichen Ursprungs werden mit einem Heteromyelom verschmolzen, das in der hierin angeführten US PS Nr. 4.547.116 beschrieben ist. Die Hybridomen werden ausgedehnt, unter einschränkender Verdünnung kloniert und die Klonen auf Antikörper zum Kernlipid A gescreent. Die resultierenden Humanantikörper können hinsichtlich des Schutzes gegen Bakteriämie und anaphylaktischen Schock gescreent werden.
Ein weiteres Beispiel ist die Verwendung chimärer Wirte zur Untersuchung einer Krankheit. Beispielsweise kann eine chimäre Maus, in die Human-Fötallebergewebe, Thymusgewebe und Lymphknotengewebe eingeführt wurden, zur Untersuchung von HIV verwendet werdne. Nach einem Zeitraum von vier Wochen nach der Einführung von fötalem Lebergewebe, als der T-Zellentiter etwa maximiert war, wird die Maus mit einer intravenösen Dosis von 10&sup4; infektiösen Einheiten HIV infiziert. Eine Woche später erfolgt eine Biopsie, um sicherzustellen, daß Infektion eintrat. Die Maus kann dann dazu dienen, therapeutische HIV-Mittel zu screenen. Beispielsweise wird 5-50 mg/kg Wirts-anti-CD4 als tägliche Dosis über einen Zeitraum von 3 Tagen bis zu einer Woche hinzugefügt, wobei der Infektionsverlauf durch serielle Biopsie verfolgt wird.
Antikörper, die die Infektionsrate senken, dienen dazu, den Verabreichungsverlauf vor der Verwendung in menschlichen Wirten zu variieren.
Die folgenden Beispiele sind veranschaulichend und nicht einschränkend.

VERSUCHSTEIL

Verfahren

1. Mäuse

C.B17 scid/scid-Mäuse stammten von Dr. Leonard D. Schultz des Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME. Die Mäuse werden in standardmäßigen Isolatorkäfigen in einer herkömmlichen Tierhaltungseinrichtung untergebracht. Unter diesen Bedingungen haben sie eine Lebensdauer, die als deutlich kürzer angesehen wird als bei anderen angeborenen immunokompetenten Stämmen (z.B. 1-2 Jahre gegenüber 3-4 Jahre). Die Todesursache steht normalerweise mit Infektionsmöglichkeiten in Zusammenhang (am häufigsten durch Pneumocystis carinii). Man verwendet Protokolle, um derartige Infektionen duch Verabreichung prophylaktischer Antibiotika (Trimethoprim/Sulfamethoxasol) an die Mäuse (siehe oben) zu verhindern, wobei als Richtlinien Protokolle herangezogen werden, die zur Prophylaxe von Patienten mit AIDS oder ARC entwickelt wurden. In jeder anderen Hinsicht (z.B. Käfigstreu, Nahrung, tägliche Nahrungszyklen usw.) werden die Mäuse gemäß den Routineprotokollen der Tierhaltungseinrichtung behandelt.

2. Sammlung und Vorbereitung von Humanfötalgeweben

Die über den Patienten zur Verfügung stehenden Informationen umfassen das ungefähre Schwangerschaftsalter (oder, falls bekannt, das tatsächliche Schwangerschaftsalter) des Fötus und den angegebenen Grund des Schwangerschaftsabbruchs; im letzteren Fall sind auch die Details jeglicher genetischer oder morphologischer Anomalien bekannt, die durch die amniotische Fluidanalyse und/oder Ultrasonographie /z.B. chromosomale Fehler, Anenzephalie, Hydrops usw.) entdeckt werden. In anfänglichen Versuchen wird Gewebe aus offensichtlich normalen Föten verwendet; in späteren Versuchen schuf man genau festgelegte Situationen, worin Gewebe von Föten mit genetischen Anomalien verwendet wurden.
Die Gewebe stammten direkt aus dem OP; sie waren fötale Teile nach freiwilligem oder medizinisch indiziertem Abortus (mit Schwangerschaftsalterns von 7-24 Wochen). Ohne Beachtung strenger Sterilität werden diese Teile sofort in einen Sezierraum gebracht. Die erwünschten Gewebe werden identifiziert, herausgeschnitten, in ein RPMI 1640- Medium mit 10% fötalem Kalbsserum gelegt und direkt zu einem weiteren Labor gebracht. In jenen Situationen, in denen "Vollorgan"-Transplantationen durchgeführt werden (d.h. Gewebe einschließlich sowohl der Stromalelemente als auch der darin befindlichen hämatopoietischen Elemente), werden die jeweiligen Organe zu Stücken geschnitten, die eine Größe von etwa 1 x 4 mm aufweisen. (Ein Gewebestück dieser Größe paßt leicht in ein zum Einsetzen verwendetes Trokar Nummer 19.) In jenen Situationen, in denen dispergierte Zellen injiziert werden sollen, werden die relevanten Organe zerlegt, um lebensfähige Zellen in Suspension zu ergeben. Im Falle fötaler Leber werden die Suspensionszellen durch Ficoll-Hypaque-Dichtegradient- Zentrifugierung hinsichtlich hämatopoietischer Vorläufer angereichert; die Grenzflächenschicht, die die erwünschten Zellen enthält, wird dann dreimal ausgewaschen, gezählt und auf etwa 10&sup8; Zellen/ml gebracht. Zur Subfraktionierung von Stammzellenvorläufern werden die auf Ficoll-Hypaque-Gradienten isolierten fötalen Leberzellen anschließend mit monoklonalen Antikörpern gegen relevante Zelloberflächenmarker gefärbt und durch Verfahren einschließlich negativer Selektion mit Magnetperlen und positiver Selektion auf FACS isoliert.
Zur Markierung des genetischen Ursprungs des Donor-Fötalgewebes erfolgt eine HLA- Histotypisierung auf Fötalthymozyten unter Verwendung monoklonaler Antikörper (siehe unten), die gemeinsame HLA-Allele erkennen. Auf diese Weise erhält man vor dem Implantieren einen histotypisierten "Fingerabdruck", durch den die gesamte Nachkommenschaft der eingeführten Stammzellen in der SCID-hu-Maus genau verfolgt werden kann.
Gewebe wird normalerweise in einem möglichst frischen Zustand eingebracht, weshalb die Gewebesammlung, -bildung, -histotypisierung und -implantierung alle am selben Tag erfolgen. Gefrorenes Gewebe scheint jedoch im Falle von fötalen Leberzellen und fötalem Thymusgewebe gut zu funktionieren. Es werden daher Aliquote von verbleibendem Gewebe von jeder Probe am Ende des Tages unter Verwendung von Standard-Verfahrensweisen 10%DMSO/50%FCS gefroren und dann in einem Lagergefriergerät mit flüssigem Stickstoff katalogisiert.

3. Transplantation von Humangewebe in SCID-Mäuse

Mäuse wurden im allgemeinen in einem Alter von 4-8 Wochen entweder ohne Vorbehandlung oder nach Vorbehandlung entweder mit (a) anti-Asiaologlykoprotein GM1 oder (b) fraktionierten Bestrahlungsabläufen (175 rad wöchentlich x 4 Wochen) verwendet. Die letzteren zwei Vorbehandlungen wurden entwickelt, um die Möglichkeit zu testen, daß die Entfernung endogener natürlicher Killerzellenaktivität im SCID eine bessere Konstituierung mit xenogenem Gewebe gestattet.
Gewebe wurde auf unterschiedlichem Wege eingebracht: intravenös, intrarenal, intrasplenogen oder subkutan. In den letzteren drei Fällen werden die Mäuse zuerst mit Halothan anästhesiert. Ein Einschnitt von 1 cm wird vorgenommen, um entweder die Niere oder die Milz offenzulegen, und ein Nr.19-Trocar dient dazu, menschliches Gewebe unterhalb der Kapsel eines der beiden Organe einzuführen. Danach wird der Einschnitt mit chirurgischen Nähten verschlossen. Für intravenöse Injektionen dient eine Nr.30-Nadel dazu, Suspensionszellen in den retroorbitalen venösen Plexus einzubringen. Von diesen Wegen bietet das Implantieren von Gewebe in die linke Nierenkapsel einige große Vorteile: erstens ist sie leicht zugänglich; zweitens kann die Niere wiederholt geöffnet werden, um das Wachstum des transplantierten Gewebes zu beobachten und Biopsieproben daraus zur histologischen Analyse zu entfernen.

4. Analyse von SCID-hu-Mäusen

A. Immunophenotypisierung

Eine Anzahl an monoklonalen Antikörpern gegen verschiedene Zelloberflächenmarkierungen menschlicher Lymphozyten wurden zur Analyse der in SCID/HU-Mäusen vorgefundenen Zellen gebildet. Dazu gehören Markierungen für reife menschliche periphere Blut-T-Zellen (OKT4, OKT8, OKT3, OKT11), Markierungen menschlicher peripherer Blut-B-Zellen (anti-IgM, anti-IgG, anti-Leichtkette) und Markierungen des Human-HLA-Komplexes (einschließlich sowohl polymorpher als auch monomorpher Determinanten von Klasse I-Antigenen). Diese Mäuse-Antikörper wurden in Immunofluoreszenzassays entweder als primäre Antikörper, die sekundär mit einem fluoreszierten (FITC) Antimaus-Antikörper umgesetzt werden, oder als biotinylierte Antikörper verwendet, die sekundär mit Avidin-FITC umgesetzt werden. In einigen Fällen wurden auch direkt fluoreszeinierte Antikörper verwendet. Nach der Transplantation wird Mäusen durch einen Schwanzveneneinschnitt wöchentlich Blut abgenommen; man erhält etwa 100 ul Vollblut (es enthält üblicherweise 1-2 x 10&sup5; Zellen). Kernzellen werden durch Ausfällen roter Blutzellen mit Dextransulfat angereichert, durch Waschen von den Plättchen befreit und anschließend auf Mikrotiterplatten mit 96 Näpfen mit den monoklonalen Antikörpern gefärbt. Nach Abschluß des Assays erfolgt eine visuelle Inspektion auf positive Zellen (d.h.jener mit deutlicher Oberflächenfluroeszenz) unter dem Immunofluoreszenzmikroskop. Wenn menschliche Zellen mehr als 1 % der gesamten peripheren Kernzellen ausmachen, können sie durch dieses Verfahren leicht nachgewiesen und mit statistischer Signifikanz auch mit Mehrfachparameter-FACS quantifiziert werden.
Wenn sich die Proben durch direkte Inspektion als positiv herausstellen, werden sie dann durch FACS analysiert. Bei dieser Analyse werden die Zellen zuerst mit 1% Formalin fixiert und dann 10 min lang mit 1 ug/ml Propidiumiodid (PI) inkubiert (das durch die kernhältigen Zellen aufgenommen wird). In anschließenden FACS-Analysen werden die Zellen zunächst auf PI gegatet (d.h. sie werden mit einem Kern versehen) und dann auf Färbung mit FITC bewertet. Auf diese Weise kann man leicht den Prozentsatz FITC-positiver Zellen als Funktion der gesamten kernhaltigen Zellen erhalten.

B. Histologie

Zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Transplantation werden Gewebe entweder durch Biopsie (z.B. des Gewebes, das unterhalb der linken Nierenkapsel wächst) oder durh Autopsie gewonnen und zum Dünnschnitt in Paraffin konserviert. Danach werden Schnitte mit den obigen monoklonalen Antikörpern eingefärbt und mit einem sekundären alkalischen Phosphatase-markierten sekundären Antikörper gegengefärbt. Die Gegenwart von für den Marker positiven Zellen wird dann mit dem alkalischen Phosphatasereaktionsprodukt von Diaminobenzidin nachgewiesen und unter Lichtmikroskopie visualisiert.

C. DNA-Analyse

Die durch die Schwanzvenen-Blutabnahme oder Resuspension von Organsystemen nach der Biopsie oder Autopsie gewonnenen Zellen werden durch Standardverfahren zur Extraktion von zellulärer Gesamt-DNA behandelt. Die aus SCID-hu-Mäusen stammende zelluläre Gesamt-DNA wurde unter Verwendung verschiedener Sonden und Assaysysteme analysiert und parallel zu DNA verglichen, die aus unbehandelten SCID- Mäusen oder aus normalen Humanvergleichen gewonnen wurde. Die Sonden umfassen das folgende: 1) Alu-Wiederholungen (BLUR 8), eine DNA-Wiederholungssequenz, die sich im menschlichen Genom befindet, aber zu Mäusesequenzen nicht homolog genug ist, um unter den in diesen Versuchen herrschenden Bedingungen zu kreuzhybridisieren, 2) menschliche T-Zellenrezeptor- (B-Ketten) Sonden, 3) menschliche Ig-konstante Regionssonden, 4) Human-MHC-Sonden der Klasse I und II. Zur Verwendung in Dot Blots und in Southern Blots (erfolgten unter Standardbedingungen) werden diese Sonden zunächst durch das Hexamer-Markierungsverfahren mit ³²P markiert. Umordnung zu den T- und/oder B-Zellrezeptorgenen werden durch Restriktionsendonukleasedigestion von zellulärer Gesamt-DNA unter Verwendung bekannter Restriktionskarten und Standardbedingungen erzielt. Für Polymerase- Kettenreaktionen wurden unter Verwendung der thermostabilen Taq 1-Polymerase einige Oligonukleotide konstruiert und/oder gewonnen, einschließlich jener, um Kopien der Alu-Wiederholung und der monomorphen Sequenzen der Klasse I und Klasse II zu schaffen.

D. Karyotypenanalyse

Zur Karyotypenanalyse wurden die durch die Schwanzblutabnahme gewonnenen Zellen in eine Kultur mit Phytohemagglutinin eingebracht, um eine Vermehrung von Humanzellen zu bewirken. Nach 48 Stunden wird der Metaphase-Stillstand durch das Hinzufügen von Colchicin induziert, und es werden Chromosomen zur Analyse durch Lichtmikroskopie präpariert.

Ergebnisse

1. Menschliche fötale Thymusdrüse wächst in SCID-Mäusen

Das Wachstum von menschlicher fötaler Thymusdrüse wurde in den meisten (> 80%) SCID Mäusen beobachtet, die mit menschlicher fötaler Thymusdrüse transplantiert wurden (einschließlich > 300 Mäuse in hintereinander erfolgenden Experimenten zu verschiedenen Zeitpunkten in einem Zeitraum von 18 Monaten). In jenen Fällen, wo man kein Thymuswachstum beobachtete, sind Probleme im Zusammenhang mit dem Implantierungsverfahren die wahrscheinliche Ursache. Die ungefähre Architektur wird beobachtet, indem der anfänglich zum Einsetzen der Thymusproben vorgenommene Flankeneinschnitt erneut geöffnet und die Niere freigelegt wird. 4-8 Wochen nach dem Implantieren ist fast immer eine deutliche Größenzunahme festzustellen (sehr grob gesprochen im Bereich einer Erhöhung um das Zweifache bis zum 20- bis 30-fachen). In mehreren Fällen wurden Fragmente von in eine Maus implantierter menschlicher fötaler Thymusdrüse entfernt und in eine zuvor unbehandelte Maus eingesetzt. Auch in diesen Fällen konnte man anschließend ein drastisches Wachstum von Thymusgewebe feststellen. Das Thymusgewebe weist sowohl hinsichtlich der Farbe als auch der Konsistenz Ähnlichkeiten zu normaler menschlicher fötaler Thymusdrüse auf. Ein gut definiertes Gefäßsystem kann bei geringer Vergrößerung beobachtet werden. Wenn Biopsieproben für Gewebeschnitt gebildet und mit monoklonalen Antikörpern gegen die auf Human- oder Mäusezellen vorhandenen Antigene gefärbt werden, stellt man fest, daß der zelluläre Gehalt der implantierten Thymusdrüse zumeist menschlich ist (siehe unten) und daß die mikroskopische Anatomie des Gewebes im allgemeinen bewahrt wurde. Somit sind gut definierte medulläre und kortikale Abteilungen vorhanden, wobei eine charakteristische Färbung epithelialer Komponenten mit den Antikörpern MD1 bzw. CDR2 zu beobachten ist. Dendritenartige Zellen, die für Humandeterminanten der Klasse II positiv sind, befinden sich im Knochenmark und in einem geringeren Ausmaß in der Rinde. Thymozyten, die für die menschlichen T- Zellmarker CD3, CD4, CD8, und CD2 färben, sind auch vorhanden. Bei Analyse durch Doppellaser-FACS ist der Prozentsatz der Zellen, die für CD4 und CD8 doppelt positiv, für CD4 oder CD8 einfach positiv oder für beide Marker doppelt negativ sind, ähnlich wie jener, den man in einer normalen, altersangepaßten fötalen Thymusdrüse feststellt. Die obigen Ergebnisse wurden mit Mäusen erzielt, die Thymusgewebe von menschlichen Föten mit einem Alter von 9-22 Schwangerschaftswochen erhielten.
Der einzige Unterschied, den man bislang zwischen dem SCID-hu-Thymusimplantat und einer normalen menschlichen fötalen Thymusdrüse feststellen konnte, ist beim ersteren und nicht bei der letzteren die Gegenwart von dendritenartigen Zellen in der Rinde und in einem geringeren Ausmaß in der Medulla, die Mäusedeterminanten der Klasse II exprimieren. Diese Zellen stammen wahrscheinlich von Mäuse- Markvorläufern, die in das vaskularisierte SCID-hu-Thymusimplantat hineinwandern.
Einige wichtige Schlußfolgerungen können aus den obigen Beobachtungen gezogen werden. Erstens wird menschliches fötales Thymusgewebe durch die SCID-Maus nicht abgestoßen. Es wird hingegen in hohem Maße vaskularisiert und wächst. Zweitens weist das implantierte menschliche Thymusgewebe bezüglich der ungefähren Morphologie und mikroskopischen Anatomie eine starke Ähnlichkeit zu seinem menschlichen Gegenstück auf. Somit scheint das Organ die wesentlichen Eigenschaften für die räumlich korrekte Regeneration beizubehalten.
Außerdem scheint die Anzahl und relative Untergruppenverteilung von Thymozyten normal zu sein. Schließlich befinden sich Mäuse-Dendritenzellen, die Mäusedeterminanten der Klasse II tragen, in der SCID-hu-Thymusdrüse. Diese Zellen können daran beteiligt sein, den sich entwickelnden menschlichen Thymozyten zu "lehren", MHC-Mäuse-Antigene zu vertragen (und möglicherweise auf diese MHC- eingeschränkt zu sein). Auf diese Weise kann man die durch die Wechselwirkung zwischen Transplantat und Wirt entstehenden Erkrankungen verhindern.

2. Phenytoypisch reife menschliche T-Zellen befinden sich im peripheren Blutkreislauf von SCID/Hu-Mäusen.

Dieses Phänomen wurde in > 300 Versuchsgruppen beobachtet. Durch FACS-Analyse unter Verwendung monoklonaler Antikörper gegen menschliche T-Zellenmarker sieht man, daß es erwartungsgemäß zeitabhängig ist und 4-12 Wochen nach der intravenösen Einführung von menschlichen fötalen Leberzellen in eine SCID-Maus eintritt, die zuvor (oder gleichzeitig) mit fötaler Humanthymusdrüse implantiert wurde.
Es erhielten Mausgruppen menschliche fötale Thymusimplantate. Diese wurden in Untergruppen unterteilt: einige erhielten intravenös und zur gleichen Zeit 10&sup7; fötale Leberzellen (FLC), einige erhielten 10&sup7; fötale Leberzellen auf intrathymischem Wege zwei Wochen später, und einige erhielten überhaupt keine fötalen Leberzellen. Nach drei Wochen wurde das periphere Blut jeder Untergruppe auf die Gegenwart von Zellen untersucht, die für die menschlichen T-Zellenmarker CD3, CD4, CD8, CD2 färben; alle waren negativ. Nach 4-12 Wochen jedoch waren solche Zellen auf FACS sichtbar (sie stellten 2-40% der gesamten mononukleisierten Zellpopulation dar). Das Verhältnis von CD4&spplus; zu CD8&spplus; Human-T-Zellen im SCID-hu-peripheren Blutkreislauf lag während dieses Zeitraums zwischen 3-4 (Mittelwert 3,5, n=85, S.D.=0,86), deutlich innerhalb des normalen Bereichs. Beim erneuten Testen etwa 12-15 Wochen nach der FLC- Transplantation waren keine Zellen mehr zu beobachten, die diese Marker aufwiesen. Dieses allgemeine Muster war ungeachtet des anfänglichen Verabreichungswegs der FLC-Zellen immer festzustellen.
Aus dieser Analyse scheint hervorzugehen, daß es 4 Wochen braucht, bis eine große Anzahl an Marker von menschlichen T-Zellen aufweisenden Zellen im peripheren Blut von SCID-hu-Mäusen auftritt. Davor sind sie nicht vorhanden und nach 12 Wochen verschwinden sie. Eine Schlußfolgerung daraus ist, daß das Immunophenotypisieren wahrscheinlich angebracht ist; d.h. daß die verwendeten Antikörper nur in zeitabhängiger Weise reaktiv sind und sich nicht wahllos an Mäusezellen zu binden scheinen. Interessehalber könnte die transiente Welle menschlicher T-Zellen in der Peripherie gelegentlich beobachtet werden, um zu sehen, ob fötale Leberzellen vorhanden sind oder nicht. Dies scheint zu bedeuten, daß Zellen, die innerhalb des fötalen Thymusgewebes vorhanden sind, zum Zeitpunkt seines Implantierens auch aus dem Thymusgewebe austreten und in den peripheren Blutkreislauf eintreten können.
Nachdem bestimmt worden war, daß periphere, menschliche Marker tragende Blutzellen in SCID-hu-Tieren fehlen, wurden alle noch einmal mit FLC rekonstituiert; man beachte, daß alle dieser Tiere die urprünglichen menschlichen fötalen Thymusimplantate behielten. In dieser zweiten Rekonstituierungsrunde wurden die Tiere wieder in Untergruppen unterteilt: einige erhielten auf intravenösem Wege abgestufte Dosen von FLC-Zellen (von 5x10&sup6; bis 5x10&sup7;); andere erhielten Fragmente von ganzer fötaler Leber, die sowohl subkutan als auch intrasplenogen verabreicht wurden. Die Analyse des peripheren Bluts 3 Wochen später zeigte das völlige Fehlen von menschliche Marker tragenden Zellen. Nach 6 Wochen zeigten hingegen alls Tiere wieder die Gegenwart einer großen Anzahl an Zellen, die die menschlichen Marker CD3, CD4, CD8 und CD2 trugen (etwa 4-30% der gesamten mononuklearen Zellen); insbesondere exprimierten 3-15% dieser Zellen den CD4-Marker. Als zwei Mäuse eine Woche später (Woche 7) einer Autopsie unterzogen wurden, wiesen beide Zellen in der Peripherie auf, die entweder mit OKT4 (einem Marker der T-Helferzellen- Abstammungslinie) oder mit OKT8 (einem Marker der T-zytotoxischen/Suppressorzell- Abstammungslinie(n)) färbten; das Verhältnis der zwei jeweiligen Unterpopulationen betrug 2,3:1, was deutlich innerhalb des normalen Verhältnisses lag, das man in menschlichem peripheren Blut selbst vorfindet. Um zu ermitteln, ob diese Zellen tatsächlich in Mäusemilz, -thymusdrüse oder -lymphknoten beheimatet sind, wurde eine FACS-Analyse auf Zellen durchgeführt, die von diesen Organen stammen. In diesen Fällen wurden keine Zellen beobachtet, die die menschlichen T-Zellenmarker trugen. In nachfolgenden FACS-Analysen von peripherem Blut wurde bei allen bis auf eine Mäusegruppe beobachtet, daß sie wieder die periphere Population menschlicher T- Zellen verloren.
Wenn SCID-Mäuse mit ganzen fötalen Leberfragmenten und fötaler Thymusdrüse implantiert werden und dann intravenös mit fötalen Leberzellen injiziert werden, kann man mit einem wesentlichen Unterschied die gleichen Beobachtungen machen. Anstelle eines Zeitraums von 12 Wochen befinden sich die menschlichen T-Zellen zumindest 40 Wochen lang im peripheren Blutkreislauf. Wiederum ist das CD4/CD8- Verhältnis durchwegs normal.
Die zweite Rekonstituierungsrunde führt zu einigen wichtigen Schlußfolgerungen. Erstens ist das Phänomen einer transienten Welle menschlicher Zellen im peripheren Blut von SCID-hu-Mäusen, denen FLC intravenös verabreicht wurde, reproduzierbar. Da zweitens die FLC intravenös verabreicht wurden und sie anschließend Marker reifer T- Zellen zeigten, ist es wahrscheinlich, daß sie im und durch das implantierte menschliche fötale Thymusgewebe beheimatet sind. Drittens exprimieren die in der Peripherie befindlichen reifen T-Zellen ein "physiologisches" Gleichgewicht von CD4/CD8-Subpopulationen. Viertens ist es offensichtlich, daß diese peripheren Human- T-Zellen tatsächlich nicht in den vorhandenen Mäuseorganen beheimatet sind (Milz, Lymphknoten, Thymusdrüse). Somit wurden in den laufenden Versuchen die Humanäquivalente in SCID-hu-Mäuse implantiert. Schließlich stellt man fest, daß die Einführung von ganzer fötaler Leber eine längere Welle menschlicher Zellen in der Peripherie erzeugt. Diese Beobachtung deutet auf die Gegenwart einer sich selbst erneuerenden Stammzellenpopulation innerhalb von FLC ist, die sich in Abwesenheit fötaler Leberstromalzellen nicht replizieren kann.
Trotz der offensichtlichen Spezifität der monoklonalen Antikörper gegen reife Human-T- Zellenmarker (man beachte, daß selbst bei jenen Mäusen, die hohe Prozentsätze färbender Zellen im peripheren Blut aufwiesen, die zur gleichen Zeit analysierten Milzzellenpopulationen negativ waren) blieb die theoretische Möglichkeit bestehen, daß das Färben auf ein unvorhergesehenes Artefakt zurückzuführen war. Um diese Möglichkeit zu untersuchen, wurde eine DNA-Analyse der im peripheren Blut befindlichen Zellen unter Verwendung einer Sonde durchgeführt, die für sich wiederholende menschliche aber nicht für Mäuse-DNA-Sequenzen spezifisch war (ALU- Wiederholung: BLUR-8). Durch diese Analyse stellte sich heraus, daß die peripheren Blutzellen aus der SCID-hu-Maus nicht nur die für menschliche T-Zellen charakteristischen phenotypischen Marker aufweisen, sondern auch DNA enthalten, die stark mit der menschlichen ALU-Sonde hybridisierte.
Wenn eine Thymusdrüse und ein Lymphknoten eines menschlichen Fötus in SCID- Mäuse implantiert und diesen dann intravenös fötale Humanleberzellen verabreicht werden, kann man auch menschliches IgG im Serum nachweisen. Die IgG-Menge variiert zwischen 5-10% der normalerweise festgestellten. Die das IgG produzierenden Plasmazellen können auf dem implantierten Lymphknoten lokalisiert werden. Die Human-IgG-Produktion erfordert zumindest die Einführung menschlicher Fötalleberzellen und von menschlichem Lymphknoten in SCID-Mäuse.
In einem eigenen Versuch wurden SCID-Mäuse in mit Abdeckungen versehenen Isolationskäfigen gehalten; sie erhielten 3 Tage lang in jeder Woche TMS in Suspension durch das Trinkwasser (40 g Trimethoprim und 200 mg Sulfamethoxazol pro 5 ml Suspension; 0,125 ml Suspension pro 4 ml Trinkwasser pro Maus pro Tag). Während des Verabreichens des Arzneimittels wurde die Trinkwasserflasche täglich umgedreht; den Tieren wurde an den verbleibenden 4 Tagen jeder Woche herkömmliches Trinkwasser gegeben. Ein menschlicher Fötalthymuslappen von 9 g.w. und einer Größe von 0,5 mal 0,5 mal 2 mm und ein 0,5 mal 0,5 mal 2 mm großes Segment eines menschlichen Lymphknotens wurden unter der linken Nierenkapsel implantiert. Diese Organe stammten von einem HLA-A2&spplus;, HLA-B7&supmin;-Donor. Gleichzeitig hatte die Maus 10&sup7;-Leberzellen intravenös erhalten; diese Zellen waren hingegen HLA-A2&supmin;, HLA-B7&spplus;.
Die fötalen Leberzellen wurden durch Zerkleinern gewonnen; die im RPMI 1640- Medium mit 10% FCS suspendiert gebliebenen Zellen wurden durch Ficoll-Hypaque- Zentrifugierung zu einer mononuklearen Fraktion aufgeteilt; die Grenzflächenzellen wurden dann dreimal in RPMI 1640 mit 10% FCS gewaschen und bei einer Konzentration von 10&sup8; Zellen/ml zur intravenösen Verabreichung erneut suspendiert.
Zur Implantierung von Gewebe wurden Mäuse zunächst mit Halothan anästhesiert. Ein 1-cm großer Flankeneinschnitt wurde durchgeführt, um die linke Niere freizulegen. Nähte wurden zur Approximierung aufeinanderfolgender peritonealer und faszialer Schichten angebracht und Metallklammern über der Wunde befestigt, um das Heilen zu gewährleisten. Suspendierte fötale Leberzellen wurden auf retroorbitale Weise mit einer Nr.30-Nadel intravenös injiziert.
Gefrorene fixierte Serienschnitte der Thymusdrüse wurden vier Wochen nach dem Implantieren mit einer normalen fötalen Thymusdrüse gleichen Alters verglichen. Die mikroskopische Anatomie stellte sich mit Ausnahme der Gegenwart von Klasse II- positiven Mäusezellen mit dendritoider Morphologie als vergleichbar heraus. Insbesondere waren alle Thymozyten HLA-A2&supmin;, HLA-B7&spplus;; daher waren sie von Stammzellen innerhalb des intravenös verabreichten FLC-Präparats abgeleitet.
Bei der Analyse von peripherem Blut aus SCID-hu-Mäusen stellte man menschliche T- Zellen mit einem CD4/CD8-Verhältnis von 3,5 in den Wochen 4-12 fest. Diese Zellen exprimierten das Antigen HLA-B7, doch nicht HLA-A2; daher waren sie gegenüber der ursprünglichen FLC-Quelle vollständig differenzierte Zellen, wobei sie zuerst durch die HLA-A2&spplus;, HLA-B7&supmin;-Thymusdrüse verarbeitet wurden.
Um besser zu bestimmen, welche der verschiedenen FLC-Unterpopulationen tatächlich die reifen menschlichen T-Zellen entstehen läßt (z.B. welche Unterpopulation(en) Stammzellaktivität aufwies(en)), wurden FLC aus einem HLA-A2&supmin;, HLA-B7&spplus;-Donor von CD4&spplus;, CD8&spplus;, M1&spplus;, M3&spplus;, Ig&spplus;, A&spplus;/B&spplus;-Zellen befreit (durch Entfernung von T-, B-, myelomonozytischen, erythrozytischen und granulozytischen Zellen), um eine "Abstammungslinienmarker-Minus"- (lin&supmin;) - Population zu bilden. Diese Population wurde durch FACS zu zwei Subpopulationen mit einem Antikörper gegen Human-Thyl angereichert: lin&supmin; thyl&supmin; und lin&supmin;thyl&spplus;. Diese Populationen wurden dann intravenös in SCID-Mäuse mit einem HLA-A2&spplus;, HLA-B7&supmin;-Human-Thymus-Implantat eingeführt. Man stellte fest, daß die lin&supmin; thyl&spplus;-Unterpopulation später HLA-B7&spplus; T-Zellen entstehen läßt; die lin&supmin;thyl&spplus;-Population war inaktiv. Daher ist es wahrscheinlich, daß die lin&supmin;thyl&supmin;- Population menschliche hämatopoietische Stammzellaktivität einschließt.
Bei der Analyse von Serumproben aus den SCID-hu-Mäusen stellte sich schließlich heraus, daß sie Human-IgG in einer Menge von 1-10 mg/ml enthielten. Menschliche Lymphknotenbiopsien zeigten die Gegenwart menschlicher IgG-hältiger Plasmazellen durch immunohistochemische Färbung.
In einer weiteren Untersuchung wurde die Fähigkeit analysiert, lymphotrophe Infektion mit einem humanspezifischen Pathogen zu bewirken. Insbesondere wurde zur Infektion ein HIV-1-Isolat verwendet, worin das Isolat sich in vivo, aber nicht in vitro als infektiös herausstellte.
Ein molekular kloniertes Isolat von HIV-1 wurde verwendet. HIV-1JR-CSF, das aus dem zellfreien Zerebrospinalfluid eines Patienten mit subakuter Enzephalopathie und dem Kaposi- Sarkom stammte, wurde zuerst in einer Kurzzeit-Kultur mit Phytohämagglutinin- stimulierten menschlichen peripheren Blutlymphozyten in vitro gezüchtet und dann molekular kloniert. Das Isolat stellte sich als infektiös für Mitogen-stimulierte menschliche T-Zellstammblasten und gliale Zellexplantate, aber nicht für primäre Monozyten/Makrophagenkulturen heraus. Es wurde in kontinuierlichen menschlichen T- oder Monozyten/Makrophage-Zellinien nicht hindurchgeführt und wächst auch nicht in ihnen. Ein derartiger Tropismus stellt einen bedeutenden Unterschied zwischen diesem und anderen Isolaten dar, die molekular kloniert und zum Wachstum in vitro angepaßt wurden (z.B. HXB2, HTLV-IIIB, ARV und LAV).
Ein Flankeneinschnitt wurde vorgenommen, um das wachsende Humanthymus- oder Lymphknotenimplantat der anästhesierten SCID-hu-Maus freizulegen. Abgestufte Dosen von HIV-1JR-CSF wurden durch direkte intrathymiale oder intranodale Impfung eingebracht. Die Mäuse wurden in Mikroisolatorkäfigen innerhalb einer Glove-Box untergebracht. Zu verschiedenen Zeitpunkten wurden Biopsieproben der infizierten Lymphoidorgane gebildet, in 4% Paraformaldehyd fixiert und auf Anzeichen einer akuten Infektion geprüft.
Die Infektion von SCID-hu-Mäusen mit HIV-1JR-CSF führt zu leicht nachweisbaren Zeichen viraler Replikation. Der am direktesten informative Assay war die in situ- Hybridisierung infizierter Gewebeabschnitte mit der RNA-Sonde pG4. Diese Sonde hybridisiert an das 3'-Ende des genomischen HIV-1-Transkripts; daher werden alle viralen Botschaften ohne Unterschied nachgewiesen. Unter den Assaybedingungen wird virale DNA nicht nachgewiesen. Die Ergebnisse zeigen, daß die Infektion der menschlichen Thymus- und Lymphknotenimplantate zeitabhängig ist. Eine Woche nach der direkten intrathymialen Impfung (mit 400-4000 infektiösen Einheiten) konnte man keine Zellen im Abschnitt beobachten, die mit der pG4-Sonde hybridisierten. Nach 2, 4 und 8 Wochen stellte man das Hybridisieren einer immer größeren Zellanzahl fest (siehe Tabelle 1). Dies läßt vermuten, daß laufende Infektionsrunden in vivo eintreten. Die infizierten Zellen waren in der gesamten Rinde und im gesamten Mark des injizierten menschlichen Thymusgewebes und diffus im injizierten menschlichen Lymphknoten verstreut. Diskrete Infektionsherde, bei denen mehr als eine angrenzende Zelle beteiligt ist, wurden nur selten beobachtet. Möglicherweise können innerhalb einer bestimmten Gewebeebene angrenzende Zellen entweder infektionsresistent oder auf nicht nachweisbarer Ebene infiziert sein. Alternativ dazu können infizierte Zellen von einem anderen Herd disseminieren, die sich nicht innerhalb des Abschnitts befinden (z.B. von wandernden Vorläuferzellen, die woanders infiziert wurden). Tabelle 1 QUANTIFIZIERUNG DER INFEKTION DURCH HIV-I IN DER SCID-HU-THYMUSDRÜSE Woche nach der Infektion Medulla Cortex ISH - in situ Hybridisierung IH - Immunohistochemie - virales Protein (GB)
Die ausgedrückten Ergebnisse sind die Anzahl infizierter Zellen, Zellen, die durch ISH oder IH in 10 unabhängigen Feldern hoher Leistung (200X) nachgewiesen werden. Abgelesen durch zwei Beobachter.
Die beschriebenen Ereignisse sind für die HIV-1-Infektion spezifisch. Eine vorherige Wärmeinaktivierung des Virus (80ºC, 1 h) zerstörte die Infektiosität. Es wurden keine Zellen im infizierten Gewebe festgestellt, die mit den pG4 RNA-Sonden in der "sense"- Ausrichtung hybridisierten. Ebenso hybridisierten keine Zellen in nichtinfizierten Geweben an pG4-Sonden in beiden Ausrichtungen. Schließlich ist die Infektion nicht nur zeit- sondern auch dosenabhängig. Somit stellte sich eine 10&supmin;¹-Verdünnung von HIV-1JR-CSF als infektiös heraus; Verdünnungen von 10&supmin;³-10&supmin;&sup5; waren jedoch nicht infektiös. Unter Verwendung von Schätzungen viraler Titer durch in vitro-Assays entspricht die 10&supmin;¹ Konzentration 400-4000 infektiösen Einheiten.
Die obige Analyse wurde durch immunohistochemische Färbung der Gewebeschnitte vor in situ-Hybridisierung ausgedehnt. Auf diese Weise konnte die Gegenwart von viralem Protein in den virale RNA-Transkripte herstellenden Zellen festgestellt werden; darüber hinaus konnte der Zelloberflächenphenotyp infizierter Zellen bestimmt werden. In diesem Fall wurde ein polyklonales Antiserum (GB) verwendet, das gegen gag-, pol- und env-Epitope reaktiv war, um Abschnitte von menschlicher Thymusdrüse zwei Wochen nach der Infektion mit HIV-1JR-CSF zu analysieren. In der Medulla waren mehr Zellen infiziert als in der Rinde, obwohl es in jeder Abteilung eine ausgiebige Vertretung von CD4+-Thymozyten gab. Eine ähnliche Situation konnte man 4 und 8 Wochen nach der Infektion in mehreren Beobachtungsebenen feststellen. Innerhalb jedes bestimmten Abschnitts waren zu jedem bestimmten Zeitpunkt 70-90% der infizierten Zellen in der Medulla. Selten sah man infizierte mehrkernige Zellen, die möglicherweise Syncytien darstellen.
Sowohl in der Medulla als auch in der Rinde der Thymusdrüse sowie im Lymphknoten waren zwei unterschiedliche Modi viraler Replikation durch Kombinationsimmunohistochemie und in situ-Hybridisierung offensichtlich. In einem Modus stellte man fest, daß Zellen nachweisbare Mengen an viralem Protein und RNA erzeugen; in anderen wurden nur virale RNA-Transkripte beobachtet. Die letztere Population stellt die Mehrheit der gesamten infizierten Zellen in jeder Abteilung dar (Tabelle 1). Die Grundlage dieser Beobachtung ist nicht eindeutig. Ein mit der Verfahrensweise in Zusammenhang stehendes Artefakt scheint unwahrscheinlich, die jeden Replikationsmodus exprimierenden Zellen sind wahllos verteilt und häufig angrenzend. Jene Zellen hingegen, die nicht mit Antiserum-GB gefärbt sind, bilden möglicherweise virales Protein in einer Menge unterhalb der Nachweisgrenze; alternativ dazu könnten sie unterschiedliche virale Proteine erzeugen (z.B. mit Epitopen, die durch verschiedene Antikörper im Serum nicht nachgewiesen werden).
In beiden Fällen müssen ungleiche Muster transkripitionaler und/oder translationaler Steuerung nach der Infektion herangezogen werden. Da die Ergebnisse aus der Infektion mit einem molekularen Klon von HIV-1 stammen, ist es wahrscheinlich, daß einzelne Zellumgebungen die Steuerungsunterschiede diktieren. Diese verschiedenen Umgebungen können unterchiedliche Zellabstammungslinien und aufeinanderfolgende Aktivierungs- und Differenzierungsschritte innerhalb solcher Abstammungslinien umfassen. Komplexe Muster dieser Art wurden in vivo nach der Infektion mit anderen Lentiviren dokumentiert (z.B. Visna, Hunde-Arthritisenzepahlitis-Virus). Ihre Existenz stimmt mit kürzlich durchgeführten Experimenten mit HIV-1 in vitro überein. Die Regulationsmechanismen, durch die sie auftreten, können nun mit HIV-1 in vivo in der SCID-Hu-Maus untersucht werden.
Es ist aus den obigen Ergebnissen offenkundig, daß die vorliegende Erfindung aufgrund der Fähigkeit, Gewebe in einem xenogenen Säugetier zu bilden, eine breite Palette an Möglichkeiten bietet, worin nicht nur einzelne Organe, sondern auch Zellen und Gewebe aus unterschiedlichen Organen herangebildet werden können, worin die Zellen und/oder Organe in Wechselwirkung treten können, z.B. im hämatopoietischen oder endokrinen System u.dgl. Aufgrund der Fähigkeit, Fremdgewebe wachsen zu lassen kann die Auswirkung verschiedener Substanzen auf das Gewebe und die Wechselwirkung verschiedener Gewebe in einer Umgebung bestimmt werden, die in einem beträchtlichen Ausmaß an die normale Umgebung des Gewebes herankommt. Weiters ermöglicht das hämatopoietische Gewebe die Immortalisierung von Zellen, die im Säugetierwirt erzeugt werden. Man kann Stammzellen, die das hämatopoietische System entstehen lassen, durch FACS isolieren und ihre aktive Beschaffenheit aufzeigen. Sie können dann mit bekannten Wachstumsfaktoren in vitro kultiviert werden. Alternativ dazu können sie dazu dienen, unbekannte Faktoren zu identifizieren, die an ihrer Selbsterneuerung beteiligt sind. Monoklonale Antikörper, die früher schwierig zu erhalten waren, insbesondere menschliche monoklonale Antikörper, können durch Immunisierung des Säugetierwirts mit einer Vielzahl an Antigenen leicht gebildet werden, deren Verwendung in einem Säugtierwirt normalerweise nicht möglich ist. Auf diese Weise kann der Anwendungsbereich menschlicher monoklonaler Antikörper zur Behandlung verschiedener Erkrankungen, u.a. der Infektion durch Pathogene, neoplastischer Krankheiten u.dgl., deutlich ausgedehnt werden. Auf diese Weise können differenzierte, antigenspezifische, MHC-eingeschränkte oder nichteingeschränkte menschliche T-Zellen zur Expansion in vitro und zur späteren therapeutischen Verwendung isoliert werden. Weiters kann man Organe verwenden, die in einen gegenüber der Gewebequelle allogenem Wirt transplantiert werden können.
Alle in der vorliegenden Beschreibung erwähnten Veröffentlichungen und Patentanmeldungen legen Zeugnis über das Wissen der Fachleute auf dem Gebiet ab, dem die Erfindung angehört. Alle Veröffentlichungen und Patentanmeldungen sind hierin solcherart durch Quellenangaben aufgenommen, so als ob jede einzelne Veröffentlichung oder Patentanmeldung einzeln durch eine Quellenangabe aufgenommen wäre.
Obwohl die obige Erfindung zum besseren Verständnis und zur Veranschaulichung ausführlich durch Beispiele erläutert wurde, ist zu beachten, daß bestimmte Veränderungen und Modifizierungen im Schutzumfang der beigelegten Ansprüche vorgenommen werden können.

Claims

1. Chimärer, nicht-menschlicher, tierischer Wirt, umfassend:

einen immunodefizienten, tierischen Wirt, umfassend zumindest einen Abschnitt eines Immunsystems, dem funktionelle syngene Lymphozyten fehlen, in dem aber der Thymus vorhanden ist; und

xenogenes Zellmaterial, das ein xenogenes Organ oder Gewebe ist, das im Wirt funktionsfähig ist, oder xenogene Zellen zusammen mit, falls zum Reifen der Zellen benötigt, einem derartigen Organ oder Gewebe, wobei das xenogene Zellmaterial in den tierischen Wirt mit einem Alter von zumindest neugeboren eingebracht wird.

2. Chimärer, tierischer Wirt nach Anspruch 1, worin der tierische Wirt aufgrund eines genetischen Defekts an Lymphoidzellen immunodefizient ist.

3. Chimärer, nicht-menschlicher, tierischer Wirt, umfassend:

einen immunodefizienten, tierischen Wirt, der zumindest einen Abschnitt eines Immunsystems aufweist, dem funktionelle syngene Lymphozyten fehlen, in dem aber der Thymus vorhanden ist; und

worin als Ergebnis des Einbringens der xenogenen Zellen, des Gewebes und/oder des Organs in den tierischen Wirt mit einem Alter von zumindest neugeboren zumindest ein Organ einen xenogenen funktionellen Thymus und wahlweise xenogene Zellen, Gewebe und/oder Organe umfaßt, wobei die Zellen zumindest eine Art ausgewählt aus blutbildenden Stammzellen, unreifen, differenzierten, blutbildenden Zellen und reifen, differenzierten, blutbildenden Zellen umfassen.

4. Chimärer, tierischer Wirt nach Anspruch 3, worin das zumindest eine Organ in der Lage ist, vom Zeitpunkt des Einbringens in den Wirt weg zumindest drei Monate lang zu funktionieren.

5. Chimärer, tierischer Wirt nach Anspruch 3, worin das Tier ein Säugetier ist.

6. Chimärer, nicht-menschlicher, Säugetierwirt, umfassend:

einen immunodefizienten Säugetierwirt, dem funktionelle syngene Lymphozyten fehlen, in dem aber der Thymus vorhanden ist; und als Ergebnis des Einbringens der xenogenen Zellen und des Organs oder dessen Vorläufers in den tierischen Wirt mit einem Alter von zumindest neugeboren

xenogene Zellen und zumindest ein Organ oder einen Vorläufer davon, worin das zumindest eine Organ einen funktionellen Thymus und die Zellen zumindest eine Art ausgewählt aus blutbildenden Stammzellen, unreifen, differenzierten, blutbildenden Zellen und reifen, differenzierten, blutbildenden Zellen umfassen.

7. Chimärer Säugetierwirt nach Anspruch 6, worin das zumindest eine Organ weiters zumindest eine Art ausgewählt aus Lymphknoten, Lebergewebe und genetischen Vorläufern davon umfaßt.

8. Chimärer Säugetierwirt nach Anspruch 6, worin die xenogenen Zellen menschliche Zellen sind und das Organ aus menschlichen Zellen besteht.

9. Chimärer Säugetierwirt nach Anspruch 8, worin der Säugetierwirt als Ergebnis von in vivo Reifung der Stammzellen, die in den Säugetierwirt eingebracht wurden, reife, differenzierte, menschliche, blutbildende Zellen umfaßt.

10. Chimärer Säugetierwirt nach Anspruch 9, worin die Stammzellen von einem menschlichen Wirt mit einem Alter von zumindest neugeboren stammen.

11. Chimärer Säugetierwirt nach Anspruch 6, worin die xenogenen Zellen und das Organ beim Einbringen in den Säugetierwirt menschlich und fötal sind.

12. Chimärer Säugetierwirt nach Anspruch 11, worin der Säugetierwirt als Ergebnis von in vivo Reifung der Stammzellen, die in den Säugetierwirt eingebracht wurden, menschliche, reife, periphere Blutlymphozyten umfaßt.

13. Chimärer Säugetierwirt nach Anspruch 12, worin die xenogenen Zellen oder das Organ mit einem Pathogen infiziert werden.

14. Chimärer, streng kombinierter, immunodefizienter Mäusewirt, umfassend:

xenogene Zellen und zumindest ein Organ oder Vorläufer davon, worin das zumindest eine Organ einen funktionellen Thymus und die Zellen als Ergebnis des Einbringens der xenogenen Zellen und des Organs oder dessen Vorläufers in den Mäusewirt mit einem Alter von zumindest neugeboren zumindest eine Art ausgewählt aus blutbildenden Stammzellen, unreifen, differenzierten, blutbildenden Zellen und reifen, differenzierten, blutbildenden Zellen umfassen.

15. Mäusewirt nach Anspruch 14, worin das zumindest eine Organ weiters zumindest eine Art ausgewählt aus Lymphknoten, Lebergewebe und Vorläufern davon umfaßt.

16. Mäusewirt nach Anspruch 14, worin die xenogenen Zellen menschliche Zellen sind und das Organ aus menschlichen Zellen besteht.

17. Mäusewirt nach Anspruch 16, worin der Mäusewirt als Ergebnis von in vivo Reifung der Stammzellen, die in den Mäusewirt eingebracht wurden, reife, differenzierte, blutbildende Zellen umfaßt.

18. Mäusewirt nach Anspruch 17, worin die differenzierten, blutbildenden Zellen periphere Blutlymphozyten umfassen.

19. Mäusewirt nach Anspruch 14, worin die Stammzellen aus einer Säugetierquelle mit einem Alter von zumindest neugeboren stammen.

20. Mäusewirt nach Anspruch 14, worin die xenogenen Zellen und das Organ beim Einbringen in den Mäusewirt fötal sind.

21. Mäusewirt nach Anspruch 20, worin der Mäusewirt als Ergebnis von in vivo Reifung der Stammzellen, die in den Mäusewirt eingebracht wurden, menschliche, reife, differenzierte, blutbildende Zellen umfaßt.

22. Mäusewirt nach Anspruch 21, worin die xenogenen Zellen oder das Organ mit einem Pathogen infiziert werden.

23. Mäusewirt nach Anspruch 22, worin das Pathogen HIV ist.

24. Mäusewirt nach Anspruch 21, worin das zumindest eine Organ weiters zumindest einen Lymphknoten oder einen Vorläufer davon und der Mäusewirt weiters menschliche Antikörper umfaßt.

25. Verfahren zur Herstellung von menschlichen Plasmazellen, wobei das Verfahren umfaßt:

das Züchten eines chimären, streng kombinierten, immunodefizienten Mäusewirts, umfassend als Ergebnis des Einbringens der xenogenen Zellen und des Organs oder des Vorläufers davon in den Mäusewirt mit einem Alter von zumindest neugeboren:

menschliche Zellen, zumindest zwei Organe, worin die zumindest zwei Organe einen funktionellen Thymus und einen funktionellen Lymphknoten und die Zellen zumindest eine Art ausgewählt aus blutbildenden Stammzellen, unreifen, differenzierten, blutbildenden Zellen oder reifen, differenzierten, blutbildenden Zellen, umfassen, und ein von den reifen, differenzierten, blutbildenden Zellen erkanntes Antigen, wodurch Plasmazellen produziert werden.

26. Verfahren zur Herstellung von menschlichem Immunoglobulin, wobei das Verfahren umfaßt:

das Isolieren von Plasmazellen oder Vorläufern davon aus einem chimären, streng kombinierten, immunodefizienten Mäusewirt, umfassend als Ergebnis des Einbringens der xenogenen Zellen und des Organs oder des Vorläufers davon in den Mäusewirt mit einem Alter von zumindest neugeboren:

xenogene Zellen, zumindest ein Organ, worin das zumindest eine Organ einen funktionellen Thymus und die Zellen reife, differenzierte, blutbildende Zellen, umfassen, und Plasmazellen als Ergebnis der Gegenwart eines von den reifen, differenzierten, blutbildenden Zellen erkannten Antigens;

das Immortalisieren der isolierten Plasmazellen oder der Vorläufer davon, um eine immortalisierte Zelle bereitzustellen, die Immunoglobulin sekretiert; und

das Screenen der immortalisierten Zellen auf die Produktion von Immunoglobulin.

27. Verfahren zum Bestimmen der Wirkung einer Variation einer Bedingung auf Krankheitssymptome oder durch einen Krankheitszustand hervorgerufenen Indikationen in einem Säugetierwirt, wobei das Verfahren umfaßt:

das Hervorrufen eines Krankheitszustands in einem chimären, streng kombinierten, immunodefizienten Mäusewirt, umfassend als Ergebnis des Einbringens der xenogenen Zellen und des Organs oder des Vorläufers davon in den Mäusewirt mit einem Alter von zumindest neugeboren:

xenogene Zellen, zumindest ein Organ, worin das zumindest eine Organ einen funktionellen Thymus und die Zellen zumindest eine Art ausgewählt aus blutbildenden Stammzellen, unreifen, differenzierten, blutbildenden Zellen und reifen, differenzierten, blutbildenden Zellen, umfassen, und ein zweites Organ, falls das Krankheitssymptom oder die Indikation mit einem derartigen zweiten Organ assoziiert ist;

das Unterwerfen des Mäusewirts der Variation; und

das Bestimmen der Auswirkung der Variation auf das Krankheitssymptom oder die Indikation.

28. Verfahren nach Anspruch 27, worin die Variation die Verabreichung eines Arzneimittels ist.

29. Verfahren nach Anspruch 27, worin die Variation die Verabreichung von für den Krankheitszustand spezifischen, lymphozytischen oder myelomonozytischen Zellen ist.

30. Verfahren zur Herstellung eines chimären Wirts, der zur Verarbeitung von xenogenen Stammzellen befähigt ist, wobei das Verfahren umfaßt:

das Einbringen an einer Stelle, wo sich xenogene Zellen vermehren können, von fötalem Thymusgewebe, und von xenogenen Stammzellen an derselben oder einer davon verschiedenen Stelle, in eine streng kombinierte, immunodefiziente Maus.

31. Verfahren nach Anspruch 30, umfassend den zusätzlichen Schritt des Einbringens zumindest einer Art ausgewählt aus xenogenem Lymphknotengewebe und Lebergewebe.

32. Verfahren nach Anspruch 31, worin die xenogenen Zellen und das Gewebe menschliche Zellen und Gewebe sind.

33. Verfahren nach Anspruch 31, worin das Alter des fötalen Thymusgewebes etwa 9 - 24 Schwangerschaftswochen und das des Lymphknotengewebes mehr als etwa 15 Schwangerschaftswochen beträgt.

34. Verfahren nach Anspruch 33, worin die xenogenen Zellen und das Gewebe menschliche Zellen und Gewebe sind.

35. Verfahren nach Anspruch 30, worin die Stelle für das Thymusgewebe die Nierenkapsel ist.

36. Verfahren nach Anspruch 30, worin der Mäusewirt in einer anderen physiologischen Funktion als der des blutbildenden Systems einen Defekt aufweist.

37. Verfahren zum Bestimmen der Gegenwart von Stammzellen in einer ein Zellgemisch umfassenden Zusammensetzung, wobei das Verfahren umfaßt:

das Aufteilen der Zellen in Fraktionen auf der Basis von Oberflächenmembran- Proteinmarkern;

das Einbringen von zumindest einer der Zellfraktionen in eine Maus nach Anspruch 14;

das Reifen-Lassen der Stammzellen in dem Mäusewirt;

das Entfernen eines Ursprungs von peripheren Blutlymphozyten aus dem Mäusewirt; und

das Bestimmen der Gegenwart von differenzierten Zellen aus den Stammzellen als Nachweis für die Stammzellen in der Fraktion.

38. Verfahren zur Herstellung einer Teilmenge von menschlichen, blutbildenden Zellen, wobei das Verfahren umfaßt:

das Einbringen von menschlichen, blutbildenden Stammzellen in einen Mäusewirt nach Anspruch 14, zusammen mit zumindest einem Lymphokin zum Bewirken von Differenzierung in zumindest eine der blutbildenden Linien;

das Halten der Wirte über eine für die Stammzellen ausreichende Zeit zur Differenzierung und Fortpflanzung, um Zellen der Teilmenge zu produzieren; und

das Ernten der Teilmenge von menschlichen, blutbildenden Zellen.

39. Verfahren zur Herstellung von modifizierten, menschlichen Zellen, umfassend das Aussetzen von menschlichen Zellen der Umgebung eines chimären, immunodefizienten, nicht-menschlichen, tierischen Wirts, der zumindest einen Abschnitt seines Immunsystems, dem syngene Lymphozyten fehlen, umfaßt, in dem jedoch der Thymus vorhanden ist, ohne Zellen des Wirtsäugetiers der Modifikation zu unterziehen.

40. Chimäres, immunodefizientes, nicht-menschliches Säugetier, das menschliche Zellen enthält, wobei die menschlichen Zellen als Ergebnis der Umgebung in dem Säugetier spezifisch modifiziert sind, wobei das Säugetier zumindest einen Teil seines Immunsystems besitzt, ihm syngene Lymphozyten fehlen, in dem jedoch der Thymus vorhanden ist.

41. Verfahren oder Säugetier nach Anspruch 39 oder 40, worin die Zellen als Teil eines Organs vorliegen.

42. Verfahren oder Säugetier nach Anspruch 39, 40 oder 41, worin die menschlichen Zellen Lymphozytenzellen sind und die Modifikation in den Zellen ein Immunrespons ist.

43. Verfahren oder Säugetier nach Anspruch 39, 40 oder 41, worin die menschlichen Zellen Ziel eines Injektionswirkstoffes sind und die Modifikation eine Injektion der Zellen ist.

44. Verfahren oder Säugetier nach Anspruch 43, das zusätzlich einen therapeutischen Wirkstoff umfaßt, der mit den injizierten Zellen in Kontakt tritt.

45. Säugetier nach irgendeinem der Ansprüche 40 - 44, worin die menschlichen Zellen aus dem Lymphknoten stammen oder der Lymphknoten sind und das Säugetier zur Verwendung beim Testen auf HIV dient.