DE3686599T2

DE3686599T2 - Verfahren zur bestimmung der leichten kette von myosin.

Info

Publication number: DE3686599T2
Application number: DE19863686599
Authority: DE
Inventors: Shinichi Chino; Masao Ishige; Hirohisa Kato; Manami Kuroda; Masahito Sugi; Yoshio Yazaki
Original assignee: Yamasa Shoyu KK
Current assignee: Yamasa Shoyu KK
Priority date: 1985-06-13
Filing date: 1986-06-12
Publication date: 1993-01-07
Anticipated expiration: 2006-06-13
Also published as: JPH0625762B2; EP0205177A3; JPH02211896A; EP0205177B1; DE3686599D1; EP0478017A1; CA1289870C; EP0205177A2; JPS61286752A

Description

Technisches gebiet

Die vorliegende Erfindung betrifft eine Methode zum immunologischen Bestimmen von freien leichten Myosinketten im Blut.

Stand der Technik

La Due et al haben darüber berichtet, daß die Glutamin-Oxalessigsäure-Transaminase(GOT)-Aktivität im Serum eines Patienten, der an einem akuten Herzinfarkt leidet, ansteigt(J.S.La Due et al, Science, 120, 497(1954)), und daraufhin wurden erfolgreiche Methoden zur biochemischen Diagnose von Herzinfarkt entwickelt, indem die Aktivitäten der aufgrund von ischämischer Herzdysfunktion aus Herzzellen in das Blut übergehenden Enzyme untersucht wurden. Dabei können die Aktivitäten von GOT, Laktatdehydrogenase( LDH) ,und Kreatinphosphokinase(CPK), relativ leicht bestimmt werden, und es hat sich gezeigt, daß die Enzymaktivität in den Seren von Patienten mit akutem Herzinfarkt um 90% oder mehr ansteigt(N.S. Sarensen, Acta. Med. Scand. 174, 725(1963)). Auch die biochemischen Diagnoseverfahren gewinnen unter dem Gesichtspunkt der Therapieauswertung und der Prognosebeurteilung an Bedeutung nicht nur für die Diagnose von Herzinfarkten, sondern auch als Methode zum Feststellen, in welchem Ausmaß die Herzmuskeln infarziert sind.
Diese biochemischen Diagnose-Methoden sind allerdings mit Problemen verbunden, wie z.B. (1) einem Problem bezüglich der Spezifität für das Zielenzym aufgrund der Gegenwart von Isozymen, die von anderen Organen abgesondert worden sind,(2) die Ungewißheit bezüglich der Beziehung zwischen der Menge des aus dem Herzmuskel im infarzierten Abschnitt in das Blut abfließenden Enzyms und dem Ausmaß des Herzinfarkts, und(3) die Beendigung dieser Wechselbeziehung mit der Menge an infarzierten Herzmuskeln bei der Verwendung eines thrombolytischen Wirkstoffes, wie z.B. Urokinase oder eines Gewebeplasminogenaktivators, der seit kurzem zur Therapie von Herzinfarkt zur Verfügung steht, da diese Medikamente ein sofortiges Abfließen der oben erwähnten zellplasmatischen Enzyme in das Blut(Auswascheffekt) bewirken.
Als eine der Markierungssubstanzen, die in einem alternativen Herzinfarkt- Diagnoseverfahren für solche biochemischen Diagnoseverfahren des Standes der Technik neue Anzeigesubstanzen darstellen können, hat das Herzmyosin besondere Beachtung gefunden. Ein Herzmyosinmolekül liegt unter den Einweißbausteinen der Herzzellen im Überfluß(60%) vor, ist ein strukturelles Protein mit einem Molekulargewicht von ca. 500 000, dem bei dem Mechanismus der Muskelkontraktion die zentrale Rolle zukommt, und weist eine Struktur-Untereinheit mit zwei schweren Ketten mit einem Molekulargewicht von 200 000, zwei leichten Ketten I(LCI) mit einem Molekulargewicht von 27 000 und zwei leichten Ketten (LCII) mit einem Molekulargewicht von 20 000 auf. Man ist der Ansicht ,daß die leichte Kette des Herzmyosins oder ein Fragment derselben den Abbauprozeß von Herzzellen aufgrund von Ischämie unmittelbar reflektiert, da sein Abfließen in das Blut von einem Abbau der Zellmembranen aufgrund von ischämischer Herzdysfunktion begleitet wird. Den Beweis dafür liefert ein Radioimmunoassayverfahren unter Verwendung eines Kaninchen-Antiserums mit einer Spezifität für leichte Ketten des Herzmyosins(R.Nagai et al, Biochem. Biophys. Res. Commun., 86, 683(1979), und es wird auch berichtet, daß sich Herzmyosin vor allem bei der klinischen Diagnose von Herzinfarkten anwenden läßt(Ryozo Nagai et al, Journal of Internal Medicine of Japan, 70, 16(1981); Katus et al, Am. J.Cardiol., 54, 964-970(1984)).
Als Markierungssubstanz, die aufgrund ischämischer Dysfunktion in das Blut abfließt, hat die leichte Kette des Hermyosins die folgenden spezifischen Merkmale:
(1) Das Herzmyosin liegt als Eiweißbaustein in den Herzzellen im Überschuß vor.
(2) Das Herzmyosin hat eine Struktur-Untereinheit, umfassend schwere Ketten und leichte Ketten, kann leicht durch Änderung des pH-Wertes usw. aus dem Myosin-Molekül abdissoziiert werden, wobei die leichte Kette mit dem niedrigeren Molekulargewicht leicht aus den Zellen abgegeben wird.
(3) Die leichte Kette des Herzmyosins enthält nur eine kleine Menge an Thiolgruppen, ist ein biochemisch stabiles Protein, und spricht nicht auf die Wirkung von im Gewebe oder Blut vorliegenden proteolytischen Enzymen an.
(4) Sogar bei einem Patienten, dem ein thrombolytischer Wirkstoff, wie z.B. Urokinase verabreicht worden ist, wird die leichte Kette des Herzmyosins nicht von dem gleichzeitigen Auswascheffekt beeinträchtigt, und die zeitliche Änderung des Herzmyosinspiegels der leichten Kette im Blut stimmt mit dem Muster des Abbauprozeßes der Herzzellen aufgrund von Ischämie überein.
Bezüglich Verfahren zur Durchführung immunologischer Analyse der leichten Kette des Herzmyosins unter Verwendung eines Antiserums mit einer Spezifität für die leichte Kette des menschlichen Herzmyosins, die hier noch nicht erwähnt worden sind, gibt es die nachstehenden Berichte.
Trahern et al, Am.J.Cardiol, 41, 4, 641-645 (1978).
Khaw et al, Circulation, 58, 1130-1136(1979).
Katus et al, Circulation, 60 (Suppl. II) 139 (1979).
Es gibt ferner Berichte über Verfahren, bei welchen ein monoklonaler Antikörper mit einer Spezifität für das Herzmyosin als Antikörper beim Immunoassay-Verfahren eingesetzt wird; sie sind im folgenden genannt.
Haber et al., J.Mol.Cell.Cardiol. 14, Suppl.3, 139-146(1982);
Katus et al., Molecular Immunology, 19, 3, 451-455(1982)
Bei der immunologischen Analyse der leichten Kette des Herzmyosins weist die Methode der Anwendung eines monoklonalen Antikörpers mit einer Spezifität für die leichte Kette des Herzmyosins als Antikörperreagens, verglichen mit der Methode, bei welcher ein Antiserum eingesetzt wird, Vorteile auf, die z.B. darin bestehen, daß (1) der Antikörper eine hohe Spezifität für die leichte Kette des Herzmyosins aufweist und eine geringe Kreuzreaktion mit der leichten Kette eines Skelettmyosins zeigt, und daß (2) der Antikörper mit der hohen Spezifität in großer Menge und kontinuierlich zugeführt werden kann, und daher für die praktische Durchführung der Diagnose eines Herzinfarkts durch Analyse einer leichten Kette des Herzmyosins besser geeignet ist.
Andererseits fließt auch bei Skelettmuskelerkrankungen, wie z.B. der multiplen Muskelentzündung oder der Muskeldystrophie nach Duchene, eine leichte Kette des Skelettmyosins, ähnlich wie bei einer Herzkrankheit, in das Blut des Patienten ab und wird ein Indikator für den Abbau des Muskelgewebes, wie durch das Radioimmunoassay-Verfahren unter Verwendung eines Antikörpers einer leichten Kette eines Anti-Herzmyosins mit großer Kreuzreaktivität mit der leichten Kette des Skelettmyosins festgestellt wurde(Nippon Rinsho, 40, Suppl. in Autumn, 107- 111(1982)). Eine immunologische Analyse davon ist jedoch noch nicht durchgeführt worden.
Bei der immunologischen Analyse einer leichten Kette des Herzmyosins unter Verwendung eines monoklonalen Antikörpers des Standes der Technik sind Schwierigkeiten aufgetaucht derart, daß z.B.(1) die meisten der mittels Verwendung der isolierten und gereinigten leichten Kette des Herzmyosins erhaltenen monoklonalen Antikörper, die für die isolierte und gereinigte leichte Kette des Herzmyosins eine Spezifität aufweisen, die leichten Ketten des Herzmyosins im Blut eines Herzinfarktpatienten nicht binden, was durch unsere Versuche bestätigt wurde, und keine solche Möglichkeit einer Analyse der leichten Kette des Herzmyosins im menschlichen Serum untersucht worden ist und daß (2), da die für die Standardsubstanz verwendete leichte Kette des Herzmyosins oder die markierte leichte Kette des Herzmyosins aus dem Menschen gewonnen wird, es schwierig ist, eine solche leichte Kette des Herzmyosins herzustellen, um es bei diesen Immunoassay-Systemen als Diagnose-Reagens praktisch anzuwenden
Die vorliegende Erfindung dient der Lösung dieser Probleme durch Zurverfügungstellen eines Verfahrens der immunologischen Analyse der leichten Myosinkette als Diagnoseverfahren bei Herzinfarkt oder Skelettmuskelerkrankung.

Zusammenfassung der Erfindung

Wir haben verschiedene Untersuchungen durchgeführt, um eine Methode zur Verfügung zu stellen, mit welcher die leichte Myosinkette immunologisch analysiert werden kann und die als Diagnoseverfahren bei Muskelerkrankungen praktische Anwendung finden kann, und als Ergebnis davon haben wir erfolgreich monoklonale Antikörper erhalten, die nicht nur mit der gereinigten leichten Kette des menschlichen Myosins, sondern auch mit der leichten Myosinkette im Serum eines an einer Muskelerkrankung, wie z.B. einem Herzinfarkt, leidenden Patienten reagieren können. Ferner hat man durch Auswählen eines solchen monoklonalen Antikörpers aus diesen monoklonalen Antikörpern, der mit der leichten Myosinkette eines xenogenen Tiers, wie eines Schweins, eines Hundes oder Rindes, die im wesentlichen der leichten Kette des menschlichen Myosins gleicht, reagieren kann, und durch Einsetzen desselben bei der immunologischen Analyse der leichten Myosinkette, die vorliegende Erfindung verwirklicht.
Genauer gesagt, stellt das Verfahren der vorliegenden Erfindung eine Methode zum immunologischen Analysieren der leichten Myosinketten in einer menschlichen Serumprobe zur Verfügung, in welcher als Antikörperreagens ein monoklonaler Antikörper mit einer Spezifität für die leichte Myosinkette eingesetzt wird, der die gemeinsame Antigendeterminante der leichten Myosinkette im menschlichen Serum und der leichten Myosinkette mindestens eines xenogenen Tiers erkennt, und in welcher als Antigenreagens die leichte Kette eines xenogenen Tiers eingesetzt wird, an welche der genannte monoklonale Antikörper gebunden werden kann.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Fig.1 ist eine graphische Darstellung, die die in Beispiel 1 des Verfahrens der vorliegenden Erfindung erhaltenen Standardkurven darstellt;
Fig.2 stellt die in Beispiel 3 erhaltenen Standardkurven dar;
Fig.3 stellt die in Beispiel 4 erhaltenen Standardkurven dar; und
Fig.4 ist eine graphische Darstellung, die den sich mit der Zeit ändernden Gehalt an der leichten Kette des Herzmyosins im Serum eines Herzinfarktpatienten , wie in Beispiel 5 beschrieben, darstellt.

Detaillierte Beschreibung der Erfindung

Beim Verfahren der vorliegenden Erfindung bezieht sich der Ausdruck "leichte Myosinkette" auf die leichte Kette I und/oder die leichte Kette II des Herzmyosins(ventrikular oder atrial) oder Fragmente derselben, oder auf die leichte Kette I, die leichte Kette II und/oder die leichte Kette III des Skelettmyosins oder Fragmente derselben.
Der Ausdruck "monoklonaler Antikörper mit einer Spezifität für die leichte Myosinkette" bezieht sich auf einen monoklonalen Antikörper mit einer Bindungsfähigkeit an die leichte Kette I und/oder die leichte Kette II des Herzmyosins oder an Fragmente derselben, oder auf einen monoklonalen Antikörper mit einer Bindungsfähigkeit an die leichte Kette I, die leichte Kette II und/oder die leichte Kette III des Skelettmyosins oder an Fragmente derselben.
Der Ausdruck "xenogenes Tier" betrifft in erster Linie Säugetiere mit Ausnahme des Menschen, wie z.B. Affen, Hunde, Katzen, Schweine, Rinder, Pferde, Ziegen, Schafe, Kaninchen, Mäuse, Ratten, Meerschweinchen, Hamster und Eichhörnchen.
Ferner ist in der vorliegenden Erfindung der Ausdruck "immunologische Analyse"(Immunoassay) ein umfassender Begriff für die Methoden, die auf dem Prinzip gegründet sind, daß das Analysesystem grundsätzlich den Unterschied in der Bildung des Antigen-Antikörper-Komplexes in Abhängigkeit von der vorhandenen Menge eines Antigens in einer Probe mit chemischen oder physikalischen Mitteln entdeckt und zwar unter Verwendung des Antigens und der Bindungsfähigkeit eines Antikörpers mit einer Spezifität dafür, und die Menge an Antigen in der Probe in bezug auf die Menge in einer Standardprobe, deren Antigengehalt bekannt ist, bestimmt. Eine große Zahl solcher immunologischer Analysen sind bis jetzt schon entwickelt worden. Beispielsweise lassen sich Analysesystem grob in die Agglutinationsreaktions- Methode (Immunonephelometrie), die Agglutinationshemm-Methode, die Immunodiffusions-Methode, die Lasernephelometrie und die kompetitive Reaktions-Methode(Flüssig- oder Festphasen-Methode, die Sandwich-Analyse und die immunometrische Analyse einteilen.Als Analysesysteme, die Markierungssubstanzen enthalten, sind, je nach Art der Markierungssubstanzen, die folgenden bekannt: das Radioimmunoassay(RIA)-Verfahren, das Radioisotope, wie z.B.¹²&sup5;I, ¹³¹I,³H und ¹&sup4;C, verwendet;das Enzym-Immunoassay(EIA)-Verfahren, das Enzyme, wie z.B. β-Galaktosidase, Peroxidase, alkalische Phosphatase und Acetylcholinesterase, einsetzt; das Fluoreszenz-Immunoassay-Verfahren(FIA), das fluoreszierende Farbstoffe, wie Umbelliferon, Fluorescein, Rhodamin, Fluoresceinisothiocyanat und Phycoerythrin verwendet; das Chemilumineszenz-Immunoassay-Verfahren, das eine Chemilumineszenz- Substanz, z.B. Luminol, einsetzt; das Metall-Immunoassay-Verfahren und das Spin-Immunoassay-Verfahren. Diese Assay-Verfahren lassen sich bei der Methode vorliegender Erfindung anwenden, sofern sie auf dem genannten Prinzip basieren und für das Assay-System der leichten Myosinkette anwendbar sind.
Bei vorliegender Erfindung erfordert die Anwendung dieser individuellen Immunoassay-Verfahren keine besonderen Bedingungen oder Verfahrensschritte. Unter Einbeziehung üblicher technischer Überlegungen der Experten bei der herkömmlichen Vorgehensweise, den Einrichtungen und Bedingungen bei jedem Verfahren, kann ein Analysessystem darin bestehen, daß ein monoklonaler Antikörper mit den genannten Eigenschaften als Antikörperreagens und eine leichte Myosinkette eines xenogenen Tiers, die von dem genannten monoklonalen Antikörper als Antigenreagens erkannt wird,ausgewählt wird, so daß er für das Assay-Verfahren der leichten Kette des Herzmyosins oder das Assay-Verfahren der leichten Kette des Muskelmyosins eingesetzt werden kann. Was die Einzelheiten bezüglich allgemeiner Techniken dieser Methoden betrifft, so wird auf allgemeine Nachschlagewerke und Fachliteratur hingewiesen(z.B. Minoru Irie, ed "Radioimmunoassay" (Kabushiki Kaisha Kodansha, veröffentlicht am 10.April 1974);Minuro Irie, ed. "Radioimmunoassay, second series"(Kabushiki Kaisha Kodansha, veröffentlicht am 1.Mai 1979); Eiji Ishikawa et al, ed. "'Enzyme Immunoassay", 2.Ausgabe (Kabushiki Kaisha Igaku Shoin,veröffentlicht am 15.Dezember 1982); Nippon Rinsho, 42, Ergänzungsband, Frühling 1984 "Handbook of Clinical Immunology"(Kabushiki Kaisha Nippon Rinshosha, veröffentlicht am 20.März 1984), 1198-1227; H.V. Bunachis et al,"Methods in Enzymology" 70, ''Immunochemical Techniques Part A"(Academic Press, 1980); J.J. Langon et al, "Methods in Enzymology" 73, "Immunochemical Techniques Part B",sowie 74"Immunochemical Techniques Part C"(Academic Press, 1981)).
Analysesysteme der für diese immunologischen Analysen typischen Methoden sind nachstehend beschrieben.

(1) Die Agglutinations-Reaktionsmethode(Immunonephelometrie):

Einer Probe wird eine Antikörper mit einer Spezifität für das zu messende Antigen oder ein auf einem Träger, wie z.B. Erythrozyt- oder Polymerlatexteilchen, immobilisierter Antikörper zugegeben, und die Menge des Antigen-AntikörperKomplexes, die durch die Antigen-Antikörperreaktion gebildet worden ist, wird aufgrund des Anstiegs der Trübung oder entsprechend dem Grad der Lichtstreuung zwecks Bestimmung der Antigenmenge gemessen.

(2) Kompetitive Reaktionsmethode:

Das Antigen in einer Probe und eine vorbestimmte Menge eines markierten Antigens werden einer kompetitiven Reaktion mit einem Antikörper unterworfen; das nicht reagierte markierte Antigen (F) wird vom markierten Antigen(B),das an den Antikörper gebunden ist, abgetrennt(BF-Trennung); und die jeweilige Markierungsmenge von 13 und F wird zwecks quantitativer Bestimmung der Antigenmenge in der Probe gemessen.
Es gibt die Flüssigphasenmethode, bei welcher ein löslicher Antikörper als Antikörper und Ammoniumsulfat, Polyäthylenglykol und/oder ein zweiter Antikörper mit einer Spezifität für den oben genannten Antikörper für die BF-Trennung verwendet werden, und die Festphasenmethode, bei welcher ein Festphasen-Antikörper als Antikörper oder ein löslicher Antikörper als erster Antikörper und ein Festphasenantikörper als zweiter Antikörper eingesetzt werden.

3. Sandwich-Assay:

Man läßt das Antigen in der Probe mit einem auf einer festen Trägersubstanz immobilisierten Antikörper reagieren. Dann läßt man das Antigen mit einem markierten zweiten Antikörper reagieren, der die Stelle erkennt, an die der erste Antikörper nicht gebunden ist. Die flüssige Phase wird von der festen Phase getrennt und die Markierungsmenge in der flüssigen Phase oder in der festen Phase wird zwecks quantitativer Bestimmung der Antigenmenge in der Probe gemessen.
In einer Abwandlung dieses Verfahrens, die eine indirekte Markierungsmethode umfaßt, wird ohne direkte Markierung des zweiten Antikörpers unter Verwendung eines zweiten Antikörpers mit einen Antigen, das von dem zu analysierenden Antigen verschieden ist, oder mit einem Bindeglied(eine Verbindung wie z.B. Biotin), das daran gebunden ist, nach Abschluß der Reaktion zwischen dem zweiten Antikörper mit dem zu analysierenden Antigen und dem ersten Antikörper ein markiertes Material eines dritten Antikörpers mit einer Spezifität für das an den zweiten Antikörper gebundene Antigen öder einer bindungsfähigen Substanz(Avidin) mit einer Spezifität für das Bindeglied mit der Reaktionsmischung umgesetzt, und die flüssige Phase wird von der festen Phase abgetrennt, wobei die Markierungsmenge in den jeweiligen Phasen gemessen wird. Als Kombination des Bindeglieds und der bindungsfähigen Substanz ist die Verwendung eines Biotin-Avidin-Systems weit verbreitet.

4. Immunometrischer Assay:

Das Antigen in einer Probe und ein Festphasenantigen werden einer kompetitiven Reaktion mit einer vorbestimmten Menge eines markierten Antikörpers unterworfen; die flüssige Phase wird von der festen Phase abgetrennt; und die Markierungsmenge wird in beiden Phasen gemessen, um die Menge des Antigens in der Probe zu ermitteln.
Beim Verfahren der vorliegenden Erfindung bezieht sich der Begriff "Antikörperreagens" auf einen Antikörper, wie z.B. einen löslichen Antikörper , einen Festphasenantikörper oder einen markierten Antikörper mit einer Spezifität für das zu analysierende Antigen, das in den oben beschriebenen immunologischen Analyseverfahren verwendet wird, oder einen Antikörper mit einem Bindeglied mit einer Spezifität für ein markiertes Material, das bei der direkten Markierungsmethode eingesetzt wird.
Beim Verfahren der vorliegenden Erfindung bedeutet der Begriff "Antigenreagens" ein Antigen, wie z.B. ein Antigen für eine Standardlösung, ein Festphasenantigen oder ein markiertes Antigen, das in den oben beschriebenen immunologischen Analyseverfahren eingesetzt wird.
Herstellungsverfahren dieser Reaktionsmittel sind nachfolgend beschrieben:

1. Herstellung des Antigens(leichte Myosinkette)

Myosin läßt sich in herkömmlicher Weise durch Extraktion aus einem Herzmuskel(Ventrikular- oder Atrialmuskel) oder einem Skelettmuskel eines Tieres mit einer leichten Myosinkette, die eine mit der leichten Kette des menschlichen Myosins gemeinsame(d.h. immunologisch gleiche) Antigendeterminante aufweist, und anschließende Reinigung herstellen. Die Extraktion von Myosin wird im allgemeinen unter-Verwendung einer Salzlösung, wie z.B. 0,2 bis 0,6 M Kaliumchlorid, bei einem pH-Wert von 6,5 bis 7,0, durchgeführt. Die Herstellung einer leichten Myosinkette kann durch geeignete Anwendung eines bekannten Verfahrens erfolgen, wie z.B. der Ionenaustauschchromatographie unter Verwendung eines Ionenaustauschers, wie z.B. DEAE-Sephadex A-25, DEAE-Sephadex A-50; der Gelfiltrationschromatographie unter Verwendung eines Gelfilters, wie z.B. Sephadex G-200; der Affinitätschromatographie; der Ausfällmethode mit einem Chelatbildner; der Harnstoff- oder Guanidin-Hydrochloridbehandlung; der präparativen Elektrophorese; der Dialyse; und mit der Behandlung mit hochkonzentrierter Salzlösung(siehe "Course of Biochemical Experiments 15, Muscle"(Kabushiki Kaisha Tokyo Kagaku Dojin, veröffentlicht am 25.November 1975), 3-12; K.Nagai et al, Biochem. Biophys.Res.Commun.,86, 683(1979); A.M.Katz et al., Cir.Res.,19,611-621(1965); W. T.Perrie et al., Biochem.J., 119,31-38(1970)).
Beim Analysesystem der leichten Kette des Herzmyosins der vorliegenden Erfindung können die leichte Kette I des Herzmyosins, die leichte Kette II des Herzmyosins, die von einem xenogenen Tier abgeleitet ist, und eine Mischung davon eingesetzt werden. Das gilt auch für den Fall des Analysesystems der leichten Kette des Skelettmyosins.

2. Herstellung des Antikörpers

Die Herstellung eines beim Verfahren vorliegender Erfindung einzusetzenden monoklonalen Antikörpers mit den vorstehenden Eigenschaften läßt sich durch Anwendung der bekannten Zellverschmelzungsmethode, der Transformationsmethode mit dem EP-Virus usw. durchführen. Die Zellverschmelzungsmethode ist für die Herstellung eines Antikörpers in größerem Maßstab besser geeignet, und die Herstellungsschritte für den beim Verfahren vorliegender Erfindung einzusetzenden Antikörper mittels der Zellverschmelzungsmethode sind nachstehend beschrieben. Bezüglich Einzelheiten im Hinblick auf allgemeine Vorgehensweisen der Zellverschmelzungsmethode wird auf die Beschreibungen in der entsprechenden Literatur oder in Berichten(siehe z.B. Tatsuo Iwasaki et al., "Monoclonal Antibody-Hybridoma and ELISA" (Kabushiki Kaisha Kodansha, veröffentlicht am 20.2. 1983); G.Köhler et al, Eur.J.Immunol.,6,511-519(1976); M.Shulman et al, Nature, 276, 269-270(1978)) hingewiesen.

(a) Herstellung von Antikörper erzeugenden Zellen

Mit der in der oben beschriebenen Weise aus einem Herz- oder Skelettmuskel von Tieren oder Menschen erhaltenen leichten Myosinkette wird ein xenogenes Tier immunisiert und die Antikörper erzeugenden Zellen, wie z.B. Milzzellen, Lymphknotenzellen oder Lymphozyten aus dem peripheren Blutkreislauf werden in herkömmlicher Weise aus dem Tier gewonnen, das Immunität erlangt hat.

(b) Herstellung von Myelomzellen

Als Myelomzellen können aus verschiedenen Tieren, wie Mäusen, Ratten, Kaninchen, und aus Menschen stammende Zell-Linien, die für den Fachmann leicht erhältlich sind, eingesetzt werden. Die zu verwendende Zell-Linie sollte vorzugsweise gegen einen Hemmstoff(drug) resistent, in einem selektiven Medium nicht lebensfähig, aber nach Verschmelzung mit Antikörper erzeugenden Zellen lebensfähig sein. Die am meisten verwendete Zell-Linie ist eine 8-Azaguanin-resistente Zell-Linie, die in bezug auf Hypoxanthin-Phosphoribosyltransferase Mangelmutation zeigt und in einem Hypoxanthin-Aminoputerin-Thymidin(HAT)-Medium nicht gezüchtet werden kann. Die Zell-Linie ist vorzugsweise auch vom sogenannten "Nicht-Ausscheidungs" (non-secretor)-Typ, der kein Immunglobulin ausscheidet
Typische Beispiele für Myelom-Zell-Linien sind P3/x63-Ag 8(Nature, 256, 495-497 (1975)),P3/x63-Ag 8 U&sub1;(P3U&sub1;)(ATCC CRL- 1597)(Current Topics in Microbiology and Immunology, 81, 1-7 (1978)), P&sub3;/x63-Ag 8.6.5.3 (x63.6.5.3)(ATCC CRL-1580) (J.Immunology, 123, 1548-1550 (1979)), P&sub3;/NSI-1-Ag 4-1 (NS- 1)(European J.Immunology,6,292-295(1976)), Sp2/0-Ag 14(SP2) (ATCC CRL-1581)(Nature, 276, 269-270(1978), abgeleitet aus der Mausmyelom (MOPC-21 )-Zell-Linie.Die Rattenmyelom-Zell-Linie, wie z.B. 210 RCY. Ag 1.2.3(Y3 Ag 1.2.3) (Nature, 277,131- 133(1979), und die menschliche Myelom-Zell-Linie, wie z.B. U- 266-AR&sub1; (Proc.Natl.Acad.Sci. U.S.A., 77, 1158(1980), GM1500 (Nature, 288, 448(1980), und KR-4(Proc.Natl.Acad. Sci.U.S.A., 79, 6651(1982) stehen ebenfalls zur Verfügung.

(c) Zellverschmelzung

Bei der Zellverschmelzung werden für die Antikörper erzeugenden Zellen geeignete Myelomzellen gewählt. Die Zellverschmelzung wird durch Mischen von 107 bis 108 Myelomzellen mit Antikörper erzeugenden Zellen bei einem Mischungsverhältnis von 1:4 bis 1:10 in einem Medium zum Züchten von Tierzellen, wie z.B. "Eagle's minimum essential medium" (MEM), "Dulbecco's modified Eagle's medium" (DMEM) und "RPMI 1640" durchgeführt. Um die Zellverschmelzung zu fördern, kann ein Verschmelzungshilfsmittel, wie z.B. Polyäthylenglykol(PEG) mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht von 1000 bis 6000, ein Polyvinylalkohol oder ein Virus eingesetzt werden.

(d) Die Selektion des Hybridoms in einem selektiven Medium

Die Selektion des gewünschten Hybridoms aus den Zellen nach der Zellverschmelzung läßt sich durch selektives Wachstum in einem selektiven Medium durchführen. Die Zellen werden beispielsweise geeigneterweise mit z.B. RPMI 16040-Medium, enthaltend 15% Serum eines Kalbfötus(FCS) verdünnt und auf eine Mikrotiterplatte mit ca. 10&sup5; bis 10&sup6; Zellen pro Vertiefung aufgebracht, und ein selektives Medium(z.B. HAT-Medium) wird in jede Vertiefung gegeben, woraufhin man das selektive Medium durch ein geeignetes anderes Medium austauscht. Wenn beispielsweise eine 8-Azaguanin-resistente Zell-Linie als Myelomzelle und ein HAT-Medium als selektives Medium eingesetzt werden, dann sterben nichtverschmolzene Myelomzellen ca. am 10.Tag nach dem Züchten ab und die Antikörper erzeugenden Zellen, welche normale Zellen sind, können über einen längeren Zeitraum in-vitro nicht gezüchtet werden. Demgemäß sind alle Zellen, die zwischen dem 10. und 14. Tag gezüchtet werden, Hybridome. (e)Das Erkennen von Hybridomen, die einen Antikörper für die leichte Kette des Antimyosins produzieren. Das Erkennen von Hybridomen, die einen Antimyosin-Antikörper produzieren, läßt sich beispielsweise nach der "Enzyme Linked Immunosorbent Assay(ELISA)"-Methode oder nach der "Radioisotope Immunoassay( RIA)"-Methode durchführen.Beispielsweise wird der Hybridome enthaltende Überstand einer Kultur auf eine 96 Vertiefungen aufweisende Mikroplatte aufgebracht, die mit einer leichten Kette eines menschlichen Myosins oder eines Myosins eines xenogenen Tiers überzogen ist, um den spezifischen Antikörper damit reagieren zu lassen, und dann läßt man den gebundenen spezifischen Antikörper mit einem mit einem Enzym markierten Antiimmunglobulin-Antikörper oder mit einem biotinylierten Anti-Immunglobulin-Antikörper und dann mit mit Avidin D-Enzym markiertem Material reagieren, woraufhin bei Einbringen des Substrats für das Enzym in jede Vertiefung eine Farbbildung erfolgt. Je nach dem Ausmaß der Farbbildung kann die Vertiefung mit dem Kulturüberstand, der das Hybridom enthält, das einen Antikörper mit einer Spezifität für die leichte Myosinkette erzeugt, beurteilt werden, wodurch das Erkennen des Hybridoms stattfinden kann.
Indem man den beim Verfahren der vorliegenden Erfindung einzusetzenden monoklonalen Antikörper auf seine Eigenschaften hin untersucht, kann schließlich das einen solchen Antikörper erzeugende Hybridom selektiert werden.

(f) Klonen

Das Klonen von Hybridomen kann beispielsweise mittels der Methode der eingeschränkten Verdünnung, der weichen Agarmethode, der Fibringel-Methode und der fluoreszenzaktivierten Zellsortierungsmethode erfolgen.

(g) Herstellung des Antikörpers

Als Methode zur Herstellung eines monoklonalen Antikörpers für eine leichte Myosinkette aus dem den Antikörper für die leichte Myosinkette produzierenden Hybridom, kann eine herkömmliche Zellzüchtungsmethode oder Ascites-Bildungsmethode eingesetzt werden.
Bei der Zellzüchtungsmethode, wird das Hybridom in einem Medium zum Züchten von Tierzellen, wie z.B. dem RPMI 1640-Medium, enthaltend 10 bis 15% FCS, oder in einem serumfreien Medium gezüchtet und der Antikörper kann aus dem Züchtungsüberstand erhalten werden.
Bei der Methode zum Gewinnen des Antikörpers aus Ascites wird nach Verabreichung eines Mineralsöls wie z.B. Pristan (2,6,10,14-Tetramethylpentadecan) an ein Tier, dessen Gewebskompatibilität zum größten Teil mit dem Hybridom übereinstimmt, das Hybridom intraperitoneal in einer Menge von ca. 10&sup7; Zellen injiziert. Innerhalb 10 bis 18 Tagen werden die Hybridome in Form von Ascitestumoren wachsen, wobei Antikörper in hohen Konzentrationen im Serum und in der Ascites-Flüssigkeit erzeugt werden.
Ist eine Reinigung des Antikörpers erforderlich, so kann dies durch richtiges Auswählen und Kombinieren von Methoden, wie z.B. der Ammoniumsulfat-Aussalzmethode, der Ionenaustauschchromatographie unter Verwendung eines Anionenaustauschers wie z.B. DEAE-Zellulose, der Affinitätschromatographie unter Verwendung von sepharose 4B, an welche eine leichte Myosinkette gebunden ist, oder von Protein A-Sepharose und der Molekularsiebchromatographie erfolgen.
Beim Verfahren der vorliegenden Erfindung, wenn die leichte Myosinkette im ersten Diagnoseverfahren von gewöhnlichen Muskelerkrankungen oder im Diagnoseverfahren der Krankheit, bei welcher eine Herzmuskelerkrankung und eine Skelettmuskelerkrankung nicht gemeinsam auftreten, gemessen wird, ist es möglich, einen Antikörper mit einer Kreuzreaktivität mit sowohl der leichten Kette des Herzmyosins als auch mit der leichten Kette des Skelettmyosins einzusetzen.

(3) Herstellung der Markierungssubstanz

Zur Herstellung einer markierten leichten Myosinkette oder eines markierten monoklonalen Antikörpers für eine leichte Kette eines Myosins kann das bereits bekannte Verfahren zum Markieren oder das eingesetzte Markierungssystem Anwendung finden. Zum Beispiel kann im Fall einer Markierung mittels Radioisotopen die Chloramin-T-Methode oder die Laktoperoxidase-Methode angewendet werden. Im Fall einer Enzymmarkierung läßt sich die Säureanhydrid-Methode, die Carbodiimid-Methode, die Glutaraldehyd- Vernetzungmethode, die Periodsäurevernetzungsmethode, die Maleinimid-Vernetzungs-Methode usw. anwenden.

(4) Herstellung eines eine feste Phase bildenden Reaktionsmittels

Für die Herstellung der leichten Myosinkette oder des monoklonalen Antikörpers für die leichte Myosinkette kann auch ein Träger, der für das eingesetzte Meßsystem geeignet ist, ausgewählt und die Festphasenbildung gemäß den bekannten Methoden durchgeführt werden.
Beispielsweise umfassen Trägermaterialien Träger aus natürlichem Polymerderivat, wie z.B. Cyanogenhalogenid-aktivierte Produkte von Polysacchariden(z.B. Zellulose, Dextran, Stärke, Dextrin, Hydroxyäthylzellulose, p-Aminophenoxyhydroxypropyldextran, Agarose, Sephadex ) (siehe japanische Patentveröffentlichung Nr. 38543/1970), Natriummetaperiodat-aktivierte Produkte von Polysacchariden(siehe japanische Offenlegungsschrift Nr. 756/1983), aminoäthylierte oder aminopropylierte Produkte von Zellulose oder deren Derivaten(siehe japanische Offenlegungsschrift Nr.42452/1984),mercaptisierte Produkte von Zellulose oder deren Derivaten(siehe japanische Offenlegungsschrift Nr. 80558/1983), cyanierte Produkte von Polysacchariden(siehe japan. Patentveröffentlichung Nr. 28031/1974), mit Epichlorhydrin- p-aminophenol behandelte Produkte von Polysacchariden(siehe japanische Offenlegungsschrift Nr. 158994/1979), diazotierte Produkte von Polysaccharidderivaten, enthaltend aromatische Aminogruppen( behandelt mit verdünnter Salzsäure, Natriumnitrit), Zellulosecarbonat-Derivate, Zelluloseacetat,natürliche Zellulose(Baumwolle,Hanf, Wolle); Polymer- oder Copolymerträger aus Äthylen, Propylen, Styrol, Vinylalkohol, Acrylamid, Acrylnitril, Acrylsäure, Methacrylsäure, Acrylsäureester, Methacrylsäureester, Vinylacetat oder Maleinsäureanhydrid; oder Träger der vorstehend genannten Art, in welche reaktive funktionelle Gruppen, wie z.B. Amino-, Hydroxyl-, Carboxyl-, Sulfon-,Thiol-Azid-, Isocyangruppen, eingebaut sind.
Ferner kann der Träger die Form z.B. eines Röhrchens, einer Testplatte, von Perlen, einer Scheibe, einer Kugel, eines Stäbchens aufweisen oder als Latex vorliegen.
Als Festphasen-Bildungsmethode kann jedes physikalische Adsorptionsverfahren, die Kovalenzbindungs-Methode, die Vernetzungsmethode und die Einschlußmethode eingesetzt werden. Bezüglich Einzelheiten in bezug auf diese Festphasen-Bildungsverfahren sind die bekannten Methoden zur Enzymimmobilisierung anwendbar, und es wird auf die entsprechende Literatur oder Berichte, wie z.B."Immobilized Enzyme", herausgegeben von Ichiro Chibata(veröffentlicht von Kabushiki Kaisha Kondansha, am 20.März 1975), Seiten 9 bis 75, verwiesen.
Bei der Durchführung des Verfahrens der vorliegenden Erfindung ist für die Herstellung einer Serumprobe keine spezielle Vorbehandlung nötig, und Serum kann als solches für Analysezwecke zur Anwendung kommen. Zwecks Stabilisierung der Antigen-Antikörper-Reaktion und zum Verhindern nicht-spezifischer Reaktionen kann z.B. EDTA bis zu einer Endkonzentration von 5 bis 10 mM zugegeben werden.
Nach dem Verfahren der vorliegenden Erfindung ergeben sich verschiedene vorteilhafte Wirkungen, die nachfolgend dargestellt werden. (1) Die praktische Diagnose von Muskelerkrankungen, wie z.B. Herzinfarkt, wird durch die Selektion eines monoklonalen Antikörpers mit einer Spezifität nicht nur für die leichte Kette des gereinigten menschlichen Myosins, sondern auch für die leichte Myosinkette, die im Serum eines Patienten mit einer Muskelerkrankung, wie z.B.einem Herzinfarkt, vorliegt, ermöglicht. (2) Durch Selektion eines Antikörpers mit Reaktionsbereitschaft in bezug auf die leichte Myosinkette eines xenogenen Tiers, die ähnlich der menschlichen Myosinkette ist, ist es möglich, die leichte Myosinkette des xenogenen Tiers als Antigenreagens bei der immunologischen Analyse einzusetzen, um eine große Menge des Antigenreagens zur Verfügung zu stellen. Durch die mit vorliegender Erfindung erzielbaren vorteilhaften Wirkungen wurde zum ersten Mal der Einsatz eines praktischen Diagnoseverfahrens bei Patienten mit Muskelerkrankungen, wie Herzinfarkt, durch immunologische Analyse von leichten Myosinketten möglich gemacht.

Bezugsbeispiel 1

(Herstellung eines monoklonalen Antikörpers mit einer Spezifität für die leichte Myosinkette)

Eine leichte Kette(1 mg/ml) eines menschlichen Ventrikularmyosins, die nach der bekannten Methode hergestellt worden ist(Biochem. J.113, 31-38 (1970)) wird in einer physiologischen Salzlösung gelöst und mit einem kompletten Freund's Adjuvans in einem Verhältnis von 1:1 zur Herstellung einer Emulsion gemischt. Die Emulsion wird einer BALB/c-Maus(weiblich, 6 Wochen alt) in Abständen von 2 Wochen in einer Menge bis zu 50 µg /Kopf intraperitoneal verabreicht, und schließlich werden 10 bis 30 µg intravenös verabreicht.
Drei Tage nach der letzten Immunisierung werden Milzzellen aus der Maus entnommen und mit MEM gewaschen. Das Mausmyelom P&sub3;U&sub1; wird mit MEM gewaschen und mit den Milzzellen in einem Verhältnis von 1:10 gemischt. Nach dem Zentrifugieren wird nach und nach 1 ml einer 5O%-igen PEG 1000-MEM-Lösung zu einem so erhaltenen Kügelchen zugegeben, um eine Zellverschmelzung durchzuführen. Außerdem wird die MEM-Lösung allmählich zugegeben, um eine Endmenge von 10 ml zu erhalten. Dann wird wieder zentrifugiert und das Kügelchen wird in RPMI 1640-Medium, enthaltend 10% FCS auf 3 x 10&sup4; Zellen/0,1 ml als P&sub3;U&sub1; suspendiert und auf eine 96 Vertiefungen aufweisende Mikroplatte in 0,1 ml pro Vertiefung aufgebracht.
Einen Tag später werden Anteilsmengen von je 0,1 ml an HAT-Medium zugegeben, und daraufhin wird die Hälfte des Mediums alle 3 bis 4 Tage mit frischem HAT-Medium erneuert. Je 50 µl des Überstands in der Vertiefung, in welcher ein Wachstum von Hybridomen erkennbar ist, werden auf eine 96 Vertiefungen aufweisende Mikroplatte gegeben, die vorher mit der leichten Kette des menschlichen Ventrikularmyosins bedeckt worden ist. Unter Verwendung eines biotinylierten Anti-Maus-IgG-Immunglobulins(Produkt der Firma Vector Co.) als der biotinylierte Anti- Immunglobulin-Antikörper, von Avidin-D-Peroxidase(hergestellt von der Firma Vector Co.) als das Avidin-Enzymkonjugat, Wasserstoffperoxid als Substrat und 4-Aminoantipyrin-plus-Phenol als chromogene Substanz wird das Hybridom, das einen Antikörper produziert, der mit der leichten Kette des menschlichen Ventrikularmyosins reagiert, nach der oben beschriebenen ELISA-Methode ausgewählt und mittels der Methode der eingeschränkten Verdünnung geklont.
Für die durch die Hybridome erzeugten monoklonalen Antikörper werden Unterklassen der Antikörper bestimmt, und es werden bezüglich Kreuzreaktivität mit leichten Myosinketten vom Menschen, vom Hund, vom Schwein und vom Rind, und mit den leichten Ketten des Ventrikularmyosins im Serum eines Herzinfarktpatien ten Untersuchungen durchgeführt. Die Ergebnisse sind in den Tabellen 1,2 und 3 dargestellt.
Die Bestimmung von Unterklassen wird mittels Verwendung eines MONOABID EIA KIT(geliefert von der Firma Zymed Co.) nach Aufbringen jedes monoklonalen Antikörpers auf eine 96 Vertiefungen aufweisende Mikroplatte, die mit der leichten Kette des Ventrikularmyosins bedeckt ist, und nach Blockieren mit PBS, enthaltend 1% Serumalbumin vom Rind(BSA), durchgeführt.
Der Index für die Spezifität wird als relatives Bindungsverhältnis ausgedrückt, wobei die Bindungsfähigkeit des MLM-527- Antikörpers, der an die leichte Kette des menschlichen Ventrikularmyosins gebunden ist, mit 100 definiert ist, (+++) den Bereich von 100 bis 80%, (++) den Bereich von 80 bis 50%, (+) den Bereich von 50 bis 10% und(-) den Bereich von 10 bis 0% definiert.
Bevorzugte Beispiele des beim Verfahren der vorliegenden Erfindung einzusetzenden Antikörpers umfassen MLM-5O8, MLM-520, MLM- 527, MLM-536, MLM-544, MLM-162, MLM-515 und MLM-576. Tabelle I ANTIKÖRPER, DIE MIT DER LEICHTEN KETTE I DES MENSCHLICHEN VENTRIKULARMYOSINS REAGIEREN: leichte Kette des menschl. Myosins leichte Kette des Myosins vom Hund Monoklonaler Antikörper Unterklasse leichte Kette I d.Ventrikularmyosins leichte Kette eines Patientenserums Skelettmuskel leichte Kette des Ventrikularmyosins vom Rind leichte Kette des Ventrikularmyosins vom Schwein Tabelle I (Fortsetzung) leichte Kette des menschl. Myosins leichte Kette des Myosins vom Hund Monoklonaler Antikörper Unterklasse leichte Kette I d.Ventrikularmyosins leichte Kette eines Patientenserums Skelettmuskel leichte Kette des Ventrikularmyosins vom Rind leichte Kette des Ventrikularmyosins vom Schwein Tabelle II ANTIKÖRPER, DIE MIT DER LEICHTEN KETTE II DES MENSCHLICHEN VENTRIKULARMYOSINS REAGIEREN: leichte Kette des menschl. Myosins leichte Kette des Myosins vom Hund Monoklonaler Antikörper Unterklasse leichte Kette I d.Ventrikularmyosins leichte Kette eines Patientenserums Skelettmuskel leichte Kette des Ventrikularmyosins vom Rind leichte Kette des Ventrikularmyosins vom Schwein Tabelle III ANTIKÖRPER, DIE MIT DER LEICHTEN KETTE I, DER LEICHTEN KETTE II DES MENSCHLICHEN HERZMYOSINS UND MIT DER LEICHTEN KETTE DES SKELETTMYOSINS REAGIEREN: leichte Kette des menschl. Myosins leichte Kette des Myosins vom Hund Monoklonaler Antikörper Unterklasse leichte Kette I d.Ventrikularmyosins leichte Kette eines Patientenserums Skelettmuskel leichte Kette des Ventrikularmyosins vom Rind leichte Kette des Ventrikularmyosins vom Schwein

Bezugsbeispiel 2

(Herstellung einer leichten Kette eines Ventrikularmyosins vom Schwein)

Der Ventrikularmuskel eines Schweineherzes wird in passende Stücke geschnitten, die mit dem 10-fachen Gewicht eines 50 mM- Phosphatpuffers, enthaltend 1 mM EDTA(pH 6,85), gewaschen werden. Den Gewebsstücken wird ein 0,6 N Kaliumchlorid - 0,15 M- Phosphat-Puffer(pH 6,85, enthaltend 1 mM EDTA und 3 mM Kaliumpyrophosphat) zugegeben und die Mischung wird 15 Minuten lang zwecks Extraktion von Myosin gerührt. Dann wird das 13-fache Gewicht einer 1 mM EDTA-Lösung zugegeben und die Mischung wird filtriert. Zu dem Filtrat wird dann das 24-fache Gewicht einer 1mM-EDTA-Lösung zugegeben, und die Mischung wird bei 4ºC über Nacht stehen gelassen. Der Überstand wird abgesaugt und die Ausfällung wird mit 8500 UpM bei 4ºC 20 Minuten lang zentrifugiert. Dann wird die Ausfällung entnommen und gewogen. Die 2- fache Menge eines 20 mM-Trishydrochlorid-Puffers(pH 7,5), enthaltend 1 M Kaliumchlorid, 2 mM EDTA, 40 mM Adenosintriphosphat und 10 mM Magnesiumchlorid und die gleiche Menge an destilliertem Wasser werden zugegeben, und die Mischung wird zweimal unter Eiskühlung homogenisiert. Nach dem Ultrazentrifugieren bei 100000 xg über einen Zeitraum von 1 Stunde, wird die 9-fache Menge einer 1 mM-EDTA-Lösung zu dem Überstand gegeben und unter Zugabe eines Tropfens Mercaptoäthanol läßt man die Mischung bei 4ºC über Nacht stehen. Die Ausfällung wird mittels 20-minütigem Zentrifugieren mit 8500 UpM bei 4ºC abgetrennt und dann gibt man zu der erhaltenen Ausfällung Guanidinhydrochlorid bis zu einer Konzentration von 5 M, woraufhin weiteres Mercaptoäthanol zugegeben wird. Die Mischung wird bei Raumtemperatur 3 Stunden lang gerührt und dann wird die gleiche Menge gekühltes Wasser und die 4-fache Menge Äthanol zugegeben, woraufhin man mit 10000 UpM bei 4ºC 20 Minuten lang zentrifugiert. Der Überstand wird mehrmals gegen eine gekühlte 1 mM-EDTA-Lösung dialysiert, und die dialysierte innere Lösung wird entnommen, wobei 100 mg der leichten Kette des Ventrikularmyosins vom Schwein erhalten werden.

Bezugsbeispiel 3

(Reinigung der leichten Kette I des Ventrikularmyosins vom Schwein)

Nach der Reinigung des monoklonalen Antikörpers MLM 515 für die leichte Kette II des Herzmyosins mittels DEAE-Zellulosesäulenchromatographie werden 100 mg des Antikörpers an 5ml Affigel 10 gebunden(hergestellt von der Firma Bio Rad Co.)(Bindungsanteil; 42%) und das Gel wird nach Blockieren mit 1 M Äthanolamin in eine Säule gegeben und mit 0,2 M Glycinhydrochloridpuffer(pH 2,5) und einer phosphat-gepufferten physiologischen Salzlösung (PBS) gewaschen. Die Säule wird mit 11 mg der in Bezugsbeispiel 2 hergestellten leichten Kette des Ventrikularmyosins vom Schwein beladen, die dann mit PBS eluiert wird, wobei man eine gereinigte Probe der leichten Kette I des Ventrikularmyosins vom Schwein erhält.

Beispiel 1

(1) Herstellung eines mit [¹²&sup5;I]-markierten monoklonalen Antikörpers([¹²&sup5;I])-Antikörper)

Der monoklonale Antikörper MLM 508 für die leichte Kette I des menschlichen Herzmyosins von Maus-Ascites wird durch Ammoniumsulfatfraktionierung, DEAE-Zellulose-Ionenaustauscher-Säulenchromatographie und Ultrogel AcA 44 (LKB CO.)-Gelfiltrations-Säulenchromatographie gereinigt.
Der gereinigte Antikörper wird als eine 1mg/ml -Lösung zubereitet, wovon 40 µl mit 200 µCi Natriumiodid ([¹²&sup5;I)] gemäß der Chloramin T-Methode(Hunter et al, Nature, 194, 495-496(1962)) ¹²&sup5;I-markiert werden. Dieser wird mittels der Sephadex G 25- Säulenchromatographie von freiem radioaktivem Natriumiodid abgetrennt, wodurch der [¹²&sup5;I]-Antikörper erhalten wird.

(2) Herstellung eines mit Antikörper bedeckten Röhrchens

Der monoklonale Antikörper MLM 544 für die leichte Kette I des menschlichen Herzmyosins wird in der oben beschriebenen Weise gereinigt. Der gereinigte Antikörper wird in PBS bis zu 50 µg/ml gelöst(pH 7,4), und die Lösung wird in Anteilsmengen von je 0,5 ml in ein Polystyrolröhrchen gegeben und bei 4ºC über Nacht stehen gelassen, um einen Überzug herzustellen. Die Lösung wird aus dem Röhrchen entnommen und PBS, enthaltend l% BSA und 01% Natriumazid, wird zugegeben. Die Lösung läßt man dann bei Raumtemperatur 2 Stunden lang stehen, um einen Blokkierungseffekt zu erzielen. Die BSA-Lösung wird entfernt und das Röhrchen zweimal mit destilliertem Wasser gewaschen, gefriergetrocknet und in trockenem Zustand bei 4ºC gebrauchsfertig gelagert.

(3) Analyse

Die Standardlösungen der gereinigten leichten Kette I des menschlichen Ventrikularmyosins oder der leichten Kette I des gereinigten Ventrikularmyosins vom Schwein werden durch schrittweise Verdünnung mit 1 %-iger BSA-haltiger PBS von 1000 ng/ml auf 1 ng/ml hergestellt. Das mit dem Antikörper überzogene Röhrchen wird mit je 200 µl der Standardlösungen gefüllt und jeweils 250 µl des auf 50000 c.p.m./250 µl verdünnten [¹²&sup5;I]-Antikörpers werden daraufhin zugegeben.
Nach 16-stündigem Inkubieren bei Raumtemperatur wird der Überstand abgesaugt und, nach zweimaligem Waschen mit destilliertem Wasser wird die Radioaktivitätsdosis jedes Röhrchens mit einem Gammazähler gemessen.
Als Ergebnis wird, wie in Fig.1 dargestellt, im wesentlichen die gleiche Standardkurve für die Standardlösung der leichten Kette I des menschlichen Ventrikularmyosins und für die Standardlösung der leichten Kette I des Ventrikularmyosins vom Schwein im Bereich von 1 ng/ml bis 100 ng/ml erhalten.
Somit ist klargestellt worden, daß die Menge der leichten Kette I des menschlichen Ventrikularmyosins, wenn sie mit dem richtigen Faktor multipliziert wird, aus der Standardkurve der leichten Kette I des Ventrikularmyosins vom Schwein berechnet werden kann.

Beispiel 2

Aus von 21 gesunden Menschen und von 9 Patienten mit akutem Herzinfarkt gesammelten Serumproben werden jeweils 50 µl in der oben beschriebenen Weise in ein mit einem Antikörper bedecktes Röhrchen gegeben, und 1% BAS-haltige PBS wird zugegeben, woraufhin 250 µl einer [¹²&sup5;I]-Antikörper-Lösung zugegeben werden. Nach 16-stündigem Inkubieren bei Raumtemperatur wird der Überstand abgesaugt und das Röhrchen wird zweimal mit destilliertem Wasser gewaschen und dann mit einem Autogammazähler auf seine Radioaktivität hin gemessen. Auf der Grundlage der mit der leichten Kette I des Ventrikularmyosins vom Schwein als Standardsubstanz erhaltenen Standardkurve wird die leichte Myosinkette im Serum quantitativ bestimmt.
Als Ergebnis wird in der Serumprobe eines gesunden Menschen ein Gehalt an leichter Myosinkette von 0,62 + 0,67 ng/ml festgestellt. Andererseits wird bei einem Patienten mit akutem Herzinfarkt ein Gehalt von 11,7 ± 14,3 ng/ml am Tag des Infarkts festgestellt, der am 3. bis 6.Tag nach dem Infarkt den Höchstwert erreicht. Der Höchstwert ist 23,3 ± 13,8 ng/ml, und der Gehalt reduziert sich daraufhin in vielen Fällen, bis 1 bis 2 Wochen später der Normalwert wieder erreicht ist.

Beispiel 3

(1) Herstellung eines Biotinyl-Antikörpers

Der monoklonale Antikörper MLM 508 für die leichte Kette I des menschlichen Herzmyosins wird in der in Beispiel 1 beschriebenen Weise mittels DEAE-Zellulose-Ionenaustauschchromatographie und Ultrogel AcA 44 Gelfiltrations-Säulenchromatographie gereinigt und gegen eine wäßrige 0,1 M Natriumhydrogencarbonatlösung dialysiert, und dann wird die innere dialysierte Lösung mit der gleichen wäßrigen Lösung auf eine Antikörperkonzentration von 1 mg/ml verdünnt. 0,75 ng N-Hydroxysuccinylbiotin werden in 1 ml Dimethylformamid gelöst und dann werden 0,1 ml der Lösung zu 1 ml einer Antikörperlösung gegeben und damit vermischt, und die Mischung wird bei Raumtemperatur 4 Stunden stehen gelassen. Die Mischung wird dann gegen PBS, enthaltend 0,1% Natriumazid dialysiert, wobei ein Biotinylantikörper als PBS-Lösung, enthaltend 0,1 % BSA und 0,1% Natriumazid, erhalten wird.

(2) Analyse

Das in der in Beispiel 1 beschriebenen Weise hergestellte, mit dem Antikörper bedeckte Röhrchen wird mit je 100 µl der Standardlösungen der leichten Kette I des menschlichen Herzmyosins oder der leichten Kette I des Herzmyosins vom Schwein, die durch schrittweise Verdünnung mit 1% BSA-haltiger PBS von 1000 ng/ml auf 1 ng/ml hergestellt worden sind, und mit je 150 µl PBS, enthaltend 1% BSA und 0,1% Natriumazid, befüllt. Nach eineinhalbstündigem Inkubieren bei Raumtemperatur wird das Röhrchen zweimal mit PBS gewaschen. 250µl des verdünnten Biotinylantikörpers werden in jedes Röhrchen gegeben, das man dann 1 1/2 Stunden bei Raumtemperatur stehen läßt und zweimal mit PBS wäscht. 250 µl einer Lösung von Avidin-D-Peroxidase(hergestellt von der Firma Vector Co.), gelöst in einer PBS-Lösung, enthaltend 1% BSA und 0,01% Natriumäthylquecksilberthio-salicylat, werden in jedes Röhrchen gegeben, und dann läßt man das Röhrchen 15 Minuten bei Raumtemperatur stehen und wäscht es dreimal mit PBS. Ein chromogener Wirkstoff wird durch Lösen von 2 mg o- Phenylendiamin in 10 ml eines Citratpuffers(pH 5,0) hergestellt, und 1 ml des chromogenen Wirkstoffes und 50 µl einer 340 mM-Wasserstoffperoxid-Lösung werden entsprechend in jedes Röhrchen gegeben. Nach 20-minütigem Inkubieren bei Raumtemperatur wird die Reaktion unter Zugabe von 1 ml einer 1N -Schwefelsäure gestoppt, und die Extinktion jeder Röhrchenlösung bei O.D. 490 nm wird gemessen.
Als Ergebnis wird, wie in Fig.2 dargestellt, im wesentlichen die gleiche Standardkurve für die Standardlösung der leichten Kette I des menschlichen Ventrikularmyosins und für die der leichten Kette I des Ventrikularmyosins vom Schwein im Bereich von 1 ng/ml bis 100 ng/ml festgestellt.

Beispiel 4

In entsprechender Weise wie in Bezugsbeispiel 2 werden Myosine aus Ventrikularmuskeln von Schweinen, Rindern, Hunden und Ratten extrahiert, und jede leichte Myosinkette wird mittels 5 M Guanidinhydrochloridbehandlung isoliert. Daraufhin wird jede dieser Proben schrittweise mit PBS, enthaltend 1% BSA, verdünnt, um Standardlösungen herzustellen, und je 25 µl werden in das mit dem gleichen Antikörper bedeckte Röhrchen gegeben, der in Beispiel 1 hergestellt worden ist, und dann bei Raumtemperatur über Nacht unter Zugabe von 75 µl PBS und 250µl des gleichen [¹²&sup5;I]-Antikörpers wie in Beispiel 1 inkubiert. Nach Entfernen des Überstands und nach dem Waschen wird die Radioaktivitätsdosis jedes Röhrchens mit einem Autogammazähler gemessen.
Die Ergebnisse sind in Fig.3 darstellt. Es ist bestätigt worden, daß die aus Standardlösungen der entsprechenden leichten Ketten des Ventrikularmyosins von Schweinen, Rindern, Hunden und Ratten im wesentlichen mit denen der leichten Kette des menschlichen Ventrikularmyosins übereinstimmen, und daher konnten die leichten Ketten des Herzmyosins dieser xenogenen Tiere als Standardsubstanzen für die Bestimmung der leichten Kette des menschlichen Herzmyosins eingesetzt werden.

Beispiel 5

Eine Serumprobe eines Patienen mit akutem Herzinfarkt wird sofort nach dem Infarkt entnommen und es wird daran sowie an weiteren im Verlauf der Zeit entnommenen Serumproben nach dem RIA- Sandwich-Verfahren von Beispiel 1 und der ELISA-Methode von Beispiel 3 die Menge an leichter Kette des Herzmyosins analysiert.
Die Ergebnisse sind in Fig.4 dargestellt. Auch wenn die analysierten Werte, die mit der ELISA-Methode erhalten worden sind, geringfügig über den mit der RIA-Sandwich-Methode erhaltenen Werten liegen, kann eine Beziehung zwischen beiden Werten hergestellt werden(Korrelationskoeffizient 0, 92).
Somit ist klargestellt, daß beide Verfahrensweisen für die Diagnose von Herzinfarkt geeignet sind.

Claims

1. Eine Immunoassay-Methode für leichte Myosinketten in einer menschlichen Serumprobe, umfassend

a) Herstellung eines monoklonalen Antikörpers,der eine Spezifität für eine leichte menschliche Myosinkette I, erhalten(isoliert oder extrahiert) aus Muskelmaterial, aufweist und auch die gemeinsame determinante Gruppe von sowohl leichten Myosinketten I und/oder II, erhalten(isoliert oder extrahiert) aus xenogenem Tiermuskelmaterial, als auch von leichten Myosinketten, wie sie im menschlichen Serum eines an einer Muskelkrankheit leidenden Patienten vorkommen, erkennt;

b) Herstellung einer Standardkurve aus Standardlösungen der leichten Myosinketten I und/oder Il, erhalten(isoliert oder extrahiert) aus xenogenem tierischem Material durch Binden des genannten monoklonalen Antikörpers an die genannte leichte Myosinkette I und/oder II und Bestimmen des Myosingehalts mittels einer an sich bekannten Methode; und

c) Binden des genannten monoklonalen Antikörpers an die leichten Myosinketten, die in der menschlichen Serumprobe enthalten sind, und Bestimmen des Myosingehalts unter Verwendung der Standardkurve nach Stufe b).

2. Eine Methode nach Anspruch 1, bei welcher die leichte Myosinkette eine leichte Herzmuskelmyosinkette ist.

3. Eine Methode nach Anspruch 1, bei welcher die leichte Myosinkette eine leichte Skelettmuskelmyosinkette ist.

4. Eine Methode nach Anspruch 1, bei welcher ein Immunogen zur Verwendung bei der Herstellung von Antikörpern produzierenden Zellen, die zur Herstellung des Antikörperreagens verwendet werden, eine leichte menschliche Myosinkette ist.

5. Eine Methode nach Anspruch 1, bei welcher Antikörper produzierende Zellen, die zur Herstellung des Antikörperreagens eingesetzt werden, aus Mäusen oder Ratten entnommen werden.

6. Eine Methode nach Anspruch 1, bei welcher das xenogene Tier ein Affe, ein Hund, eine Katze, ein Schwein, ein Rind, ein Pferd, eine Ziege, ein Schaf, ein Kaninchen, eine Maus, eine Ratte, ein Meerschweinchen, ein Hamster oder ein Eichhörnchen ist.