DE3689386T2

DE3689386T2 - Proteaseresistente Urokinase-Zusammensetzung, deren Herstellung und Verwendung.

Info

Publication number: DE3689386T2
Application number: DE3689386T
Authority: DE
Inventors: Michael Blaber; Herbert Louis Heyneker; Gordon Allen Vehar
Original assignee: Genentech Inc
Current assignee: Genentech Inc
Priority date: 1985-04-22
Filing date: 1986-04-21
Publication date: 1994-05-19
Anticipated expiration: 2006-04-22
Also published as: DK181386D0; DD264939A5; PT82428B; ES8800347A1; GR861036B; EP0200451A1; DK175304B1; HUT40696A; ES554249A0; EP0200451B1; DK181386A; ATE98686T1; DD251791A5; US5219569A; HU202586B; DE3689386D1; PT82428A

Description

Urokinase (E.C. 3.4.21.31) ist eine Serinprotease, die Plasminogen zu Plasmin aktiviert. Das Protein wird in einer Vielfalt von Geweben einschließlich Endothel und Niere erzeugt und wird in Spurenmengen in Harn ausgeschieden. Gereinigte Urokinase existiert in zwei aktiven Formen, einer Form mit hohem Molekulargewicht (HUK; etwa 50 K) und einer Form mit niedrigem Molekulargewicht (LUK; etwa 30 K). Die gesamte Aminosäuresequenz beider humanen Formen wurde bereits bestimmt (1,2,3). Es wurde nachgewiesen, daß LUK von HUK durch einen proteolytischen Schnitt nach Lysin 135 abgeleitet wird; dieser Schnitt setzt die ersten 135 Aminosauren von HUK frei (1). Nach herkömmlichen Ansichten mußte HUK oder LUK in proteolytisch aktive Formen durch proteolytische Hydrolyse eines einkettigen Vorläufers zwischen Lysin 158 und Isoleucin 159, der auch als Prourokinase bezeichnet wird, umgewandelt werden, um eine zweikettige aktivierte Form zu erzeugen (die weiterhin entweder HUK oder LUK entspricht.) Die sich aus diesem hydrolytischen Schnitt ergebenden, proteolytisch aktiven Urokinasegattungen enthalten zwei Aminosäureketten, die durch eine einzige Disulfidbindung zusammengehalten werden. Die beiden durch den Aktivierungsschnitt gebildeten Ketten wurden als A oder A&sub1; Ketten (jeweils HUK oder LUK) bezeichnet und die B-Kette enthält den Proteasebereich des Moleküls.
Es hat sich bisher gezeigt, daß Urokinase ein wirksames thrombolytisches Mittel ist. Da sie jedoch in der Natur in Spurenmengen erzeugt wird, sind die Kosten des Enzyms für eine wirksame Dosierung hoch. Urokinase wurde bisher auch in rekombinanten Zellkulturen produziert und für Urokinase kodierende DNA ist zusammen mit geeigneten Vektoren und Wirtsorganismen bekannt (3,8).
Wie schon vorstehend angeführt wurde, wurde bisher angenommen, daß Plasminogenaktivatoren als proteolytisch inaktive Zymogene existieren, die durch Proteolyse "aktiviert" werden müssen, bevor das Enzym auf Plasminogen wirken kann, um die fibrinolytische Kaskade einzuleiten (4,5). Obwohl beobachtet wurde, daß das einkettige Proenzym von Urokinase hohe Aktivitätswerte bei zymographischen und fibrinolytischen Vorgängen zeigt (4,6), hat die Tatsache, daß das Proenzym auch nur geringe amidolytische Aktivität auf synthetische Polypeptidsubstrate von geringem Molekulargewicht zeigt, zur Schlußfolgerung geführt, daß die fibrinolytische Aktivität von Prourokinase (4) Spuren von kontaminierender aktiver (zweikettiger) Urokinase in den Proenzym-Zubereitungen, oder Spuren von Plasmin im Plasminogen zuzuschreiben ist, das in den Fibrinplatten-Analysen eingesetzt wird. Dies würde zwangsweise zu der Folgerung führen, daß einkettige Urokinase in die zweikettige Form umgewandelt werden muß, um Plasminogen zu spalten und die Fibrinolyse in vivo einzuleiten.
Die Rolle der Urokinase bei der Gerinnsellyse in vivo ist kompliziert. Gegenwärtig wird angenommen,daß eine Wechselwirkung zwischen Prourokinase und einem Inhibitor in Plasma besteht. Von Fibrin wird postuliert, daß es diesen Inhibitor freisetzt, woraufhin Prourokinase für die Wirkung auf Plasminogen freigesetzt wird (7). Es ist unklar, ob Entfernung des Inhibitors allein dazu ausreicht, die Plasminogenhydrolyse einzuleiten oder ob Freisetzung aus dem Inhibitor nur die herkömmliche Urokinaseaktivierung zur zweikettigen Form erleichtert. Der vom Inhibitor gebundene Urokinasebereich ebenso wie der Bindungsmechanismus ist unbekannt. Eine weitere komplizierende Hypothese schreibt eine fibrinbindende Fähigkeit der Urokinase an die HUK-Spezies zu, insbesondere an einen Bereich, der als "Kringle" bezeichnet wird und sich etwa innerhalb der Reste 49 bis 132 befindet (8). Das Verhältnis dieser Hypothese zum Inhibitor-Postulat und ihr vergleichbarer Wert bleiben ungelöst.
Ein Haupthindernis für die Verwendung von zweikettiger Urokinase für die Behandlung von Blutgerinnseln besteht darin, daß die zweikettige Form offensichtlich nicht durch den vermuteten Inhibitor von Prourokinase gebunden ist. Wenn zweikettige Urokinase peripher verabreicht wird, ist sie daher geeignet, Plasminogen an jedem beliebigen Punkt innerhalb des Kreislaufsystems zu aktivieren, was zu unerwünschten Nebenwirkungen führt. Zweikettige Urokinase, die durch Plasminhydrolyse von einkettiger Urokinase an der Gerinnselstelle erzeugt wird, tritt in das Kreislaufsystem mit den gleichen unerwünschten Nebenwirkungen ein, insbesondere systemischer Fibrinogenolyse und Verarmung an α 2 anti-Plasmin. Diese Nebenwirkungen behindern die richtige Thrombogenese in vivo. Es besteht die Nachfrage nach einer verbesserten Form der einkettigen Urokinase, die (a) fähig ist, entweder Fibrin oder den postulierten Inhibitor zu binden, d. h. die am Ende im wesentlichen wie native Prourokinase in bezug auf die Plasminogenaktivierung an den Gerinnselstellen funktioniert; resistent gegen proteolytische Digestion, insbesondere gegen Umwandlung in die zweikettige Form ist; und (c) minimale oder keine Antigenizität bei Patienten zeigt, an die es verabreicht wird.
Um eine Verbesserung zu erzielen, wird gemäß der vorliegenden Erfindung eine Zusammensetzung geschaffen, die proteaseresistente einkettige Urokinase enthält. Proteaseresistente einkettige Urokinase wird durch Kombinieren von Urokinase mit einem Komplexbildner mit Urokinase oder durch kovalentes Modifizieren einkettiger Urokinase an Proteolysestellen erzielt, so daß die Urokinase an diesen Stellen nicht mehr anfällig für Proteasehydrolyse ist. Die Zielstellen umfassen Arg&sub1;&sub5;&sub6; bis Lys&sub1;&sub5;&sub8; und vorzugsweise die Stelle an den Resten Lys&sub1;&sub3;&sub5; bis Lys&sub1;&sub3;&sub6;. Kovalente Modifizierungen werden erzielt, indem native Urokinase mit derivatisierenden Reagenzien oder durch die rekombinante Synthese von Mutanten mit stellenspezifischen Substitutionen, Einfügungen oder Löschungen von Aminosäureresten an der bzw. den Zielstelle(n) umgesetzt wird. Komplexbildner wie Antikörper binden an Urokinase an den Zielstellen oder flankierenden Stellen, so daß der Zugang zu den Stellen für die Protease behindert oder verhindert wird. All diese Urokinase-Zusammensetzungen sind dazu bestimmt, die Neigung von Proteasen, an Zielstellen zu spalten, zu reduzieren oder zu beseitigen. Die Umwandlung von einkettiger Urokinase zu zweikettiger Urokinase durch Plasmin, bakterielle Proteasen, Trypsin und andere Proteasen wird durch solche stellenspezifische Mutationen behindert und verringert dadurch unerwünschte Nebenreaktionen in vivo, ohne gleichzeitig die Fähigkeit der mutanten Urokinasespezies zu hemmen, ansonsten die gleiche Leistung zu vollbringen wie native einkettige Urokinase. Insbesondere ist es unnötig, die einkettige Urokinase in zweikettige Urokinase in vivo umzuwandeln, um das Plasminogen zu aktivieren. Die erfindungsgemäß geschaffenen Mutanten sind im wesentlichen nicht-immunogen beim Menschen, sie bleiben durchwegs fibrin-spezifisch und sind dazu geeignet, Plasminogen zu aktivieren, ohne zweikettige Urokinase in das Gefäßsystem frei zusetzen.
In der gemäß Art. 54(3)EPÜ zum Stand der Technik gehörenden EP-A-0210279 sind prourokinase-artige Polypeptide beschrieben, die eine Aminosäuresequenz identisch zur natürlichen menschlichen Prourokinase aufweisen, jedoch einen Rest einer sauren Aminosäure in Stellung 157 und gegebenenfalls Methionin am N-Terminus besitzen.
In den Zeichnungen zeigt Fig. 1 die Aminosäure- und Nukleotidsequenz für menschliche Urokinase. Die Aminosäuresequenz ist in der obersten Linie dargestellt, die Nukleotidsequenz darunter. Auch untranslatierte 5'- und 3'-Bereiche sind dargestellt.
Einkettige Urokinase wird als das Protein mit der in den Fig. 1A und 1B dargestellten Aminosäuresequenz von menschlicher Urokinase in ihrer Spezies mit hohem Molekulargewicht (etwa 54.000 Da, NH&sub2;-Ser&sub1;Gln&sub2;Glu&sub3;-Terminus) oder niedrigem Molekulargewicht (etwa 33.000 Da, NH&sub2;-Lys&sub1;&sub3;&sub6;Pro&sub1;&sub3;&sub7;Ser&sub1;&sub3;&sub8;- Terminus) definiert, die Aminosäuresequenzvariationen und Derivate derselben umfassen natürliche Allele, worin das Molekül aus einer einzelnen Aminosäurekette besteht, die an der Proteolysestelle ungespalten bleibt, die die Reste Arg&sub1;&sub5;&sub6; bis Lys&sub1;&sub5;&sub8; umfaßt (und in der Folge als "Kettenumwandlungsstelle" bezeichnet wird). Proteaseresistente einkettige Urokinase ist ein Urokinasederivat mit einer einzelnen Aminosäurekette, die weniger anfällig für die proteolytische Hydrolyse ist als die entsprechende underivatisierte, native Form der Urokinase. Insbesondere ist proteaseresistente Urokinase resistent gegen Umwandlung in zweikettige Urokinase durch Proteolyse an der Kettenumwandlungsstelle. Typisch wird dies bestimmt, indem das Urokinasederivat, von dem angenommen wird, daß es proteaseresistent ist, mit Humanplasmin inkubiert wird und die Aktivität des behandelten Anwärters auf einem chromogenen Substrat wie S-2444 im Vergleich zu nativer einkettiger Urokinase verglichen wird, die auf die gleiche Weise behandelt und analysiert wurde. Wenn die Plasminumwandlungsrate des Anwärter-Urokinasederivates in die zweikettige Spezies (analysiert durch ein Ansteigen der S-2444 hydrolytischen Aktivität) weniger als etwa 50% beträgt, üblicherweise weniger als 10% der Umwandlungsrate der vergleichbaren nativen Urokinase in die zweikettige Spezies, wird der Anwärter als proteolyseresistent bezeichnet. Dieser Vorgang wird in den Beispielen näher beschrieben.
Proteolyseresistente einkettige Urokinase umfaßt auch einkettige Urokinasederivate, die im wesentlichen unfähig zur proteolytischen Spaltung an der Lys&sub1;&sub3;&sub5;Lys&sub1;&sub3;&sub6; Stelle (in der Folge als "LUK" Stelle bezeichnet) sind. Diese Derivate werden als jene bezeichnet, bei denen die Umwandlung von HUK zu LUK bei einer geringeren Rate mit der proteolyseresistenten Urokinase als mit der nativen einkettigen Urokinase vor sich geht. Falls die Rate der Trypsinumwandlung des Anwärter-Urokinasederivates in die LUK-Form (analysiert mittels Gel-Elektrophorese, Gelfiltration, Immunanalyse od. dgl.) weniger als etwa 50% beträgt, üblicherweise weniger als etwa 10% der Umwandlungsrate der vergleichbaren Urokinasespezies in LUK, ist der Anwärter als proteolyseresistent anzusehen.
Proteolyseresistenz wird gegebenenfalls auch in bezug auf andere Proteasen definiert, die in der Umgebung der einkettigen Urokinase zu erwarten sind. Mikroorganismen, die als Wirte für die rekombinante Synthese von einkettiger Urokinase eingesetzt werden, enthalten Proteasen wie Endo- und Exopeptidasen sowie einige Esterasen oder Amidasen mit proteolytischer Aktivität. Einige dieser vorteilhaften Proteasen spalten einkettige Urokinase und sind insbesondere während der Reinigung schwierig zu behandeln, wenn die rekombinante Urokinase löslich ist und einer erhöhten Konzentration dieser Proteasen ausgesetzt werden kann. Bisher bestand die Antwort auf dieses Problem in der Verwendung von Proteolysehemmern, z. B. 1M Guanidin HCl, in den Reinigungslösungsmitteln (3). Zusätzlich wurde ein als einkettige Urokinase identifiziertes Enzym aus natürlichen Quellen durch rasche Trennungsverfahren isoliert (6), die dazu bestimmt waren, die Umwandlung in die zweikettige Spezies zu verhindern.
Die proteaseresistente einkettige Urokinase wird nach an sich bekannten Verfahren hergestellt, die dem Fachmann geläufig sind. Die Kettenumwandlungsstelle, und vorzugsweise auch die LUK-Stelle, werden entweder kovalent modifiziert, um weniger anfällig für proteolytische Spaltung zu sein, oder mit einem Mittel kombiniert, das den Zugang der Protease zu den Stellen hemmt.
Mittel, die den Zugang der Protease hemmen, schließen monoklonale Antikörper oder Fragmente derselben, z. B. fab-Fragmente, die gegen die in Frage stehenden Stellen gerichtet sind, oder benachbarte Epitope ein, die so positioniert sind, daß der gebundene Antikörper den Zugang der Proteasen zur Stelle sterisch behindert. Bei dieser Ausführungsform kann die Urokinase nativ als auch ein mutantes Molekül sein, sie ist jedoch nicht-kovalent mit einem anderen Molekül assoziiert, das Proteaseresistenz verleiht. Geeignete Antikörper oder andere Bindungsproteine sind leicht durch Immunisieren eines Tieres, z. B. von Mäusen gegen einkettige Urokinase in Freunds vollständigem Adjuvans, Gewinnen der Milzzellen des immunisierten Tieres, Verschmelzen der Zellen, um Hybridoma zu produzieren und Screenen der Verschmelzungskulturüberstände in bezug auf antiproteolytische Aktivität identifizierbar. Eine geeignete Screening-Analyse wird durchgeführt, indem der Anwärter-Antikörper zuerst mit einkettiger Urokinase und dann mit Plasmin, Trypsin oder einer beliebigen anderen in Frage kommenden Protease inkubiert wird. Danach wird ein Proteaseinhibitor zugegeben, um die Reaktion abzubrechen und die Fragmente werden mittels Gel-Elektrophorese abgetrennt. Ein Vergleich mit und ohne Reduktion an einem Elektrophoresegel zeigt an, ob der Antikörper die einkettige Urokinase geschützt hat oder nicht, d. h. das Vorliegen eines Bandes, das mit einkettiger Urokinase auf dem reduzierenden Gel migriert, zeigt den Grad des Schutzes an, der von der einkettigen Urokinase geboten wird.
Gemäß einer anderen Ausführungsform wird die kovalente Modifizierung von einkettiger Urokinase an der Kettenumwandlungsstelle und vorzugsweise an der LUK-Stelle durchgeführt, um ihre Anfälligkeit für die proteolytische Spaltung zu verringern. Die kovalente Modifikation wird im allgemeinen auf eine von zwei Weisen durchgeführt. Bei einer Ausführungsform wird einkettige Urokinase einer derivatisierenden Verbindung ausgesetzt und umgesetzt, bis wenigstens ein Rest in einer wesentlichen Population der Kettenumwandlung oder LUK-Stellen substituiert durch oder sterisch gehindert durch kovalente Bindung der Urokinase an eine organische Gruppe wird. Die Reaktionsbedingungen werden durch einen einfachen Matrixversuch bestimmt, bei dem die Erhaltung der plasminogenaktivierenden Aktivität der Urokinase mit Steigerungen in proteolytischer Resistenz verglichen wird. Geeignete Mittel sind monofunktionelle Verbindungen, die unter solchen Bedingungen eingesetzt werden, daß sie maximal selektiv für die Seitenketten der Arginin-, und vorzugsweise der Lysinreste einschließlich 1,2-Cyclohexandion, Essigsäureanhydrid und Phenylglyoxal sind. Die unerwünschte Derivatisierung der urokinaseaktiven Stelle und Kringle-Struktur wird auf ein Minimum eingeschränkt, indem die Reaktion mit einem stöchiometrischen Überschuß von Plasminogen (oder einem anderen Substrat oder Substratanalog) und Fibrin oder Benzamidin durchgeführt wird. Da das Mittel monofunktionell ist, werden die Proteine nicht vernetzt.
Das bevorzugte Verfahren zur Herstellung der proteaseresistenten einkettigen Urokinase gemäß der vorliegenden Erfindung besteht jedoch darin, eine Aminosäuresequenz-Variation in die Kettenumwandlungs- oder LUK-Stellen nach rekombinanten Verfahren einzuführen. Eine DNA-Sequenz, die für einkettige Urokinase kodiert, ebenso wie Verfahren zur ihrer Expression in rekombinanten Wirtszellen sind bekannt (3, 8). An sich bekannte Verfahren können dazu verwendet werden, Mutationen in diese DNA einzuführen, die als proteolyseresistente Aminosäuresequenzvarianten exprimiert werden. So z. B. werden DNA-Segmente, die für die Kettenumwandlungs- und LUK-Stellen kodieren (sowie nach Bedarf flankierende Bereiche) aus der für Urokinase kodierenden DNA durch sequentielle Digestion mit Restriktionsendonukleasen exzisiert, die an Stellen wirken, die die für Proteolysestellen kodierende DNA flankieren (mittels DNA- Sequenzanalyse bestimmt), die entsprechend gespaltene DNA wird gewonnen (bestimmt mittels Gelfiltration), ein für die gewünschte Aminosäuresequenz und flankierende Bereiche kodierendes Oligonukleotid wird hergestellt, es wird mit den Restriktionsenzymen digeriert, die auch für die Exzision des unerwünschten Fragmentes verwendet werden, wodurch kohäsive Termini geschaffen werden, und die synthetische DNA wurde in den verbleibenden Teil des Strukturgens der einkettigen Urokinase ligiert. Für die LUK-Stelle kodierende DNA wird z. B. durch partielle Digestion von pUK54trp207-1(3) mit MstI und BalI, Gewinnen des Vektorfragments und Rekonstituieren des Vektors durch Ligieren dieses Fragments an ein synthetisches Oligonukleotid mit der gewünschten Sequenz exzisiert. Bei dieser Ausführungsform wird für [Lys&sub1;&sub3;&sub5;→Δ] - Human-Urokinase kodierende DNA geschaffen, indem an den MStI und BalI Termini ein Oligonukleotid mit der Sequenz
eingefügt wird (die Zahlen unter der Sequenz korrelieren mit Fig. 1).
Auf ähnliche Weise wird die DNA, die für die Kettenumwandlungsstelle kodiert, z. B. durch partielle Digestion der Urokinase-DNA mit BalI und EcoRI auf gleiche Weise und Ligieren eines Oligonukleotids, das die gleiche Basensequenz aufweist, die für die gewünschten Aminoreste kodiert, in das geöffnete Gen exzisiert. Als repräsentatives Beispiel sei das Oligonukleotid
angeführt, das für die Herstellung von [Arg&sub1;&sub5;&sub6;→His; Lys&sub1;&sub5;&sub8;→Δ] Human-Urokinase eingesetzt wird.
Andere Sequenzvarianten werden hergestellt, indem geeignete Oligonukleotide auf analoge Weise hergestellt und eingefügt werden. Üblicherweise ist es jedoch günstiger, die Urokinase-DNA unter Anwendung des M13-Phagen-Mutageneseverfahrens (9) zu mutieren. Dieses Verfahren ist an sich bekannt.
Die hierin beschriebenen Aminosäuresequenz-Mutanten sind durch die Löschung oder Substitution der basischen Reste (Arginin und/oder Lysin), die in den Proteasestellen vorliegen, oder durch die Einfügung von Resten gekennzeichnet, die die basischen Reste im wesentlichen unfähig zur Teilnahme an der proteolytischen Spaltung machen. Es werden Kombinationen von Einfügungen, Löschungen oder Substitutionen verwendet. Bevorzugte Mutationen sind in der nachstehenden Tabelle angeführt. Diese Tabelle ist nicht einschränkend in bezug auf nützliche Mutationen. Urokinase-Rest(e) Mutations-Ergebnis
Wenn Lys&sub1;&sub3;&sub5; ungestört bleibt oder zu Arginin mutiert wird, sollte Lys&sub1;&sub3;&sub6; zu Prolin mutiert oder gelöscht werden. Zusätzlich sollte, falls Lys&sub1;&sub5;&sub8; ungestört bleibt oder zu Arginin mutiert wird, Prolin zwischen Lys&sub1;&sub5;&sub8; und Ile&sub1;&sub5;&sub9; eingefügt oder Prolin für Ile&sub1;&sub5;&sub9; eingesetzt werden. Die am meisten bevorzugten Ausführungsformen sind die Löschungsmutanten, insbesondere jene von Lys&sub1;&sub3;&sub5;, Arg&sub1;&sub5;&sub6; und Lys&sub1;&sub5;&sub8;, knapp gefolgt von Histidinylsubstitutionen dieser drei Reste, da solche Mutationen am wenigsten wahrscheinlich Auto-Antikörper in Patienten bilden. Die bevorzugte Ausführungsform ist eine Löschung von Lys&sub1;&sub3;&sub5; oder Lys&sub1;&sub3;&sub6; kombiniert mit einer Löschung von Phe&sub1;&sub5;&sub7;Lys&sub1;&sub5;&sub8;. Dieser Mutant weist den Vorteil auf, daß, obwohl eine begrenzte Proteolyse nach Arg&sub1;&sub5;&sub6; erfolgt, wenn die proteolytische Umwandlung zur zweikettigen Form vor sich geht, das erhaltene Molekül die gleichen C und N Termini in beiden Urokinaseketten aufweist wie die zweikettige Urokinase (normale Proteolyse der Prourokinase in vivo setzt das Phe Lys Dipeptid frei). Weiters bleibt mit dem bevorzugten Mutanten das Molekül in der HUK-Form.
Die für die proteaseresistente Variante kodierende Nukleinsäure wird in einen Expressionsvektor eingefügt, der Vektor wird zum Transformieren einer Wirtszelle verwendet, der Transformant wird kultiviert, bis sich die variante Urokinase in der Kultur ansammelt und die Variante wird dann aus der Kultur gewonnen. Die Verfahren zur Herstellung von rekombinanter Urokinase, die in der veröffentlichten Literatur beschrieben sind (3), werden hierin ausdrücklich durch Verweis aufgenommen und sind durchwegs zufriedenstellend für die Herstellung der Varianten. Ein beispielhaftes Verfahren ist in den nachstehenden Beispielen beschrieben. Es wird jedoch vorausgesetzt, daß andere Vektoren und Wirtszellen zufriedenstellend für die Herstellung der hierin beschriebenen Varianten eingesetzt werden können.
Variante Urokinase, die direkt (d. h. ohne Verwendung eines Sekretionsleaders) in rekombinanten Bakterien hergestellt wird, wird als intrazellulare, wasserunlösliche Aggregate abgelagert, die als refraktile Körper bezeichnet werden. Diese werden gewonnen, indem die refraktilen Körper aus Zellbruchstücken wie Zellwandfragmenten u. dgl. abgetrennt werden. Dies wird günstig mittels Zentrifugierverfahren, z. B. Saccharose-Gradienttrennung erzielt. Danach werden die refraktilen Körper in einem Protein-Denaturierungsmittel wie 6M Guanidinhydrochlorid solubilisiert, das Protein wird neu gefaltet, das Mittel z. B. mittels Dialyse entfernt und die variante Urokinase wird weiter nach herkömmlichen Verfahren wie mit Ionenaustauscherharz- oder Gel-Säulen gereinigt. Da variante Urokinase jedoch proteaseresistent ist, ist es nicht nötig, Benzamidinsepharose einzusetzen, um einkettige von zweikettiger Urokinase zu trennen oder einen Proteaseinhibitor (1 M Guanidinhydrochlorid) oder rasche Abtrennungsverfahren während der Reinigungsschritte zu verwenden.
Proteaseresistente Urokinase, ungeachtet dessen, ob es variante Urokinase ist, die in rekombinanten Bakterien, Hefe oder höheren eukaryoten Zellkulturen hergestellt wird, oder durch kovalente oder adsorptive Modifizierung nativer Urokinase hergestellt wird, wird dann in eine Zusammensetzung für die therapeutische Verabreichung an Patienten mit Blutgerinnseln übergeführt. Die Urokinasekonzentration, Art der Verabreichung und pharmazeutische Excipientien, die bisher für die native Urokinase eingesetzt wurden, sind ebenso für die erfindungsgemäße proteaseresistente Urokinase geeignet. Typisch werden etwa 10.000- 75.000 IE/ml resistente Urokinase als Formulierungen in 5-%-iger Dextrose oder einem anderen isotonischen intravenösen Vehikel nach Bedarf zusammen mit Trägermitteln, Excipientien und Stabilisatoren eingesetzt. Die proteaseresistente Urokinase wird intravenös mit einer Rate infundiert, die ausreicht, um die Perfusion der okkludierten Arterie oder Vene zu erzielen, wie an herkömmlichen Verfahren gezeigt, üblicherweise einer Rate von mehr als etwa 4.000 IE/kg/h. Im allgemeinen variiert jedoch die Infusionsrate und Konzentration an Urokinase beträchtlich je nach der Aktivität des ausgewählten Urokinasederivates, dem Allgemeinzustand des Patienten, z. B. dem Ausmaß des Gerinnsels und dem hämostatischen Status des Patienten und der Art der Verabreichung, z. B. mittels Herzkatheter oder peripherer Verabreichung. Die Bestimmung der geeigneten Urokinasekonzentrationen und Verabreichungsraten ist dem Durchschnittsfachmann geläufig. Es ist zu beachten, daß das relative Fehlen von Nebenwirkungen, das mit den erfindungsgemäßen Urokinasespezien erzielt wird, die Anwendung von stärkeren Dosen und Verabreichungsraten zuläßt, als dies bisher mit zweikettiger Urokinase möglich war.

Beispiel 1

Konstruktion des Lys&sub1;&sub3;&sub6;→ΔMutanten

Plasmid pUK 54trp207*TX wurde als Ausgangsplasmid eingesetzt. Dieses Plasmid enthält DNA, die für das gesamte HUK-Gen unter der Steuerung des E.coli trp Promotors kodiert. Dieses Plasmid ist identisch mit pUK54trp207-1 (3) mit der Ausnahme, daß es nur eine EcoRI Stelle nahe dem 3'Ende des trp Promotors enthält und die 641 bp zwischen den AvaI und PvuII Stellen des pBR322 Vektorbestandteils gelöscht wurden (die sogenannte "XAP"Löschung (14).
Plasmid pUK54trp207-1*TX wird nach einem bekannten Verfahren (3) hergestellt, mit der Ausnahme, daß das in diesem Verfahren eingesetzte Ausgangsplasmid pHGH207-1*XAP anstelle von pHGH207-1 war. pHGH207-1*XAP wurde durch partielle EcoRI Digestion von pHGH207-1 hergestellt, um das Plasmid zu öffnen, die kohäsiven Termini wurden mit Klenow-Fragment von DNA Polymerase I aufgefüllt, das Plasmid wurde unter Verwendung von T4 Ligase rezirkularisiert und danach für die Transformierung von E.coli verwendet. Es wurde ein Plasmid pHGH207-1* gewählt, in dem nur die EcoRI Stelle am 3' Ende des trp Promotors überlebte, wie mittels Restriktionsenzymanalyse bestimmt wurde.
Um die XAP-Löschung zu erzielen, wurde pHGH207-1* mit Aval und PvuII digeriert, das große Vektorfragment gewonnen, die kohäsiven Termini wurden mit dem Klenow-Fragment von DNA Polymerase I aufgefüllt, das stumpfendige Plasmid wurde unter Verwendung der T4 Ligase ligiert und E.coli wurde mit der Ligierungsmischung transformiert. pHGH207-1*XAP wurde gewonnen und nach dem bekannten Verfahren eingesetzt, um pUK54trp207*TX zu erhalten.
pUK54trp207-1*TX wurde mit PstI und BclI digeriert und das etwa die Basen 439-732 umspannende Plasmid wurde gewonnen. Doppelstrangiges M13mp10 (äquivalentes Phagen-M13mp18 ist handelsüblich und wird von Bethesda Research Laboratories vertrieben) wurde mit PstI und BamHI digeriert und mit dem PstI-BcII-Urokinase DNA-Fragment verschmolzen, um M13mp10UK1 zu bilden. E.coli JM101 Zellen (ATCC Nr. 33876) wurde mit der doppelstrangigen replikativen Form (RF) von M13mp10UK1 transformiert. einstrangiges und RF M13mp10UK1 wurden auf bekannte Weise aus infizierten E.coli JM101 Zellen isoliert. Man beachte, daß BclI und BamHI kohäsive Termini bilden, so daß der M13mp10 Phage fähig war, mit der Urokinase-Einfügung zu rezirkularisieren. Die einstrangige Form wurde für die stellenspezifische Mutagenese von Urokinase an der Lys&sub1;&sub3;&sub6;Stelle verwendet.
Ein synthetisches Oligonukleotid wurde nach dem Festphasen-Phosphotriesterverfahren (16) für die Verwendung als Mutageneseprimer hergestellt. Der folgende Primer wurde für die Löschung von Lys&sub1;&sub3;&sub6; ein gesetzt:
Dies ist der Abschnitt des für Urokinase kodierenden Stranges, der Lys&sub1;&sub3;&sub6; flankiert, mit der Ausnahme, daß der AAG Kodon für Lys&sub1;&sub3;&sub6; gelöscht wurde.
Der nachstehend beschriebene Vorgang wurde dazu verwendet, einen Urokinaseklon zu erzeugen, der die mutierte Sequenz des synthetischen Primers enthielt. Dieser Vorgang ist an sich allgemein bekannt (9).
50 ng des synthetischen Oligonukleotids wurden 30 Minuten lang bei 37ºC in 10 ul eines Gemisches aus 50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 10 mM MgCl&sub2;, 10 mM Dithiothreitol, 1 mM ATP mit einem Gehalt von 8 E T4 Polynukleotidkinase phosphoryliert. Für die Verwendung als Sonde wurden 400 ng des synthetischen Oligonukleotids wie vorstehend beschrieben phosphoryliert, mit der Ausnahme, daß ATP durch 60 mCi [γ ³²P]-ATP (3.000 Ci/mMol) ersetzt wurde, was zu etwa 50-60·10&sup6; cpm/400 ng 24mer führte. Für die Heteroduplexbildung wurden 100 ng einstrangiges M13mp10UK1 10 Minuten lang auf 95ºC erwärmt und innerhalb von 30 Minuten langsam in 40 ul einer Mischung aus 10 mM Tris-HCl pH 7,5, 10 mM MgCl&sub2;, 1 mM Dithiothreitol und 10 ng des phosphorylierten Primers und 500 ng mit EcoRI digeriertem großem M13mp10UK1 Fragment auf Raumtemperatur abgekühlt. Die Primerverlängerung wurde durch die Zugabe von 10 ul Puffer mit einem Gehalt von 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 10 mM MgCl&sub2; und 1 mM Dithiothreitol, 2 mM ATP, je 0,25 mM dGTP, dTTP, dCTP und dATP, 5 E E.coli großes Fragment von DNA Polymerase I und 400 E T4 DNA Ligase eingeleitet. Nach 1 Stunde bei 12ºC wurde das Reaktionsgemisch dazu verwendet, E.coli JM101 Zellen zu transformieren.
Die Transformation wurde durchgeführt, indem 10 ul der Ligierungsmischung mit 200 ul der kompetenten JM101 Zellen vermischt und darauf 30 Minuten lang auf Eis und 5 Minuten bei 37ºC inkubiert wurden. Dann wurden 3,5 ml 2 γ top Agar bei 55ºC mit 300 ul gesättigten JM101 Zellen, 10 IPTG (200 mM) und 50 ul Xgal vermischt und nach Zugabe der transformierten Zellen auf Petrischalen mit einem Durchmesser von 9 cm plattiert, die LB ohne Drogen enthielten.
Zwei farblose Plaques (B2 und G12) wurden entnommen und in eine Mikrotiterschale übertragen, die 100 ul 2 γ T Medium enthielt. Die beimpften Mikrotiterfluide wurden auf LB Agar-Platten mit einem Durchmesser von 15 cm, überlagert mit einem Rasen enthaltend 600 JM101 Zellen in 8 ml 2 γ T top Agar aufgedrückt und über Nacht bei 37ºC inkubiert. Die geformten Platten wurden durch 1 Minute langen physischen Kontakt auf eine Nitrozellulosescheibe übertragen. Die Nitrozellulosescheibe wurde mit 0,5 M NaOH, 1,5 M NaCl 3 Minuten lang behandelt und zweimal mit 3 M NaCl-0,5 M Tris-HCl, pH 7,5 15 Minuten lang und danach 15 Minuten lang mit 2X SSC gewaschen. Die Prähybridisierungsmischung enthielt 10 mM Tris, pH 7,5, 5 mM EDTA, 0,9 mM NaCl, 1X Denhardt, 0,5% NP40, 100 um ATP, 1 mM Natriumpyrophosphat, 1 mM Natriumphosphat und 50 ug/ml E.coli tRNA. 1X Denhardt's enthält pro Liter 200 mg Ficoll, 200 mg Polyvinylpyrrolidon, 200 mg Rinderserumalbumin (BSA; Fraktion V). Die Scheibe wurde bei 80ºC im Vakuum 90 Minuten lang erwärmt und dann 3 Stunden lang mit 6 ml Prähybridisierungsfluid in einer Petrischale inkubiert, gefolgt von der Zugabe von 5·10&sup6; cpm markiertem Primer und Hybridisieren über Nacht. Selektives Waschen der Scheibe wurde mit 0,4X SSC bei 49ºC durchgeführt, nach Lufttrocknung wurde die Scheibe einem Röntgenfilm ausgesetzt. Die positiv hybridisierenden Klone wurden weiter durch Didesoxysequenzierung analysiert. Es wurde bestätigt, daß der B2 Klon die richtige Sequenz enthielt, die die Lys&sub1;&sub3;&sub6; Löschung aufwies.
Das Expressionsplasmid wurde rekonstituiert, indem XbaI-Bcl und XbaI-PstI-Fragmente von pUK54trp207-1*TX mit dem Sau3A-PstI Einfügungsfragment von der Platte B2 ligiert wurden und die Ligierungsmischung in E.coli transformiert wurde. Es wurde ein Transformant ausgewählt, der ein Plasmid enthielt, das das mutante Gen enthielt (pUK54B2). Die Fragmente wurden durch herkömmliche Restriktionsenzymdigestion und Gewinnung des gewünschten Fragmentes erhalten. Obwohl während dieses Vorgangs sowohl die BclI als auch die BamHI Stellen zerstört werden, ist zu beachten, daß die M13 Urokinase- Einfügung am gleichen Punkt wie die BclI und BamHI-Ligierung durch Sau3A exzisiert wurde, das die vier zentralen Basen jeder der BclI, BamHI oder BclI-BamHI- Ligierungsstellen erkannte.
pUK54B2 wurde dazu verwendet, E.coli zu transformieren. Gegenwärtig ist der bevorzugte Stamm von E.coli W3110fhuA&supmin;. Dieser Stamm ist nicht wesentlich für die Herstellung der anmeldungsgemäßen Mutanten, ist jedoch günstiger, da er resistenter gegen kontaminierende Phagen und daher praktischer für die Herstellung im gewerblichen bzw. industriellen Maßstab ist.
E.coli W3110 fhuA&supmin; ist ein T1 phagenresistentes Bakterium, das durch eine Löschung oder Inversion von DNA-Sequenzen gekennzeichnet ist, die mit dem fhuA Gen assoziiert sind.
Kurz gesagt wird E.coli W3110 (ATCC 27325) mit lambda Bakteriophage transduziert, der das transponierbare Element Tn10 enthält, das Tetracyclinresistenz verleiht. Stämme von mit Tn10 transduziertem W3110 wurden für die Resistenz auf Phageninfektion ausgewählt. Die phagenresistenten Stämme werden vereinigt und mit Bacteriophage P1 infiziert. Das entstandene Lysat wurde dazu verwendet, E.coli AT982 zu transduzieren (17). Der Stamm AT982 enthält eine DAP Mutation, die nahe am fhuA Gen gelegen ist. Aus der Transduktion des Stammes AT9B2 durch das P1 Lysat und Selektion von Transduktanten, die tetracyclinresistent sind und die DAP Funktion regenerieren, geht hervor, daß das Transposon Tn10 innerhalb des fhuA Gens gelegen ist. Stämme, die tetracyclinresistent sind und regenerierte DAP Funktion aufweisen, sind die Quelle von DNA für Bakterienphage P1 Transduktion von E.coli W3110. Es werden transduzierte W3110 Stämme ausgewählt, die Tetracyclinresistenz und Phagenresistenz exprimieren. Diese Stämme werden dann auf der Basis von Resistenz gegen Phageninfektion und Umkehrung zu Tetracyclinempfindlichkeit (18) ausgewählt. Die Umkehrung zur Tetracyclinempfindlichkeit gekoppelt mit der Erhaltung der Resistenz gegen T1 Phageninfektion zeigt an, daß die DNA Sequenz, die mit dem fhuA Gen assoziiert ist, entweder gelöscht oder irreversibel invertiert wurde. Die so konstruierten Stämme werden als E.coli W3110 fhuA&supmin; bezeichnet.
Der Phage, der das transponierbare Element Tn10 enthielt, das für die Einfügung von Tn10 in W3110 verwendet wurde, wurde wie folgt konstruiert. Das Ausgangsmaterial war lambda c1857b 2210am29. Dieser Phage ist dem Fachmann geläufig (19) und wurde aus drei gut bekannten Mutanten von lambda Phage nach bekannten Verfahren konstruiert. Ein Lysat dieses lambda Phagen wurde auf dem bernsteinfarbenen Suppressor E.coli C600 (ATCC Nr. 23724) hergestellt, der nach dem Fachmann geläufigen Verfahren auch so manipuliert wurde, daß er das Tn10 Transposon trug (19). Dieses Lysat wurde dazu verwendet, E.coli C600 (lambda C1857) zu infizieren, der einen bernsteinfarbenen Suppressor und einen lambda Prophagen enthält, der den c1857 Genotyp trägt. Lysate von tetracyclinresistenten Kolonien wurden durch Wärmeinduktion hergestellt, indem die tetracyclinresistenten Kolonien zuerst in Brühe bei 32ºC und dann bei 42ºC 90 Minuten lang kultiviert wurden. Das Lysat wurde dann auf E.coli C600 plattiert und replikaplattiert. Die auf E.coli C600 aufscheinenden Plaques wurden bei 32ºC auf E.coli C600 und E.coli W3102 sup+ (lambda imm434) replikaplattiert, der den heteroimmunen Prophagen lambda imm434 enthält (20). Platten, die auf dem heteroimmunen Stamm aufscheinen, werden auf Tetracyclinplatten plattiert. Auf diesen Platten aufscheinende Plaques sind fähig, Tetracyclinresistenz zu transduzieren und werden nach dem vorstehend beschriebenen Verfahren dazu verwendet, E.coli W3110 fhuA zu erzeugen.
Rekombinante native und (Lys&sub1;&sub3;&sub6;→Δ) Humanurokinase werden aus 1 l Kulturen von W3110 oder W3110FhuA&supmin; Zellen erhalten, die mit dem geeigneten Plasmid transformiert waren. Die Expression wurde weiter durch Zugabe von Indolacrylsäure induziert.

Beispiel 2

Konstruktion von [Lys&sub1;&sub3;&sub6;→Δ; Phe&sub1;&sub5;&sub7;Lys&sub1;&sub5;&sub8;→Δ] Humanurokinase

Im wesentlichen das gleiche Verfahren wurde dazu verwendet, Expressionsplasmide zu erzeugen, die andere oder zusätzliche Mutanten trugen. In manchen Fällen ist es günstig, bei der Herstellung von DNA, die an zusätzlichen Stellen mutiert wird, den M13 Phagen einzusetzen, der schon einen oder mehrere Mutanten trägt. Das folgende Verfahren wurde dazu verwendet, [Phe&sub1;&sub5;&sub7;Lys&sub1;&sub5;&sub8;→Δ; Lys&sub1;&sub3;&sub6;→Δ) Humanurokinase herzustellen. M13mp10UK1 wurde als Schablone für einen Primer mit folgender Sequenz verwendet:
Nach dem vorstehend beschriebenen Verfahren wurde Plaque 2F3 identifiziert. Es wurde bestimmt, daß Phagen von Plaque 2F3 ein Urokinase-DNA-Fragment trugen, das die Phe&sub1;&sub5;&sub7;Lys&sub1;&sub5;&sub8;→Δ Mutation enthielt. Das Expressionsplasmid für diese Mutation, das auch die Lys&sub1;&sub3;&sub6; Löschungsmutation (Beispiel 1) enthielt, wurde rekonstituiert, indem das Vektorfragment von einer BalI-BclI-Digestion von pUK54B2 mit dem BalI-Sau3A-Einfügungsfragment von Phage 2F3 ligiert wurde und E.coli W3110 oder W31l0Fhu&supmin; transformiert und kultiviert wurde. Die transformierten Zellen wurden auf Minimalmedium über Nacht auf eine optische Dichte bei 550 nm von 1,2 kultiviert. Zusätzliches Medium wurde zugegeben. Indolacrylsäure, eine Verbindung, die die Expression von durch das Tryptophanoperon gesteuerten Genen noch weiter induziert, wurde auf eine Konzentration von 10 ug/ml zugegeben. Die Zellen wurden 2 Stunden lang inkubiert und geerntet.
Obwohl tatsächlich bei der Herstellung der in vorliegender Anmeldung beschriebenen proteaseresistenten Urokinasesequenzvarianten pUK54trp207-1*TX als Plasmid eingesetzt wurde, ist dem Fachmann geläufig, daß für die erfindungsgemäße Verwendung auch andere Expressionsvektoren geeignet sind. Erforderlich ist nur für Urokinase kodierende, klonierte DNA. Diese DNA wird durch Synthese oder Erhalten von mRNA aus geeigneten Zellen, z. B. Detroit 562-Zellen (ATCC Nr. CCL 138), und Herstellung von cDNA daraus erhalten (3). Diese DNA wurde durch wenigstens wesentliche DNA- und Aminosäure-Sequenz-Homologie mit der in Fig. 1 dargestellten nativen Urokinasesequenz identifiziert. Geeignete Restriktionsenzymstellen wurden aus der DNA-Sequenz identifiziert und nach Bedarf zusammen mit Adaptern oder Linkern dazu eingesetzt, DNA zu erhalten, die für die Einfügung in den ausgewählten Expressionsvektor geeignet ist. Die Verwendung anderer Plasmidkonstruktionen und Wirt-Vektor-Systeme ist dem Fachmann geläufig.

Beispiel 3

Reinigung von [Lys&sub1;&sub3;&sub6;→Δ; Phe&sub1;&sub5;&sub7;Lys&sub1;&sub5;&sub8;→Δ] Humanurokinase

200 mg Zellenpaste, die aus der Hälfte eines Fermentors mit 10 l Fassungsraum geerntet wurde, wobei die Fermentation wie in Beispiel 2 beschrieben durchgeführt wurde, wurde bei 4ºC in 10 l 0,05 M Tris, pH 7,2, mit einem Gehalt von 0,02 M EDTA, 0,5 g/l Lysozym (Sigma) und je 0,01 g/l Ribonuklease (Sigma) und Desoxyribonuklease (Sigma) homogenisiert. Die Lösung wurde dreimal durch eine Menton-Gaulin-Mühle bei 4,500 psi geleitet und 30 Minuten lang bei 4,700 · g bei 5ºC zentrifugiert. Das erhaltene Pellet, das Urokinase gemäß Bestimmung mit SDS-PAGE und Western-Blotting enthielt, wurde durch Homogenisieren in 500 ml 0,05 M Tris und 0,02 M EDTA bei pH 7,2 erneut suspendiert. Diese Suspension wurde auf 1,3 l 50-%-igem Glyzerin aufgeschichtet und erneut 30 Minuten lang bei 4,700 · g zentrifugiert.
Die wieder im Pellet gefundene Urokinase wurde unter 6-8 Stunden langem Rühren in 300 ml 6,0 M Guanidinhydrochlorid bei 4ºC aufgelöst. Das unlösliche Material wurde durch 30 Minuten langes Zentrifugieren bei 4,700 · g entfernt. Der überstand wurde zum erneuten Falten auf 6,0 l verdünnt. Die Endkonzentration von Salzen im Faltpuffer mit pH 9,0 betrug 0,05 M Tris, 1,0 M Guanidinhydrochlorid, 0,2 M Arginin, 0,005 M EDTA, 0,005% Tween 80, 1,25 mM reduziertes Glutathion und 0,25 mM oxydiertes Glutathion. Das Volumen von 6,0 l war dazu berechnet, eine optische Dichte OD&sub2;&sub8;&sub0; ≤ 1 zu ergeben. Die Lösung wurde 24 Stunden lang bei 4ºC stehen gelassen, um maximale Ausbeuten an Aktivität zu erhalten, die mittels Fibrinplattenanalyse gemessen wurden. Die Reagentien für erneute Faltung wurden durch Dialyse bei 4ºC gegen zwei Wechsel von je 60 l 0,05 M Natriumphosphat, pH 6,8 mit einem Gehalt von 0,005% Tween 80 entfernt. Die Dialyse wurde über Nacht durchgeführt. Alle darauffolgenden Reinigungsschritte wurden bei 4ºC vorgenommen.
Die dialysierte Lösung wurde in Chargen mit 400 ml DE-52 Zellulose (Whatman) extrahiert, die mit dem Dialysepuffer äquilibriert war. Der Schlamm wurde mittels Buchner-Trichters gefiltert. Der nicht adsorbierte Urokinase enthaltende überstand wurde sofort auf eine 100 ml (5 · 5 cm) Hydroxylapatitsäule (BioRad) eingebracht, die vorher mit dem Dialysepuffer äquilibriert worden war. Die Säule wurde mit 0,125 M Natriumphosphat bei pH 6,8 mit einem Gehalt von 0,005% Tween 80 gewaschen. Die Urokinase wurde mit 0,4 M Natriumphosphat bei pH 6,8 mit einem Gehalt von 0,005% Tween 80 eluiert.
Der Elutionspool aus der Hydroxylapatitsäule wurde unter Verwendung eines YM10 Amicon-Filters auf etwa 30 ml eingeengt und auf eine 2,5 · 130 cm Sephacryl S-200 Klassiersäule gebracht, die mit 0,05 M Natriumphosphat, pH 6,8 mit einem Gehalt von 1,0 M Guanidinhydrochlorid und 0,005% Tween 80 äquilibriert war. Der Urokinase enthaltende Peak wurde vereinigt und gegen 100 Vol. 0,05 M Natriumphosphat, pH 7,3 mit einem Gehalt von 0,15 M Natriumchlorid und 0,005% Tween 80 dialysiert.

Beispiel 4

Aktivität von [Lys&sub1;&sub3;&sub6;→Δ; Phe&sub1;&sub5;&sub7;Lys&sub1;&sub5;&sub8;→Δ] Humanurokinase

Urokinase und ihre Mutanten wurden auf Fibrinplatten (11) analysiert. Die Fibrinplatten bestanden aus 1,25% Agarose, 4,1 mg/ml Humanfibrinogen, 0,3 Einheiten/ml Thrombin und 0,5 ug Sojabohnentrypsininhibitor. Urokinase und ihre Mutanten wurden auch, wie angeführt, durch direktes chromogenes Substrat S-2444 (Helena Laboratories, Beaumont, Texas) (12) analysiert. Alle Analysen wurden mit dem Urokinasestandard (Calbiochem) in bezug auf absolute Aktivitäten verglichen.
Die relativen Aktivitäten von [Lys&sub1;&sub3;&sub6;→Δ; Phe&sub1;&sub5;&sub7;Lys&sub1;&sub5;&sub8;→Δ] rekombinanter Humanurokinase, rekombinanter nativer HUK (3) und nativer HUK wurden mittels Fibrinplattenanalyse verglichen. Die Resultate waren jeweils 96.250, 126.200 und 121.200 Plough-Einheiten (PE)/mg. Dies zeigt, daß die drei Aminosäurelöschungen die Plasminogenaktivierungsfähigkeit der mutanten Urokinase nicht wesentlich modifizierten. 300 PE des Mutanten enthielten nur 0,76 PE durch S-2444 chromogene Aktivität. Dies betrug nur etwa 0,25% der S-2444 Aktivität von nativer Urokinase. Es wurde gefolgert, daß der Mutant entweder einige restliche S-2444 Aktivität aufwies oder daß eine beschränkte Umwandlung in die zweikettige Form erfolgt war.
Es wurde ein Vergleich der Aktivität von Plasmin auf [Lys&sub1;&sub3;&sub6;→ Δ;Phe&sub1;&sub5;&sub7;Lys&sub1;&sub5;&sub8;→Δ] Humanurokinase und rekombinante einkettige, native Urokinase vorgenommen. Wenn 0,0625 Einheiten Plasmin 300 PE (Fibrinplatte) des Mutanten zugegeben und 1 Stunde bei 37ºC inkubiert wurden, wurde ein Enzym produziert, das eine S-2444 Aktivität von 10,36 PE aufwies, während eine geringere Menge Plasmin (0,005 Einheiten), die über einen kürzeren Zeitraum (15 Minuten) bei 37ºC mit 50 PE rekombinanter, einkettiger, nativer Urokinase inkubiert wurde, Enzyme mit einer viel höheren S-2444-Aktivität ( 45 PE) ergab. Die vergleichbaren S-2444 spezifischen Aktivitäten von mit zwei Ketten und Plasmin inkubierter, rekombinanter nativer und rekombinanter mutanter Urokinasen sind nachstehend angeführt.
Enzym S-2444-Aktivität (PE·10³/mg) Rekombinante einkettige HUK 89,0
Zweikettige rekombinante HUK 102,2
Zweikettige native HUK 92,7
Mutante rekombinante einkettige HUK 3,3
Der Mutant ist daher weit weniger anfällig für Plasmin-Aktivierung als das native Molekül.

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Claims

1. Zusammensetzung enthaltend einkettige Urokinase, die gegen proteolytische Umwandlung zu zweikettiger Urokinase resistent ist und fibrinolytische Aktivität besitzt, wobei die genannte Urokinase keine native einkettige Urokinase und keine Urokinase ist, die eine Aminosäuresequenz aufweist, die identisch mit der natürlichen Human-Prourokinase gemäß Fig. 1 ist, jedoch einen Rest einer sauren Aminosäure in Stellung 157 und gegebenenfalls Methionin am N-Terminus aufweist.

2. Zusammensetzung nach Anspruch 1, worin die Urokinase eine Aminosäuresequenzvariante ist.

3. Zusammensetzung nach Anspruch 2, worin die Urokinase menschlichen Ursprungs ist und die Variation eine mutante Aminosäuresequenz im Bereich der Reste Arg&sub1;&sub5;&sub6; bis Lys&sub1;&sub5;&sub8; umfaßt.

4. Zusammensetzung nach Anspruch 3, worin die Urokinase Phe&sub1;&sub5;&sub7;Lys&sub1;&sub5;&sub8; →Δ Urokinase ist.

5. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 2 bis 4, worin die Variation auch eine mutante Aminosäuresequenz im Bereich der Reste Lys&sub1;&sub3;&sub5; bis Lys&sub1;&sub3;&sub6; umfaßt.

6. Zusammensetzung enthaltend Urokinase, die fibrinolytische Aktivität besitzt und eine Aminosäuresequenzvariante von Humanurokinase ist, wobei die Variante eine mutante Aminosäuresequenz im Bereich der Reste Lys&sub1;&sub3;&sub5; bis Lys&sub1;&sub3;&sub6; aufweist, so daß die Variante gegen proteolytische Spaltung an der Lys&sub1;&sub3;&sub5;Lys&sub1;&sub3;&sub6; Stelle resistent ist; wobei die genannte Urokinase keine Urokinase ist, die eine Aminosäuresequenz identisch mit der natürlichen Human-Prourokinase gemäß Fig. 1 besitzt, jedoch einen Rest einer nicht-basischen Aminosäure in Stellung 135 und gegebenenfalls Methionin am N-Terminus aufweist.

7. Zusammensetzung nach Anspruch 6, worin die Urokinase Lys&sub1;&sub3;&sub6;→Δ- Urokinase ist.

8. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 2 bis 6, worin die Urokinase ein Löschungsmutant von Urokinase ist.

9. Zusammensetzung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, worin die Urokinase gegen bakterielle Protease resistent ist.

10. Zusammensetzung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, worin die Urokinase gegen Plasmin resistent ist.

11. Zusammensetzung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, worin die proteaseresistente einkettige Urokinase bei Inkubation mit Humanplasmin in zweikettige Urokinase mit einer Rate von weniger als etwa 10% der Umwandlungsrate von nativer einkettiger Urokinase umgewandelt wird.

12. Zusammensetzung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, worin die proteaseresistente Urokinase weniger anfällig gegenüber proteolytischer Umwandlung in zweikettige Urokinase ist als native einkettige Urokinase.

13. Zusammensetzung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, worin die Urokinase aus Lys&sub1;&sub3;&sub6;→Δ -Humanurokinase, Phe&sub1;&sub5;&sub7; Lys&sub1;&sub5;&sub8;→Δ Humanurokinase, Phe&sub1;&sub5;&sub7; Lys&sub1;&sub5;&sub8; Lys&sub1;&sub3;&sub6; →Δ Humanurokinase, Arg&sub1;&sub5;&sub8; -Humanurokinase, His&sub1;&sub5;&sub8; -Humanurokinase, Gly&sub1;&sub5;&sub8; -Humanurokinase, Ser&sub1;&sub5;&sub8; -Humanurokinase, Tyr&sub1;&sub5;&sub8; -Humanurokinase, Arg&sub1;&sub5;&sub6; → His; Lys&sub1;&sub5;&sub8; → Ser -Humanurokinase, Arg&sub1;&sub5;&sub6; Lys&sub1;&sub5;&sub8; → Δ -Humanurokinase, Arg&sub1;&sub5;&sub6;Phe&sub1;&sub5;&sub7;Lys&sub1;&sub5;&sub8;→Δ -Humanurokinase, Lys&sub1;&sub5;&sub8;Ile&sub1;&sub5;&sub9; → Lys&sub1;&sub5;&sub8; Pro Ile&sub1;&sub5;&sub9; -Humanurokinase, Phe&sub1;&sub5;&sub7; Lys&sub1;&sub5;&sub8; →Δ; Arg&sub1;&sub5;&sub6; → His -Humanurokinase und Arg&sub1;&sub5;&sub6;Phe&sub1;&sub5;&sub7;→Δ; Lys&sub1;&sub5;&sub8; → Gly -Humanurokinase ausgewählt wird.

14. Zusammensetzung nach einem der vorhergehenden Ansprüche enthaltend eine therapeutisch wirksame Konzentration der proteaseresistenten Urokinase vermischt mit einem pharmakologisch verträglichen Excipiens.

15. Zusammensetzung nach Anspruch 14, worin die Konzentration etwa von 10.000 bis 75.000 IE Urokinase/ml beträgt.

16. Nukleinsäure, die für eine einkettige Urokinase kodiert, die gegen proteolytische Umwandlung in zweikettige Urokinase resistent ist, fibrinolytische Aktivität besitzt und eine Aminosäuresequenzvariante von Urokinase, aber keine Urokinase ist, die eine Aminosäuresequenz identisch mit der natürlichen Human-Prourokinase gemäß Fig. 1 besitzt, jedoch einen Rest einer sauren Aminosäure in Stellung 157 und gegebenenfalls Methionin am N-terminus aufweist.

17. Nukleinsäure nach Anspruch 16, worin die Urokinase menschlichen Ursprungs ist und die Variation eine mutante Aminosäuresequenz im Bereich der Reste Arg&sub1;&sub5;&sub6; bis Lys&sub1;&sub5;&sub8; aufweist.

18. Nukleinsäure nach Anspruch 16 oder 17, worin die Variation weiters eine mutante Aminosäuresequenz im Bereich der Reste Lys&sub1;&sub3;&sub5; bis Lys&sub1;&sub3;&sub6; aufweist.

19. Nukleinsäure, die für eine Urokinase mit fibrinolytischer Aktivität kodiert und eine Aminosäuresequenzvariante von Humanurokinase ist, wobei die Variante eine mutante Aminosäuresequenz im Bereich der Reste Lys&sub1;&sub3;&sub5; bis Lys&sub1;&sub3;&sub6; aufweist, so daß die Variante gegen proteolytische Spaltung an der Lys&sub1;&sub3;&sub5;Lys&sub1;&sub3;&sub6; Stelle resistent, aber keine Urokinase ist, die eine Aminosäuresequenz identisch mit der natürlichen Human-Prourokinase gemäß Fig. 1 besitzt, jedoch einen Rest einer nicht-basischen Aminosäure in Stellung 135 und gegebenenfalls Methionin am N-Terminus aufweist.

20. Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 16 bis 19, worin die Variante ein Löschungsmutant des Urokinasegens ist.

21. Nukleinsäure nach Anspruch 20, worin der Mutant Lys136→Δ -Humanurokinase ist.

22. Replizierbarer Vektor, der eine Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 16 bis 21 enthält.

23. Rekombinante Wirtszelle, die mit einem Vektor nach Anspruch 20 transformiert ist.

24. Verfahren zur Herstellung einer Variante von Urokinase, umfassend (a) die Bereitstellung von Nukleinsäure, die für ein fibrinolytisch aktive Aminosäuresequenzvariante von einkettiger Urokinase kodiert, welche Variante gegen proteolytische Umwandlung in zweikettige Urokinase resistent, aber keine Urokinase ist, die eine Aminosäuresequenz identisch mit der natürlichen Human-Prourokinase gemäß Fig. 1 besitzt, jedoch einen Rest einer sauren Aminosäure in Stellung 157 und gegebenenfalls Methionin am N-Terminus aufweist, (b) Transformieren einer Wirtszelle mit der Nukleinsäure nach Schritt (a), (c) Kultivieren der transformierten Wirtszelle, bis sich die Urokinasevariante in der Kultur ansammelt und (d) Gewinnen der Urokinasevariante aus der Kultur.

25. Verfahren zur Herstellung einer Variante von Urokinase umfassend (a) Bereitstellung einer Nukleinsaure, die für eine Urokinase kodiert, die fibrinolytische Aktivität besitzt und eine Aminosäuresequenzvariante von Humanurokinase ist, wobei die Variante eine mutante Aminosäuresequenz im Bereich der Reste Lys&sub1;&sub3;&sub5; bis Lys&sub1;&sub3;&sub6; aufweist, so daß die Variante gegen proteolytische Spaltung an der Lys&sub1;&sub3;&sub5;Lys&sub1;&sub3;&sub6; Stelle resistent, aber keine Urokinase ist, die eine Aminosäuresequenz identisch mit der natürlichen Human-Prourokinase gemäß Fig. 1 besitzt, jedoch einen Rest einer nichtbasischen Aminosäure in Stellung 135 und gegebenenfalls Methionin am N-Terminus aufweist; (b) Transformieren einer Wirtszelle mit der Nukleinsäure nach Schritt (a), (c) Kultivieren einer transformierten Wirtszelle, bis sich die Urokinasevariante in der Kultur ansammelt und (d) Gewinnen der Urokinasevariante aus der Kultur.

26. Verfahren nach Anspruch 24 oder 25, worin die Wirtszelle eine prokaryote Zelle ist.

27. Verfahren nach einem der Ansprüche 24 bis 26, worin die Urokinase aus der Kultur nach einem Verfahren gewonnen wird, das

(a) Ernten von refraktilen Körpern, die die einkettige Urokinase enthalten;

(b) Solubilisieren der in den refraktilen Körpern enthaltenen Urokinase;

(c) Adsorbieren unerwünschter Proteine an einem Kationenaustauscherharz;

(d) Adsorbieren der solubilisierten Urokinase an Hydroxylapatit und

(e) Eluieren der Urokinase aus dem Hydroxylapatit umfaßt.

28. Verfahren nach einem der Ansprüche 24 bis 27, worin die Urokinase nach einem Verfahren gewonnen wird, das weder die Verwendung eines exogen zugegebenen Proteolyseinhibitors noch von Benzamidinsepharose umfaßt.

29. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 13 für die Verwendung bei der Behandlung einer vaskulären Embolie.

30. Zusammensetzung nach Anspruch 29, worin die Urokinase Lys&sub1;&sub3;&sub5;Phe&sub1;&sub5;&sub7; Lys&sub1;&sub5;&sub8;→Δ ist, für die Verabreichung durch intravenöse Infusion bei einer Dosierung von etwa 4.000 IE/kg/h.

31. Zusammensetzung nach Anspruch 30, worin die Urokinase Lys&sub1;&sub3;&sub6;→ Δ für die Verabreichung durch intravenöse Infusion bei einer Dosierung von etwa 4.000 IE/kg/h ist.

32. Proteaseresistente, modifizierte Humanurokinase mit einer mutierten Aminosäuresequenz bei (a) den Resten Arg&sub1;&sub5;&sub6; Phe&sub1;&sub5;&sub7;Lys&sub1;&sub5;&sub8;, (b) den Resten Lys&sub1;&sub3;&sub5;Lys&sub1;&sub3;&sub6; oder (c) den Resten Arg&sub1;&sub5;&sub6;Phe&sub1;&sub5;&sub7;Lys&sub1;&sub5;&sub8; und den Resten Lys&sub1;&sub3;&sub5;Lys&sub1;&sub3;&sub6;; die (i) keine Urokinase ist, die eine Aminosäuresequenz identisch mit der natürlichen Human-Prourokinase nach Fig. 1 besitzt, jedoch einen Rest einer sauren Aminosäure in Stellung 157 und gegebenenfalls Methionin am N-Terminus aufweist, und (ii) keine Urokinase ist, die eine Aminosäuresequenz identisch mit der natürlichen Human-Prourokinase gemäß Fig. 1 besitzt, jedoch einen Rest einer nicht-basischen Aminosäure in Stellung 135 und gegebenenfalls Methionin am N-Terminus aufweist.