DE3785328T2

DE3785328T2 - Geschlechtsbestimmung bei wiederkäuern unter verwendung y-chromosomenspezifischer polynukleotide.

Info

Publication number: DE3785328T2
Application number: DE87905150T
Authority: DE
Inventors: Alexander Jones; Ellen Matthews; Clifford Reed
Original assignee: Australian National University
Current assignee: Australian National University
Priority date: 1986-08-12
Filing date: 1987-08-11
Publication date: 1993-10-21
Anticipated expiration: 2007-08-12
Also published as: DE3785328D1; JPH01500720A; NZ221410A; WO1988001300A1; JP2719337B2; CA1296270C; EP0276287A4; EP0276287B1; EP0276287A1; ATE87979T1

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf die Geschlechtsbestimmung und betrifft insbesondere die Geschlechtsbestimmung von Wiederkäuern unter Verwendung Y- chromosomenspezifischer Polynucleotide [Anmerkung: Die hier im folgenden zitierten Schriften sind am Ende der Beschreibung aufgeführt.] Die Möglichkeit, das Geschlecht eines Embryo oder Fötus zu bestimmen, ist zunehmend vorteilhaft, insbesondere im Hinblick auf Fortschritte auf dem Gebiet der reproduktiven Biologie, wie z. B. dem Embryo-Transfer. Es wurde berichtet, daß allein in der Milchvieh- und Schlachtviehindustrie im Jahre 1985 einige 50 000 Embryotransplantationen durchgeführt wurden. Da Milchkuhbetriebe weiblichen Nachwuchs bevorzugen, wäre es äußerst vorteilhaft, wenn Embryonen vor der Übertragung in einen mütterlichen Wirt routinemäßig auf ihr Geschlecht hin untersucht werden könnten. Die Verfügbarkeit von geschlechtsbestimmten Embryonen würde es den Milchproduzenten erlauben, ihren Bestand mit solchem Nachwuchs aufzufüllen, der wünschenswerte Eigenschaften wie beispielsweise gesteigerte Milchproduktion und die Fähigkeit, Kälber auszutragen, besitzt. Auch in der Schaf- und Ziegenzucht würde die Verfügbarkeit von geschlechtsgewählten Embryonen den Erzeugern ermöglichen, den am meisten erwünschten Nachwuchs für ihren Bestand auszuwählen.
Die Möglichkeit, das Geschlecht eines Embryo oder Fötus in vitro zu bestimmen, ist ebenfalls von Bedeutung. In "konventionellen" Trächtigkeiten, die ohne Embryoentransfer zustande kommen, sondern durch künstliche Befruchtung oder natürliche Befruchtung entstehen, würde die frühe Bestimmung des Geschlechtes eines Embryos oder Fötus dem Produzenten ermöglichen, die Trächtigkeit abzubrechen, sofern es sich nicht um einen Embryo oder Fötus des gewünschten Geschlechtes handeln sollte.
Das primäre Geschlecht eines Säugers wird durch das Vorhandensein oder Fehlen des gesamten Y-Chromosoms oder eines funktionellen Teils davon bestimmt. Ein auf dem Y-Chromosom vorhandenes Gene oder solche Gene ist/sind für die Bildung der Hoden und der Entwicklung des männlichen Phänotyps verantwortlich. Das primäre Geschlecht eines individuellen Säugers ist deshalb davon abhängig, ob ,sein Genom bestimmte DNA-Sequenzen enthält oder nicht, und zwar spezifisch solche Sequenzen, die denjenigen Teil des Y-Chromosoms enthalten, dem für das bzw. die für die Hodenbildung verantwortliche(n) Gen(e) codiert.
Das Geschlecht oder das vermutete Geschlecht eines individuellen Säugers kann deshalb durch Analyse auf für das Y-Chromosom spezifische Gene in der DNA des Lebewesens bestimmt werden. Alternativ kann das Geschlecht durch Analyse auf damit nicht verwandte, jedoch genetisch verknüpfte Sequenzen bestimmt werden, die spezifisch mit dem Y-Chromosom verbunden sind. Um infolge seltener genetischer Rekombinationsereignisse mögliche Irrtümer möglichst gering zu halten, werden solche Analysen am besten mit solchen Sequenze) durchgeführt, die eng mit an dem oder den hodenerzeugenden Gene(n) gebunden sind.
Eine Reihe von Forschern hat DNA-Sequenzen identifiziert, die vorzugsweise oder ausschließlich mit männlicher DNA hybridisieren (1, 2). Diese DNA-Sequenzen sind noch nicht funktionell charakterisiert worden. Darüber hinaus ist es unbekannt, ob diese Sequenzen mit nicht-menschlichen Spezies hybridisieren können.
Cell 37, 171-177 (1984) offenbart Y-spezifische DNA aus Mäusen, die durch Screening von Klonen einer Y-DNA-Bibliothek auf spezifisch männliche Sequenzen selektioniert wurden, und zwar auf dem Weg der Hybridisierung mit männlicher/weiblicher genomischer DNA.
Die australische Patentanmeldung Nr. 59561/86 offenbart Rinder-DNA-Sonden, die vorzugsweise mit männlicher DNA hybridisieren. Von diesen DNA-Sequenzen wurde festgestellt, daß sie als Hybridisierungssonden für die Geschlechtsbestimmung in Embryonen und Föten geeignet sind.
Ein besonderer Nachteil, der mit den in der australischen Patentanmeldung Nr. 59561/86 beschriebenen DNA-Sequenzen verbunden ist, ist, daß sie speziesspezifisch sind, d. h. spezifisch für Rinder, und nicht mit DNA von anderen wiederkäuenden Tieren wie z. B. Schafen oder Ziegen hybridisieren. Die Speziesspezifität dieser Sequenzen schränkt daher ihre Verwendbarkeit als allgemeines Reagens für die Bestimmung des Geschlechts von Föten oder Embryonen von wiederkäuenden Tieren ein.
Die vorliegende Erfindung basiert auf dem Auffinden einer Y-chromosomenspezifischen DNA-Sequenz, die in Wiederkäuern universell konserviert ist und in allen bis heute untersuchten Wiederkäuern gefunden wurde. Die Sequenz wird in verschiedenem Grade wiederholt, wobei die Anzahl der Wiederholungen zwischen nicht miteinander verwandten Individuen unterschiedlich ist, und sie wird stabil vererbt.
Gemäß einer Ausgestaltung der vorliegenden Erfindung wird ein Nukleinsäureisolat zur Verfügung gestellt, das zur ausschließlichen Hybridisierung von Y-chromosomenspezifischen DNA-Sequenzen von Rindern, Schafen und Ziegen geeignet ist, wobei dieses Isolat einen oder beide Stränge von BRY.1 oder irgendeinen zusammenhängenden Teil davon mit 12 oder mehr Nukleotiden umfaßt und eine Sequenz wie in den Fig. 1 und 2 dargestellt oder eine Variante davon aufweist, die geeignet ist, mit der BRY.1-Nukleotidsequenz zu hybridisieren.
Das Nukleinsäureisolat entspricht der gesamten oder einem Teil einer DNA-Sequenz, die auf dem Y-Chromosom von Rindern gefunden wird und hier im folgenden als BRY.1 bezeichnet wird.
Die BRY.1-DNA-Sequenz ist in Fig. 1 dargestellt. Diese Sequenz umfaßt 307 Nukleotide, von denen die ersten 237 in der australischen vorläufigen Patentanmeldung Nr. PH 07385/86 offenbart sind, deren Priorität die vorliegende Anmeldung in Anspruch nimmt.
Der Ausdruck "BRY.1" bezieht sich auf die spezifische, i Fig. 1 dargestellte DNA-Sequenz. Dieser Ausdruck beinhaltet auch Varianten, in denen Nukleotide in der in Fig. 1 dargestellten Sequenz substituiert, zu ihr hinzugefügt oder davon deletiert sind, sofern die Varianten spezifisch mit der gesamten oder einem Teil der in Fig. 1 dargestellten Sequenz hybridisieren und nicht mehr als 25% von dieser Sequenz abweichen.
Diese Varianten können natürlich auftretende allele Varianten sein, die innerhalb einer Population von Individuen infolge von Punktmutationen, Deletionen oder Insertionen von DNA-Sequenzen auftreten. Alternativ können diese Varianten künstlich erzeugt sein, beispielsweise durch ortsspezifische Mutagenese ("site directed mutagenesis"), durch mit Hilfe vor Endonukleasen oder Restriktionsenzymen erzeugte Deletion von DNA-Fragmenten oder durch eine durch Ligieren von DNA-Teilen aneinander erzeugte Hinzufügung von DNA-Sequenzen.
Die vorliegende Erfindung erstreckt sich auch auf einen beliebigen zusammenhängenden Teil von 12 oder mehr Nukleotid? von BRY.1, hier im folgenden mit "Oligonukleotide", bezeichnet Solche Oligonukleotide können als Hybridisierungssonden zum Auffinden von BRY.1 verwendet werden, und sie können synthetisch unter Verwendung von kommerziell erhältlichen DNA Synthesevorrichtungen, wie beispielsweise des Applied Biosystems 380A DNA-Synthesizers, unter Verwendung von Standardverfahren gebildet werden. Oligonukleotide mit weniger als 12 Nukleotiden weisen eine verminderte Wirksamkeit als Hybridisierungsonden auf.
Gemäß einer weiteren Ausgestaltung der vorliegenden Erfindung wird ein Nukleinsäureisolat zur Verfügung gestellt, das einen beliebigen zusammenhängenden Teil von 12 oder mehr Nukleotiden von BRY.1 enthält.
Die vorliegende Erfindung erstreckt sich auch auf RNA, die BRY.1 entspricht (die der Fig. 1 entsprechende RNA- Sequenz ist in Fig. 2 dargestellt) und auf jeden beliebigen zusammenhängenden Teil von 12 oder mehr Nukleosiden der RNA- Sequenz der Fig. 2.
Gemäß einer weiteren Ausgestaltung der vorliegenden Erfindung wird ein Nukleinsäureisolat zur Verfügung gestellt, das einem oder beiden Strängen von BRY.1 oder einem beliebigen zusammenhängenden Teil von 12 oder mehr Nukleotiden von BRY.1 entsprechende RNA enthält.
Das erfindungsgemäße Nukleinsäureisolat kann als Hybridisierungssonde verwendet und mit radioaktiven Markern wie z. B. 32P, 14C, 3H, 1251 oder mit nicht-radioaktiven Markern, wie z. B. Biotin oder Bromdesoxyuridin nach bekannten Verfahren (3 bis 8) markiert werden.
RNA, die dem gesamten BRY.1 oder einem Teil davon entspricht, kann unter Verwendung von ,Transkriptions-Systemen in vitro erzeugt werden, wobei beispielsweise SP6 RNA- Polymerase oder T7 RNA-Polymerase eingesetzt wird (7, 8).
Das Nukleinsäureisolat der vorliegenden Erfindung kann als Hybridisierungssonde verwendet werden, um Y- chromosomenspezifische DNA-Sequenzen aufzufinden, und dadurch das Geschlecht beispielsweise eines Embryo oder Fötus zu bestimmen. In gleicher Weise kann das Nukleinsäureisolat verwendet werden, um Abwandlungen bezüglich der Menge und/oder kleinere Sequenzänderungen von BRY.1 in einzelnen Tieren aufzufinden. Eine solche Analyse ist für den Vaterschaftstest von Wert.
Auch fraktioniertes Sperma kann mit dem Nukleinsäureisolat der vorliegenden Erfindung untersucht werden. Insbesondere kann Sperma mit angereichertem Y- Chromosomengehalt unter Verwendung des erfindungsgemäßen Nukleinsäureisolats bewertet werden.
Wenn das Geschlecht eines Embryo, Fötus oder individuellen Wiederkäuers bestimmt werden soll, wird eine Zellprobe für den Test entnommen, und daraus wird nach bekannten Methoden DNA extrahiert (9). Dann wird die isolierte DNA an einen festen Träger, wie z. B. Nitrocellulose oder Zetaprobe membrane (Warenzeichen der Bio-Rad Corporation), gebunden oder in einer Gelmatrix elektrophoretisch aufgetrennt und dann auf einen festen Träger überführt. Der feste Träger wird dann mit dem erfindungsgemäßen Nukleinsäureisolat, das wie voranstehend beschrieben mit einem detektierbaren Marker markiert ist, hybridisiert. Markiertes Isolat, das an die DNA des festen Trägern bindet, wird beispielsweise durch Autoradiogrpahie aufgefunden (10). Wenn das markierte Isolat an das in der DNA-Probe vorhandene BRY.1-Gen bindet, kann das Geschlecht unzweideutig als männlich bestimmt werden.
Gemäß dem obigen Verfahren kann die aufzufindende DNA des Embryo, Fötus etc., nämlich das BRY.1-Gen, nach den Verfahren von Saiki et al (11, 12) amplifiziert werden.
Das erfindungsgemäße Nukleinsäureisolat kann auch unter Verwendung von Standardtechniken der in situ-Hybridisierung an fixierte Zellen oder Metaphase-Chromosomen hybridisiert werden (13).
Gemäß einer weiteren Ausgestaltung der Erfindung wird ein Verfahren zum Bestimmen der Geschlechtschromosomen- Beschaffenheit einer Gewebe- oder Zellprobe zur Verfügung gestellt, umfassend das Isolieren der DNA aus der Gewebe- oder Zellprobe, Immobilisieren der isolierten DNA auf einer Trägermatrix, Hybridisieren der immobilisierten DNA mit einem Nukleinsäureisolat, das nur an Y-chromosomenspezifische DNA- Sequenzen von Wiederkäuern binden kann, und zwar unter Bedingungen, die dem Nukleinsäureisolat ermöglichen, an komplementäre DNA-Sequenzen zu binden, Auswaschen von ungebundenem Nukleinsäureisolat aus der Trägermatrix und anschließend Detektieren der Bindung des Nukleinsäureisolats an auf der Trägermatrix gebundene DNA.
Gemäß einer weiteren Ausgestaltung der Erfindung wird ein Verfahren für das Bestimmen des Vorhandenseins oder Fehlens eines Y-Chromosoms in fixierten Zellen oder Aussaaten von Metaphasenchromosomen (auch bezeichnet als Metaphasenchromosomfortpflanzungen) bereitgestellt, umfassend das Hybridisieren der fixierten Zellen oder Metaphasenchromosomen mit einem Nukleinsäureisolat, das nur mit Y-chromosomenspezifischen DNA-Sequenzen von Wiederkäuern hybridiseren kann, und zwar unter Bedingungen, die der Nukleinsäure ermöglichen, an komplementäre DNA-Sequenzen zu binden, Auswaschen von nicht-gebundenem Nukleinsäureisolat und Auffinden der Bindung des Nukleinsäureisolats.
Gemäß einer weiteren Ausgestaltung der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Feststellung der Geschlechtschromosomenbeschaffenheit einer Gewebe- oder Zellprobe bereitgestellt, umfassend das Isolieren von DNA aus der Gewebe- oder Zellprobe und Denaturieren der isolierten DNA, um die entsprechenden codierenden und nicht-codierenden Stränge zu trennen, Hybridisieren ("Annealen") der denaturierten DNA mit einem synthetischen Oligonukleotid, das 12 oder mehr Nukleotiden von BRY.1 entspricht, Inkubieren der hybridisierten DNA mit DNA-Polymerase 1, um das Oligonukleotid über die BRY.1-Sequenz hinweg zu verlängern, sofern diese in der Gewebe- oder Zellprobe vorhanden ist, Wiederholen dieser Abfolge mit der gewünschten Häufigkeit, um BRY.1 auf die gewünschte Menge zu vermehren, und anschließend Auffinden der BRY.1-DNA in der amplifizierten Probe durch entweder:
(a) Immobilisieren der DNA auf einer Trägermatrix, Hybridisieren der immobilisierten DNA mit einem Nukleinsäureisolat, das nur mit Y-chromosomenspezifischen DNA-Sequenzen von Wiederkäuern hybridisieren kann und mit einem detektierbaren Marker markiert worden ist, und zwar unter Bedingungen, die es dem markierten Nukleinsäureisolat ermöglichen, an komplementäre Sequenzen zu binden, Auswaschen von nicht-gebundenem Isolat aus der Trägermatrix und anschließend Detektieren der Bindung des Nukleinsäureisolates an die DNA, die an die Trägermatrix gebunden ist, oder
(b) sofern markierte Nukleotid-Vorläufer bei der Inkubation mit der DNA-Polymerase vorhanden sind, Fraktionieren der Probe durch Elektrophorese in einer Gelmatrix und Auffinden der markierten BRY.1-Sequenzen, die in der Gelmatrix fraktioniert sind.
Nukleinsäurehybridisierungen werden unter Standardbedingungen nach den Verfahren von Reed und Mann (14) und Maniatis et al. (9) durchgeführt.
Das erfindungsgemäße Nukleinsäureisolat kann einen Reagenzsatz (Kit) zum Auffinden des Vorliegens oder Fehlens von Y-chromosomenspezifischen Sequenzen in einer Gewebe- oder Zellprobe umfassen oder Teil eines solchen sein. Das Nukleinsäureisolat kann mit detektierbaren Markern markiert sein. Die Reagenzsätze können Puffer zum Verdünnen der Reagentien, (eine) markierte Verbindung(en) und feste Träger umfassen, auf denen Tests durchgeführt werden können.
Gemäß einer zusätzlichen Ausgestaltung der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zum Isolieren von Y- chromosomenspezifischer DNA bereitgestellt, umfassend:
(i) Hybridisieren ("Annealen") einzelsträngiger genomischer Rinder-DNA, die von männlichen und weiblichen Tieren stammt,
(ii) Isolieren der hybridisierten DNA und deren Insertieren in einen replizierbaren Vektor, (iii) Transformieren von Wirtszellen mit dem replizierbaren Vektor, der die hybridisierte DNA enthält,
(iv) Hybridisieren der transformierten Wirtszellen mit einer markierten DNA-Sonde, die aus weiblicher genomischer Wiederkäuer-DNA gewonnen wurde und Identifizieren derjenigen Wirtszellen, die genomische Rinder-DNA enthalten, die nicht an die markierte Sonde bindet- und
(v) anschließend Isolieren der nicht-hybridisierenden Y- chromosomenspezifischen DNA.

BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

Fig. 1 zeigt die doppelstängige DNA-Sequenz von BRY.1; und in dieser Figur bedeuten C Desoxycytidin-5'-phosphat, G Desoxyguanosin-5'-phosphat, A Desoxyadenosin-5'-phosphat und T Desoxythymidin-5'-phosphat.
Fig. 2 zeigt die doppelsträngige RNA-Sequenz, die der DNA-Sequenz von BRY.1 entspricht. In dieser Figur bedeuten C Cytidin-5'-phosphat, G Guanosin-5'-phosphat, A Adenosin-5'- phosphat und U Uridin-5'-phosphat.

DEFINITIONEN UND ABKÜRZUNGEN

DNA - Desoxyribonukleinsäure
RNA - Ribonukleinsäure
cDNA - komplementäre DNA (enzymatisch synthetisiert aus einer mRNA-Sequenz)
mRNA - Messenger-RNA
A - Adenn
T - Thymin
G - Guanin
C - Cytosin
U - Uracil
Tris - Tris (hydroxymethyl) aminomethan
EDTA - Ethylendiamintetraessigsäure
SDS - Natriumdodecylsulfat
psi - amerikanische Pfund pro Quadratinch
K. MES - Kaliummorpholinoethansulfonat Polynukleotid - einzel- oder doppelsträngige DNA oder RNA.

BEISPIELE

BEISPIEL 1

Isolierung von BRY-.1 DNA (14):
Im Schlachthof wurden Leberstücke von männlichen und weiblichen Rindern gesammelt und sofort in flüssigem Stickstoff eingefroren. Proben (0,8 g) gefrorener Leber einzelner Tiere wurden in 8 ml HB (0,1 M NaCl, 10 mM Tris-HCI (pH 7,5), 1 mM EDTA) homogenisiert. Zu jedem Homogenat wurden, unter gründlichem, yorsichtigem Vermischen, 2,2 ml 0,5 M EDTA und 1,22 ml 20%iges (Gew./Vol.) Sarcosyl hinzugefügt. Die Suspensionen wurden 15 min lang unter gelegentlichem schwachem Mischen auf 65ºC erhitzt, 11,6 g festes CsCl wurden in jeder gelöst, dann wurde 1 ml Ethidiumbromid (10 mg/ml) zugesetzt und eingemischt. Die Suspensionen wurden in 13,5 ml fassende Zentrifugenröhrchen überführt, die in einen Beckman Ti80-Rotor gesetzt und in einer Beckman L8-80-Ultrazentrifuge 60 h lang bei 25ºC und 45 000 Upm zentrifugiert wurden.
Die rosafarbene Bande aus konzentrierter DNA nahe der Röhrchenmitte wurde durch seitliches Anstechen (mit einer 18 g Nadel, die mit einer 1 ml Plastikspritze verbunden war) entnommen und in ein verschlossenes Röhrchen überführt. Durch wiederholtes Extrahieren mit Butanol (zuvor aquilibriert mit gesättigter NaCl-Lösung) wurde das Ethidiumbromid entfernt, und die gebildete klare DNA-Lösung wurde gegen 3·2 Liter TE (10 mM Tris-HCl,. pH 8,0, 1 mM EDTA) bei 4ºC dialysiert.
Anreicherung an klonierbaren für das männliche Geschlecht spezifischen Sequenzen durch heterologe Hybridisierung (15):
1 mg von aus der Leber einer Kuh isolierter DNA wurde durch Scherkraft nach dem Zufallsprinzip auf eine mittlere Fragmentgröße von ungefähr 500 Bp gebracht, indem sie wiederholt (5x) unter einem Druck von 20 000 psi durch eine "French Press" passagiert wurde, dann durch Zugabe von Natriumacetat (pH 5,0) auf 0,25M und Ethanol auf 70% (Vol./Vol.) und anschließend durch über Nacht erfolgendes Abkühlen auf -20ºC ausgefällt. Die DNA wurde abzentrifugiert, und das Pellet wurde mit 70% (Vol./Vol.) Ethanol gewaschen und kurz im Vakuum getrocknet.
Neun ug von aus der Leber eines Bullen isolierter DNA wurde mit der Restriktionsendonuklease Sau3AI unter Standardbedingungen vollständig verdaut und dann nacheinander mit Phenol und Ether extrahiert. Sie wurde durch Zusatz von Ammoniumacetat auf 2M und Ethanol auf 70% (Vol./Vol.), inniges Vermischen, Ausfrieren in flüssigem Stickstoff, kurzes Auftauen und 15minütiges Zentrifugieren bei 4ºC isoliert. Das Pellet aus verdünnter männlicher DNA wurde dann mit 70%igem (Vol./Vol.) Ethanol gewaschen und kurz im Vakuum getrocknet.
Diese beiden präparierten DNA-Proben (1 mg nach dem Zufallsprinzip durch Sicherung zerkleinerte weibliche genomische Rinder-DNA und 9 ug "geschnittener" männliche genomische Rinder-DNA) wurden in 0,1 ml PE (50 mM Natriumphosphat (pH 6,8), 5 mM EDTA) zusammengegeben und durch 5minütiges Erhitzen auf 100ºC denaturiert, dann sofort auf Eis/Wasser gegeben und mit 0,1 ml 4M Ammoniumsulfat in PE vermischt. Diese Lösung wurde 24 h lang bei 68ºC inkubiert, was wegen der 50fachen Beschleunigung der Reassoziierung durch 2M Ammoniumsulfat zu einer Reassoziierung der DNA auf einen C0t-Wert von 1,320 Mol.1-1.s führte, entsprechend einem C0t- Äquivalent von 66 000 Mol.1-1.s (C0t = molare Konzentration an einzelsträngiger DNA zur Zeit Null (Nukleotide/1)·Zeit/s); die tatsächlichen C0t-Werte sind durch Bezugnahme auf die äquivalente Reassoziierungsrate in 0,12M Natriumphosphat, pH 6,8, standardisiert).
Die reassozlierte DNA wurde durch Passagieren der Mischung durch eine Hydroxyapatit-Säule (HAP) von einzelsträngiger DNA getrennt. Die Säulenmatrix wurde durch Suspendieren von 3 g Hydroxyapatit (Bio-Rad DNA GRADE) in 200 ml PB (0,12M Natriumphosphat, pH 6,8) und 15minütiges schwaches Kochen hergestellt. Die Aufschlämmung wurde dann in eine von einem Wasserkühlmantel umgebene Glassäule auf ein Bett aus 1/4" gekochtem Sand geschüttet (um das Verstopfen der zum Zurückhalten angebrachten Scheibe aus gesintertem Glas am Boden der Säule zu verhindern) und absitzen gelassen. Die HAP- Säule wurde durchgängig bei 60ºC gehalten. Nachdem die HAP- Säule mit 25 Säulenvolumina PB vorgewaschen war, wurde die Lösung der reassoziierten DNA mit PB auf 5 ml verdünnt und auf die HAP-Säule aufgebracht. Die Säule wurde mit 5 Säulenvolumina PB und dann mit 5 Säulenvolumina 0,6M Natriumphosphat, pH 6,8, eluiert. In der mit PB eluierten Fraktion wurden ungefähr 95% der Gesamt-DNA wieder gefunden, bei der es sich um die doppelsträngige (reassoziierte) DNA handelte. Diese Fraktion wurde gegen TE dialysiert, durch wiederholte Extraktion mit Butanol aufkonzentriert und dann mit (mit Wasser gewaschenem) Ether extrahiert und zentrifugiert, um teilchenförmiges Material zu entfernen. Die DNA wurde durch Ausfällen mit Natriumacetat/Ethanol wie oben beschrieben isoliert.
Herstellung des Klonierungsvektors (Plasmid pUC9) (16): Der Klonierungsvektor wurde durch Verdauen von 100 ug des Plasmids pUC9 mit der Restriktionsendonuklease BamHI und anschließenden Zusatz von SDS auf 0,5% (Gew./Vol.) und 1/6 Volumen 1M Tris-HCl, pH 9,0, und 1stündiges Inkubieren mit 40 Ig alkalischer Phosphatase aus Kalbsdarm (Boehringer ELISA grade) hergestellt. Diese Lösung wurde mit Phenol behandelt, worauf die DNA wie oben beschrieben durch Fällung mit Natriumacetat/Ethanol isoliert wurde. Die geschnittene DNA wurde in TE/0,2% (Gew./Vol.) Sarcosyl gelöst und als Schicht auf kalte (4ºC) Saccharose mit einem linearen Gradienten von 2 -25% (Gew./Gew.), gelöst in TE/0,2% (Gew./Vol.) Sarcosyl, in ein Ultrazentrifugationsröhrchen Beckman SW41 eingebracht. Das Röhrchen wurde 20 h lang bei 4ºC in einer Beckman L8-80- Ultrazentrifuge mit 36 000 Upm zentrifugiert, dann wurden Fraktionen von 0,5 ml mit einem Gradienten-Fraktionator (ISCO) gesammelt.
Proben (10 ul) einer jeden Fraktion wurden in einem 1,5%igen (Gew./Vol.) Ethidiumbromid (0,5 ug/ml) enthaltenden Agarosegel elektrophoretisch aufgetrennt, dann unter ultravioletter Belichtung (302 nm) photographiert, um die visuelle Identifizierung von Fraktionen mit linearisiertem Plasmid zu ermöglichen.
Herstellung kompetenter Zellen:
Kompetente Bakterienzellen (Escherichia coli Stamm JM83) wurden hergestellt (17), indem zuerst 100 ml 2YT-Medium (steriles 1, 6%iges (Gew. /Vol.) Bacto-Trypton, 1% (Gew. /Vol.) Hefeextrakt, 0,5% (Gew./Vol.) NaCl, pH 7,4) mit JM83-Zellen inokuliert und dann unter kräftigem Schütteln inkubiert wurden, bis die optische Dichte ("absorbance") der Kultur bei 600 nm 0,4 betrug. Der Kulturkolben wurde 5 min lang in Eis/Wasser abgeschreckt, worauf die Zellen durch Zentrifugation geerntet wurden. Das Pellet wurde in 50 ml 50 mM CaCl2 resuspendiert, auf Eis 20 min lang stehengelassen und dann nochmals zentrifugiert. Das Pellet wurde in 5 ml kaltem 50-mM CaCl2 resuspendiert und 24 h lang auf Eis stehengelassen, bevor es für Transformationstests verwendet wurde.
DNA wurde, wie oben beschrieben, aus Proben von jeweils 20 il einer jeden der obigen Gradientenfraktionen durch Ausfällen mit Ammoniumacetat/Ethanol gewonnen. Zu diesen Proben wurden 50 ul kompetente JM83-Zellen hinzugefügt. Die Suspensionen wurden 30 min lang auf Eis gehalten, 90 s lang auf 42ºC erwärmt und dann mit 0,1 ml 2YT-Medium vermischt und 1 h lang bei 37ºC inkubiert. Die Zellen wurden durch Zentrifugation abgetrennt, in 0,2 ml 2YT-Medium resuspendiert, auf 2YT-Agar (2YT-Medium mit 1,5% (Gew./Vol.) Agar), der 50 ug/ml Ampicillin enthielt, ausplattiert und über Nacht bei 37ºC inkubiert. Das Auszählen der Koloniezahlen auf jeder Schale ermöglichte die Identifizierung von
Gradientenfraktionen mit zirkulärem (ungeschnittenem) Plasmid Die Gradientenfraktionen #13-16 (die Numerierung beginnt mit der Spitze des Gradienten), die den Großteil an linearem, phosphatasegespaltenem Plasmid und nur wenig zirkuläres Plasmid enthielten (geschätzt aus der Transformierungskapazität), wurden gepoolt, worauf die DNA durch Ausfällung mit Natriumacetat/Ethanol wie oben beschrieben gewonnen wurde.
Herstellung einer mit für das männliche Geschlecht spezifischen DNA-Sequenzen angereicherten Teil-"Genbank":
Proben reassoziierter genomischer DNA (200 ug) und gradienten-gereinigter linearer Vektor-DNA (10 ug) wurden in ml Ligierungspuffer (66 mM Tris-HCl, pH 7,5, 6,6 mM MgCl2, 1 mM ATP, 100 ug/ml BSA (Rinderserumalbumin, Boehringer, nukleasefrei), 10 mM Dithiotreitol und 50 Einheiten T4 DNA- Ligase (New England BioLabs)) zusammengegeben und über Nacht bei 14ºC inkubiert.
Ein Vorrat an JM83-Zellen wurde durch verdünnendes Ausstreichen einer Zellprobe auf LM-Agar (steriles 1%iges (Gew./Vol.) Bacto-Trypton, 0,5% (Gew./Vol.) Hefeextrakt, 10 in NaCl, 10 mM MgSO4, 1,5% (Gew./Vol.) Agar) und über Nacht erfolgendes Inkubieren bei 37ºC hergestellt. Einige wenige isolierte Kolonien wurden zum Beimpfen von 20 ml vorgewärmtem SOB-Medium (steriles 2%iges (Gew./Vol.) Bacto-Trypton, 0,5% (Gew./Vol.) Hefeextrakt, 10 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 20 mM MgSO4) verwendet, die Kultur wurde unter kräftiger Belüftung bis auf eine optische Dichte ("absorbance") von 0,5 bei 550 nm gezüchtet und mit 20 ml sterilem SOB:Glycerin (Volumenverhältnis 60 : 40) verdünnt. Proben (0,1 ml) wurden in 1,5 ml fassende, verschließbare Röhrchen überführt und 10 min auf Eis gekühlt und dann in Trockeneis/Ethanol eingefroren und bei -70ºC gelagert.
Kompetente JM83-Zellen wurden aus einzelnen Kolonien hergestellt, indem zuerst ein Bröckchen der gefrorenen Vorratszellsuspension auf LM-Agar abgekratzt, unter Verdünnung ausgestrichen und dann über Nacht bei 37ºC inkubiert wurde. Zehn 2,5 mm (Durchmesser) Kolonien wurden jeweils in 1 ml vorgewärmtem SOB-Medium durch Vortex-Mischen suspendiert. Die Suspensionen wurden in 90 ml vorgewärmtem SOB-Medium gepoolt, worauf die Kultur unter kräftiger Belüftung bei 37ºC inkubiert wurde, bis die optische Dichte (Absorption) bei 550 nm 0,5 betrug. Die Kultur wurde in 2·50 ml fassende Zentrifugenröhrchen überführt, 15 min lang auf Eis/Wasser abgekühlt, worauf dann die Zellen durch Zentrifugation bei 4ºC (2 500 Upm, 12 min lang) geerntet wurden. Das Zellpellet wurde in 33 ml eiskaltem TEB (steriles 10 mM K-MES (Sigma), pH 6,3, 100 mM RbCl, 45 mM MgCl2, 10 mM CaCl2, 3 mM Kobalthexammintrichlorid (Fluka)) resuspendiert und 15 min lang auf Eis stehengelassen. Die Suspension wurde bei 4ºC zentrifugiert (10 min lang bei 2 500 Upm), worauf das Pellet in 8 ml eiskaltem TFB resuspendiert wurde. Zu der Suspension wurden 0,28 ml DM50 (Dimethylsulfoxid, Merck, spektroskopisch rein) gegeben. Die Mischung wurde geschwenkt und 5 min auf Eis stehengelassen, dann wurden 0,28 ml 2,25M Dithiothreitol (Calbiochem; sterile Lösung in 40 mM Kaliumacetat, pH 6) zugesetzt und die Zellen wurden nochmals geschwenkt und weitere 10 min auf Eis stehengelassen. Schließlich wurden 0,28 ml DMSO vorsichtig zugesetzt und eingemischt, worauf die Zellen ein weiteres Mal 5 min lang auf Eis stehengelassen wurden.
Transformation:
Proben von Zellen (210 ul) wurden in 24 gekühlte Polypropylenröhrchen mit 10 ul ligierter DNA eingebracht, worauf die Röhrchen sanft geschüttelt und 30 min lang auf Eis stehengelassen wurden. Die Röhrchen wurden dann 90 s lang in ein 42ºC warmes Wasserbad gegeben, 2 min lang auf Eis/Wasser gestellt, worauf 0,8 ml SOC-Medium (steriles SOB-Medium mit 20 mM Glucose) zugesetzt wurden. Dann wurde die Suspension bei 37ºC 1 h lang unter sanftem Schütteln inkubiert. Die Suspensionen aus 4 Röhrchen wurden gepoolt, worauf die Zellen mit Hilfe von Vakuumfiltration auf einem modidifizierten Buchner-Trichter gleichförmig auf einen scheibenförmigen Nitrocellulosefilter mit 82 mm Durchmesser (Schleicher & Schuell) ausgebracht wurden. Der Filter wurde auf Ampicillin (50 ug/ml) enthaltenden 2YT-Agar gegeben und über Nacht bei 37ºC inkubiert. Dieses Verfahren wurde mit allen Proben wiederholt, wobei man 6 Filterplattierungen erhielt.
Ungefähr 1 500 Kolonien transformierter Zellen konnte man nach Inkubation über Nacht auf jedem Filter beobachten, was eine "Genbank"-Komplexizität von ungefähr 9 000 für die 240 41 an für die Transformation verwendeter reassoziierter genomischer DNA ergibt (entsprechend einer potentiellen Gesamtkomplexizität von 187 500 Transformanten für die 5 ml Ligierungsmischung). Die Zellen auf den sechs Filtern wurden vorsichtig in 10 ml Ampicillin (50 ug/ml) enthaltendem SOB- Medium suspendiert. Die Suspensionen wurden auf einen Gehalt von 20% (Vol./Vol.) in Glycerin gebracht, worauf Anteile von jeweils 1 ml auf verschließbare Röhrchen verteilt, in flüssigem Stickstoff eingefroren und bei -70ºC als amplifizierte Teilbibliothek gelagert wurden.
Screening der teilweise angereicherten Genbank auf für das männliche Geschlecht spezifische Sequenzen (19):
Vier Proben der amplifizierten Teilbibliothek, die jeweils ungefähr 2 000 transformierte Zellen enthielten, wurden bei 37ºC jeweils in 4 ml 2YT-Agar/Ampicillin verdünnt. Jeder Filter ("Master") wurde dann benutzt, um daraus ein Replikat als Screening-Filter zu erzeugen, indem es mit der Kolonieoberfläche nach oben auf ein Kissen aus zwei Blatt Filterpapier (Schleicher & Schuell 3MM) placiert und mit einer Scheibe aus frischem Nitrocellulosefilter (die durch Aufbringen auf 2YT-Agar/Ampicillin zuvor angefeuchtet worden war) und sodann zwei Blatt 3MM Filterpapier bedeckt wurde. Der "Sandwich" wurde mit einem glatten, samtbezogenen Aluminiumblock fest zusammengedrückt. Dann wurden die zwei oberen Blatt 3MM Filterpapier entfernt. Der Sandwich aus zwei scheibenförmigen Nitrocellulosefiltern (Master und Replica) wurde dann "chiffriert", indem er mehrere Male mit einer 22 g Nadel, die mit einer wasserfesten schwarzen Tinte enthaltenden Spritze verbunden war, durchstochen wurde. Dann wurden die Filter vorsichtig voneinander abgelöst und das Master-Filter zur Lagerung bei 4ºC zurück auf seine 2YT-Agar/Ampicillin- Schale gelegt. Das Replica-Filter wurde mit der Kolonieoberfläche nach oben auf 2YT-Agar/Ampicillin gelegt und ungefähr 4-6 h (bis die Kolonien auf einen Durchmesser von ungefähr 0,5 mm angewachsen waren) bei 37ºC inkubiert, dann auf 2YT-Agar mit Chloramphenicol (200 ug/ml) überführt und über Nacht bei 37ºC inkubiert, um das Zellwachstum zum Stillstand zu bringen, ohne die Plasmid-Replikation zu inhibieren (Chloramphenicol-Amplifizierung der Plasmid- Kopienzahl).
Dann wurden die Replica-Filter 5 min lang (mit den Kolonien auf der Oberseite) auf ein Kissen aus 4 Blatt 3MM Filterpapier überführt, das gleichmäßig mit 0,5M NaOH, 1,5M NaCl angefeuchtet worden war. Überschüssige Flüssigkeit wurde aus den Filtern abgetupft, indem sie auf trockenes 3MM Filterpapier gelegt wurden (wobei darauf geachtet wurde, daß sie fortwährend in horizontaler Orientierung verblieben, um ein Verlaufen von plasmidischer DNA, die durch die alkalische Behandlung aus den Kolonien freigesetzt war, zu minimieren), worauf die alkalische Behandlung wiederholt wurde. Die geblotteten Filter wurden dann zweimal nacheinander 5 min lang ähnlich wie oben mit 0,5M Tris-HCl (pH 7,5), 1,5M NaCl behandelt. Nach kurzem Blotten ließ man sie 30 min lang auf 3MM Filterpapier stehen. Die aus den Kolonien freigesetzte DNA wurde auf den neutralisierten Filtern fixiert, indem diese in einem Vakuumofen 2 h lang auf 80ºC erhitzt wurden. Zelltrümmer wurden dann durch 1stündiges Waschen der Filter bei 50ºC in 5·SSC (1·SSC ist 0,15M NaCl, 15 mM Na3.Citrat), 0,5% SDS unter fortdauerndem leichtem Schütteln entfernt.
Die gewaschenen Filter wurden über Nacht unter fortgesetztem leichtem Schütteln bei 42ºC in Hybridisierungslösung (50% (Vol./Vol.) Formamid 5·SSPE (1·SSPE ist 0,18M NaCl, 10 mM Natriumphosphat (pH 7,7), 1 mM EDTA), 1% (Gew./Vol.) SDS, 0,5 mg/ml hitzedenaturierte, der Scherung unterworfene DNA aus Lachssperma (Sigma, gelöst mit 10 mg/ml in destilliertem Wasser und autoklaviert), 0,5% (Gew. /Vol.) Magermilchpulver) vorhybridisiert. Die vorhybridisierten Filter wurden in frische Hybridisierungsiösung, die radioaktive Sonden-DNA in einer Menge von 10 ng/ml enthielt, überführt und über Nacht unter fortwährendem leichten Schütteln bei 42ºC inkubiert.
Sondenherstellung:
Die radioaktive Sonden-DNA wurde durch das Zusammenführen gleicher Mengen von aus den Lebern von sechs nicht miteinander verwandten Kühen isolierter DNA und das Markieren eines Teiles dieser Mischung durch Nick-Translation hergestellt. Die Probe der gemischten DNA (0,2 ug) wurde mit 25 pg/ml DNase I (E. coli Desoxyribonuclease I) in einem Gesamtvolumen von 40 41 mit 50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 7,5 mM MgCl2, 5 mM Dithiothreitol, 0,1 mg/ml BSA, 20 uM dATP, 20 uM dGTP, 20 uM dTTP und 100 uCi [ -32P]dCTP (Amersham; ungefähr 3 000 Ci/mMol) bei 15ºC 20 min lang vorinkubiert. Während dieser Zeit wurde eine kleine Probe (ungefähr 0,2 ul) abgenommen und auf die Anfangsmarkierung auf einem kleinen Blatt (ungefähr 4·8 cm) Dünnschichtchromatographiematerial aus PEI-Cellulose (Merck) aufgetragen. Nach der Vorinkubation wurde DNA Polymerase I (Boehringer; ungefähr 5 Einheiten) zugesetzt, worauf die Inkubation 20 min lang bei 15ºC fortgesetzt wurde. Die Nick-Translationsreaktion wurde durch den Zusatz von SDS auf 1% (Gew./Vol.) und EDTA auf 20 mM gestoppt. Es wurde eine zweite sehr kleine Probe abgenommen und in Nachbarschaft zur ersten auf das Blatt aus PEI-Cellulose aufgetragen. Das Dünnschicht-Chromatogramm wurde in 0,75M Kaliumphosphat, pH 3,5, entwickelt, wobei sich eine Trennung der dCTP von der DNA ergab. Es erfolgte eine 15minütige Belichtung des Chromatogramms auf eine Röntgenfilmfolie (Fuji RX). Die Entwicklung des Röntgenfilms ermöglichte die visuelle Abschätzung der Effizienz des Einbaus von -32P]dCTPin die DNA. Dies wurde nachfolgend durch Szintillationszählung geeigneter Bereiche des Chromatogramms mit einem Befund von über 95% quantifiziert, so daß man im Ergebnis gemischte weibliche genomische Rinder-DNA, markiert mit einer spezifischen Aktivität von ungefähr 109 dpm [32P]/ug, erhalten hatte. Vor deren Zusatz zu der Hybridisierungslösung wurde die markierte DNA durch Ausfällung mit Ammoniumacetat/Ethanol wie oben beschrieben isoliert, dann in destilliertem Wasser gelöst und durch 5minütiges Erhitzen auf 100ºC denaturiert.
Nach der Hybridisierung wurden die Nitrocellulosefilter kurz bei Raumtemperatur in 2·SSC gespült und dann in 2·SSC, 0,1% (Gew./Vol.) SDS 15 min lang bei Raumtemperatur unter mäßigem Schütteln gewaschen, worauf sie, wiederum unter mäßigem Schütteln, in 0,5·SSC, 1% SDS, 15 min lang bei 68ºC gewaschen wurden. Schließlich wurden sie kurz bei Raumtemperatur mit 0,5·SSC abgespült, trockengetupft, in Gladwrap eingewickelt und mit einem DuPont Cronex "Lightning Plus" (Warenzeichen)-Intensivierungsschirm bei -70ºC 3 Tage lang auf einen Röntgenfilm (Fuji RX) belichtet.
Die Autoradiographiesignale auf dem entwickelten Röntgenfilm entsprechen der Hybridisierung rekombinanter Plasmide in einzelnen Kolonien mit Nick-translatierter weiblicher genomischer DNA. Solche Kolonien enthalten DNA- Sequenzen, die in mehrfachen Kopien in weiblicher (und deshalb auch männlicher) genomischer DNA vorhanden sind, da die spezifische Aktivität der Sonde ungefähr zu 1 dpm/106 Basenpaaren genomischer DNA äquivalent war. Der Vergleich des Autoradiogramms mit den ursprünglichen Master-Filtern ermöglichte die Identifizierung von Kolonien, die kein Hybridisierungssignal lieferten; Zellen in diesen Kolonien sollten enthalten: (i) Hintergrund- (nicht-rekombinante) Plasmide, (ii) rekombinante Plasmide mit Sequenzen, die in den Genomen von sowohl männlichen als auch weiblichen Rindern in relativ kleiner Kopienzahl vorliegen, und (iii) rekombinante Plasmide, die ausschließlich im Genom männlicher Rinder vorhandene Sequenzen enthalten. Bevor gründlichere Screening- Analysen durchgeführt wurden (die zuletzt erwähnten sind die interessierenden Kolonien), wurden diese "negativen" Transformanten durch Klonbildung gereinigt.
Kolonien, die kein Hybridisierungssignal lieferten (ungefähr 80, oder 1% der Gesamtmenge), wurden unter Verdünnung auf 2YT-Agar/Ampicillin ausgestrichen und über Nacht bei 37ºC inkubiert. Sterile Zahnstocher wurden verwendet, um Proben acht isolierter Kolonien aus jeder Schale auf Replika-Netzmuster auf 2YT-Agar/Ampicillin (zweiter Master) und Nitrocellulosescheiben auf 2YT-Agar/Ampicillin (zweite Replika) zu übertragen. Die Masterschalen wurden über Nacht bei 37ºC inkubiert und für die Lagerung auf 4ºC gebracht. Die Replikas wurden ungefähr 6 h lang bei 37ºC inkubiert worauf die Filterscheiben auf 2YT- Agar/Chloramphenicol übertragen wurden, wo sie über Nacht bei 37ºC inkubiert wurden. Die Filter wurden dann genau wie oben chemisch behandelt, hybridisiert, gewaschen und autoradiographiert.
Wenn zwei oder mehr der acht über Klone gereinigten Transformanten, die aus einer einzigen "negativen" Kolonie des ersten Screenings stammten, beim zweiten Screening negativ blieben, wurde der Plasmidgehalt eines der negativen zweiten Klone analysiert. Ein steriler Zahnstocher wurde verwendet, um einen Teil einer solchen Kolonie in 20 41 Lysispuffer (NaOH, EDTA, SDS, Glycerin, Bromcresolgrün) zu übertragen. Die Mischung wurde 30 min lang auf 65ºC erhitzt und dann in einem 1%igen Agarosegel parallel zu intakten zirkulären Plasmiden bekannter Größe elektrophoretisch aufgetrennt. Die Gele wurden mit Ethidiumbromid angefärbt und unter ultravioletter Beleuchtung photographiert, um eine visuelle Abschätzung der Größe von Plasmiden in speziellen Transformanten zu ermöglichen. Dann ließ man die Gele sich 15 min lang in 2 Volumina 0,25M HCl vollsaugen, unterwarf sie sodann einem Kapillartransfer in 0,4M NaOH, wodurch die DNA innerhalb der Gele der Scherung unterworfen, denaturiert und auf ein Blatt ladungsmodifizierte Nylonmembran (Bio-Rad Zeta-Probe) transferiert und durch "alkalisches Southern Blotting" (14) fixiert wird. Die Membranen wurden daraufhin durch kurzes Spülen in 2·SSC neutralisiert, dann 4 h bei 68ºC in Hybridisierungslösung (2·SSPE, 1% (Gew./Vol.) SDS, 0,5% (Gew. /Vol.) Magermilchpulver, 10% (Gew. /Vol.) Dextransulfat, 0,5 mg/ml der Scherung unterworfene, denaturierte Lachssperma- DNA) vorhybridisiert. Dann wurden sie in frische Hybridisierungslösung mit radioaktiver Sonde (gemischte weibliche genomische DNA, hergestellt wie oben beschrieben) übertragen und über Nacht bei 68ºC hybridisiert, worauf sie wie oben beschrieben gewaschen und autoradiographiert wurden.
Das entwickelte Autoradiogramm erlaubte es, zahlreiche potentielle "Negative" aus den weiteren Überlegungen auszuschließen.
Rekombinante Kolonien (die durch die darin enthaltene Plasmidgröße als solche erkannt worden waren), die unter diesen Bedingungen erhöhter Empfindlichkeit immer noch keine Hybridisierung zeigten, wurden verwendet, um 2 ml 2YT- Medium/Ampicillin für Kulturen zu beimpfen, die über Nacht bei 37ºC gehalten wurden. Die Zellen wurden durch Zentrifugation isoliert. Plasmid wurde daraus nach dem alkalischen/SDS-Lyse- Verfahren isoliert (9).
Proben einzelner plasmidischer Mini-Preps wurden dann durch Nick-Translation markiert und als Sonde in alkalischen Southernblots "geschnittener" männlicher und weiblicher genomischer Rinder-DNA verwendet. 4 ug genomischer, aus den Lebern von jeweils zwei nicht miteinander verwandten Kühen und zwei nicht miteinander verwandten Stieren isolierte DNA wurde mit der Restriktionsendonuklease BamHI vollständig verdaut und in 1%igen (Gew./Vol.) Agarose-Minigelen (Pharmacia GNA-100) elektrophoretisch aufgetrennt. Nach Anfärben und Photographieren wurden die Gele mit Säure versetzt. Die DNA wurde auf Zeta-Probe-Membranen übertragen und fixiert, worauf die Membranen neutralisiert und vorhybridisiert wurden (alle Verfahren wie oben beschrieben). Die Membranen (eine Membran mit der DNA von jeweils zwei weiblichen und zwei männlichen Tieren für jedes plasmidische Mini-Prep) wurden auf Proben frischer Hybridisierungslösung übertragen, die jeweils 10% (Gew./Vol.) Dextransulfat und eine radiomarkierte plasmidische DNA (20 ng/ml) enthielten. Proben plasmidischer Mini-Preps (ungefähr 0,2 ug) wurden durch Nick-Translation bis zu einer spezifischen Aktivität von ungefähr 2·108 dpmä32P)/ug der plasmidischen DNA wie oben beschrieben markiert. Die Membranen wurden daraufhin wie oben beschrieben gewaschen, getrocknet und autoradiographiert.
Bei einem der Plasmide konnte man feststellen, daß es mit der DNA von beiden männlichen, aber keinem der weiblichen Tiere einzelne Hybridisierungsbanden lieferte. Dieses Plasmid (pBRY.1) enthielt einen Einschub von ungefähr 300 Bp (bestimmt durch elektrophoretische Analyse von Restriktionsverdauungen des Mini-Preps).

BEISPIEL 2

Bestätigung der Spezifität des Plasmids pBRY.1 für das männliche Geschlecht:
Eine Probe (0,2 ug) pBRY.1 Mini-Prep wurde durch Nick- Translation markiert und an alkalische Southernblots genomischer, mit BamHI verdauter DNA hybridisiert, die aus peripheren Blutlymphozyten einer Anzahl von verwandten männlichen und weiblichen Rindern isoliert worden war.
Für dieses Experiment wurden 50 ml Peripherblut von einem Bullen und sechs weiblichen Tieren, die er gedeckt hatte, zusammen mit der Nachkommenschaft aus diesen Paarungen (unter Verwendung von EDTA als Antikoagulans) gewonnen. Mit Lymphozyten angereicherte Zellfraktionen wurden aus den Blutproben durch Ficoll-Paque-Zentrifugation (Pharmacia) und danach schnellen osmotischen Schock (um den Hauptteil der verbliebenen kontaminierenden roten Zellen zu lysieren) sowie Zentrifugation, um die Lymphozyten zu pelletieren, isoliert. Aus den Lymphozytenpräparationen wurde mit dem obigen für Leber beschriebenen Verfahren DNA isoliert. DNA-Proben (4 ug) wurden mit der Restriktionsendonuklease BamHI vollständig verdaut, dann wie oben beschrieben der Elektrophorese unterworfen, durch alkalisches Southernblotting hybridisiert und mit Nick-translatiertem pBRY.1 autoradiographiert. DNA- Isolate des Bullen und aller seiner männlichen Nachkommenschaft zeigte identische Hybridisierungsbanden. Dagegen lieferte aus den weiblichen Tieren und der gesamten weiblichen Nachkommenschaft gewonnene DNA keinen Hinweis auf Hybridisierung mit pBRY.1.
Dot-Blot-Hybridisierung mit Leber- und Nieren-DNA:
Proben von aus der Leber und den Nieren einer Reihe von weiteren, nicht miteinander verwandten Stieren und Kühen isolierter DNA wurden verwendet, um alkalische Dot-Blots herzustellen. In diesem Experiment wurden 8 ug aenomischer DNA aus jedem Tier in 1 ml 0,4M NaOH, 20 mM EDTA verdünnt und 10 min lang auf 100ºC erhitzt. Eine Hälfte dieser Probe (0,5 ml) wurde in 0,5 ml 0,4M NaOH, 20 mM EDTA überführt, worauf nach Vermischen 0,5 ml dieser Verdünnung nochmals in 0,5 ml 0,4M NaOH, 20 mM EDTA eingetragen wurde. Die serielle Verdünnung wurde wiederholt, so daß sieben Verdünnungen einer jeden Probe gewonnen wurden. Die erste, dritte, fünfte und siebte Probe (jeweils 0,5 ml mit 4, 1, 0,25 bzw. 0,0625 ug DNA) wurden unter Verwendung einer Dot-Blot-Mikrofiltrationsmaske (Bio- Rad) auf die Zeta-Probe-Membran aufgebracht. Nach einer Vakuumfiltration wurden die Probenvertiefungen mit 0,4 ml einer 0,4M NaOH gespült, worauf die Membran neutralisiert und wie oben beschrieben mit Nick-translatiertem pBRY.1 hybridisiert wurde. Die Autoradiographie zeigte, daß keine der DNA-Proben aus weiblichen Tieren mit der Sonde hybridisierte, während alle aus männlichen Tieren isolierte DNA-Proben Hybridisierung zeigten. Die Intensität der autoradiographierten Punkte schwankte zwischen männlichen Tieren, was Unterschiede unter den männlichen Tieren bezüglich der Kopienzahl von BRY.1 in ihrer genomischen DNA zeigte (es wurden eine ungefähr 20fache Schwankung der Intensität beobachtet, was eine Schwankungsbreite um das 20fache zwischen miteinander nicht verwandten männlichen Tieren bezüglich der Kopienzahl von BRY.1 in ihrem Genom nahelegt).
Blindversuch mit Kälber-DNA:
Weitere Blutproben wurden von einer Anzahl von Kälbern (mit den vorher beschriebenen Tieren nicht verwandt) für den Einsatz in einem Blindversuch gewonnen. 20 41 einer jeden Blutprobe wurden in 0,4M NaOH, 20 mM EDTA verdünnt, 20 min lang auf 100ºC erhitzt und zweimal in Serie verdünnt. Die drei Verdünnungen (jeweils 0,5 ml mit einem Gehalt von 10, 5 und 2,5 41 Blut) wurden für die oben beschriebenen Dot-Blot- Hybridisierungen verwendet. Die Autoradiographie ermöglichte eine klare Unterscheidung zwischen männlichen und weiblichen Kälbern auf der Basis, daß ausschließlich bei den ersteren Hybridisierung mit pBRY.1 beobachtet wurde.
Schaf-DNA:
Aus den Lebern von zwei männlichen Schafen und einem weiblichen Schafisolierte DNA-Proben wurden einer vergleichbaren alkalischen Dot-Blot- und Southernblot- Hybridisierungsanalyse unterworfen. Es wurde gefunden, daß das Plasmid BRY.1 mit der DNA beider männlichen Schafe hybridisierte, jedoch nicht mit der des weiblichen Schafs.
Diese Daten zeigen, daß die in das Plasamid pBRY.1 einklonierte Sequenz bei Rindern und Schafen spezifisch für das männlichen Geschlecht ist und deshalb ein Bestandteil des (geschlechtsbestimmenden) Y-Chromosoms in diesen Spezies ist.

BEISPIEL 3

Sequenzanalyse für BRY.1:
Der Einschub im Plasmid pBRY.1 wurde durch Verdauen mit den Restriktionsendonukleasen BamHI und HindIII herausgeschnitten. Der Einschub (ungefähr 300 Bp) wurde durch Elektrophorese des Verdauungsprodukts in Agarose mit niedriger Schmelztemperatur (LMT) (Marine Colloids "Sea-Plaque") und anschließendem Ausschneiden eines Agarosestückes mit der Bande der insertierten DNA gereinigt und durch ultraviolette Bestrahlung und anschließender Ethidiumbromid-Anfärbung wie oben beschrieben sichtbar gemacht. DNA wurde durch 10minütiges Schmelzen der Agarose bei 65ºC aus dem Gelstück isoliert, zweimal mit redestilliertem Phenol extrahiert. Anschließend wurde die Lösung unter wiederholten Butanolextraktionen aufkonzentriert, worauf die DNA mit Ammoniumacetat/Ethanol ausgefällt wurde (Verfahren wie oben beschrieben).
Der gewonnene Einschub wurde in die Plasmidvektoren pTZ18u und pTZ19u (bio-Rad), die durch Verdauen mit den Restriktionsendonukleasen BamHI und HindIII und anschließendes Behandeln mit alkalischer Phosphatase (wie oben beschrieben) hergestellt worden waren, ligiert. Proben der Ligationsreaktionsmischung wurden verwendet, um den E. coli Stamm JPA101 (der wie oben beschrieben durch CaCl2-Behandlung kompetent gemacht worden war) zu transformierten, worauf die Zellen auf 2YT-Agar/Ampicillin ausplattiert und über Nacht bei 37ºC inkubiert wurden. Diejenigen Kolonien, die die gesuchten rekombinanten Plasmide enthielten, wurden durch Restriktionsenzym-Analyse, Elektrophorese, alkalisches Southernblotting und Hybridisierung (oben beschrieben) identifiziert.
Einzelne Kolonien eines jeden der beiden rekombinanten Plasmidtypen wurden verwendet, um 5 ml Kulturen von 2YT- Medium/Ampicillin (50 ug/ml) zu beimpfen. Die Bakterien wurden mit dem Bakteriophagen M13, Stamm K07 (25 ul der Phagenstammlösung mit 108 pfu (plaquebildenden Einheiten)) infiziert und 1 h lang bei 37ºC inkubiert. Kanamycin wurde zugegeben (70 ug/ml), worauf die Inkubation unter kräftiger Belüftung über Nacht bei 37ºC fortgesetzt wurde. Dann wurden die Kulturen zentrifugiert. Die Überstände wurden abgetrennt und mit Ribonuklease A (5 ug/ml) 30 min lang bei 37ºC behandelt. Verpackte einzelsträngige Plasmid-DNA wurde durch Zugabe von 0,3 ml Polyethylenglycol (PEG) 6 000 (Kock-Light) in 2,5M NaCl ausgefällt. Nach gründlichem Mischen und 15minütigem Stehenlassen bei Raumtemperatur wurden die Niederschläge durch Zentrifugation gewonnen und die Überstände vollständig entfernt. Die Pellets wurden in 0,1 ml TE resuspendiert und kurz zentrifugiert, um teilchenförmiges Material zu entfernen, dann mit Phenol extrahiert, worauf die DNA wie oben beschrieben durch Ausfällung aus Natriumacetat/Ethanol isoliert wurde. Die gespülten und getrockneten Pellets wurden als Matrizen für Didesoxy- Sequenzierungsreaktionen nach Sanger (20) verwendet.
Die komplementären Sequenzen von BRY.1, die aus dem sequenzierten Einschub in beiden Richtungen bestimmt wurden (erhalten aus den "komplementären" Rekombinanten in pTZ18u und pTZ19u), stimmten vollständig überein und lieferten die in Fig. 1 dargestellte Sequenz.
Die Nukleotidsequenz der Fig. 1 ist im gebräuchlichen einbuchstabigen Code angegeben, wobei die einzelnen Desoxyribonukleotide mit den folgenden Buchstaben bezeichnet werden: C = Desoxycytidin-5'-phosphat, G = Desoxyguanosin-5'- phosphat, T = Desoxythymidin-5'-phosphat, A = Desoxyadenosin- 5 '-phosphat.
Fig. 2 zeigt die doppelsträngige mRNA-Sequenz, die der DNA-Sequenz der Fig. 1 entspricht.

LITERATURHINWEISE

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Claims

1. Nukleinsäureisolat geeignet zur ausschließlichen Hybridisierung von Y-Chromosomspezifischen DNA-Sequenzen von Rindern, Schafen und Ziegen, wobei dieses Isolat einen oder beide Stränge des BRY.1 oder irgendeinen zusammenhängenden Teil davon mit 12 oder mehr Nukleotiden umfaßt, wobei es eine Sequenz wie weiter unten dargestellt (BRY.1 Genomsequenz und entsprechende RNA-Sequenz) oder eine Variante davon aufweist, die geeignet ist, mit der BRY.1 Nukleotidsequenz zu hybridisieren.

2. Nukleinsäureisolat nach Anspruch 1 enthaltend RNA entsprechend einem oder beiden Strängen des BRY. 1 oder irgend eines zusammenhängenden Teils von 12 oder mehr Nukleotiden des BRY.1.

3. Nukleinsäureisolat nach Anspruch 1 oder 2, das mit einer detektierbaren Markierung gekennzeichnet ist.

4. Nukleinsäureisolat nach Anspruch 3, in welchem die detektierbare Markierung aus 32pP, 14C, 3H 125I, Biotin oder Bromdeoxyuridine ausgewählt ist.

5. Replikationsvektor mit einem Nukleinsäureisolat mit BRY.1 oder irgendeinem zusammenhängenden Teil davon mit 12 oder mehr Nukleotiden.

6. Verfahren zur Bestimmung der Geschlechtschromosomzusammensetzung einer Gewebe- oder Zellenprobe und damit des Geschlechts der Probe mit folgenden Schritten: Isolieren der DNA von der Gewebe- oder Zellenprobe, Immobilisieren der isolierten DNA auf einer Trägermatrix, Hybridisieren der immobilisierten DNA mit einem Nukleinsäureisolat gemäß Anspruch 3 unter Bedingungen, die dem Nukleinsäureisolat ermöglichen an komplementäre Sequenzen zu binden, Auswaschen von ungebundenem Nukleinsäureisolat aus der Trägermatrix und anschließend Detektieren von Nukleinsäureisolat, das an an der Trägermatrix gebundene DNA gebunden ist.

7. Verfahren zur Bestimmung des Vorhandenseins oder des Nichtvorhandenseins von Y-Chromosomen in fixierten Zellen oder Metaphasenchromosomfortpflanzungen mit folgenden Schritten: Xybridisieren der fixierten Zellen oder Metaphasenchromosomen mit Nukleinsäureisolaten gemäß Anspruch 3 unter Bedingungen, die es dem Nukleinsäureisolat ermöglichen, zwei komplementäre Sequenzen zu binden, Auswaschen von nicht gebundenem Nukleinsäureisolat und Feststellen der Bindung des Nukleinsäureisolates an den fixierten Zellen oder Metaphasenchromosomen.

8. Verfahren zur Feststellung der Geschlechtschromosomkonstitution einer Gewebe- oder Zellenprobe mitfolgenden Schritten: Isolieren der DNA von der Gewebe- oder Zellenprobe und Dencittirieren der isolierten DNA zur Trennung der entsprechenden kodierenden und nicht kodierenden Stränge, Behandeln der danaturierten DNA mit einem synthetischen Oligonukleotid entsprechend den 12 oder mehr Nukleotiden des BRY.1, Inkubieren der behandelten DNA mit DNA-Polymerase um das Polynukleotid durch die BRY.1 DNA Sequenz auszudehnen, wenn sie in der Gewebe- oder Zellenprobe vorhanden ist, Wiederholen dieser Schritte so häufig, wie es gewünscht ist, um die BRY.1-Level zu verstärken und anschließendes Detektieren der BRy.1 DNA-Sequenz an in der vergrößerten Probe durch eines der folgenden Verfahren:

a) Immobilisieren der vermehrten DNA auf der Trägermatrix, Hybridisieren der immobilisierten DNA mit dem Nukleinsäureisolat nach Anspruch 3 unter Bedingungen, die es dem Nukleinsäureisolat ermöglichen, komplementäre Sequenzen zu binden, Auswaschen des ungebundenen Nukleinsäureisolates aus der Trägermatrix und anschließendes Detektieren der Bindung des Nukleinsäureisolates mit der DNA, die auf der Trägermatrix gebunden ist oder

b) wo gekennzeichnete Nukleotidvorstufen bei der Inkubation mit DNA-Polymerase eingeschlossen sind, Fraktionieren der Probe durch Elektrophorese in einer Gelmatrix und Detektieren der gekennzeichnet BRY.1 DNA Sequenzen.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 6 bis 8, in welchem die Gewebe- oder Zellenprobe von einem Embryo, einem Fötus, Sperma oder Spermafraktionen erhalten ist.

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 6 bis 9, in welchem das Nukleinsäureisolat mit einer detektierbaren Markierung gekennzeichnet ist.

11. Verfahren nach Anspruch 10, in welchem die detektierbare Markierung ausgewählt ist aus 32P, 14C, 3H, 125i, Biotin und Bromdioxyuridin,

12. Reagenzsatz zur Festellung dem Vorhandensein- oder Nichtvorhandenseins von Y-Chromosomspezifischen Sequenzen in einer Gewebe- oder Zellenprobe mit einem Nukleinsureisolat nach einem der Ansprüche 1 bis 4,

13. Reagenzsatz nach Anspruch 12, der zusätzlich Puffer für die Verdünnung der Reagentien enthält.

14. Verfahren zur Isolierung der Y-Chromosomspezifischen DNA mit folgenden Schritten:

(I) Behandeln einer Einzelstrang-Rinder-Genom-DNA, die von männlichen oder weiblichen Tieren stammt;

(II) Isolieren der behandelten DNA und Einsetzen derselben in einen replizierbaren Expressionsvektor;

(III) Übertragen der Wirtszellen mit dem replizierbaren Expressionsvektor, der die behandelte DNA enthält;

(IV) Hybridisieren der transformierten Wirtszellen mit einer gekennzeichneten DNA-Probe, die von einer weiblichen Wiederkäuer-Genom-DNA stammt und Identifizieren derjeniger Wirtszellen, die Rinder-Genom-DNA enthalten, die sich nicht an die gekennzeichnete Probe binden und

(V) anschließendes Isolieren der nicht hybridisierten Y-chromosomspezifischen DNA.