DE3686304T2

DE3686304T2 - Typenspezifische papillomavirus-dns-sequenzen und peptide.

Info

Publication number: DE3686304T2
Application number: DE8686902614T
Authority: DE
Inventors: A Jenson; D Lancaster
Original assignee: Georgetown University
Current assignee: Georgetown University
Priority date: 1985-04-04
Filing date: 1986-03-28
Publication date: 1993-02-11
Anticipated expiration: 2006-03-29
Also published as: WO1986005816A1; ATE79138T1; JP2872582B2; JPH08322580A; DE3686304D1; EP0217919A4; US5057411A; EP0217919B1; JP2693145B2; JPS62502378A; JP2648303B2; JPH07143888A; EP0217919A1

Description

Technischer Bereich

Diese Erfindung betrifft die Entdeckung, daß innerhalb der Polynucleotidsequenz des Papillomavirus (PV) Segmente von Nucleotidsequenzen vorhanden sind, die zur Unterscheidung und Differenzierung zwischen PV-Typen und -Arten geeignet sind. Diese Regionen innerhalb des Genoms, die variablen Regionen, sind für den besonderen PV-Typ spezifisch und bilden die Basis für die Bildung von DNA- Sonden, (markierten und unmarkierten) Antikörpern, Polyptidsegmenten, markierten Polypeptidsegmenten und Impfstoffen, die fur ein bestimmtes besonderes PV spezifisch sind.
In einem weiteren Teil der vorliegenden Erfindung wurde auch entdeckt, daß die Polynucleotidsequenz aller PVs eine stark konservierte Region enthält, die für alle PVs kennnzeichnend ist und die Basis für die Erzeugung von (markierten und unmarkierten) Antikörpern und (markierten und unmarkierten) Polyptidsegmenten bildet, die PV-gattungsspezifisch sind, d.h. jedes PV erkennen und unterscheiden und zwischen nicht-PV-Viren und viralen Produkten differenzieren. Diese letztere DNS- Sequenz wird als "gattungsspezifisch" bezeichnet.

Wissenschaftlicher Hintergrund

Die Suche nach einem Virus, das bei der Auslösung von menschlichem Krebs beteiligt ist, war bis jetzt enttäuschend. Eine Reihe von Viren stehen wieder als mögliche menschliche Krebsviren im Mittelpunkt des Interesses; eines dieser Viren ist das menschliche Papillomavirus (HPV). Obwohl HPV eines der ersten Viren war, die durch Elektronenmikroskopie sichtbar gemacht wurden, stand bis vor kurzem wenig Information über die Biologie des Virus zur Verfügung. In frühen Studien gelang es nicht, einen direkten Hinweis zu erhalten, daß HPV mit Malignitäten in Zusammenhang steht (diese Studien wurden von Roson et al., Bacteriol. Rev., 31: 110-131 (1967) besprochen). Es gab jedoch bereits in den dreißiger Jahren einen experimentellen Beweis, daß das Waldkaninchen-Papillomavirus (CRPV) in seiner Wirtsart onkogen ist (Rous et al., J. Exp. Med., 65:523-548 (1935)). Ferner wurde nachgewiesen, daß andere tierische Papillomaviren Tumore in Versuchstieren erzeugten und bei einigen wurde festgestellt, daß sie zu einer morphologische Transformation von Zellen in Kulturen fähig sind (Olson et al., Arch. Environ. Health, 19: 827-837(1969)). Jedoch war weder die experimentelle Übertragung von HPV auf Versuchstiere, noch ein Gewebekultursystem, das eine Virusreplikation oder Expression von biologischer Aktivitat zuläßt, von Erfolg gekrönt. Dementsprechend war die Erforschung des HPV größtenteils auf die physikalische und chemische Charakterisierung von Virionen, die von Papillomen erhalten wurden, beschrankt.
Die Unfähigkeit, ein System zu bestimmen, das für die Replikation des HPV- Virus in Kultur geeignet ist, wurde bis zu einem gewissen Grad durch molekulares Klonen viraler DNS-Sequenzen umgangen, die eine genaue molekulare Analyse ermöglichen. Ferner wurden zahlreiche, geringfügig verwandte Virustypen mit bevorzugten anatomischen Angriffspunkten entdeckt und HPV-Antigene und DNS in Läsionen mit malignem Potential nachgewiesen. Zuvor wurden die Ursachen dieser Läsionen anderen Infektionserregern oder irgendeiner anderen unbekannten Ätiologie zugeschrieben. Durch diese Entwicklungen wurde die Studie des HPV vom Standpunkt der viralen Onkogenese aus interessant.
Es ist bekannt, daß die Mitglieder der Papillomavirusgattung kleine (50-55 nm im Durchmesser), hüllenlose Viren mit einer ikosaedrischen Symmetrie sind. Ihr Genom besteht aus einem kreisförmigen doppelsträngigen DNS-Molekül, das etwa 8.000 Basenpaare (8 kb) enthält. Die Virionen können leicht von Papillomen, die durch Elektronenmikroskopie virus-positiv sind, durch mechanisches Aufbrechen des Epithels und eine anschließende Reihe von verschiedenen Zentrifugationschritten und Bandentechnik in Caesiumchlorid isoliert werden. Bei den meisten Präparaten können zwei Banden sichtbar gemacht werden, eine bei 1,33 gm/ml und die andere bei 1,29 gm/ml. Es wird angenommen, daß ersteres die "vollen" Virionen darstellt, die DNS enthalten, wahrend letzteres aus "leeren" Virushülsen besteht. Die DNS kann durch Aufbrechen der Virionen mit ionischem Detergens und Entfernung des Proteins durch organische Extraktion isoliert werden. Das erhaltene DNS-Praparat enthält im allgemeinen zwei DNS-Formen, eine supergeknäuelte Fraktion (Fo I) und eine Kreisförmige Form mit Einzelstrangbruch (Fo II).
Es wurden fünf verschiedene Viren identifiziert, die Rinder infizieren, d.h. die Kinder-Papillomaviren (BPV). Diese Viren weisen ein unterschiedliches Maß an DNS-Sequenzhomologie, antigener Verwandtschaft, Gewebsspezifität (Haut- oder Schleimhautflächen) auf und rufen verschiedene Läsionsarten hervor (Fibropapillome oder Papillome).
Die menschlichen Papillomaviren unterscheiden sich noch stärker. Bis jetzt wurden achtzehn verschiedene HPV-Typen in der Literatur beschrieben und es wird angenommen, daß noch weitere Typen entdeckt werden. Um als neuer Virustyp klassifiziert zu werden, darf die DNS-Sequenzhomologie unter Standard- Hybridisierungsbedingungen nicht mehr als 50% zu bereits typisierten Viren betragen; eine Virus-DNS, die zu mehr als 50% Sequenzhomologie zu einem bestimmten Virustyp hybridisiert, wird als Subtyp bezeichnet (Coggin et al., Cancer Res., 39: 545-546 (1979)). Standardhybridisierungen werden bei 25ºC unter der Schmelztemperatur der DNS (Tm-25ºC) durchgeführt, wobei eine Basen-Fehlpaarung von etwa 17% entstehen kann (Laird et al., Nature, 244:149-154(1969)).
Es scheint nun, daß die HPVs in bezug auf die Sequenzhomologie und den Infektionsangriffspunkt, wie in der folgenden Tabelle 1 angeführt, in Gruppen eingeteilt werden können. Tabelle 1 Die menschlichen Papillomaviren (HPV) ANGRIFFSPUNKT LÄSION % HOMOLOGIE IN DER GRUPPE HAUT Sohlenwarze gemeine Warze gemeine Fleischerwarze Flachwarze HAUT U. SCHLEIMHAUT/SCHLEIMHAUT Genitalwarze Larynxpapillom fokale epitheliale Hyperplasie Zervixkarzinom * Pityriasisähnliche Läsionen von Epidermodysplasia verruciformis
Viren, die Hautflächen infizieren weisen eher ein gewisses Maß an Homologie mit anderen HPVs auf, welche die Haut infizieren, als mit jenen, die Schleimhautflächen infizieren. Ferner kann gelegentlich ein bestimmter Virustyp, der zwar vorzugsweise mit einer bestimmten Läsion in Verbindung steht, in anderen Läsionen vorhanden sein. Wie von Jensen et al., Lab. Invest., 47: 491-497 (1982) berichtet wird, steht HPV-1 mit etwa 85% der Sohlenwarzen in Verbindung, aber HPV-2 wurde auch bei geringen Prozenten der Sohlenwarzen festgestellt und umgekehrt. Besonders interessant ist eine Gruppe menschlicher Papillomaviren, die Typen 3, 5, 8-10, 12-15 und 17. Es hat sich herausgestellt, daß diese Viren bei Personen mit Epidermodysplasia verruciformis (EV) auftreten, einer seltenen recessiven Erkrankung, die durch allgemeine pityriasisähnliche Läsionen oder Flachwarzen gekennzeichnet ist (Jablonska et al., Cancer Res., 32: 583-589 (1972)). Mit Ausnahme der Typen 3 und 10 wurde diese Gruppe von HPVs nicht in Warzen von gesunden Personen nachgewiesen, sondern wurden nur in Läsionen von immunsupprimierten Nierentransplantat- Empfängem identifiziert (Lutzner et al., J. Invest. Dermatol., 75: 353-356 (1980)). Es wurde auch berichtet, daß Läsionen, die HPV-5 und HPV-8 enthalten, häufig eine maligne Veränderung erfahren, wenn sie in sonnenbestrahlten Bereichen vorhanden sind. Hybridisierungsanalysen von primären und metastatischen Karzinomen haben die Anwesenheit von HPV-5- und HPV-8-DNS-Sequenzen in diesen Tumoren gezeigt (Orth et al., Cell Prolif., 7: 259-282(1980); Ostrow et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 79:1634-1638 (1982); und Pfister et al., Rev. Physiol. Biochem. Pharmacol., 99: 111-181(1983)).
Jüngste Untersuchungen unter nichtstringenten Hybridisierungsbedingungen haben gezeigt, daß DNS-Sequenzen unter den Genomen jedes HPV-Genoms wie auch zwischen HPVs und anderen tierischen Papillomaviren konserviert sind. (Heilman, C. A., J. Virol., 36:395-407 (1980); und Law, M. F., J. Virol., 32: 199-207 (1979)). Es ist daher möglich, eine PV-spezifische DNS-Sonde zur Untersuchung der DNS zu verwenden, die von einer vermeintlichen PV-bedingten Läsion erhalten wurde, um mittels nichtstringenter Hybridisierungsbedingungen verwandte Sequenzen zu finden. Diese Methode hat sich bei HPV-DNS-Sequenzen unbekannter HPV-Typen wie auch bei der DNS, die von Feigwarzen (Krzyzek, R.A. et al., J. Virol., 36: 236-244(1980)) und von juvenilen Larynxpapillomen (Lancaster, W.D., Intervirology, 15: 204-212(1981)) erhalten wurde, als erfolgreich erwiesen.
Trotz des Fehlens eines geeigneten Gewebekultursystems zur Analyse von PV- Genomen, wurde ein beträchtlicher Einblick in die möglichen Funktionen der Virus- genome als Ergebnis der DNS-Sequenzanalyse erhalten, wobei wesentliche Mengen der DNS durch molekulare Klonierungstechniken erzeugt wurden. Die Nucleotidsequenzen für das Rinder-Papillomavirus Typ 1 (BPV-1) (Chen et al., Nature, 299: 529-534(1982)), HPV-1a (Danos et al., Embo. J., 1: 231-236(1982)) und HPV-6b (Schwartz et al., Embo. J., 2: 2341-2348(1983)) sind nun bekannt. Ebenso bekannt sind die DNS-Sequenzen für HPV-11, HPV-16 und das Rotwild-Papillomavirus (DPV).
Es wurde auch nachgewiesen, daß die Papillomaviren antigenisch verwandt sind. Obwohl Antisera, die gegen intakte virale Teilchen eines bestimmten HPV gebildet werden, typenspezifisch sind und in Geweben, die von einem anderen HPV- Typ infiziert sind, nicht reagieren, zeigen Antisera, die gegen PV-Virionen gebildet wurden, die durch Wärme und Detergens aufgebrochen wurden, eine Kreuzreaktion mit Kapsidantigenen aller HPVs wie auch PVs anderer Tierarten (Jensen, A. B. et al., JNCI, 64:495 - 500(1980)). Diese Information hat zu der Annahme geführt, daß es in den Hauptkapsidproteinen von Papillomaviren konservierte Aminosäuresequenzen gibt, die für diese gattungsspezifische antigenische Kreuzreaktivität verantwortlich sind, und daß diese konservierten Aminosäuresequenzen nicht an der Oberfläche der Virionteilchen exponiert sind (Howley, P.M., Arch. Pathol. Lab. Med., 106; 429-432(1982)).
Die Verwendung von Antisera, die gegen die gemeinsamen PV-Antigene gebildet werden, ist dann zur Identifikation von Zellen zweckmäßig, die produktiv mit einem HPV, bekannt oder unbekannt, infiziert sind. Diese kreuzreagierenden Antisera ermöglichten Pathologen und klinischen Forschern, HPVs als den ätiologischen Erreger der juvenilen Larynxpapillomatose (Costa, J. et al., Am. J. Clin. Pathol., 75: 194-197 (1981); und Lack, E. et al., Intervirology, 14: 148-156 (1981)) und der flachen Zervixwarze (Kurman, R.J. et al., Am. J. Obstet. Gynecol., 140: 931-935 (1981); und Morin, C. et al., JNCI, 66: 831-835(1981)) zu identifizieren. Die Antisera sind jedoch nicht für die Identifizierung eines spezifischen HPVs zweckmäßig oder geeignet. Zusätzlich ist es wesentlich, daß die virale Infektiosität bis zu dem Punkt der Proteinexpression fortgeschritten ist, wobei Antisera in den frühen Stadien der Infektiosität oder in den Stadien, in denen noch keine Proteinexpression eingetreten ist, nicht brauchbar sind.
Bis jetzt ist wenig über die funktionellen Aspekte der HPV-Genome bekannt. Mehr Information ist in Hinblick auf tierische Papillomavirus-Systeme erhältlich. Da die genomische Organisation unter den Papillomaviren stark konserviert ist, kann mit gutem Grund davon ausgegangen werden, daß ähnliche Verwandtschaften in bezug auf die Genomstruktur und Funktion zwischen tierischen und menschlichen Papillomaviren herrschen. Da einige der tierischen Papillomaviren stark onkogen sind, ist wahrscheinlich, daß die gesamte oder ein Teil dieser Funktion auch eine Eigenschaft einiger der HPVs sein kann. Viele HPV-bedingten Läsionen wie gemeine Warzen, Sohlenwarzen und Flachwarzen sind völlig gutartig und klinisch nicht mit der Weiterentwicklung zu Karzinomen verbunden. Einige HPVs werden jedoch gelegentlich mit einer Entwicklung zu Plattenepithelkarzinomen in Verbindung gebracht und HPV-5 wurde bei Patienten mit Epidermodysplasie verruciformis mit Hautkarzinomen in Verbindung gebracht. Juvenile Larynxpapillomatose wird durch das Papillomavirus HPV-11 verursacht. Seltene Fälle der spontanen Entwicklung zu invasivem Plattenkarzinom der Larynx bei fehlender Bestrahlung wurden von Runckel, D. et al., Am. J. Surg. Pathol. 4 293-296 (1980) beschrieben. Häufiger entwickelt sich juvenile Larynxpapillomatose nach einer Bestrahlungstherapie zu Plattenepithelkarzinom. Feigwarzen (Condyloma acuminatum) werden durch eine Reihe unterschiedlicher HPVs verursacht. Die Literatur enthält Berichte über die Entwicklung einiger dieser Läsionen zu lokalem invasiven Plattenkarzinom (Zur Hausen, H., Curr. Top. Microbiol. Immunol., 78:1-30(1977)). Ferner wurden HPV-spezifische Antigene in 50% der zervikalen Läsionen, die als dysplastisch gedeutet wurden, nachgewiesen. Die eindeutige epidemiologische Verbindung von cervikaler Dysplasie mit Karzinom in situ und invasivem Zervixkarzinom läßt auf zumindest ein HPV in dieser Entwicklung schließen.
Das Vorhandensein einer großen Zahl von PVs, wobei mehr als ein PV bei gewissen PV-bedingten Läsionen auftritt, die enge Verbindung von Papillom und verschiedenen Karzinomen, wie auch die nicht mit Krebs in Zusammenhang stehenden medizinischen Probleme, die sich aus virusbedingten Papillomen ergeben, haben einen anhaltenden, ständig steigenden Bedarf an einer Methodologie geschaffen, mit der die spezifische Ätiologie des Papilloms mit einem hohen Maß an Gewißheit identifiziert werden kann. Es besteht daher nach wie vor der Bedarf an einem Mittel zur Differenzierung zwischen der großen Anzahl von PV-Typen, die bekanntermaßen existieren, wie auch an einem Mittel zur Identifizierung von noch unbekannten PV- Typen.
Gleichzeitig wäre die Bestimmung der stark konservierten Nucleotidsequenz, die alle PVs gemeinsam besitzen, und des "gemeinsamen" Antigens, für das die stark konservierte Nucleotidsequenz kodiert, von großen Wert und wird auch nach wie vor benötigt. Die Bestimmung dieser Sequenz wäre bei der Erzeugung von Antikörpern, die mit allen PVs kreuzreagieren, von großem Wert.
Es ist nun bekannt, daß eine produktive Papillomavirus-Infektion der Epithelialzellen zu einer Hyperplasie von Zellen in der Stachelzellenschicht (Akanthose) führt. Die Zellen weisen vergrößerte und vermehrte Desmosome und Tonofibrillen auf. Andere Epithelialzellen zeigen degenerative Veränderungen mit Verringerung der Tonofibrillen, Lösung von Desmosomen, Kernfaltung und zytoplasmatischer Vakuolisierung. In den oberen Schichten des Epithels sind diese Veränderungen starker ausgebildet. Die Zellen in der Körnerschicht zeigen nukleare Degeneration, Randstellung und Kondensation des Chromatins. Virionen sind in den Kernen von degenerierten Zellen in der Keratinschicht durch Elektronenmikroskopie und häufig interkristalline Anordnung offensichtlich.
Die Immunantwort des Wirts auf eine Papillomavirvsinfektion ist nicht ausreichend bekannt, aber die Infektion tritt üblicherweise im jungen Alter auf, wonach die Warze eine unterschiedlich lange Zeit bestehen bleibt. Nach der Rückbildung bleibt der Wirt gegen eine neuerliche Infektion durch dasselbe Virus immun. Bei Menschen ist die Antikörperteaktion auf eine HPV-Infektion durch das Auftreten von IgM vor Beginn der Rückbildung gekennzeichnet. Unmittelbar nach der Rückbildung sind sowohl IgM- als auch IgG-Antikörper vorhanden; lange nach der Rückbildung ist nur IgG nachweisbar (von Krough, G. J. Dermatol., 18: 195-204 (1979)). Diese Umwandlung von IgM zu IgG wurde auch bei Rindern beobachtet, die versuchsweise mit BPV infiziert wurden (Lee, K. P. et al., Cancer Res., 32:1393-1397(1969)).
Es hat den Anschein, als wäre die Abstoßung von Papillomen eng mit der zellvermittelten Immunität verbunden. Bei Rindern, die versuchsweise mit Papillomavirus infiziert wurden, erfolgt vor der Rückbildung eine Infiltration mononuclearer Leukozyten, vorwiegend Lymphozyten. Dies geschieht im allgemeinen in perivaskulären Regionen, aber auch als weite Streuung im Papillom (Lee, K. P., et al., J. Invest. Dermatol., 52: 454-464(1969)).
Bei Menschen zeigen rückbildende Flachwarzen ein ähnliches histologisches Bild mit perivaskulärer Infiltration mononuclearer Leukozyten in der Oberhaut, mit stark auf das Papillom begrenztem epidermalen Befall (Tagami, H. et al., J. Dermatol., 90: 147-154 (1974)). Diese gleichzeitige Rückbildung der vielzähligen Warzen an voneinander entfernten Stellen läßt darauf schließen, daß die zellvermittelte Immunität eine wichtige Rolle bei der Papillomabstoßung spielt. Die Rückbildung von Flachwarzen hat jedoch bei demselben Patienten keine Auswirkung auf Sohlen- oder Handflächenwarzen, woraus geschlossen werden kann, daß die Rückbildung HPV- typenspezifisch ist (Berman, A. et al., Br. J. Dermatol., 39:179-182 (1978)). Eine ähnliche differentielle Rückbildung von Warzen wurde auch bei Rindern beobachtet, die mit mehreren BPV-Typen infiziert waren (Barthold, S. W. et al., J. Am. Vet. Med. Assoc., 165:276-280 (1974)).

Beschreibung der Erfindung

Zur Entwicklung eines Tests zur Identifizierung spezifischer PVs ist die Erzeugung PV-spezifischer Antisera wünschenswert, aus denen kompetitive und/oder immunometrische Tests entwickelt werden könnten. Für einige Papillomaviren wie HPV-1 kann aufgrund der großen Menge an viralem Material, das in Sohlenwarzen vorhanden ist, und aufgrund der Tatsache, daß bisher keine HPV-DNS identifiziert wurde, die unter stringenten Bedingungen mit der HPV-1-DNS kreuzhybridisiert, typenspezifisches Antigen oder Antikörper hergestellt werden. Es ist jedoch äußerst schwierig, bei jenen Viren, die das Schleimhautepithel infizieren, ausreichende Mengen an viralen Teilchen zur Verwendung als immunogene Stoffe zu erhalten. Wegen der gemeinsamen antigenen Determinanten, die auf dem Kapsidprotein (vermutlich im Inneren) nachgewiesen wurden, würden polyklonale Antikörper höchstwahrscheinlich eine Kreuzreaktivität mit anderen PVs bewirken.
Angesichts der anhaltenden Notwendigkeit eines Tests zur Unterscheidung zwischen den verschiedenen, nachweislich bestehenden PVs, nahmen die Erfinder ursprünglich an, daß eine typenspezifische antigenisch-determinative Region im Kapsidprotein von einer Computeranalyse der DNS-Sequenz, die für das Hauptkapsidprotein jedes PV kodiert, abgeleitet werden könnte. Durch den Einsatz molekularer Klonierungstechniken wurden ausreichende Mengen der DNS für die Sequenzierung erhalten.
Diese Annahme führte zu der vorliegenden Erfindung, zu der Entdeckung, daß die DNS-Sequenz des offenen Leserasters, die das Haupt-PV-Kapsidprotein (L1) eines bestimmten PV-Typs kodiert, wirklich zumindest ein DNS-Segment enthält, das tatsächlich mit dem entsprechenden Segment in jedem anderen PV-Typ keine Identität zeigt, und daß diese nichtidentische DNS-Sequenz in der Herstellung von PV- typenspezifischen DNS-Sonden, Oligopeptiden zur Verleihung typen-spezifischer immunogener und/oder immunologischer Eigenschaften, markierten Oligopeptiden, markierten Antikörpern, im wesentlichen reinen Antikörpern, diagnostischen Verfahren, Testpackungen und Impfstoffen verwendet werden kann.
Eine ähnliche Analyse hat zu einem weiteren Merkmal der vorliegenden Erfindung geführt, nämlich zu der Entdeckung der hoch-konservierten DNS-Sequenz innerhalb der Sequenz, die für das Hauptkapsidprotein L1 kodiert, das für das oder die gemeinsamen PV-Antigen(e) kodiert. Dieses Antigen (Polypeptid) löst die Bildung von Antikörpern aus, die mit jedem und allen PVs kreuzreaktiv sind. Die Entdeckung dieser hoch-konservierten DNS-Sequenz ermöglicht die Herstellung von PV- gattungsspezifischen Antikörpern, Oligopeptiden zur Verleihung gattungsspezifischer immunogener und immunologischer Eigenschaften, markierten gattungsspezifischen Antikörpern, diagnostischen Verfahren, Testpackungen und ähnlichem.

Beschreibung der Zeichnungen

Figuren 1A, 1B und 1C zeigen den DNS-Sequenzhomologievergleich der offenen L1 Leseraster von BPV-1, HPV-1a bzw. HPV-6b.
Figur 2 zeigt die Aminosäuresequenz der L1 Leseraster für BPV-1 und DPV.
Figur 3 zeigt die Aminosäuresequenz der L1 Leseraster für BPV-1, DPV und eines Teils von BPV-2.
Figuren 4A und 4B zeigen die mit maximaler Übereinstimmung angeordneten Aminosäuresequenzen der L1 Leseraster für BPV-1, DPV, HPV-1a, HPV-6b, CRPV und eines Teils von BPV-2. Es sind homologe Markierungsregionen A, B, C, D und E wie auch bevorzugte und besonders bevorzugte typenspezifische (TS) Regionen dargestellt.
Figur 5 ist ein Vergleich der DNS-Sequenzhomologie zwischen Nucleotid 6040 und 6754 des BPV-1-Genoms und des BPV-2-Genoms.
Figur 6 zeigt die Neutralisierungskinetik der BPV-1-Transformierungsaktivität durch das Antiserum gegen das typenspezifische Decapeptid.

Beste Ausführungsform der Erfindung

Die Erfindung kann bei jedem PV angewendet werden. Man muß nur die Nucleotidsequenz für den L1 Leseraster des Hauptkapsidproteins unter Anwendung herkömmlicher und in der Wissenschaft gut bekannter Sequenzierungstechniken, d.h. Maxam und Gilbert (1977), auf die Bezug genommen wird, erhalten. Der erste ATG- Kodon wird als die erste Aminosäure angesehen. Durch den Vergleich mit bereits bekannten PV-Sequenzen, besonders mit jenen typenspezifischen Sequenzen, die in der Folge angeführt sind, oder durch die Gegenüberstellung gemeinsamer homologer Regionen unter Verwendung von beispielsweise Computervergleichen können die variablen Regionen innerhalb der Nucleotidsequenz, jener Regionen, die PV- Typenspezifität verleihen können, sofort identifiziert werden.
Wenn die PV-typenspezifische variable Region innerhalb der DNS-Sequenz derart lokalisiert wurde, kann man dann (1) die DNS-Sequenz selbst in markierter Form als typenspezifische Sonde verwenden; (2) von der DNS-Sequenz ableitbare Peptidsequenzen in markierter Form in PV-typenspezifischen kompetitiven Tests verwenden; (3) aus Peptidsequenzen, die von der DNS-Sequenz abgeleitet werden können, im wesentlichen reine Antikörper herstellen, die PV-typenspezifisch sind; (4) markierte PV-typenspezifische Antikörper für immunometrische Tests herstellen; (5) Aminosäuresequenzen zur Verleihung PV-spezifischer immunogener Eigenschaften herstellen; und (6) PV-typenspezifische Impfstoffe aus den PV-typenspezifischen Aminosäurefragmenten herstellen. Kurz gesagt, alle Möglichkeiten, die für die hierin genau erklärten Nucleotidsequenzen mit typenspezifischer variabler Region beschrieben sind, stehen als Ergebnis dieser Erfindung nun dem wissenschaftlichen Fachmann zur Verfügung, wobei sich die Techniken und Prinzipien auf alle PVs übertragen lassen.
Zum Beispiel sind in den Figuren 1A, 1B und 1G Vergleiche der L1 Nucleotidsequenz von drei nicht miteinander verwandten Viren, BPV-1, HPV-1a und HPV-6b dargestellt, die durch Computeranalyse unter Verwendung eines Hash-Matrix- Algorithmus erhalten wurden. Die Figuren 1A, 1B und 1G zeigen, daß es Regionen mit signifikantem Ausmaß an Sequenzhomologie gibt. Die Diagonale stellt die homologen Regionen innerhalb des L1 Leserasters dar. Das Ausmaß der Homologie für jeden Datenpunkt entlang der Diagonale wird in dem Balkendiagramm unter jedem Feld angegeben. Figur 1A ist ein Vergleich von BPV-1 (x-Achse) mit HPV-1a; Figur 1B ist ein Vergleich von BPV-1 (x-Achse) mit HPV-6b; und Figur 1C ist ein Vergleich von HPV-6b (x-Achse) mit HPV-1a.
Wenn die Aminosäuresequenz der L1 Leseraster für BPV-1 und DPV verglichen werden, zeigt sich ein höheres Maß an Identität als bei der L1 Polynucleotidsequenz aufgrund der Redundanz des genetischen Codes ersichtlich wäre (Figur 2). Die Aminosäuresequenzen wurden durch Translation der Nucleotidsequenz des offenen L1 Leserasters bestimmt. Die Aminosäuren sind im Ein-Buchstabenkode angegeben (siehe Lehninger, A. L., Biochemistry, 2. Aufl., Seite 72 (1975)) und die Polypeptidsequenzen sind vom ersten Methioninrest an numeriert. Die BPV-1-Sequenz ist in großen Großbuchstaben geschrieben und wo eine Fehlpaarung auf der DPV-Sequenz gefunden wurde, ist die Aminosäure in kleinen Großbuchstaben geschrieben. Für die Anordnung mit maximaler Übereinstimmung wurden Abstände in den Sequenzen gemacht. Die Identität wird als Pluszeichen zwischen den beiden entsprechenden Resten dargestellt.
In Figur 3 werden zwei Viren, BPV-1 und DPV, die etwa 10% DMS- Sequenzhomologie besitzen (Flüssigphasenhybridisierung) und die (zwar sehr schwach) antigenisch kreuzreaktiv sind, miteinander verglichen; das Ausmaß der Aminosäureidentität ist äußerst hoch, mit Ausnahme von fünf Regionen. Jene Regionen auf der BPV-1 Aminosäuresequenz (die vom ersten Methioninrest des L1 Leserasters aus numeriert sind) mit einer Länge von mehr als 6 Aminosäuren, die keine wesentliche Identität mit der DPV-Aminosäuresequenz zeigen, reichen von den Positionen 27 bis 31, 46 bis 57, 260 bis 281, 342 bis 348 und 465 bis 484 und stellen mögliche typenspezifische Bereiche dar. Wenn die BPV-1- Aminosäuresequenz mit der teilweisen BPV-2 Aminosäuresequenz verglichen wird, herrscht eine nahezu vollständige Identität in den Regionen, die von Aminosäuren von Position 342 bis 348 und 464 bis 495 begrenzt werden, wobei eine Region zwischen den Positionen 262 und 283 verbleibt, die eine wesentliche Divergenz in der Aminosäurenidentität aufweist, die sich zwischen diesen beiden eng verwandten Viren zeigt. In Figur 3 wurden Aminosäuresequenzen durch Translation der Nucleotidsequenz des offenen L1 Leserasters bestimmt. Die Aminosäuren sind im Ein-Buchstabenkode dargestellt und die Polypeptidsequenzen sind vom ersten Methioninrest an numeriert. Die BPV-1-Sequenz ist in großen Großbuchstaben geschrieben und wo eine Fehlpaarung auf der BPV-2- oder DPV-Sequenz gefunden wurde, ist die Aminosäure in kleinen Großbuchstaben geschrieben. Für die Anordnung mit maximaler Übereinstimmung wurden Abstände in den Sequenzen gemacht. "-" kennzeichnet die Region der BPV-2 L1-Nucleotidsequenz, die unbekannt ist. Die Identität wird als Pluszeichen zwischen den beiden entsprechenden Resten dargestellt.
Figuren 4a und 4B zeigen die Aminosäuresequenz des L1 Leserasters für BPV-1, DPV, HPV-1a, HPV-6b, CRPV und einen Teil von BPV-2. Aminosäuresequenzen wurden durch Translation der Nucleotidsequenz des jeweiligen offenen L1 Leserasters bestimmt. Die Aminosäuren sind im Ein-Buchstabenkode dargestellt und jede Sequenz ist vom ersten Methioninrest an numeriert. Aminosäuren sind in großen Großbuchstaben geschrieben, wenn zwei oder mehr ident sind; kleine Großbuchstaben zeigen an, daß es keine Identität gibt. Für die Anordnung mit maximaler Übereinstimmung wurden Abstände in den Sequenzen gemacht. "-" kennzeichnet die Region der BPV-2-Nucleotidsequenz, die unbekannt ist. "-" gibt an, wo zumindest zwei Aminosäuren gleich sind und "+" zeigt an, daß alle Aminosäuren gleich sind.
Zur Bestätigung der Auffassung, daß der von den Aminosäurepositionen 262 bis 283 (inklusive) des BPV-L1 Leserasters begrenzte Bereich ein typenspezifisches Immunogen darstellen könnte, wurde ein Decapeptid, das zwischen den Aminosäurepositionen 274 und 283 gefunden wurde, synthetisiert und Antikörper dagegen gebildet. Das Decapeptid, das von der BPV-1-L1-Sequenz abgeleitet wurde, hat folgende Sequenz (vom N-Terminus ausgehend):
lys-asn-asn-lys-gly-asp-ala-thr-leu-lys.
Bei Verwendung des Ein-Buchstabenkodes lautet diese Sequenz:
KNNKGDATLK.
Die vollständigen Einzelheiten des Verfahrens zur Bildung von Antikörpern gegen das synthetisierte Polypeptid, wie auch dessen Ergebnisse, sind in der Folge in Beispiel 1 angeführt. Es stellte sich heraus, daß die hyperimmunen Seren zu intaktem BPV-1 von Kaninchen mit BPV-1 kreuzreagieren; es stellte sich ebenso heraus, daß es mit BPV-2 bei einer etwa zehnfach geringeren Verdünnung reagiert. Der gegen das Decapeptid gebildete Antikörper reagiert nicht mit BPV-2-Fibropapillomen, selbst bei einer Verdünnung von 1:2, während es bei einer Verdünnung von 1:50 mit BPV-1-Fibropapillomen regierte. Die Ergebnisse weisen nachdrücklich darauf hin, daß Antikörper zu dem Decapeptid BPV-1 typenspezifisch sind; von noch größerer Bedeutung ist, daß dieser typenspezifische Antikörper zwischen zwei Viren (BPV-1 und BPV-2) unterscheiden kann, die zur Bestimmung des Unterschieds zwischen Papillomavirustyp und -subtyp verwendet wurden, d.h. mehr oder weniger als 50% DNS-Sequenzhomologie. Das BPV-1-Virus und BPV-2-Virus haben 50% DMS- Sequenzhomologie.
Ein Merkmal der vorliegenden Erfindung betrifft die Entdeckung gewisser Nucleotidsequenzen im L1 Leseraster, die selbst typenspezifisch sind und für verhältnismäßig Kleine Aminosäuresequenzen kodieren, die ebenso typenspezifisch sind. Diese isolierten Sequenzen sind ihrerseits nützlich, d.h. in markierter Form für die DNS- Hybridisierungsanalyse. Der Begriff "isolierte Sequenz" soll DNS-Fragmente umfassen, die nicht natürlich als Fragmente vorkommen und im natürlichen Zustand nicht vorkämen. Diese Sequenzen sind üblicherweise 5 bis 75 Nucleotide lang, vorzugsweise zumindest 18 Nucleotide lang.
Figur 5 zeigt einen Vergleich einer DNS-Sequenzhomologie zwischen Nucleotid 6040 und Nucleotid 6754 des BPV-1-Genoms und des BPV-2-Genoms. Das Balkendiagramm stellt das Ausmaß der Homologie zwischen den viralen Genomen in einer Region unmittelbar stromaufwärts von Position 6440 dar, die das geringste Ausmaß an Sequenzhomologie zeigt. Die obere Nucleotidsequenz zeigt das Homologieausmaß in dieser Region. Identische Nucleotide sind mit "*" bezeichnet. Diese Region mit geringer Sequenzhomologie stellt die Region des offenen L1 Leserasters dar, in der eine Aminosäuredivergenz herrscht. Der Balken zeigt die Region an, die das Polypeptid kodiert, das synthetisiert und zur Bildung BPV-1 typenspezifischer Antikörper verwendet wurde.
Bei einer Numerierung vom ersten Methioninrest aus, reicht die Region von größtem Interesse im offenen L1 Leseraster von Aminosäureposition 262 bis 283 für BPV-1 (22 Aminosäuren; 66 Nucleotide); von Aminosäureposition 263 bis 283 für DPV (21 Aminosäuren; 63 Nucleotide); von Aminosäureposition 271 bis 294 für HPV-1a (24 Aminosäuren; 72 Nucleotide); von Aminosäureposition 266 bis 290 für Waldkaninchen-Papillomavirus (CRPV) (25 Aminosäuren; 75 Nucleotide); von Aminosäureposition 263 bis 283 für HPV-6b (21 Aminosäuren; 63 Nucleotide) und von Aminosäureposition 262 bis 283 für BPV-2 (22 Aminosäuren; 66 Nucleotide). Die Nucleotidsequenz für diese Region ist in der Folge für jedes Virus angeführt:
Diese typenspezifische Region der DNS kodiert für eine typenspezifische Aminosäuresequenz, ein Polypeptid, das eine verhältnismäßig kleine Sequenz von Aminosäuren innerhalb der Aminosäuresequenz ist, die das Hauptkapsidprotein bildet. In der vorliegenden Erfindung umfassen die Begriffe "verhältnismäßig kleine typenspezifische Aminosäuresequenz" und "verhältnismäßig kleines Fragment" eine Aminosäuresequenz, die dem Peptid immunogene und/oder immunologische Spezifität verleiht. Als solches enthält das Peptid zumindest 6 Aminosäuren und kann bis zu etwa drei natürlich vorkommende flankierende Aminosäuren an jeder Seite enthalten, unter der Voraussetzung, daß die natürlich vorkommenden, nichtspezifischen, flankierenden Aminosäuren nicht in einer derartigen Anzahl vorhanden sein dürfen, daß das Peptid mit atypischen PVs (eines anderen Typs) kreuzreaktiv wird. Als obere Grenze der Aminosäuresequenz umfaßt die vorliegende Erfindung 15 bis 25 Aminosäurereste. Es wird jedoch noch einmal darauf hingewiesen, daß das Polypeptid immunospezifisch sein muß, um in den Bereich der Erfindung zu fallen.
Mit den Begriffen "typenspezifisches Polypeptid" und "ein Polypeptid mit einer Sequenz von Aminosäuren, die für ein bestimmtes PV spezifisch ist" sollen die Polypeptide bezeichnet werden, die dem L1-Kapsidprotein entsprechen und Typenspezifität verleihen ("typenspezifisch" und "Typenspezifität" wie oben definiert). Die Polypeptide der vorliegenden Erfindung entsprechen der Aminosäuresequenz, die vorzugsweise durch die Reste 251 und 291, besonders bevorzugt durch die Reste 262 und 283, des L1-Kapsidproteins von BPV-1 begrenzt wird. Der Begriff umfaßt sowohl natürlich vorkommende Polypeptide, synthetische Polypeptide, die zu den natürlich vorkommenden Polypeptiden homolog sind, als auch Derivate davon. Unter "Derivate davon" werden jene Polypeptide verstanden, die sich von der natürlichen Sequenz unterscheiden, aber noch immer Typenspezifität verleihen.
Ferner umfaßt diese Erfindung auch synthetische Peptide, die synthetisiert wurden, um ausreichende Reste aus der typenspezifizierenden Region zu enthalten, um typenspezifische immunogene und/oder immunologische Eigenschaften zu verleihen, und ferner andere Reste zu enthalten, die nicht Teil der natürlichen Sequenz sind.
Das verhältnismäßig kleine typenspezifische Aminosäurensegment der vorliegenden Erfindung kann zum Beispiel zur Herstellung typenspezifischer PV-Antisera unter Anwendung der in der Folge in Beispiel 1 beschriebenen Technik verwendet werden. Die vorliegende Erfindung ist jedoch keineswegs auf die Art und Weise, in der Antisera und Antikörper hergestellt werden, beschränkt, sondern umfaßt bereits bekannte oder noch zu bestimmende Techniken, welche die Antikörpererzeugung aus isoliertem Antigen beinhalten.
Wie oben angeführt, enthalten die natürlich vorkommenden Peptidsegmente ausreichende Mengen der Aminosäuren in der variablen Region, um Typenspezifität zu verleihen, können aber bis zu drei flankierende Aminosäuren an jeder Seite der variablen Regionen enthalten.
Wie für den Fachmann offensichtlich ist, ist es gelegentlich notwendig, für die Anordnung der Sequenzen mit maximaler Übereinstimmung in den Aminosäuresequenzen Zwischenräume einzufügen.
Bei der übereinstimmenden Anordnung der Aminosäuresequenzen werden spezifische Bereiche innerhalb der einzelnen Sequenzen verwendet, die eine exakte Homologie mit den entsprechenden Restpositionen in jeder Sequenz zeigen. Bei Verwendung der BPV1-Aminosäuresequenz (Figur 4) als Basissequenz für den numerischen Bezug und mit neuerlicher Bezugnahme auf Figur 4 kann leicht festgestellt werden, daß es fünf Regionen innerhalb der Aminosäuresequenz für alle sechs Papillomaviren gibt, die eine exakte Sequenzhomologie zeigen. Diese Regionen liegen - einschließlich der Endpunkte - zwischen den Resten 105 und 110 (eine Sequenz aus sechs Aminosäuren, RGQPLG, in der Folge Region A), zwischen den Resten 193 und 196 (eine Sequenz aus vier Aminosäuren, DGDM, in der Folge Region B), zwischen den Resten 200 und 203 (eine Sequenz aus vier Aminosäuren, GFGA, in der Folge Region C), zwischen den Resten 227 und 230 (eine Sequenz aus vier Aminosäuren, YPDY, in der Folge Region D) und zwischen den Resten 292 bis 295 (eine Sequenz aus vier Aminosäuren, PSGS, in der Folge Region E).
Wie aus den Figuren 4A und 4B hervorgeht, führt die Anordnung mit maximaler Übereinstimmung der Aminosäuresequenzen für das Hauptkapsidprotein jedes der hier dargestellten PVs (die durch Sequenzierung des Polynucleotids von jedem erhalten wurde) zu einem Bereich, der besonders frei von Sequenzhomologie ist, wobei der Bereich zwischen den Resten den BPV-1 Resten 251 bis 291, vorzugsweise 262 bis 283, entspricht. Die Zwischenräume, die in Figur 4 dargestellt sind, wurden bestimmt (und können bestimmt werden), indem besonders auf die Übereinstimmung des Tetrapeptids der Region D mit dem Tetrapeptid der Region E und wenn möglich auf die Übereinstimmung der Aminsoäurereste, die durch die Regionen D und E begrenzt werden, geachtet wird. Auf diese Art und Weise können die typenspezifischen Sequenzen für jedes PV sofort bestimmt werden.
Wie oben für BPV-1 gezeigt wurde, bestimmt die Aminosäuresequenz von PV, die den Positionen 251-291, vorzugsweise 262 bis 283, einschließlich der Enden entspricht, die Region der Typenspezifität innerhalb des L1-Kapsidproteins von PV. Gleichfalls bestimmt die entsprechende Region innerhalb der Polynucleotidsequenz, die für das L1-Kapsidprotein kodiert, jene Region der DNS, die typenspezifisch ist.
Unter dieser Voraussetzung und wie angeführt, kann nun die typenspezifische DNS-Sequenz (und Aminosäuresequenz) für jedes PV sofort bestimmt werden. Man muß nur die DNS für das Gen sequenzieren, die für das Hauptkapsidprotein kodiert, die Aminosäuresequenz für das Protein davon ableiten, die Sequenz mit einer bekannten Sequenz wie BPV-1 in Übereinstimmung bringen (wobei besonders die "Markierungssequenzen", Regionen A-E, verwendet werden) und das DNS-Segment (oder entsprechende Aminosäuresegment) auswählen, das den Aminosäureresten 251-291, vorzugsweise 262-283, der BPV-1 Aminosäuresequenz entspricht.
In der vorliegenden Erfindung umfassen die Begriffe "typenspezifische Papillomavirus-DNS" oder "Polynucleotidsequenz, die für einen bestimmten Papillomavirustyp spezifisch ist" das Polynucleotid, das für den typenspezifischen Teil des Hauptkapsidproteins, der den Resten 251-291, vorzugsweise 262-283, der BPV-1 Aminosäuresequenz entspricht, oder für jedes Derivat dieser Aminosäuresequenz kodiert, unter der Voraussetzung, daß die Derivate auch eine Typenspezifität aufweisen. Für den Fachmann ist offensichtlich, daß die Begriffe die natürlich vorkommenden Sequenzen und die synthetischen, von den natürlich Sequenzen abgeleiteten Sequenzen umfassen sowie die Sequenzen, die aufgrund des genetischen Codes degeneriert sind und jene Sequenzen, die aufgrund der "Wobble"-bedingten Flexibilität in der dritten Base Variationen sind (Siehe Watson, J. D. et al., Recombinant DNA: A Short Course, S. 38 (1983), Freeman and Company, New York) und in der Folge "Wobble-Derivate" genannt werden.
Ferner umfaßt der Begriff jene DNS-Sequenzen, die genügend Nucleotide in der gekennzeichneten Polynucleotidsequenz enthalten, um Typenspezifität zu verleihen, d.h. Sequenzen, die an dem einen oder anderen Ende überlappen, wodurch sie "typenspezifische Fragmente" des PV-Genoms darstellen.
Die Polynucleotide dieser Erfindung, die "typenspezifisch" sind oder "Typenspezifität" aufweisen, umfassen jene Polynucleotide, welche die Fähigkeit besitzen, unter Verwendung herkömmlicher Hybridisierungstechniken zwischen PV-Typen zu unterscheiden, wobei diese PVs eine DNS-Sequenzhomologie von weniger als 50% aufweisen.
Spezifische Polynucleotide in der vorliegenden Erfindung umfassen Polynucleotide, die oben beschrieben wurden und für Polyptide kodieren, die den Positionen 251 bis 291, vorzugsweise 262 bis 283, der BPV-1 Sequenz entsprechen, sowie aufgrund des genetischen Codes Degenerierte und "Wobble"-bedingte Variationen davon.
In einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wurde auch entdeckt, daß ein spezifisches Polynucleotidsegment in der DNS, das für das Hauptkapsidprotein des Papillomavirus kodiert, für ein Polyptid kodiert, welches das "gemeinsame Antigen" des Papillomavirus ist.
Unter Anwendung derselben Methodologie, die oben für die "typenspezifischen" Polynucleotide und Polypeptide beschrieben wurde, worin BPV-1 die Basis- Aminosauresequenz für die Numerierung darstellt, wurde nun bestimmt, daß die Aminosauresequenz aller PVs, die dem Hexapeptid zwischen den Resten 105 und 112 entspricht, das oben als Markierungsregion A identifiziert wurde, homolog ist. Diese kodierte Sequenz aus sechs Aminosauren stellt dadurch das "gemeinsame Antigen" dar, d.h. sie erzeugt Antikörper, die gattungsspezifisch sind. Diese gattungsspezifischen Antikörper sind mit allen PVs kreuzreaktiv und in einer Reihe von Immunotests zweckmaßig. Die markierte Peptidsequenz und ihre Derivate sind auch für Immunotests zweckmäßig. Kurt gesagt, dieselbe Nützlichkeit, die dem typenspezifischen Polypeptid zugeschrieben wurde, wird auch den gattungsspezifischen Polypeptiden zugeschrieben, d.h. markierte Antikörper, Testpackungen, usw. Auf ähnliche Weise liegt auch ein sechs-mer Peptid, das die aus B, C, D, E, oder einer anderen "gemeinsamen" Region gewählten homologen Regionen enthalt, im Bereich dieser Erfindung.
Wie aus Figur 4 hervorgeht, umfaßt eine Ausführungsform dieses Merkmals der Erfindung das Hexapeptid:
Arg-Gly-Gln-Pro-Leu-Gly
Wie für den Fachmann offensichtlich, sind auch die dafür kodierenden gattungsspezifischen Polynucleotide enthalten. Als "Derivate" werden jene Aminosäuresequenzen verstanden, die sich von den entsprechenden, natürlich vorkommenden Polypeptiden derart unterscheiden, daß das gattungsspezifische Wesen der Sequenz unverändert ist.

Immunotests

In einer Ausführungsform können die gegen typenspezifische und gattungsspezifische Aminosäuresequenzen des Hauptkapsidproteins gebildeten Antikörper unter Verwendung herkömmlicher Markierungstechniken, die in der Technik allgemein bekannt sind, nachweisbar markiert werden. Die Antikörper können daher unter Verwendung beispielsweise radioaktiver Isotope wie ³H, ¹²&sup5;I, ¹³¹I und ³&sup5;S radioaktiv markiert werden.
Auf ähnliche Weise kann die Peptidsequenz selbst z.B. mit einem radioaktiven Isotop nachweisbar markiert werden.
Der typenspezifische oder gattungsspezifische Antikörper oder das gattungs- oder typenspezifische Peptidsequenzantigen kann auch mit fluoreszierenden Markierungen, Enzymmarkierung, Frei-Radikal-Markierung oder Bakteriophage-Markierung unter Anwendung von Techniken, die in der Wissenschaft bekannt sind, markiert werden (Chard, supra).
Zu den typischen fluoreszierenden Markierungen zählen Fluorescein, Isothiocyanat, Rhodamin, Phicoerythrin, Phicocyanin, Alophicocyanin und Texasrot.
Da spezifische Enzyme durch kovalente Verbindung an andere Moleküle gekoppelt werden können, besteht auch die Möglichkeit, daß sie als Markierung für die Herstellung von Indikatorsubstanzen verwendet werden. Zu den geeigneten Enzymen zählen alkalische Phosphatase, Beta-Galactosidase, Glukose-6-phosphatdehydrogenase, Maleatdehydrogenase und Peroxidase. Zwei wesentliche Arten des Enzym-Immunotests sind die enzymverknüpfte Immunadsorptionsbestimmung (ELISA) und der homogene Enzymimmunotest, der auch unter dem Namen "enzyme-multiplied immunoassay" (EMIT, Cyva Corporation) bekannt ist. Im ELISA-System kann die Trennung z. B. durch Verwendung von Antikörpern erfolgen, die an eine feste Phase gebunden sind. Das EMIT-System hängt von der Deaktivierung des Enzyms im Indikator-Antikörperkomplex ab; die Aktivität kann dadurch ohne Abtrennungsschritt gemessen werden.
Zusätzlich können Chemolumineszenz-Verbindungen als Markierungen verwendet werden. Zu typischen Chemolumineszenz-Verbindungen zählen Luminol, Isoluminol, aromatische Acridiniumester, Imidazole, Acridiniumsalze und Oxilatester. Ebenso können Biolumineszenz-Verbindungen zur Markierung verwendet werden, wobei die Biolumineszenz-Verbindungen Luciferin, Luciferase und Aequorin umfassen.
Nach der Markierung können das antigene Polypeptid oder der Antikörper gegen dieses zur Identifizierung und quantitiven Bestimmung immunologischer Gegenstücke (Antikörper oder antigenes Polypeptid) unter Anwendung der in der Wissenschaft allgemein bekannten Techniken verwendet werden.
Eine gute Beschreibung eines Radioimmunotests (RIA) ist in Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology von Work, T.S. et al. gegeben, mit besonderer Bezugnahme auf das Kapitel "An Introduction to Radioimmune Assay and Related Techniques" von Chard, T., North Holland Publishing Company, New York, New York (1978), auf das hierin Bezug genommen wird.
Eine gute Beschreibung allgemeiner verschiedenartiger immunometrischer Tests ist in den folgenden U.S.-Patenten gegeben: 4.376.110 (David et al.) oder 4.098.867 (Piasio).
Eine besonders interessante Testart umfaßt das Inkubieren einer kleinen Testfluidprobe, von der angenommen wird, daß sie ein PV-Virus enthält, mit einer unlöslichen Scheibe, die mit gereinigten Antikörpern beschichtet ist, die mit dem PV- typenspezifischen Antigen reagieren. Wenn das PV-typenspezifische Antigen (die Aminosäuresequenz) in dem Fluid enthalten ist, bildet sich eine immunochemische Bindung zwischen dem Antigen und dem immobilisierten Antikörper. Nach dem Abwaschen des löslichen Materials wird die unlösliche Scheibe einer zweiten Inkubation unterzogen, diesmal mit einem Enzym- oder radioaktiv markierten, konjugierten Reagens. Wenn in der Probe ein Antigen vorhanden ist, bildet sich eine zweite immunochemische Bindung zwischen dem immobilisierten Antigen auf der Scheibe und dem markierten Antikörper. Nach einer weiteren Waschung zur Entfernung von nichtgebundenem Material wird die Scheibe einer Bestimmung unterzogen, z.B. einer dritten Inkubation mit einem Substrat, das unter dem katalytischen Einfluß eines immobilisierten Enzyms eine chemische Reaktion zur Bildung eines nachweisbaren Endprodukt durchläuft. Dieses Endprodukt kann in der Lösung nur dann vorhanden sein, wenn in der Probe Antigene vorhanden waren, da andernfalls keine Markierungssubstanz immobilisiert wird und das Endprodukt nicht erzeugt werden kann.
Zusätzlich sind die Materialien zur Verwendung in dem Test der Erfindung bestens für die Herstellung einer Packung geeignet. Eine solche Packung kann ein Trägermittel enthalten, das zur Aufnahme eines oder mehrerer Behältermittel, wie Phiolen, Teströhrchen und ähnliches in kleine Sektionen unterteilt ist, wobei jedes der Behältermittel eines der unterschiedlichen, in dem Verfahren verwendeten Elemente enthält.
Zum Beispiel kann eines dieser Behältermittel einen löslichen, nachweisbar markierten Antikörper in lyophilisierter Form oder in Lösung enthalten. Ein anderer Behälter kann unlöslich gemachten Antikörper enthalten. Das Trägermittel kann zusätzlich auch eine Vielzahl von Behältern enthalten, von welchen jeder eine unterschiedliche, vorbestimmte, bekannte Menge an Antigen enthält. Diese letzteren Behälter können dann zur Erstellung einer Standardkurve verwendet werden, in welche die Ergebnisse interpoliert werden, die aus der Probe, welche die unbekannte Menge an Antigen enthält, erhalten wurden.

DNS-Hybridisierungstests

Virale Genome eignen sich aufgrund ihrer Einzigartigkeit und begrenzten Komplexität besonders gut für verschiedene Hybridisierungsmethoden. Die Techniken umfassen die radioaktive Markierung von als Sonden verwendeten Nucleinsäuren, DNS-DNS und RNS-DNS-Hybridisierung mit immobilisierten Nucleinsäuren, Cytohybridisierung und Verfahren der kinetischen Analyse der DNS-DNS und RNS-DNS- Hybridisierung in Lösung. Reinheit und spezifische Radioaktivität der als Sonden verwendeten Nucleinsäuren ist wesentlich, im allgemeinen der Nucleinsäuren mit hoher spezifischer Radioaktivität.
Die Reinheit der als Sonde verwendeten Nucleinsäure ist ein besonders kritischer Punkt in der spezifischen Hybridisierung. Es wird die Verwendung von Viren bevorzugt, die aus extrazellulären Flüssigkeiten anstatt von infizierten Zellen gewonnen wurden, besonders wenn komplementäre RNS (cRNS) oder komplementäre DNS (cDNS) verwendet werden. Viren, die aus Zellen gewonnen werden, enthalten kontaminierte zelluläre DNS, wobei diese nicht immer durch DNase-Behandlung entfernt wird. Daher ist der erste Schritt die Beschaffung eines Virus, das durch ein in der Technik bekanntes Verfahren hoch gereinigt wurde, das die Vollständigkeit der Virionen bewahrt, so daß die Behandlung mit DNase keine Fragmentierung des eingekapselten Genoms verursacht. Die extrahierte virale DNS sollte zu diesem Zeitpunkt gründlich gereinigt sein und das Genom, das sich aus der Reinigung ergibt, ist großteils nicht fragmentiert, so daß es von zellulären Nucleinsäuren aufgrund der physikalischen Eigenschaften wie Größe als auch Dichte oder supergeknäuelter Zustand getrennt werden kann. Danach wird das hoch gereinigte Genom mit Endonucleasen zur Fragmentierung behandelt mit anschließender Isolierung und Gewinnung des Fragments, das die gesuchte Nucleotidsequenz enthält, die für das typenspezifische oder gattungsspezifische virale Protein kodiert. Es kann aber auch eine spezifizierte Polynucleotidsonde unabhängig synthetisiert werden. Schließlich wird die Sonde nachweisbar markiert, wobei die zweckmäßigsten Markierungen ³H, ³²P, ¹²&sup5;I, Enzyme, Biotin/Avidin oder ähnliches sind. Eine vollständigere Besprechung der Nucleinsäure- Hybridisierungstechnik findet man bei Huang, E.D. et al., Bd. 6, S. 457-497(1977), auf das hierin Bezug genommen wird.
Die Polynucleotid- oder Oligonucleotidsonde kann mit einem Atom oder anorganischen Radikal markiert werden, wobei am häufigsten Radionuclide aber vielleicht auch Schwermetalle verwendet werden. In einigen Situationen kann auch die Verwendung eines Antikörpers möglich sein, der spezifisch an die Sonde bindet, die an die einzelsträngige DNS hybridisiert ist. Die Oligonucleotid-Sondentechnik wird von Szostak, J.W. et al., Meth. Enzymol., 68:419-428 (1979) beschrieben, auf das hierin Bezug genommen wird.
Am häufigsten wird eine radioaktive Markierung verwendet, wobei geeignete radioaktive Markierungen ³²P, ³H, ¹&sup4;C oder ähnliches umfassen. Es kann jede radioaktive Markierung verwendet werden, die ein angemessenes Signal liefert und eine ausreichende Halbwertszeit besitzt. Andere Markierungen umfassen Liganden, Fluoreszenzstoffe, Chemolumineszenzstoffe, Enzyme, Antikörper und ähnliches.
Durch Computeranalyse der Nucleotidsequenz von sech; einzigartigen PV- Typen, BPV-1, DPV, HPV-1a, HPV-6b, CRPV und BPV-2 wurde eine Nucleotidsequenz identifiziert, die vollkommen nichthomolog ist und für antigenisch typenspezifische Proteine kodiert. Die Sequenzen lauten:
Unter Verwendung bekannter Techniken zur Herstellung markierter DNS- Sonden ist es möglich, typenspezifische DNS-Sonden zu Hybridisierungszwecken zu konstruieren. Ein Merkmal der vorliegenden Erfindung betrifft daher PV- typenspezifische DNS-Sequenzen, die als Ergebnis einer Sequenzanalyse ermittelt werden können.
In der vorliegenden Erfindung umfaßt der Begriff "typenspezifische DNS- Sequenz" die stark variable Region im PV-Genom, die für das immunologisch spezifische Hauptkapsidstrukturprotein kodiert. Als solche enthält die gesuchte Nucleotidsequenz auch flankierende, natürlich vorkommende Nucleotide, unter der Voraussetzung, daß diese flankierenden Nucleotide nicht in einer derartige Anzahl vorhanden sein dürfen, daß die Hybridisierungspezifität der DNS-Sequenz geändert wird. Üblicherweise enthält die DNS-Sequenz zumindest 18 Nucleotide. Ferner sollen alle anderen Nucleotide, die zumindest 18 Elemente enthalten und für immunologisch spezifische Strukturproteine kodieren, im Bereich der Erfindung enthalten sein.
Außer der Zweckmäßigkeit zur Erzeugung der Peptidsequenzen selbst, sind die typenspezifischen DNS-Sequenzen der PVs auch zur Herstellung von DNS-Sonden unter Anwendung von in der Wissenschaft allgemein bekannten Techniken geeignet. Typische Herstellungsverfahren für DNS-Sonden sind bei Maniatis, T., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory (1982) beschrieben. Bei einer beschriebenen Technik kann E. coli-DNS-Polymerase I verwendet werden, um dem 3'-hydroxy-Terminus, der beim Bruch eines Strangs eines doppelsträngigen DNS- Moleküls entsteht, Nucleotidreste hinzuzufügen. Zusätzlich kann das Enzym, durch seine 5'- bis 3'-Exonuclease-Aktivität Nucleotide von der 5'-Seite des Bruchs entfernen. Die Entfernung der Nucleotide von der 5'-Seite und die folgende Anfügung von Nucleotiden an die 3'-Seite führt zur Bildung des Bruchs (Nick-Translation) entlang der DNS (Kelley et al., J. Biol. Chem., 245:39 (1970)). Durch Austausch von zuvor bestehenden Nucleotiden durch hoch radioaktive Nucleotide ist es möglich, markierte DNS mit einer Spezifität von mehr als 10&sup8; cpm/ug herzustellen (Rigby, P. W. J. et al., J. Mol. Biol., 113:237(1977)).
Es wird eine Reihe von Techniken für die molekulare Hybridisierung zur Bestimmung der viralen DNS-Sequenzen in Geweben verwendet; jede weist gewisse Vorteile und Nachteile auf. Wenn große Gewebsmengen verfügbar sind, bietet die Analyse der Hybridisierungskinetik die Möglichkeit, die Menge an vorhandener viraler DNS exakt zu quantifizieren, eng verwandte aber für die Sonde nicht identische Sequenzen zu unterscheiden und die Homologie in Prozent zu bestimmen. Die Reaktionen laufen unter Hybridisierungsbedingungen (Tm-25ºC), wobei die Reassoziationsgeschwindigkeit der Sonde optimal ist (Wetmur, J. G. et al., J. Mol. Biol., 31: 349-370 (1968)). Die Reaktionskinetik ist zweitrangig, wenn die Sequenzen in dem Gewebe mit jenen der Sonde identisch sind; die Reaktion zeigt jedoch eine komplexe Kinetik, wenn Sondensequenzen eine teilweise Homologie mit jenen im Gewebe aufweisen (Sharp, P.A. et al., J. Mol. Biol., 86. 709-726(1974)).
Üblicherweise kann DNS aus Gewebe durch Sektionieren auf einem Cryostat, Lysieren der Sektionen mit einem Detergens, wie SDS, und einem Chelatbildner, wie EDTA, und wahlweise durch Digestion über Nacht mit Proteinase K (50ug/ml) isoliert werden. Protein wird durch Phenol- und Chloroformextraktionen entfernt und die Nucleinsäuren werden mit Ethanol ausgefällt. RNS wird durch Behandlung mit wärmebehandelter RNase A entfernt und die DNS mit Phenol und Chloroform reextrahiert. Für kinetische Untersuchungen werden die DNS-Lösungen durch Beschallung zu einer gleichförmigen einzelsträngigen Stückgröße (etwa 500 Nucleotide) geschert. Die Sonden-DNS werden entweder durch ³H-Thymidintriphosphat oder Alpha-³²P-Desoxynucleotidtriphosphat durch Nicktranslation auf hohe spezifische Aktivität markiert (Rigby et al., supra). Die Konzentration der Sonde zur Zell-DNS wird durch die gewünschte Empfindlichkeit bestimmt. Der Nachweis eines Papillomavirus-Genoms pro Zelle erforderte 1,3 pg der Sonde pro ug Zell-DNS (Gelb, L.D. et al., J. Mol. Biolog., 57: 129-145 (1971)). DNS werden vermischt, denaturiert, auf die geeignete Salzkonzentration und Temperatur gebracht und unterschiedliche Zeiträume hybridisieren gelassen. Die Reassoziationsgeschwindigkeit kann durch quantitative Bestimmung der Menge an hybridisierter Sonde entweder durch Hydroxyapatitchromatographie (Britten, R. J. et al., Science, 161: 529-540 (1968)) oder S1-Nucleasedigestion (Sutton, W. D., Biochem. Biophys. Acta, 240: 522-531(1971)) bestimmt werden.
Ein etwas flexibleres Hybridisierungsverfahren ist das Southern-Blotting (Southern, E. N., J. Mol. Biol., 93: 503-517(1975)). Bei dieser Technik sind Unterschiede in der Stringenz der Hybridisierungsreaktion möglich, wie auch die Bestimmung des Zustands der viralen Sequenzen in der analysierten Probe. Zell-DNS (5-20 ug) kann entweder durch Restriktionsendonucleasen digeriert werden oder unverdaut bleiben und einer Elektrophorese durch Agarosegele unterzogen werden. Die DNS wird in situ mit Alkali denaturiert, neutralisiert und auf eine Nitrocellulosemembran übertragen. Zur Erleichterung der Übertragung von DNS in Gele, die unverdaute oder FO-I-Sequenzen enthalten, wird DNS vor der Denaturierung durch Behandlung des Gels mit verdünnter HCl depuriniert (Wahl, G. M. et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 76: 3683-3687(1979)). Nach dem Waschen wird die Membran unter Vakuum zwei Stunden bei 80ºC hitzebehandelt und in 10X Denhardt-Lösung (jeweils 0,2% Ficoll, Rinderserumalbumin, Polyvinylpyrrolidon) in 4X SSC (SSC = 0,15M NaCl, 0,05M Natriumcitrat), die 50 ug/ml beschallte und denaturierte Lachsspermien-DNS enthält, vier Stunden bei 60ºC vorhybridisiert. Es wird eine stringente Hybridisierung (Tm-25ºC) 16-24 Stunden bei 37ºC in einer Lösung durchgeführt, die 1-5 X 10&sup6; Zählmarken/min ³²P-markierte nick-translatierte DNS (spezifische Aktivität von 1-2 X 10&sup8; Zählmarken/m/ug DNS), 1M NaCl, 1X Denhardt, 0,15M TES [Tris(hydroxymethyl)methyl-2-aminoethan Sulfonsäure], pH 7,5 mit 50 ug/ml beschallter und denaturierter Lachsspermien-DNS in 50% Formamid enthält. Die Membrane werden gründlich in 0,1X SSC bei 52ºC gewaschen, luftgetrocknet und einem Röntgenfilm ausgesetzt. Bei einer nicht stringenten Hybridisierung (Tm-43ºC) führt eine vollständige zelluläre DNS zu einer Hintergrundhybridisierung, die den Nachweis der HPV- Sequenzen beeinträchtigt. Für diese Reaktionen werden Überstandfraktionen durch Lysieren von Gewebssektionen wie oben beschrieben isoliert, aber vor der Deproteinisierung werden die viskosen Lösungen auf 1M NaCl gebracht und bei 4ºC über Nacht stehen gelassen, um Sequenzen mit hohem Molekulargewicht auszufällen. Die Fraktionen mit hohem und geringem Molekulargewicht werden durch Zentrifugation bei 12.000 X g 20 Minuten in der Kälte getrennt. Der Überstand wird deproteinisiert und die DNS wird ausgefällt und zur Southern-Analyse verwendet. Die Reaktionen werden wie oben beschrieben durchgeführt, mit der Ausnahme, daß menschliche Lymphozyten-DNS anstelle der Lachsspermien-DNS verwendet wird und die Hybridisierungen 30% Formamid enthalten. Die Membranen werden gründlich in 4X SSC bei 52ºC gewaschen, luftgetrocknet und einem Röntgenfilm ausgesetzt. Da die Papillomaviren konservierte DNS-Sequenzen besitzen, die unter nicht stringenten Hybridisierungsbedingungen nachgewiesen werden können, ist die nicht stringente Hybridisierung zur Identifizierung von PVs, aber nicht von typenspezifischen PVs geeignet.
Eine wichtige Überlegung in Verbindung mit der Hybridisierungsanalyse von Papillomaviren ist das Ausmaß der Verwandtschaft, das die Sonde mit den Sequenzen aufweist, die in der untersuchten Probe enthalten sind. Dies ist beim Southern- Blotting bedeutend, da ein geringes Maß der Sequenzhomologie unter stringenten Hybridisierungsbedingungen ein starkes Signal erzeugen kann, selbst wenn die Sonde und die Sequenzen in der Probe unterschiedliche Virustypen darstellen. HPV-6 und HPV-11 weisen unter stringenten Bedingungen etwa 25% Sequenzhomologie auf (Gissman, L. et al., J. Virol., 44:393-400(1982)) und wenn keine Restriktionsenzymanalysen durchgeführt werden, ist es schwierig festzustellen, ob ein Signal von den HPV-6- oder HPV-11-Sequenzen ausgeht. Zur Unterscheidung dieser beiden Virustypen und ihrer Subtypen hat sich die Pst I-Verdauung als geeignet erwiesen (Gissman, L. et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 80: 560-563(1983)). Ein Beispiel für diese Kreuzhybridisierung ist anschließend in Beispiel 2 und Figur 5 angeführt.
Die wie oben beschrieben, markierten Sonden bieten ein allgemeines diagnostisches Verfahren für den Nachweis typenspezifischer PVs. Das Verfahren ist angemessen rasch, umfaßt ein einfaches Protokoll und Reagentien, die standardisiert und als im Handel erhältlich Packungen erzeugt werden können, und ermöglicht eine rasche Durchmusterung einer großen Zahl von Proben. Bei einer Methode zur Durchführung des Verfahrens, wird ein Genom, das ein klinisches Isolat enthält, behandelt, um eine einzelsträngige genomische Nucleinsäure zu erhalten, wonach das einzelsträngige Polynucleotid auf einen Träger fixiert wird. Die fixierte Nucleinsäure, DNS oder RNS wird mit einem markierten Polynucleotid in Kontakt gebracht, dessen Basensequenz dem kodierenden Strang des Gens, das für das typenspezifische Kapsidprotein kodiert, komplementär ist.
Das erste Reagens ist die markierte Sonde, die RNS oder DNS sein kann. Im allgemeinen weist die Sonde zumindest 25 Basen, üblicherweise zumindest etwa 30 Basen, auf und es können sogar noch mehr sein. Die Grenze in dieser Hinsicht besteht darin, daß die Sonde nicht mehr als die Mindestanzahl an Nucleotiden enthalten soll, die zur Aufrechterhaltung der PV-Typenspezifität in Bezug auf das Protein, für das sie kodiert, erforderlich sind.
Die Sonde kann von Boten-RNS, von cDNS, die durch Umkehrtranskription der Boten-RNS mit reverser Transcriptase oder durch Spaltung des Genoms erhalten wird, einfach durch Endonucleaseverdauung mit anschließendem Klonen des Gens oder Genfragments gemäß der bekannten Techniken erhalten werden. Siehe z.B. Kornberg, DNA Replication, W. H. Freeman & Co., San Francisco, 1980, S. 670-679. Oder das Gen wird nach der Technik, die von Merrifield, J. M. Chem. Soc, 85:2149 (1962) beschrieben wird, synthetisiert. Nach der Isolierung des DNS- Fragments kann das Fragment zur Bereitung der Sonde verwendet werden.
Die spezielle Hybridisierungstechnik ist für die Erfindung nicht wesentlich, jede Technik, die allgemein in der Wissenschaft verwendet wird, liegt im Bereich der vorliegenden Erfindung. Eine typische Sondentechnologie ist im U.S.-Patent 4.358.535 an Falkow et al. beschrieben, auf das hierin Bezug genommen wird.
Wie bei den obenbeschriebenen Immunotests sind die Hybridisierungstests der vorliegenden Erfindung besonders gut zur Präsentation und Vermarktung in Pakkungsform geeignet, wobei die Packung ein Trägermittel umfaßt, das in eng begrenzte Abschnitte unterteilt ist, um ein oder mehrere Behältermittel (Phiole, Teströhrchen, usw.) aufzunehmen, wobei jedes der Behältermittel eines der unterschiedlichen Elemente zur Verwendung im Hybridisierungstest enthält.
Zum Beispiel kann eine Phiole eine lösliche, nachweisbar markierte typenspezifische oder gattungsspezifische DNS-Sequenz (eine markierte Sonde) enthalten, während eine oder mehrere Phiolen unterschiedliche, vorbestimmte Mengen an PV- Antigen enthalten. Diese letzteren Behälter können dann zur Erstellung einer Standardkurve für die Interpolation von Daten, die von der unbekannten Probe erhalten wurden, verwendet werden.

Impfstoffe

Ein Merkmal der vorliegenden Erfindung beinhaltet die Entwicklung PV- typenspezifischer Impfstoffe. Es gibt verschiedene Verfahren zur Herstellung von Impfstoffen gegen Viren. Die bevorzugten Grundanforderungen an jeden Impfstoff und an jedes Verfahren zur Herstellung eines Impfstoffs sind, daß (1) der erhaltene Impfstoff die erforderlichen antigenen Determinanten enthält, um die Bildung von Antikörpern im Wirt auszulösen; (2) der Impfstoff ein hohes immunogenes Potential besitzt; (3) der erhaltene Impfstoff sicher genug ist, um ohne Risiko einer klinischen Infektion, sowohl beim Empfanger als auch bei Kontaktpersonen des Empfangers, verabreicht werden zu können und daß daher das Risiko, das mit der Impfung verbunden ist, auf ein Mindestmaß herabgesetzt, wenn nicht vollständig eliminiert werden soll; (4) der erhaltene Impfstoff frei von toxischen Nebenwirkungen ist, wie z.B. Fieber durch Endotoxin, das in getöteten oder extrahierten Zellen vorhanden ist; (5) der erhaltene Impfstoff zur Verabreichung über einen wirksamen Weg, zum Beispiel den oralen, intranasalen, topischen oder parenteralen geeignet ist; (6) der erhaltene Impfstoff die Umstände einer natürlichen Infektion gut nachahmt; (7) der erhaltene Impfstoff bei langfristigen Lagerbedingungen stabil ist und diese langfristige Lagerung bei Raumtemperatur erfolgt; und (8) der erhaltene Impfstoff mit den üblichen neutralen Impfstoffträgern kompatibel ist. Diese Bedingungen können durch den Impfstoff der vorliegenden Erfindung erfüllt werden.
In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung enthalten Impfstoffe, die aus immunogenisch typenspezifischen Aminosäuresequenzen des L1 Leserasters bereitet wurden, die antigene Komponente des Impfstoffs. Es kann erforderlich oder bevorzugt sein, das Antigen kovalent an einen immunogenen Träger zu binden, z.B. Rinderserumalbumin oder klares Schlüssel-Hämocyanin. Die Impfstoffe der vorliegenden Erfindung können jedem Säugetier verabreicht werden, das für eine Infektion mit dem Papillomavirus anfällig ist. Menschliche oder nichtmenschliche Säugetiere können als Wirte Nutzen ziehen.
Die Verabreichung kann abhängig vom natürlichen Infektionsweg parenteral, aber vorzugsweise oral oder intranasal, erfolgen. Die verabreichte Dosierung kann vom Alter, der Gesundheit, dem Gewicht, gegebenenfalls von der Art gleichzeitiger Behandlung und der Art des Papillomavirus abhängen. Der Impfstoff kann in Dosierungsformen wie Kapseln, flüssigen Lösungen, Suspensionen oder Elixieren zur oralen Verabreichung, oder als sterile flüssige Zubereitungsform wie Lösungen oder Suspensionen zur parenteralen oder intranasalen Anwendung verwendet werden. Vorzugsweise wird ein neutraler, immunologisch vertraglicher Träger verwendet, wie Kochsalzlösung oder phosphatgepufferte Kochsalzlösung.
Das Verfahren der vorliegenden Erfindung ermöglicht die Herstellung von Impfstoffen gegen jedes PV, für das der spezifische Teil der Nucleinsäuresequenz, die für ein immunogenisch aktives Peptid des L1-Leserasters kodiert, bekannt ist. Ferner ermöglicht dasselbe Prinzip die Herstellung von Impfstoffen aus jeder immunogenen typenspezifischen Nucleinsäuresequenz innerhalb der DNS des PV.
Nachdem die Erfindung nun allgemein beschrieben wurde, werden die folgenden Beispiele zur Veranschaulichung angeführt und sind, falls nicht ausdrücklich darauf hingewiesen wird, nicht als Einschränkung gedacht.

BEISPIEL 1

Das Decapeptid, das von den Teilen 274 bis 283 der BPV-1 L1-Sequenz, lys- asn-asn-lys-gly-asp-ala-thr-leu-lys (vom N-Terminus) erhalten wird, wurde synthetisiert. Die chromatographische Analyse zeigte, daß die Reinheit des Decapeptids größer als 98% war. Das Decapeptid wurde an Poly-DL-alanin-poly-L-lysin gekoppelt und dieses Konjugat wurde an das Adjuvans-Peptid N-Acetylmuramyl-L-alanin-D- isoglutamin gekoppelt. Das Konjugat wurde in Freundtschem Volladjuvans homogenisiert. Mit dem konjugierten Decapeptid wurden Kaninchen intramuskulär geimpft, mit drei Injektionen dieser Zubereitung in Abständen von zwei Wochen und anschließend drei zusätzlichen Injektionen in Abständen von zwei Wochen mit nichtkonjugiertem Decapeptid. Zwei Wochen nach der dritten Konjugat-Impfung wurde durch Immunofluoreszenz auf acetonfixierten gefrorenen Abschnitten des BPV-1 Fibropapilloms eine sehr schwache Antikörperantwort festgestellt. Nach der dritten Injektion mit nichtkonjugiertem Peptid war die Antikörperantwort durch Immunofluoreszenz bei einer 1:50 Verdünnung nachweisbar. Im Gegensatz dazu wiesen hyperimmune Kaninchensera, die gegen intaktes BPV-1 gebildet wurden, einen etwa zehnmal höheren Titer-Test durch Immunofluoreszenz auf. Obwohl solche hyperimmunen Sera mit BPV-1 reagierten, reagierten sie auch mit BPV-2, das Fibropapillome bei einer Verdünnung von etwa 1:125 enthielt. Der gegen das Decapeptid gebildete Antikörper jedoch reagierte nicht mit BPV-2 Fibropapillomen bei einer Verdünnung von 1:2. Diese Ergebnisse zeigen, daß Antikörper gegen das Decapeptid BPV-1 typenspezifisch sind.
Figur 6 zeigt die Neutralisierungskinetik der BPV- Transformierungsaktivität durch das Antiserum gegen das Decapeptid. BPV-1 wurde in Gegenwart von entweder Antiserum gegen das Decapeptid (O), Antiserum gegen Detergens-gespaltenes BPV-1 oder normalem Kaninchenserum (O) inkubiert. Einlagige Schichten von C127 Mauszellen wurden mit serumbehandeltem Virus infiziert und die Fokusbildung nach drei Wochen bewertet. Fünfzig Prozent Neutralisierung der Virus- Transformierungsaktivität für Antiserum gegenüber Detergens-gespaltenem BPV-1 lag bei etwa 1:10.000; normales Kaninchenserum zeigte keine BPV-1-Transformierungsaktivität.
Nachdem die Erfindung nun vollständig beschrieben wurde, wird für den Fachmann offensichtlich sein, daß gewisse Änderungen und Modifikationen innerhalb des Bereichs der beiliegenden Ansprüche durchgeführt werden können.

Claims

1. Nachweisbar markiertes Polynucleotidsegment zur Unterscheidung von Papillomavirustypen, wobei das Segment zumindest 5 Nucleotide der Nucleotidsequenz eines bestimmten Papillomavirustyps umfaßt, die, den BPV-1 L1 Protein-Aminosäuren 251 bis 291 entspricht.

2. Isoliertes Polynucleotidsegment, welches ein Papillomavirussegment umfaßt, das zur Unterscheidung von Papillomavirustypen geeignet ist, wobei das Papillomavirussegment zumindest 5 Nucleotide der Nucleotidsequenz eines bestimmten Papillomavirustyps umfaßt, die den BPV-1 L1 Protein-Aminosäuren 251 bis 291 entspricht.

3. Polynucleotidsegment nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, wobei das Papillomavirussegment die Nucleotidsequenz eines bestimmten Papillomavirustyps umfaßt, die den BPV-1 LI Protein-Aminosäuren 262 bis 283 entspricht.

4. Polypeptid, das eine für ein besonderes Papillomavirus spezifische Sequenz von Aminosäuren aufweist und durch eine Polynucleotidsequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 3 kodiert wird.

5. PV-typenspezifischer gegen ein Polypeptid nach Anspruch 4 gebildeter Antikörper.

6. Verfahren zur Bestimmung eines Papillomavirustyps, welche folgendes umfaßt:

(a) In-Kontakt-Bringen einer Probe, die eine einzelsträngige Papillomavirus- DNS enthält, mit einer Papillomavirus-typenspezifischen Polynucleotidsonde, die ein Polynucleotidsegment nach einem der Ansprüche 1 bis 3 enthält.

(b)Zulassen der Hybridisierung zwischen der DNS und der Sonde;

(c) Nachweis des Sonden-DNS-Hybrids; und

(d) Bestimmung des Typs der Papillomavirus-DNS durch Anwesenheit oder Fehlen von Hybriden.

7. Verfahren zur Identifikation von typenspezifischem PV, wobei eine Probe, die das Virus mit einem markierten Aminosäurefragment nach Anspruch 4 enthält, mit einem Antikörper für dieses Virus in Kontakt gebracht und das Bindungsausmaß zwischen dem Antikörper und dem Fragment bestimmt wird.

8. Verfahren zur Identifikation von typenspezifischem PV, wobei eine das Virus enthaltende Probe mit dem markierten Antikörper nach Anspruch 5 in Kontakt gebracht und das Ausmaß bestimmt wird, in dem sich der Antikörper an das Virus bindet.

9. Verfahren zur Herstellung typenspezifischer PV Virusantikörper, welches die Hyperimmunisierung von Kaninchen mit einem Polypeptid nach Anspruch 4 umfaßt.

10. Papillomavirus-typenspezifischer Impfstoff, der ein Polypeptid nach Anspruch 4 mit einem Impfstoffträger umfaßt.