DE3614359C2 - Vorrichtung zur Analyse und bildlichen Darstellung des bei einer punktweisen Anregung eines Präparates durch Laserlicht entstehenden zeitlichen Intensitätsverlaufes der Fluoreszenzstrahlung - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung zur Analyse und bildlichen Darstellung des bei einer punktweisen Anregung eines Präparates durch Laserlicht entstehenden zeitlichen Intensitätsverlaufes der Fluoreszenzstrahlung gemäß Patentanspruch 1.

Die Erfindung kann zur bildlichen Darstellung und Analyse von Fluo­ reszenzsignalen, insbesondere des Abklingverhaltens solcher Signale, angewandt werden, die z. B. bei der Erforschung der Bindung von Farb­ stoffen an Substanzen in biologischen Zellen benutzt werden.

Einrichtungen zur Fluoreszenzanalyse von Mikroobjekten, bei denen das gesamte Objekt vom Erregerstrahlungsstrom andauernd getroffen wird, sind bekannt. Dabei wird mittels der vom Objekt ausgehenden Fluoreszenzstrahlung ein Bild der Objektstruktur entworfen, das üblicherweise mit Okularen betrachtet oder auch fotometrisch unter­ sucht werden kann. Diese Lösungen haben den Nachteil, daß die Fluor­ eszenzintensität während der Untersuchung nachläßt und nacheinan­ der gemessene Werte nicht unmittelbar vergleichbar sind. Es besteht keine Möglichkeit einer Kurzzeitanalyse des Fluoreszenzvorganges (Beyer, H., Handbuch der Mikroskopie, Berlin, 1977). Eine Kurzzeit­ analyse ist notwendig, wenn die zu untersuchenden Objekte eine Fluoreszenzstrahlung abgeben, die sich durch wellenlängendispersive Mittel nicht ausreichend von der Fluoreszenzstrahlung der Umgebung trennen läßt, wie in DE 28 18 841 C2 beschrieben.

Bekannt sind weiter Einrichtungen zur Kurzzeitfluoreszenzanalyse kleinster Objektstellen, bei denen ein äußerst kurzer Lichtimpuls durch ein Mikroobjektiv auf die Probe fokussiert und der von der be­ strahlten Objektstelle ausgehende Fluoreszenzimpuls mittels schnel­ ler lichtelektrischer Empfänger in seinem zeitlichen Verlauf regi­ striert und anschließend grafisch dargestellt und/oder mathematisch analysiert wird, wie in Docchio, F., et al., Journal of Microscopy, 134, 1984, Seiten 151-160 beschrieben. Diese Einrichtungen sind frei von sog. fa­ ding und bieten die Möglichkeit zeitaufgelöster Fluorometrie. Durch wiederholte Anwendung ist es mit den genannten Einrichtungen zwar prinzipiell möglich, einen Überblick über die räumliche Verteilung von Substanzen mit zeitlich verschiedener Fluoreszenzantwort zu er­ halten, aber nur mit großem Zeitaufwand.

Zur Behebung dieser Schwierigkeit wird in DE 30 37 983 C2 vorge­ schlagen, ein Empfängerdiodenarray in der Abtastrichtung in der Bildebene eines Scanning-Mikroskopes zu verwenden. Das gewährleistet wiederum nur eine geringe Zeitauflösung und kann nur bei relativ langsam abklingender Fluoreszenz eingesetzt werden, demnach nicht bei den meisten wichtigen Eigenfluoreszenzen biologischer Zellen oder sonstigen üblichen Fluorochromen.

Die Signalverarbeitung erfolgt im Takt der Abtastung, was die Zeitauflösung und erreichbare Genauigkeit einschränkt.

In DE 25 37 098 A1 ist die Unterscheidung zwischen zwei fluoreszierenden Teilchenarten mit unterschiedlichen Fluoreszenzabklingdauern beschrieben.

DE 26 28 158 A1 betrifft die Fluoreszenzspektroskopie mit einer markierten Targetsubstanz.

In DE 32 06 407 A1 erfolgt eine zeitauflösende Photonenzählung, wobei die Anregung und die Photonenzählung synchronisiert sind.

Auch in DD 205 522 erfolgt eine Synchronisation des Meßvorganges mit der Impulsfolge eingestrahlten Laserlichtes bei der Messung der Lumineszenzabklingfunktion mittels Photonenzählung, wobei nur solche Photonen verarbeitet werden, die in einem bestimmten Zeitintervall liegen, das durch das Synchronisationssignal bestimmt wird.

Durch die Kopplung von Anregung und Erfassung der Fluoreszenzstrahlung entstehen wiederum Nachteile bezüglich der Zeitauflösung und Genauigkeit der Erfassung. Die in US 4 284 897 beschriebene Lösung schränkt das fading zwar weitgehend ein, enthält aber keine Mittel zur zeitlichen Analyse des Fluoreszenzvorganges.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, eine Vorrichtung zur quanti­ tativen Fluorometrie anzugeben, mit der es möglich ist, Bilder der räumlichen Verteilung des Fluoreszenzabklingverhaltens in Mikroob­ jekten im ns-Bereich zu erzeugen und eine Darstellungsform für die räumliche Verteilung dieses Abklingverhaltens zu schaffen, die eine schnelle Gewinnung der Bilder erlaubt und bestimmte Objektdetails auf Grund der charakteristischen Impulse hervorhebt oder stetige Änderungen der Impulse in Abhängigkeit vom Ort eindeutig interpre­ tierbar dargestellt werden.

Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß durch eine Vorrichtung mit den Merkmalen des Patentanspruchs 1 gelöst. Vorteilhafte Ausgestaltungen sind in den Unteransprüchen angegeben.

Der von einem Laser ausgehende Impuls anregender Strahlung wird durch ein Objektiv auf die Probe fokussiert und diese Pro­ be mittels geeigneter Mittel, z. B. gemäß einem Raster, verschoben. Das von dem bestrahlten Ort der Probe ausgehende Fluo­ reszenzlicht wird durch eine schnell reagierende fotoelektrische Einrichtung registriert, wobei diese Einrichtung elektronische Tor­ schaltungen, Koinzidenzeinrichtungen oder eine Streak-Kamera ent­ halten kann, mit denen der gesamte Fluoreszenzimpuls oder bestimmte, zeitlich begrenzte Teile davon, weiterverarbeitet werden und die genannten Teile durch Wahl der Zeitpunkte ihres Beginns und Endes festgelegt werden können.

Weiterhin werden die Energie des Fluoreszenzimpulses oder eines oder mehrerer der erwähnten Teile oder davon abgeleitete Kenngrößen als Zahlenwerte oder geeignete physikalische Größen in Speicherelemen­ ten gespeichert, die dem bestrahlten Fleck der Probe zugeordnet sind, und daß der so beschriebene Ablauf der Messung für eine Schar Punkte des zu untersuchenden Objektfeldes, z. B. gemäß einem Raster, wiederholt werden kann, so daß schließlich die bildliche Darstel­ lung bestimmter zeitlicher Fluoreszenzunterschiede des Probenfeldes möglich wird.

Die erwähnten, zeitlich begrenzten Fluoreszenzimpulsanteile werden so gewählt und/oder mit arithmetischen und/oder logischen Operato­ ren derart verknüpft, daß auf der bildlichen Darstellung Objekt­ punkte mit speziellem Abklingverhalten ihrer Fluoreszenz hervorge­ hoben werden, wobei eine spezielle Art der genannten Verknüpfung darin bestehen kann, daß die Energiewerte der Fluoreszenzimpulse bzw. der Teile davon zur Steuerung der Grundfarben eines Farbmoni­ tors genutzt werden können.

Durch mehrfache Wiederholung des Gesamtvorganges und fortlaufende Mittelung der Werte in den Speicherelementen wird das Signal-Rausch- Verhältnis günstig beeinflußt.

Die Erfindung soll anhand von Zeichnungen näher erläutert werden. Es zeigt

Fig. 1 den schematischen Aufbau der Vorrichtung,

Fig. 2 den Verlauf von Erreger- und Fluoreszenzimpuls.

In Fig. 1 sendet ein Laser 1 eine Folge von kurzen Lichtimpulsen aus, deren Wellenlänge zur Fluoreszenzanregung in Objekten des Präparates 17 geeignet ist. Die Impulse passieren eine Anpassungsoptik 2 und ge­ langen durch den Strahlteiler 6, das Filter 4 und die Anpassungsoptik 5, den Strahlteiler 7 und das Mikroskopobjektiv 8 auf das Präparat 17, das sich in der Brennebene des Mikroskopobjektives 8 befindet. Von der getroffenen Objektstelle des Präparates 17 werden entspre­ chende Fluoreszenzimpulse ausgesandt, die nach dem Mikroskopobjektiv 8 den Strahlteiler 7, eine Optikkombination 16 und ein Filter 15 durchsetzen und auf einen schnell reagierenden Strahlungsempfänger 10 treffen. Die ausgelösten elektrischen Impulse am Strahlungsempfänger 10 werden einem Impulsanalysator 11 zugeführt. Außerdem erhält der Impulsanalysator 11 noch elektrische Impulse von der schnellen Foto­ diode 3, die vom Strahlteiler 6 einen Teil jedes Anregungsimpulses empfängt.

Durch Bedienelemente am Impulsanalysator 11, durch den Computer 19 mit seinem Bedienpult 12 und die Zähl- und Steuereinheit 18 kann der Impulsanalysator 11 auf verschiedene Betriebsarten eingestellt wer­ den, die es gestatten, entweder die Energie des gesamten Fluoreszenz­ impulses oder die Energie eines oder mehrerer Zeitabschnitte dieses Impulses weiterzuverarbeiten. Beginn und Ende des jeweiligen Impuls­ teiles ist durch einstellbare Zeitintervalle, die vom Eintreffen des elektrischen Impulses von der Fotodiode 3 bis zum gewünschten Zeit­ punkt verstreichen, wählbar.

Der Impulsanalysator 11 kann auch so eingestellt werden, daß die weiterzuverarbeitenden Energieanteile, die einer wählbaren, stets gleichen Anzahl aufeinanderfolgender Anregungsimpulse entsprechen, vor der Weiterverarbeitung gemittelt werden.

Die zu einem Präparat-Pixel gehörenden gemittelten oder ungemittel­ ten Fluoreszenzenergieanteile werden als Zahlenwerte in einem oder mehreren Elementen des Speichers 13 abgesetzt, das bzw. die dem Pixel zugeordnet sind. Je nach dem gewählten Arbeitsregime wird stets dann mittels der vom Computer 19 gesteuerten Präparatever­ schiebungseinrichtung 9 das Präparat 17 um einen Schritt verschoben, wenn von einem Pixel ein oder eine stets gleiche Anzahl von aufein­ anderfolgenden Fluoreszenzimpulsen ausgewertet wurde.

Die Größe und Richtung der vom Präparat 17 auszuführenden Schritte ist durch den Computer 19 beliebig steuerbar und erfolgt vorteilhaft nach einem Raster. So wird das gesamte gewünschte Objektfeld des Präparates 17 ausgewertet und die entsprechenden Fluoreszenzenergie­ werte im Speicher 13 abgesetzt.

Parallel zu oder anschließend an diesen Vorgang wird der Inhalt des Speichers 13 auf dem Display 14 bildlich dargestellt. Dabei erlaubt es die Arbeitsweise des Impulsanalysators 11, des Computers 19, des Speichers 13 und des Displays 14, daß wahlweise ein Bild des unter­ suchten Präparateteils gemäß der Gesamtenergie der Fluoreszenzim­ pulse oder gemäß der zeitlichen Energieanteile oder gemäß mathema­ tischer Verknüpfungen derselben dargestellt werden kann. Insbeson­ dere können die Energieanteile oder deren Verknüpfungen auf dem Display 14 zur Pseudocolorierung des Bildes verwendet werden.

In Fig. 2 ist ein möglicher Fall des Verlaufes von Erregerimpuls 20, der durch den elektrischen Impuls von der Fotodiode 3 vertreten wird, und Fluoreszenzimpuls 21 sowie einem der Impulsanteile 24, der um das Zeitintervall 22 später beginnt als der Erregerimpuls 20 und um das Zeitintervall 23 später, als der Erregerimpuls 20 beginnt, endet, dargestellt.

Claims (4)

1. Vorrichtung zur Analyse und bildlichen Darstellung des bei einer punktweisen Anregung eines Präparates durch Laserlicht entstehenden zeitlichen Intensitätsverlaufes der Fluoreszenzstrahlung, mit

• - einer Laserlichtquelle zur Erzeugung einer gepulsten Laserstrahlung,
• - einem Fotoempfänger zur Erfassung eines Startimpulses der Laserstrahlung zur Einleitung der Erfassungsvorgangs,
• - einer Anpassungsoptik zum Lenken der Laserstrahlung auf das Präparat,
• - Mitteln zur Ansteuerung einer frei wählbaren Verschiebung des Präparates zur Laserstrahlung,
• - einer schnell reagierenden Einrichtung zum Empfang des zeitlichen Intensitätsverlaufes der Fluoreszenzstrahlung,
• - einem Impulsanalysator zur zeitaufgelösten Impulserfassung des Intensitätsverlaufs der Fluoreszenzstrahlung,
• - einem Speicher mit mehreren Speicherelementen zur Speicherung des erfaßten zeitaufgelösten Impulsverlaufs der Fluoreszenzstrahlung sowie
• - Mitteln zur bildlichen punktweisen Darstellung zeitlicher Fluoreszenzunterschiede des zeitaufgelösten Intensitätsverlaufs.

2. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß zur bildlichen Darstellung einstellbare Zeitintervalle des Intensitätsverlaufs bestimmten Speicherelementen zuordenbar sind.

3. Vorrichtung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Inhalt der Speicherelemente oder eine mathematische Verknüpfung ihres Inhalts bildlich darstellbar sind.

4. Vorrichtung nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß für die bildliche Darstellung ein Farbdisplay vorgesehen ist.