DE3781017T2 - Cytotoxische zusammensetzung aus "killer"-zellen. - Google Patents

Description

• Die kontinuierliche Ausdehnung neuer Instrumente, Versuchsanordnungen, Techniken und Reagentien hat es den Molekularbiologen und Immunologen ermöglicht, neue Fragen bezüglich der ungeklärten physiologischen Prozesse zu stellen und in vielen Situationen einige Einsichten in die Komponenten des Prozesses und die Art, in der die Komponenten operieren, zu gewinnen. Wichtig für die Existenz aller Wirbeltiere ist ihre Fähigkeit, sich selbst gegen Krankheitserreger (Pathogene) zu verteidigen. Bei Säugetieren wird das Immunsystem unterteilt in eine Reihe von unterschiedlichen Wegen, von denen jeder unterschiedliche Verteidigungsmechanismen, unterschiedliche Komponenten und unterschiedliche Regelungsarten umfaßt.
• Die Killerzellen, von denen es viele Unterarten gibt, sind beschränkt oder unbeschränkt in der Lage, Zellen abzutöten, die von den normalen Zellen des Wirtes unterschieden werden können. Diese Zellen können entstehen aus einer viralen Transfektion oder Transduktion, einer neoplastischen Transformation oder einer Transplantation von einem allogenen Wirt, wobei das transplantierte Gewebe oder Organ ein oder mehr unterschiedliche Haupt-Gewebeverträglichkeits (MHC)-Oberflächenantigene der Klasse I oder Neben-Gewebeverträglichkeits-Oberflächenantigene aus dem Wirt hat.
• Es besteht ein beträchtliches Interesse daran, die natürlichen physiologischen Prozesse verstehen und beeinflussen zu können. Im Falle der Transplantation würde die Fähigkeit, die Abstoßung des Transplantats zu hemmen, den Erfolg der Transplantation stark verbessern und möglicherweise eine breitere Disparität zwischen den MHC-Antigenen des Spenders und des Empfängers erlauben. Das Verständnis der Prozesse, nach denen Killerzellen andere Zellen auswählen und zerstören, trägt dazu bei, Autoimmun-Erkrankungen zu verstehen und erlaubt es, den Individuen zu helfen, die ein Defizit an Immunabwehr aufweisen.
• Es besteht daher ein beträchtliches Interesse daran, in der Lage zu sein, die Strukturgene, die mit den Strukturgenen verbundenen Regulationsbereiche und die Expressionsprodukte der Strukturgene, die mit den verschiedenen Immunmechanismen assoziiert sind, insbesondere bei Menschen, identifizieren zu können. Ein Weg, der einen signifikanten vorteilhaften Effekt auf die Diagnose und die Therapie hätte, wäre der, über die Gene und Komponenten des Killerzellen-Lysisverfahrens verfügen zu können.
Beschreibung der relevanten Literatur
• Die von Killerzellen und ihren Zytoplasma-Granula freigesetzten Polypeptide wurden dem lytischen Ereignis der Killerzellen-Lysis-Mechanismen zugeordnet, wie z . B. Polypeptide einschließlich der Serinproteasen, toxische Lymphokine und porenbildende Polyperphorine (Henkart et al., "J. Exp. Med." (1984) 160 : 75; Podack und Konigsberg, ibid (1984) 160 : 695; Podack, "Immunology Today" (1985), 6 : 21; Henkart, "Ann. Rev. Immunol." (1985), 3 : 31; Martz, "Immunology Today" (1984), 5(9) :254. Es konnte die Hemmung der CTL- oder NK-vermittelten Targetzellenlysis durch Serinprotease-Inhibitoren mit niedrigem und hohem Molekulargewicht demonstriert werden (Wright und Bonavida in "Natural Killer Activity and Its Regulation" (Ausgabe T. Hoshinu et al) Excerpta Medica, Amsterdam, S. 145 (1984) und die darin angezogenen Literaturstellen). Hatcher in "J. Immunol." (1978), 120 : 665 isolierte eine cytotoxische Serinprotease aus nicht-stimulierten Human-Peripherblut- Lymphozyten mit einem ungefähren Molekulargewicht von 30 kB. Pasternak und Eisen, "Nature" (London) (1985), 314 : 743 berichteten über eine Trypsin-artige Serinprotease von 28kD, die für CTL-Zellen spezifisch ist. Marks, "Science" (1986), 231 : 1367, beschreibt allgemeine Theorien, welche die durch Zellen vermittelte Zytotoxizität betreffen. Vergleiche auch US-Patentanmeldung Nr. 860 085, eingereicht am 6. Mai 1986, in der über eine Maus-Killerzellen-Protease berichtet wird.
Zusammenfassung der Erfindung
• Es wurden neue DNA-Sequenzen geschaffen, die codieren für Human-Serinproteasen, die dadurch charakterisiert sind, daß sie von aktivierten Killerzellen gebildet werden, ein Molekulargewicht in dem Bereich von etwa 20 bis 30 kD aufweisen und "Ladungsübertragungs"-Reste mit einem aktiven Zentrum (Stelle) besitzen, die analog zu anderen Serinproteasen sind. Die erfindungsgemäße Human-Serinprotease verleiht in Kombination mit anderen Komponenten einer Killerzelle eine zytolytische Aktivität.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
• Die Figur stellt eine DNA-Sequenz dar, die einen Vergleich zwischen der Aminosäuresequenz der erfindungsgemäßen Human-Protease und einer Maus-Killerzellen-Protease zeigt.
Beschreibung der spezifischen Ausführungsformen
• Es werden neue Zusammensetzungen und Verfahren geschaffen, die sich auf neue Serinproteasen beziehen, die von Human- Killerzellen gebildet werden, wobei die Zusammensetzungen umfassen Nucleinsäure-Sequenzen, die codieren für biologisch aktive Fragmente der Serinproteasen, die Serinproteasen und Vorläufer der Serinproteasen. Andere Zusammensetzungen umfassen Nucleinsäure-Sequenzen, die mit anderen Nucleinsäure-Sequenzen verbunden sind für die Klonierung und Expression solcher Sequenzen. Dazu gehören auch Poly(aminosäure)-Zusammensetzungen, die enthalten ein biologisch aktives Fragment der Serinproteasen, die Serinproteasen, Vorläufer der Serinproteasen und Konjugate aus den verschiedenen Poly(aminosäuren) mit anderen Resten (Molekülen) für eine Vielzahl von Verwendungszwecken.
• Die den Gegenstand der Erfindung bildenden Human-Serinproteasen sind dadurch charakterisiert, daß sie in verschiedenen Unterarten von Human-Killerzellen gefunden werden, daß sie jedoch in anderen Arten von Zellen in wesentlich niedrigeren Mengen vorliegen oder fehlen. Die erfindungsgemäße Serinprotease ist ferner dadurch charakterisiert, daß sie ein Polypeptid-Molekulargewicht in dem Bereich von etwa 20 bis 30 kD, vorzugsweise in dem Bereich von etwa 23 bis 28 kD und insbesondere in dem Bereich von etwa 25 bis 26 kD hat. Die Serinprotease ist außerdem dadurch charakterisiert, daß sie ein aktives Zentrum der "Ladungsübertragung" mit einem ähnlichen Abstand (Zwischenraum) und einer ähnlichen Konformation wie Chymotrypsin hat, die nämlich Histidin, Aspartat und Serin in einem Abstand aufweist, wie er ungefähr bei Chymotrypsin festzustellen ist, und welche das für Trypsin spezifische Aspartat in etwa der gleichen Position wie Trypsin aufweist. Unter dem Abstand ist hier die Anzahl der dazwischen liegenden Aminosäuren zu verstehen. Insbesondere der His-Asp-Abstand beträgt etwa 41 bis 47 Aminosäuren, speziell 44 Aminosäuren, und der Asp-Ser-Abstand beträgt etwa 94 bis 100 Aminosäuren, speziell 97 Aminosäuren. Die erfindungsgemäße Serinprotease weist einen Asp-Rest aus etwa 3 bis 8 Aminosäuren, insbesondere 6 Aminosäuren auf in Richtung auf den N-Terminus ab dem 5er-Rest, ähnlich wie Trypsin. Die Serinprotease ist ferner dadurch charakterisiert, daß sie Teil des lytischen Prozesses von Killerzellen ist.
• Die in der Natur vorkommenden erfindungsgemäßen Serinproteasen sind in einer Reihe von Unterarten von Killerzellen, wie z. B. Killer-T-Zellen, zytotoxischen T-Lymphozyten (CTL), einigen T-Helferzellen, NK/NC-Zellen, K-Zellen (die Antikörper verwenden zum Aufspüren einer Fremd-Zelle) und mit Lymphokine aktivierten Killerzellen (LAK-Zellen), zu finden. Die Expression der Serinprotease läßt ein "Aktivierungsgen" vermuten, das in Beziehung steht zu einem Lysis-Mechanismus.
• Die erfindungsgemäßen Serinproteasen sind beteiligt an einem System, das divalente Kationen und Energiequellen erfordert und das anspricht auf die Inhibierung durch Serinprotease-Inhibitoren mit niedrigem und hohem Molekulargewicht, wie z. B. α-2-Makroglobulin und einen Sojabohnen- Trypsin-Inhibitor.
• Die erfindungsgemäßen Serinproteasen sind nicht zu finden in signifikanten Mengen in Zellen, wie normalen Muskelzellen, Leberzellen, unstimulierten Peripherblut-Lymphozytenzellen und Thymuszellen sowie in einer Reihe von B-Zellen-Tumorzellinien.
• In der Figur ist die Aminosäure-Sequenz angegeben im Vergleich zu den Aminosäure-Sequenzen einer Maus-Killerzellen-Protease. Die Aminosäure-Homologie innerhalb des aktiven Enzym-Abschnitts des Proteins beträgt 71 % bei einer Homologie von 77 % in dem DNA-Bereich innerhalb der entsprechenden Region. Die Gesamt-DNA-Homologie beträgt 72 %, wenn der vollständige Codierungsbereich und der 3'- untranslatierte Bereich eingeschlossen sind. Ein Pfeil zeigt die Schnittstelle an, die das aktive Enzym bildet. Die Aminosäuren des Ladungsübertragungs-Systems His&sup4;¹ Asp&sup8;&sup6; und Ser¹&sup8;&sup4; sind jeweils mit einem Stern markiert. Der saure Rest Asp¹&sup7;&sup8;, der mit einem $ markiert ist, bestimmt die Substrat-Spezifität für Lys oder Arg. Die AATAAA-Polyadenylierungs-Konsensus-Sequenz ist in dem 3'- nicht-codierenden Bereich unterstrichen. Die Asn-gebundene Kohlenhydrat-Stelle, die bei Asn¹&sup4;² auftritt, ist durch ein Plus-Zeichen markiert.
• Die Aminosäuren können durch konservative Änderungen substituiert werden, wobei die nicht-konservativen Änderungen im allgemeinen beschränkt sind auf die Positionen, die aus der aktiven Stelle entfernt wurden. Zu den Gruppen von Aminosäuren, die sich gegenseitig ersetzen können, gehören G,A; V,I,L; S,T,M; D,E; K,R; N,Q; und F,W,T,H.
• Von besonderem Interesse ist der Aminosäure-Bereich von der Aminosäure 30 bis zur Aminosäure 70, insbesondere von der Aminosäure 40 bis zur Aminosäure 60. Von Interesse ist auch der Bereich von der Aminosäure 90 bis zur Aminosäure 120, insbesondere von der Aminosäure 100 bis zur Aminosäure 110. Von weiterem Interesse ist die Aminosäuresequenz von etwa 190 bis 250, vorzugsweise von etwa 200 bis 240, insbesondere von etwa 220 bis etwa 240. Von weiterem Interesse ist eine konservierte Aminosäure-Sequenz von mindestens etwa 10 Aminosäuren, in der Regel von mindestens etwa 12 Aminosäuren, und von nicht mehr als etwa 30 Aminosäuren, in der Regel von nicht mehr als etwa 20 Aminosäuren, die in den obengenannten Fragmenten enthalten sind.
• Peptide, die aus Aminosäuren aus diesen interessierenden Bereichen bestehen, sind verwendbar für die Herstellung von Antikörpern, die binden und in Wechselwirkung treten mit dem aktiven Zentrum des Enzyms.
• Die Nucleotid-Sequenz, entweder die DNA- oder die RNA-Sequenz, insbesondere die DNA-Sequenz, die für die erfindungsgemäßen Serinproteasen oder ihre aktiven Fragmente codiert, kann auf die verschiedenste Weise verwendet werden. Fragmente der Serinproteasen können als Sonden für die Bestimmung der Anwesenheit von nicht-mutierten oder mutierten Serinproteasen, die in Säugetierzellen vorhanden sind, verwendet werden. Alternativ können die Sequenzen verwendet werden für die Expression von Aminosäure-Sequenzen mit einer biologischen Aktivität oder von verlängerten Fragmenten mit einer enzymatischen Aktivität, die innerhalb der in der Figur angegebenen Sequenz liegen. Auf diese Weise können die verschiedenen Sequenzen in Kombination mit anderen DNA-Sequenzen verwendet werden zur Erzielung von Konstrukts zum Klonieren oder die Expression der angezeigten DNA-Sequenzen. Die codierende Sequenz wird somit mit anderen flankierenden Bereichen als den natürlichen flankierenden Bereichen vereinigt. Die Sequenz, die für die Serinprotease codiert, besteht aus weniger als 5 knt (Kilonucleotiden), in der Regel weniger als etwa 2 knt. Für die Expression werden die DNA-Sequenzen mit den Regulationsbereichen und anderen funktionellen Bereichen, die von den natürlichen Bereichen verschieden sind, vereinigt zur Herstellung der gewünschten Poly(aminosäuren), die umfassen Oligopeptide von etwa 8 bis 30 Aminosäuren, insbesondere etwa 10 bis 20 Aminosäuren, oder Polypeptide von mindestens etwa 30 Aminosäuren bis etwa 235 Aminosäuren, in der Regel nicht mehr als etwa 233 Aminosäuren, insbesondere nicht mehr als etwa 232 Aminosäuren, die für die gesamte in der Natur vorkommende Serinprotease codieren können.
• Die DNA-Konstrukts in Richtung der Transkription enthalten in der Regel einen Transkriptions-Initiierungs-Bereich, wobei der offene Leseraster beginnt mit dem Initiierungs- Codon (Met) und dem gewünschten Peptid, woran sich der Transkriptions-Terminierungsbereich anschließt. Die Transkriptions-Initiierungs- und -Terminierungs-Bereiche werden so gewählt, daß sie in dem Expressions-Wirt funktionell sind, der prokaryotisch oder eukaryotisch sein kann, einschließlich solcher Wirte wie Bakterien, z. B. E. coli, Fungi, wie Hefe, z. B. Saccharomyces, Kluveromyces, fadenformigen Fungi, wie Neurospora, Aspergillus und dgl., Seidenwurm-Zellen, Säugetierzellen, wie Goldhamster-Ovarienzellen, Hamster-Nierenzellen und dgl. Für die Klonierung und Expression sind einzellige Organismen von besonderem Interesse.
• Zusätzlich zu dem Expressions-Konstrukt können ein oder mehr Marker vorhanden sein, welche die Selektion der das Expressions-Konstrukt enthaltenden Wirte erlauben. Marker können Strukturgene enthalten, die zur Expression in den Wirt fähig sind, die zu einer Antibiotika-Resistenz, einer Komplementierung, zu einer Plaque-Bildung oder dgl. führen.
• Wo eine extrachromosomale Aufrechterhaltung erwünscht ist, ist ein Ursprung eines Replikationssystems vorgesehen, der die extrachromosomale Aufrechterhaltung des Expressions- Konstrukts in dem Wirt erlaubt. Das extrachromosomale Replikationssystem kann abgeleitet sein von Plasmiden, Viren, Chromosomen (zentromeren und autonomen Replikationssystemen) und dgl. In einigen Fällen kann das Expressions-Konstrukt in die Transposone eingeführt werden für die Integration in das Wirtsgenom. Die das Expressions-Konstrukt enthaltenden Zellen werden in einem geeigneten Nährmedium gezüchtet und in Abhängigkeit davon, ob das Produkt ausgeschieden wird, können die Zellen lysiert werden und das Produkt kann auf konventionellem Wege isoliert werden oder die überstehende Flüssigkeit kann isoliert und das Produkt extrahiert werden.
• Die erfindungsgemäßen Peptide können für eine große Vielzahl von Verwendungszwecken eingesetzt werden. Die erfindungsgemäßen Peptide können zur Herstellung von polyklonalen oder monoklonalen Antikörpern verwendet werden. Wenn nur ein Fragment der erfindungsgemäßen Serinproteasen verwendet wird, kann das Fragment mit einem Immunogen vereinigt werden zur Bildung eines immunogenen Produkts für die Injektion in ein Wirbeltier zur Bildung von Antikörpern.
• Das immunogene Protein ist gegenüber dem gewünschten Wirt fremd und ein solches, gegenüber dem polyklonale Antikörper angetroffen werden können oder nicht. Die Immunogene sind in der Regel größer als 30 kD.
• Die Vereinigung von Hapten- oder Antigen-Peptiden zu einem größeren Polypeptid ist auf diesem Gebiet an sich bekannt und es stehen eine Vielzahl von verbindenden Gruppen zur Verfügung, wie z. B. Formaldehyd, Glutaraldehyd, Maleimidobenzoesäure, Methyldithioessigsäure, Ellman-Reagens oder dgl. Die spezielle Art und Weise, in der das Polypeptid-Fragment der erfindungsgemäßen Serinproteasen mit dem immunogenen Protein verbunden wird, ist für die Erfindung nicht kritisch. Zu geeigneten immunogenen Proteinen gehören Rinderserumalbumin, Tetanustoxoid, Keyhole-Limpert-Hämocyanin, Rinder-β-globulin und dgl.
• Zu den verschiedenen Wirten, denen das Immunogen injiziert werden kann, gehören Mäuse, Ratten, Vögel, Hamster oder andere Säugetiere, beispielsweise Primaten wie Menschen. Die Art der Injektion und der Herstellung von polyklonalen oder monoklonalen Antikörpern ist in der Literatur ausführlich beschrieben und braucht im Detail hier nicht mehr beschrieben zu werden. In der Regel wird das Immunogen in eine oder mehr Stellen des Wirts in Volumina von etwa 0,5 bis 5 ml mit einer immunisierend wirkenden Menge injiziert, die ausreicht für die Erzeugung eines Hämagglutinations-Titers in dem Bereich von etwa 1 : 32 bis 1 : 256, wobei eine oder mehr Injektionen in Zeitabständen von etwa 2 bis 4 Wochen angewendet werden können. Kurz nach der letzten Injektion kann Blut aus dem Wirt entnommen werden und die Immunoglobuline können isoliert werden.
• Für polyklonale Antikörper können die Immunoglobuline auf einer Vielzahl von Wegen, insbesondere durch Affinititäschromatographie, gereinigt werden. Für monoklonale Antikörper können Milzzellen entnommen und mit syngenischen Myelomzellen fusioniert werden zur Herstellung von Hybridomen, die einem Screen-Test unterworfen werden können zur Herstellung von Antikörpern, die für die gewünschte epitopische Stelle spezifisch sind.
• Die Antikörper können neutralisierend oder nicht-neutralisierend sein, je nach ihrem Effekt auf die Aktivität des Enzyms, Zweck oder Ergebnis der Komplexbildung und dgl.
• Die Antikörper gegen die erfindungsgemäßen Serinproteasen können sowohl in vivo als auch in vitro Verwendung finden. Für die Verwendung in vivo können die Antikörper für therapeutische Zwecke für die passive Immunisierung verwendet werden zur Inhibierung von Immunstörungen, zur Inhibierung einer Transplantat-Abstoßung und zur Modulierung des Immunsystems. In vitro können die Antikörper verwendet werden für diagnostische Zwecke, zur Bestimmung der Art der Zellpopulation, zur Bestimmung pathologischer Schädigungen, zur Bestimmung der Abstoßung von Organtransplantaten und zur Bestimmung des Differenzierungszustandes verschiedener Zellen.
• Die erfindungsgemäßen Human-Serinproteasen und ihre Fragmente können selbst oder in Kombination mit anderen Materialien als Markierungsmittel in diagnostischen Versuchen verwendet werden. Außerdem können die Serinproteasen zur Entfernung spezieller Zelltypen aus einer heterogenen Population von Zellen verwendet werden. So können beispielsweise Serinprotease-enthaltende Zellen aus dem Knochenmark oder aus anderen Zellgemischen entfernt werden, in denen Zellen der lytischen Kaskade unterliegen, oder anderen Inhibitorprodukten von NK- oder CTL-Zellen.
• Je nach Art und Weise, in der die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen verwendet werden sollen, können sie auf die verschiedenste Weise formuliert werden, wobei sie formuliert werden in wäßrigen Medien, wie z. B. wäßrigen gepufferten Medien, wie Phosphat-gepufferter Salzlösungen, Tris-gepufferten Lösungen oder dgl., in denen die Konzentrationen von etwa 0,05 mM bis etwa 5 mM variieren können. Es können auch andere Additive vorhanden sein, wie z. B. Proteinstabilisatoren, inerte Proteine, Bakteriostaten und Bakteriozide und dgl. Die spezielle Formulierung wird gewählt in Abhängigkeit vom jeweiligen Verwendungszweck.
• Die Formulierungen können zusätzliche Vertreter des lytischen Mechanismus für die Zytotoxizität umfassen, wie z. B. die Vorläufer der Polyperphorine, Aktivatoren für die erfindungsgemäße Protease, Substrate für die erfindungsgemäße Protease und dgl. So können einige oder alle der Komponenten der sekretorischen Granula der Killerzellen in roher Form isoliert und in Kombination mit der erfindungsgemäßen Serinprotease in im wesentlichen reiner Form verwendet werden. In der Regel kann die erfindungsgemäße Serinprotease mit mindestens 90 % ihrer nativen Aktivität, vorzugsweise mindestens etwa 95 % ihrer nativen Aktivität, versehen sein.
• Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen können auf die verschiedenste Weise verwendet werden. Aus Fragmenten der Serinprotease oder aus der gesamten Protease können Antikörper hergestellt werden, die eine Neutralisation der enzymatischen Funktion der Serinprotease bewirken können. Außerdem kann die Serinprotease dazu dienen, Suizid-Substrate, natürliche Protease-Inhibitoren, Substrat-Übergangszustands-Analoga oder andere Inhibitoren, zu identifizieren, die dazu dienen können, das;aktive Zentrum von HF-Genprodukten in Säugetieren zu neutralisieren, um so zytotoxische Zellfunktionen zu blockieren.
• Die Fähigkeit, die Serinprotease zu inhibieren, kann nützlich sein bei der Behandlung der Transplantat-Abstoßung, bei der Behandlung von Immunstörungen, bei denen die Funktion der Killerzellen zu einem pathologischen Zustand führt, und bei der Diagnose von pathologischen Schädigungen, bei denen die Anzahl, der Typ oder die Aktivität der Killerzellen als wichtiges pathognomisches Anzeichen dienen kann.
• Die Serinproteasen können für die Entwicklung von markierten Substraten, wie z. B. mit Fluorescein oder Umbelliferin markierten Substraten verwendet werden zur Reinigung von Killerzellen und natürlichen Killerzellen, die in der Therapie verwendet werden können, vor der Expansion für die anschließende Reinfusion oder bei Autoimmunstörungen zur Entfernung von Zellen durch Plasmaphorese. Außerdem können durch Herstellung von Antikörpern gegenüber dem Zymogen- Peptid oder der Kombination aus dem Zymogen-Peptid und der aktiven Serinprotease die Antikörper als diagnostisches Mittel zur Bestimmung der Häufigkeit der Blutzellen oder Gewebezellen dienen, die in der Killerzelle gebunden sind. Ferner kann die Serinprotease selbst oder in Kombination mit den anderen Vertretern des zytolytischen Prozesses der T-Zellen einschließlich der Komponenten der ausgeschiedenen Granula für die Lysis von Zellen in vitro und in vivo verwendet werden, wodurch sie ein starkes biologisches Reinigungsverfahren ermöglicht. Die Human-Serinprotease kann auch dazu dienen, Übergangszustands-Analoga und andere Protease-Inhibitoren mit niedrigem Molekulargewicht zu identifizieren, die vorzugsweise spezifisch sind für das aktive Zentrum dieses Enzyms, wodurch Moleküle identifiziert werden, die T-Zellen und/oder die NK-Zytotoxizität inhibieren können.
• Die folgenden Beispiele dienen der Erläuterung der Erfindung, ohne sie jedoch zu beschränken.
Beispiel
• Eine cDNA-Phagen-Bibliothek wurde hergestellt aus Human- Peripherblut-Lymphozyten (PBL) nach 4-tägiger Stimulierung mit Phytohämagglutinin (PHA). Diese cDNA-Bibliothek wurde in λgt10 hergestellt durch Modifizieren eines cDNA-Verfahrens, wie es von Huynh in "DNA Cloning Techniques: A Practical Approach" (Ausgabe D. Glover) IRL PRESS, Oxford (1984), beschrieben ist. Die beiden Modifikationen waren (1) der Ersatz aller Phenol-Chloroform-Extraktionen durch eine Spermin-Fällung, wie von Hoops et al in "Nucl. Acid Res." (1981) 9 : 5493, beschrieben, und (2) der Ersatz der Biogel A-50m Säule durch eine 1 bis 2 % Agarose-Horizontalgel-Elektrophorese zum Zwecke der Entfernung der überschüssigen EcoRI-Linker und der Größenfraktionierung der ds cDNA. Die ds cDNAs wurden größenselektioniert anfänglich für Längen von größer als 0,5 kb und anschließend für Längen von größer als 0,95 kb. Die selektionierten Agarose-Stücke wurden in Dialyse-Beuteln elektroeluiert (Smith, "Methods in Enzymology" (1980) 65 : 371) und Spermin-präzipitiert.
• Alle RNAs für die cDNA-Bibliotheken, die Northern- und die S1-Analyse wurden hergestellt durch Guanidiniumthiocyanat- Extraktion (Chirgwin et al., "Biochem." (1979) 18 : 5294) und polyA-selektioniert mit Oligo-dT-Cellulose.
• 2·10&sup5; rekombinante Phagen-Plaques der PHA-stimulierten PBL cDNA-Bibliothek wurden mit der Maus-Serinprotease cDNA einem Screening unterworfen. Es wurde eine Sonde hergestellt durch Nick-Translation, wie von Meinkoth und Wahl, supra, beschrieben und die cDNA-Bibliotheken wurden in einer Dichte von etwa 50 000 pfu/150 cm Platte ausplattiert, wie von Hunyh et al, supra, bechrieben. Ein Phage wurde ausgesucht und durch zwei zusätzliche Runden der Hybridisierung erneut einem Screening unterworfen, wobei man einen Plaque-gereinigten Klon erhielt. Der gereinigte λ-Phage enthielt ein 1,3 Kilobasen (kb) EcoRI cDNA-Insert, das codierte für das Human-Äquivalent des Maus-Serinprotease HF- Gens (als HuHF bezeichnet). Durch Northern-Analyse wurde diese cDNA hybridisiert zu 1,3 kb polyA-RNA-Species, die in Human-CTL-Zellen vorhanden sind, die in einer 4-Tagealloreaktiven-Misch-Lymphozytenkultur und in Jurkat-Tumorzellen gebildet werden. Mit der Northern-Analyse wurde die RNA in normalem Human-Muskel-, Leber-, Tonsillen- oder Lymphoid-Gewebe nicht nachgewiesen. Außerdem konnte keine RNA in den folgenden Tumoren nachgewiesen werden: KB-Zelle (ein Nasenrachenraum-Carcinom), RPMI 4265 und NA (B-Zellen-Tumoren) und SS II (T-zelle). Aus RNA-Punktblot-Experimenten war die RNA in drei Human-CTL-Alloreaktiv-Klonierungs-Linien nachweisbar (AI5.1, AMSB.3, AMW.6), in nichtstimuliertem, Zellen-sortiertem Leu 11+ NK und Leu 11- Leu 4+ T Zellen-großen Granula-Lymphozyten (LGL) aus PBL.
• Die Nucleotid-Sequenz wurde in beiden Strängen vollständig bestimmt mit Ausnahme der fünf ersten von 400 Nucleotiden, wobei man ein einziges offenes Leseraster erhielt (vgl. Fig. 1). In der Fig. 1 stimmen die Nucleotid-Sequenz und die Aminosäure-Translation der Human-cDNA mit der Maus-Sequenz überein. Die Aminosäure-Sequenz ist ab dem vorgegebenen Amino-Terminus des putativen aktiven Zentrums fortlaufend numeriert. Ein Pfeil zeigt eine putative Schnittstelle an, die das vorgegebene aktive Zentrum ergibt auf der Basis der Homologie-Ausrichtungen. Die Aminosäuren des Ladungsübertragungssystems His&sup4;¹, Asp&sup8;&sup6; und Ser¹&sup8;&sup4; sind jeweils mit einem Stern markiert. Der saure Rest Asp¹&sup7;&sup8;, der mit einem $ markiert ist, legt die Substrat-Spezifität fest durch Analogie mit anderen Serinproteasen. Die AATAAA-Polyadenylierungs-Konsensus-Sequenz ist in dem 3'- nicht-codierenden Bereich unterstrichen. Ein potentielles Asn-gebundenes Kohlenwasserstoff-Zentrum tritt bei Asn¹&sup4;² auf, das durch + markiert ist.
• Durch die Proteinsequenz-Homologie codiert die DNA-Sequenz für eine aktive Serinprotease von 234 Aminosäuren mit einem nicht-glycosylierten Polypeptid-Molekulargewicht von etwa 25,8 kD. Dem aktiven Enzym geht vermutlich ein Zymogen-Peptid voraus durch Analogie mit anderen Serinproteasen, wobei C-terminal geschnitten wird zu Lys (-1). Die Aminosäuren des katalytischen Serinprotease-Ladungsübertragungs-Mechanismus werden konserviert, wobei His und Asp durch 44 Aminosäuren und Asp und Ser durch 97 Aminosäuren voneinander getrennt sind, verglichen mit einer Trennung in Chymotrypsin durch 44 bzw. 92 Aminosäuren. Die HF-Serinprotease enthält einen Asp¹&sup7;&sup8;-Rest der äquivalent dem Asp¹&sup8;&sup9; von Trypsin ist, was eine Trypsin-artige Substratspezifität vermuten läßt.
• Die Aminosäure-Zusammensetzung ist in der Tabelle 1 für die ungeschnittene Protease und das geschnittene aktive Protein angegeben. Tabelle 1 Vollständiges HuHF-Protein Das ungeschnittene Protein enthält 262 Aminosäuren: sauer basisch aromatisch hydrophob Molekulargewicht Aktives HuHF-Protein Grenzen: Das geschnittene Protein enthält 234 Aminosäuren: sauer basisch aromatisch hydrophob Molekulargewicht
• Das geschnittene aktive Human-HF-Protein hat 71 % seiner Aminosäuren gemeinsam mit seinem Maus-Homologen. Dies spiegelt sich wieder in einer 77 %igen DNA-Ähnlichkeit. Die gesamte DNA-Ähnlichkeit beträgt 72 %, wenn der vollständige Codierungsbereich und der 3'-nicht-translatierte Bereich eingeschlossen sind.
• Alle Publikationen und Patentanmeldungen, die in dieser Beschreibung genannt sind, weisen hin auf den Stand des Wissens des Fachmannes auf diesem Gebiet, auf das sich die vorliegende Erfindung bezieht. Alle Publikationen und Patentanmeldungen sind hier einbezogen in dem gleichen Umfang als ob jede einzelne Publikation oder Patentanmeldung spezifisch und individuell als solche bezeichnet wäre, auf die hier Bezug genommen wird.
• Obgleich die vorstehende Erfindung im Detail beschrieben wurde anhand einer Erläuterung und eines Beispiels zum Zwecke der Erleichterung des Verständnisses, ist es für den Fachmann offensichtlich, daß auch bestimmte Änderungen und Modifikationen vorgenommen werden können.

Claims (9)

1. Human-Serin-Protease oder biologisch funktionelles Fragment davon, die (das) im wesentlichen frei von Killerzellkern-Komponenten ist, wobei die Serin-Protease dadurch gekennzeichnet ist, daß sie eine Aminosäuresequenz aufweist, die zu mindestens 90 % konserviert ist in bezug auf die Aminosäuresequenz der Human-Serin-Protease, wie sie in der Figur angegeben ist, daß sie ein Molekulargewicht in dem Bereich von etwa 20 bis 30 kD aufweist und daß sie in der Lage ist, einen Teil der cytolytischen T-Zellen mit einer cytolytischen Aktivität darzustellen.

2. Human-Serin-Protease nach Anspruch 1, wie sie in cytotoxischen T-Zellen zu finden ist.

3. DNA-Sequenz, die codiert eine Serin-Protease oder ein biologisch funktionelles Fragment davon nach Anspruch 1, die verbunden ist mit einem anderen als einem natürlichen Flankierungsbereich.

4. DNA-Sequenz nach Anspruch 3, die am 5'-Terminus verbunden ist mit einem anderen Transkriptions-Initiierungsbereich als dem natürlichen Transkriptions-Initiierungsbereich.

5. DNA-Sequenz nach Anspruch 4, die an ihren 3'-Terminus verbunden ist mit einem Transkriptions-Terminierungsbereich, wobei der Transkriptions-Initiierungsbereich und der Transkriptions-Terminierungsbereich funktionell in einer Wirtszelle sind.

6. Antikörper-Zusammensetzung, die spezifisch ist für eine Serin-Protease oder ein biologisch funktionelles Fragment davon nach einem der vorhergehenden Ansprüche.

7. Antikörper-Zusammensetzung nach Anspruch 6, worin die Antikörper-Zusammensetzung monoclonal. ist.

8. Verfahren zur Herstellung einer Serin-Protease oder eines biologisch funktionellen Fragments davon, das umfaßt

das Züchten (Wachsenlassen) von Zellen, die eine DNA-Sequenz nach Anspruch 5 enthalten, wodurch diese DNA exprimiert wird, und

das Isolieren der Serin-Protease oder eines biologisch funktionellen Fragments davon, die (das) frei von Zellbruchstücken ist.

9. Verfahren zur Identifizierung von Molekülen, welche die T-Zellen- oder NK-Cytotoxizität inhibieren können, das umfaßt

das Kontaktieren des Moleküls mit der Human-Serin-Protease nach einem der Ansprüche 1 bis 7 und

das Messen der Protease-Aktivität, relativ zur Aktivität in Abwesenheit des Moleküls.