DE3783081T2

DE3783081T2 - Verfahren zur herstellung von bernsteinsaeure durch anaerobe fermentation.

Info

Publication number: DE3783081T2
Application number: DE8787107569T
Authority: DE
Inventors: Rathin Datta; Christopher J Lemme
Original assignee: Michigan Biotechnology Institute
Current assignee: Michigan Biotechnology Institute
Priority date: 1986-06-11
Filing date: 1987-05-25
Publication date: 1993-04-15
Anticipated expiration: 2007-05-26
Also published as: FI872580A; JPH0738795B2; CA1339017C; DK295287D0; EP0249773A3; EP0249773B1; DE3783081D1; EP0249773A2; FI872580A0; JPS62294090A; ES2036188T3; US5143833A; DK295287A

Description

Die Erfindung betrifft ein verbessertes Verfahren zur Herstellung von Bernsteinsäure durch einen Fermentationsprozeß, der in der Gegenwart von Kohlendioxid durchgeführt wird.
Bernsteinsäure und ihre Derivate finden als spezielle Chemikalien für Anwendungen in Lebensmitteln, Arzneimitteln und Kosmetika weitverbreitet Verwendung. Außerdem ist Bernsteinsäure ein wertvolles Zwischenprodukt mit vier Kohlenstoffatomen, das für die Herstellung von 1,4-Butandiol, Tetrahydrofuran und gamma-Butyrolacton nützlich ist.
Obwohl das Succination ein gewöhnliches Zwischenprodukt im metabolischen Stoffwechsel vieler Organismen ist, gibt es keine Beispiele für eine Fermentation, die Succinat in großen Mengen oder mit hohen Ausbeuten produziert. Beispielsweise ist Succinat ein Schiüssel-Zwischenprodukt für anaerobe Fermentationen durch Propionat- produzierende Bakterien, aber es wird lediglich in geringen Ausbeuten und geringen Konzentrationen produziert.
Succinat wird auch von anaeroben Rumen-Bakterien produziert. Diese Bakterien umfassen Bacteroides ruminicola (im folgenden B. ruminicola), deren Züchtung und Metabolismus von Howlett et al., Applied Environ. Microbiol., 32, 274-283 (1976) beschrieben wird, und Bacteroides amylophilus (im folgenden B. amylophilus), dessen Kultivierung und Züchtung von Caldwell et al., J. Bacteriol., 98, 668-676 (1969) und von Hamlin et al., J. Bacteriol., 72, 548-554 (1956) beschrieben wird.
Obwohl die Rumen-Bakterien höhere Ausbeuten an Succinat ergeben als die Propionat- produzierenden Bakterien, wurden die berichteten Fermentationen in sehr verdünnten Lösungen duchgeführt und ergaben eine Vielzahl von Produkten in im allgemeinen geringen Ausbeuten. Außerdem neigen die Rumen-Organismen nach einer vergleichsweise kurzen Fermentationszeit zur Lyse, was dadurch zu unstabilen Fermentationen führt.
Anderson und Ordal isolierten 1961 einen fakultativen Anaerobier, Cytophaga succinicans, der Succinat, Acetat und Formiat aus Dextrose mit Fixierung von Kohlendioxid produziert, J. Bact., 81, 139 (1961). Dieser Organismus produzierte jedoch Succinat in derart geringen Konzentrationen, daß es wirtschaftlich nicht durchführbar wäre, Bernsteinsäure aus dem Fermentationsmedium zu gewinnen. Ähnliche Ergebnisse wurden mit Bacteroides fragilis beobachtet, der aus dem Gastrointestinaltrakt erhalten wurde, Caspari et al., Arch. Microbiol., 135, 16-24 (1983).
Es wurde nun ein Verfahren zur anaeroben Fermentation von Kohlenhydraten zu Succinat mit hohen Ausbeuten und mit hoher Produktivität gefunden. Außerdem wird das Succinat in dem Fermentationsmedium in ausreichend hoher Konzentration produziert, um die wirtschaftliche Gewinnung von Bernsteinsäure zu gestatten.
Nach der Erfindung wird ein verbessertes Fermentationsverfahren zur Herstellung von Bernsteinsäure in hoher Ausbeute durch Fermentation von Kohlenhydraten mit einem Succinat-produzierenden Bakterium bereitgestellt. Das verbesserte Verfahren umfaßt das Ausführen der Fermentation in einem wäßrigen Fermentationsmedium, das von dem Bakterium assimilierbare Kohlenhydrate enthält, für das Wachstum des Bakteriums erforderliche Nährstoffe und gelöstes Kohlendioxid, wobei die anlängliche Kohlenhydrat- Konzentration in dem Medium zwischen etwa 20 g/l und etwa 100 g/l liegt und der pH des Mediums während der Fermentation zwischen etwa 5,8 und 6,8 gehalten wird.
Das Fermentationsverfahren der Erfindung ist mit der Fermentation von Kohlenhydraten durch ein Succinat-produzierendes Bakterium unter Bildung von Bernsteinsäure und geringeren Mengen anderer Stoffe verbunden. Im allgemeinen kann jeder Bakterienstamm eingesetzt werden, der in erster Linie Succinat bildet. Ein zur Durchführung der Erfindung geeigneter Stamm ist der Stamm Anaerobiospirillum succiniciproducens (im folgenden A. succiniciproducens), der ursprünglich als ATCC 29305 bei der American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, hinterlegt wurde. Er wurde nach den Bestimmungen des Budapester Vertrages als ATCC 53488 neu hinterlegt und ist frei zugänglich.
Das Verfahren der Erfindung wurde auch unter Verwendung von Stämmen von Rumen- Bakterien, B. amylophilus und B. ruminicola, durchgeführt. Obwohl die mit diesen Mikroorganismen erhaltenen Ausbeuten an Succinat geringer waren als die unter Verwendung von A. succiniciproducens erhaltenen, ist klar, daß das Verfahren mit einer Anzahl von Succinat-produzierenden Bakterien durchgeführt werden kann.
Bei dem zur Durchführung der Erfindung verwendeten Kohlenhydrat kann es sich um jedes Kohlenhydrat handeln, das von dem verwendeten Bakterienstamm fermentiert wird. Für A. succiniciproducens umfassen diese Kohlenhydratquellen Dextrose, Sucrose, Fructose, Lactose, lösliche Stärken und Maissirupe. Die Fermentation wird in einem wäßrigen Medium durchgeführt, das gelöstes Kohlendioxid enthält. Nährstoffe und andere Wachstumsfaktoren, die für das Wachstum und die Reproduktion der eingesetzten Mikroorganismen benötigt werden, sind dem Medium auch beigefügt.
Die Kohlenhydrat-Konzentration in dem Medium liegt zwischen etwa 20 g/l und etwa 100 g/l, vorzugsweise zwischen etwa 40 g/l und etwa 80 g/l. Kohlenhydrat- Konzentrationen über etwa 100 g/l ergeben Lösungen mit derart hohen osmotischen Drücken, daß die Organismen nicht wachsen. Obwohl die Organismen in Lösungen wachsen werden, die weniger als 20 g Kohlenlhydrat pro Liter enthalten, ist die Konzentration an Produkt so gering, daß seine Gewinnung nicht praktikabel ist.
Das Kohlendioxid kann dem Fermentationsmedium auf verschiedene Weise zugeführt werden. Das Medium kann mit CO&sub2;-Gas durchperlt werden. Die Fermentation kann in einem unter Druck stehenden Reaktor durchgeführt werden, der Kohlendioxid unter Atmosphärenüberdruck enthält. Das CO&sub2; kann mit anderen Gasen gemischt werden, solange die eingesetzten Gase das Wachstum und den Metabolismus des verwendeten Organismus nicht stören. Kohlendioxid kann dem Fermentationsmedium auch durch Zugabe von Carbonat oder Bicarbonat zugeführt werden, die dieses Gas unter den Fermentationsbedingungen erzeugen.
Um eine gute Succinat-Produktion zu erhalten, wird der pH des Mediums im Bereich von etwa 5,8 bis etwa 6,8 gehalten. Bei höheren pH-Werten ist das Hauptprodukt Lactat statt Succinat, während bei niedrigeren pH-Werten die Fermentation gehemmt ist. Der pH wird leicht durch die Zugabe von Alkalicarbonaten, Erdalkalihydroxiden oder Gemischen davon aufrechterhalten. Wenn Calciumhydroxid verwendet wird, um den pH aufrechtzuerhalten, wird das gebildete Succinat in schwer lösliches Calciumsuccinat umgewandelt, das aus dem Reaktionsgemisch ausfällt, wodurch die Gewinnung und die weitere Reinigung des Produkts erleichtert wird.
Der Fermentationsprozeß dieser Erfindung wird bei einer Temperatur zwischen etwa 20ºC und etwa 49ºC ausgeführt. Der A. succiniciproducens-Organismus wächst optimal bei etwa 39ºC. Da es sich um einen strikten Anaerobier handelt, werden Fermentationen unter Verwendung dieses Organismus unter anaeroben Bedingungen durchgeführt, und zwar in einem Medium, das mit Hitze oder anderen in der Fermentationstechnik wohlbekannten Mitteln sterilisiert wurde.
Die folgenden Beispiele beschreiben außerdem die Ausführungsformen dieser Erfindung. Alle Teile beziehen sich auf das Gewicht, und alle Prozentsätze beziehen sich auf das Gewicht, sofern nicht anders ausdrücklich angegeben.
Die Produkte der Fermentation wurden unter Verwendung von Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) bestimmt. Die Komponenten wurden chromatographisch durch Elution mit 0,006 H&sub2;SO&sub4; von einem Kationenaustauscherharz in der Wasserstofform analysiert. Die eluierten Komponenten wurden mittels eines Differentialrefraktometers nachgewiesen, auf einem Recorder graphisch dargestellt, und unter Verwendung eines elektronischen Integrators quantifiziert. Die Fläche unter der Kurve, welche die Konzentration jeder Komponente darstellt, wird als Prozentsatz der Gesamtfläche ausgegeben. Bei dem allgemeinen Verfahren handelt es sich um das in "Analysis of Carbohydrate Mixtures by Liquid Chromatographie", Am. Soc. Brew. Chem. Proc., 1973, S. 43-46 angegebenen. Die Trennungen wurden auf einer 1-Fuß HPX-87-Säule in der Wasserstofform durchgeführt, die von den Bio-Rad-Laboratories, Richmond, California erhältlich ist. Das Kohlenhydrat wurde mit einem YSI-Dextrose-Analyzer (Yellow Springs Instrument Company, Yellow Springs, Ohio) unter Verwendung von Standardverfahren bestimmt. Ausgegeben wurden Gramm pro Liter Dextrose.

BEISPIEL 1

A. succiniciproducens, ATCC 53488 (ATCC 29305), wurde unter strikt anaerobischen Bedingungen gezüchtet und gehalten. Die anaeroben Bedingungen wurden durch die Verwendung eines Cystein HCl-Na&sub2;S 9H&sub2;O-Reduktionsmittels und einer anaeroben Schutzkammer, die eine Atmosphäre aus 5 % H&sub2;, 5 % CO&sub2; und 90 % N&sub2; enthielt, bereitgestellt.
Impfkulturen von A. succiniciproducens wurden in einem Medium mit der folgenden Zusammensetzung gezüchtet: Dextrose - 20 g/l, Polypepton - 10 g/l, Hefeextrakt - 5 g/l, K&sub2;HPO&sub4; - 3 g/l, NaCl - 1 g/l, (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4; - 1 g/l, MgCl&sub2;.6H&sub2;O - 0,2 g/l, CaCl&sub2;.2H&sub2;O - 0,2 g/l. Zu 100 ml Hitze-sterilisiertem Medium in einem 125 ml Erlenmeyer-Kolben in einer anaeroben Schutzkammer wurde 1,0 ml 0,03 M Na&sub2;CO&sub3;, gefolgt von 0,15 ml 0,18 M H&sub2;SO&sub4;, gegeben. 0,5 ml einer Lösung des folgenden Reduktionsmittels wurden zugegeben: Cystein HCl - 0,25 g/l, Na&sub2;S 9H&sub2; - 0,25 g/l. Nach 20 Minuten wurden die reduzierten Kolben mit gefrorenen Stammkulturen (-70ºC) von A. succiniciproducens inokuliert. Die Impfkolben wurden über Nacht bei 39ºC inkubiert.
Impfkulturen (50 ml) aus dem Impfkolben wurden verwendet, um 1 Liter Fermentationsmedium in einem Standard 1,4-Liter New Brunswick Bioflo, Modell C-30-Reaktor zu inokulieren. Das Fermentationsmedium hatte die folgende Zusammensetzung (g/l):
Dextrose 50
Polypepton 10
Hefeextrakt 5
K&sub2;HPO&sub4; 1,0
NH&sub4;Cl 0,4
CaCl&sub2; 2H&sub2;O 0,2
MgCl&sub2; 6H&sub2;O 0,2
FeSO&sub4; 7H&sub2;O 1 ppm (als Fe)
Vor der Inokulation wurde das Medium 20 Minuten autoklaviert, 15 psi bei 121ºC. Der Reaktor wurde ohne Rühren gekühlt, und während des Kühlens und der Temperatureinstellung auf 39ºC wurde ein CO&sub2;-Durchperler verwendet (10 ml/min). Zehn Milliliter einer sterilisierten 3 M Na&sub2;CO&sub3;-Lösung wurden zugegeben, gefolgt von 1,5 ml konzentrierter H&sub2;SO&sub4;, um den pH des Reaktors auf 6,8 einzustellen.
Ein 5 ml Aliquot einer Reduktionslösung (Cystein HCl-Na&sub2;S 9H&sub2;O) wurde zugegeben, und der Fermentor wurde vor der Inokulation 20 Minuten mit 200 Minuten&supmin;¹ gerührt.
Die Temperatur wurde bei 39ºC reguliert, das Gemisch wurde mit 200 Minuten&supmin;¹ gerührt, und ein 10 ml/min CO&sub2;-Durchperler wurde während der Fermentation verwendet. Der pH der Fermentation wurde auf 6,4 abfallen gelassen und wurde durch Zugabe einer sterilen 2 M Na&sub2;CO&sub3;-Lösung bei 6,4 gehalten. Die Fermentation mit A. succiniciproducens verlief rasch und führte innerhalb 16 Stunden zu einer hohen Zellpopulation. Zu Beginn (0-24 Stunden) waren die Zellen beweglich, und dann wurden sie gegen Ende unbeweglich. Die Fermentation dauerte 38 Stunden, wobei nach dieser Zeit < 0,5 g/l Dextrose in dem Reaktor verblieben. Während des Verlaufs der Fermentation wurde eine Gesamtmenge von 215 ml 2 M Na&sub2;CO&sub3; zur pH-Regulation zugegeben. Die Fermentationsergebnisse sind in Tabelle I gezeigt. TABELLE 1 Konzentration (Gramm/Liter) Volumen (Liter) Gesamt (Gramm) Dextrose (Anfang) Dextrose (Ende) Produkte (nach 38 Stunden) Succinat Acetat Formiat Lactat
Succinat-Ausbeute = 41.2 g Succinat/46,9 g verbrauchte Dextrose x 100 = 87,8 %

Vergleichsversuch 1

Es wurde dem Verfahren von Beispiel 1 gefolgt, mit der Ausnahme, daß der CO&sub2;- Durchperler durch einen Stickstoffgas-Durchperler ersetzt wurde. Vor der Inokulation wurde der Reaktor mit einem 5 ml Aliquot-Reduktionsmittel, Cystein HCl-Na&sub2;S 9H&sub2;O, reduziert.
Ein 10 ml Aliquot 3 M Na&sub2;CO&sub3;, gefolgt von 1,5 ml konzentrierter H&sub2;SO&sub4;, wurde zu dem Reaktor gegeben. (Die Zugabe von Carbonat war zur Einleitung des Wachstums erforderlich.) Der pH der Fermentation wurde durch die Zugabe von 4 NaOH bei 6,4 reguliert. Die Zellen von A. succiniciproducens schwollen an, und die Fermentation wurde schleppend. Die Fermentation wurde nach 40 Stunden beendet, und die Produkte wurden analysiert. Die in Tabelle II angegebenen Ergebnisse zeigen, daß der Fermentationslauf ohne gelöstes Kohlendioxid sehr wenig Bernsteinsäure und eine Anzahl von Nebenprodukten produziert. TABELLE II Produkte Gramm/Liter Lactat Acetat Formiat Succinat Ethanol Dextrose (Anfang) Dextrose (Ende) Nettoverbrauch
Succinat-Ausbeute =
Lactat-Ausbeute =

BEISPIEL 2

Das allgemeine Verfahren von Beispiel 1 wurde wie folgt modifiziert. Das Eisensalz wurde aus dem Medium entfernt und 0,5 g/l NaCl wurden zugegeben.
Die CO&sub2;-Durchperlung wurde nach der Inokulation abgestellt; so war die einzige CO&sub2;- Quelle bei der Fermentation das 3 M Na&sub2;CO&sub3;, das zur pH-Steuerung zugegeben wurde.
Der pH wurde auf pH 6,4 ± 01 gehalten. Diese Fermentation, ohne einen CO&sub2;-Durchperler, begann nicht so rasch wie die Fermentation, die mit einem CO&sub2;-Durchperler durchgeführt wurde. Die Analyse der Produkte nach einer 40 Stunden Fermentation sind in Tabelle III angegeben. TABELLE III Konzentration (Gramm/Liter) Volumen (Liter) Gesamt (Gramm) Dextrose (Anfang) Dextrose (Ende) Nettoverbrauch Produkte (nach 40 Stunden) Succinat Acetat Formiat Lactat
Succinat-Ausbeute =

BEISPIEL 3

Es wurden drei Fermentationen unter Verwendung des allgemeinen Verfahrens von Beispiel 2 durchgeführt, mit der Ausnahme, daß die pHs dieser Fermentationen bei 5,9 ± 0,1; 6,8 ± 0,1 bzw. 7,2 ± 0,1 reguliert waren. Die Ergebnisse dieser Experimente sind in Tabelle IV angegeben. Wenn die Fermentation bei pH 5,5 ± 0,1 durchgeführt wurde, war die Fermentation sehr langsam, und es wurde eine sehr geringe Konzentration an Succinat produziert.
Zusammen mit den Ergebnissen von Beispiel 2 zeigen diese Ergebnisse, daß die Produktion von Succinat am besten in einem Medium verläuft, in dem der pH zwischen etwa 5,8 und etwa 6,8, vorzugsweise zwischen etwa 5,8 und etwa 6,5, gehalten wird. TABELLE IV Dextrose (Anfang) Dextrose (Ende) Fermentationszeit (Std) Produkte Succinat Acetat Formiat Lactat Succinat-Ausbeute (%) Lactat-Ausbeute (%) a) Vergleichstest - kein Beispiel der Erfindung

BEISPIEL 4

Es wurde dem allgemeinen Verfahren von Beispiel 1 gefolgt, mit der Ausnahme, daß der pH durch die Zugabe einer 25%igen Aufschlämmung von Ca(OH)&sub2; in Wasser bei 6,4 gehalten wurde und die Fermentationstemperatur 37ºC betrug.
Die Fermentation verlief viel rascher als die Fermentation von Beispiel 1, bei der der pH durch Zugabe von Na&sub2;CO&sub3;-Lösung beibehalten wurde. 21 Stunden nach dem Start kam es zu einer plötzlichen Verfestigung des Reaktorinhalts. Der Feststoff wurde abgetrennt und der Gehalt sowohl des Feststoffs als auch der Lösung wurde analysiert. Etwa 99 % der Dextrose wurden verbraucht. Die Ausbeute an Produkten ist in Tabelle V angegeben. Diese Ergebnisse zeigen, daß die Produktion von Bernsteinsäure rasch beginnt, wenn die Fermentation in Gegenwart von Calciumionen durchgeführt wird, und zeigen, daß die Säure als schwerlösliches Calciumsalz vom Fermentationsmedium abgetrennt werden kann. Da Calciumsuccinatmonohydrat bei höheren Temperaturen weniger löslich ist, kann mehr Produkt aus der Fermentationsbrühe durch deren Erhitzen auf 80 bis 90ºC und Gewinnen des sich ergebenden Niederschlags gewonnen werden. TABELLE V als Lösung (Gramm) als Feststoff (Gramm) Gesamt (Gramm) Produkt-Ausbeute a) Succinat Acetat Formiat a) Ausbeute, bezogen auf verbrauchtes Kohlenhydrat: Succinat - 80 % Acetat - 22 % Formiat - 2 %

BEISPIEL 5

Es wurde dem allgemeinen Verfahren von Beispiel 1 gefolgt, und zwar unter Verwendung eines Stammes von Rumen-Bakterien, B. amylophilus (erhältlich von der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen, Grisebachstraße 8, 34 Göttingen, Bundesrepublik Deutschland, DSM 1361), unter Verwendung des folgenden Mediums, in dem alle Konzentrationen auf Gramm pro Liter bezogen sind, wenn nicht anders angegeben:
K&sub2;HPO&sub4; 0,9
KH&sub2;PO&sub4; 0,9
NaCl 1,8
(NH&sub4;)&sub2;SO&sub4; 1,8
CaCl&sub2; 2H&sub2;O 0,18
MgSO&sub4; 7H&sub2;O 0,4
FeSO&sub4; 7H&sub2;O 2 ppm (als Fe)
Maltose H&sub2;O 50
Resazurin 1ml
Cystein HCl Na&sub2;S 9H&sub2;O 5 ml
Die Zugabe von Maltose war erforderlich weil B. amylophilus Glucose nicht verwerten kann. Die Fermentation verlief sehr rasch und war innerhalb 21 Stunden beendet. Nach 12 Stunden begannen die Zellen von B. amylophilus zu lysieren, was durch einen Abfall in der optischen Dichte und der Zellmasse bei der Fermentation angezeigt wurde. Die Analyse der in Tabelle VI angegebenen Produkte zeigt, daß dieser Stamm von Rumen- Bakterien die Bernsteinsäure unter den Bedingungen dieser Erfindung produziert. TABELLE VI Produkte (nach 21 Stunden) Gramm/Liter Succinat Acetat Formiat Dextrose (Anfang) Dextrose (Ende) Nettoverbrauch
Succinatausbeute =

BEISPIEL 6

Es wurde dem allgemeinen Verfahren von Beispiel 1 gefolgt, mit der Ausnahme, daß es sich bei dem verwendeten Mikroorganismus um einen Stamm von Rumen-Bakterien, B. ruminicola handelte, der von der American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, als ATCC 19188 erhältlich ist. Die in Tabelle VII angegebenen Ergebnisse zeigen, daß dieser Stamm von Rumen-Bakterien, wie der von Beispiel 4, ebenfalls Bernsteinsäure nach dem Verfahren dieser Erfindung produziert. Die Succinat-Ausbeuten, die mit diesen Bakterien unter Verwendung des Verfahrens dieser Erfindung erhalten wurden, sind viel höher als die Ausbeuten, die mit diesen Bakterien mit vorbeschriebenen Verfahren erhalten wurden. Die Succinat-Ausbeuten mit Rumen-Bakterien sind jedoch geringer als die mit A. succiniciproducens erhaltenen. TABELLE VII Produkte (nach 62 Stunden) Gramm/Liter Succinat Acetat Formiat Lactat
Succinatausbeute = 18.9 g Succinat/31,7 g verbrauchte Dextrose x 100 = 59,5 %

BEISPIEL 7

Es wurde eine Reihe von Fermentationen in 160 ml Serumflaschen unter Verwendung von 25 ml eines Fermentationsmediums, ähnlich zu dem von Beispiel 1, durchgeführt. Die Dextrose-Konzentration betrug 38,2 g/l und das Fermentationsmedium enthielt auch 30 g/l MgCO&sub3;. Der pH des Mediums wurde auf 6,8 eingestellt, und der Kopfraum in den Flaschen wurde mit Kohlendioxid mit unterschiedlichen Drücken gefüllt. Nach 44 Stunden wurde der Druck in den Gefäßen gemessen, und der Gehalt des wäßrigen Mediums wurde analysiert. In jedem Kolben betrug die Ausbeute an Lactat etwa 5 % und die Ausbeute an Acetat etwa 23 %. Die Ausbeuten an Succinat bei verschiedenen Drücken sind in Tabelle VIII angegeben. Sie demonstrieren, daß die Ausbeute an Succinat in dem Ausmaß steigt, wie der Druck des Kohlendioxid-Gases im Gleichgewicht mit der Fermentation über Atmosphärendruck ansteigt. TABELLE VIII Enddruck (atm.) Succinat-Ausbeute (%)a) a) wie in Beispiel 1 berechnet.
Somit ist klar, daß nach der Erfindung ein verbessertes Fermentationsverfahren zur Herstellung von Bernsteinsäure bereitgestellt wird. Obwohl die Erfindung in Verbindung mit konkreten Ausführungsformen davon beschrieben wurde, ist klar, daß viele Alternativen, Modifikationen und Variationen dem Fachmann angesichts der vorstehenden Beschreibung ersichtlich sind. Folglich sind alle derartigen Alternativen, Modifikationen und Variationen im Erfindungsgedanken enthalten und vom Schutzumfang der beigefügten Patentansprüche umfaßt.

Claims

1. Fermentationsverfahren zur Herstellung von Bernsteinsäure in hoher Ausbeute, bei dem ein Kohlenhydrat mit einem Succinat-produzierenden Bakterium in einem wäßrigen Fermentationsmedium fermentiert wird, das von dem Bakterium assimilierbare Kohlenhydrate enthält, andere für das Wachstum des Bakteriums erforderliche Nährstoffe und gelöstes Kohlendioxid, wobei die anfängliche Kohlenhydrat-Konzentration in dem Medium zwischen etwa 20 g/l und etwa 100 g/l liegt und der pH des Mediums während der Fermentation zwischen etwa 5,8 und 6,8 gehalten wird und wobei ausreichend Calciumionen dem Fermentationsmedium zugefügt werden, um einen Niederschlag von Calciumsuccinat zu ergeben, der dann von dem Fermentationsmedium abgetrennt wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem die Calciumionen in Form von Calciumhydroxid dem Fermentationsmedium zugefügt werden.

3. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die anfängliche Konzentration an Kohlenhydrat in dem Medium zwischen etwa 40 g/l und etwa 80 g/l liegt.

4. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Fermentationsmedium während des Fermentationsprozesses von Kohlendioxid durchperlt wird.

5. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Fermentationsmedium sich mit Kohlendioxid-Gas oberhalb Atmosphärendruck im Gleichgewicht befindet.

6. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Fermentation als kontinuierliches Verfahren durchgeführt wird.