DE3587623T2

DE3587623T2 - Enzymatische Hydrolyse von körniger Stärke direkt bis zu Glukose.

Info

Publication number: DE3587623T2
Application number: DE3587623T
Authority: DE
Inventors: Leroy Eugene Jackson; Martin Seidman
Original assignee: Genencor Inc
Current assignee: Genencor Inc
Priority date: 1984-08-06
Filing date: 1985-07-19
Publication date: 1994-05-19
Anticipated expiration: 2005-07-20
Also published as: EP0171218A3; AU587984B2; DK341785D0; JP2589941B2; DK341785A; EP0171218B1; JPH06339375A; JPH0740939B2; NZ212978A; ATE95837T1; CA1282724C; EP0171218A2; AU4523385A; JPS6147189A; DE3587623D1

Description

Stärke ist ein hochmolekulargewichtiges Polymer, bestehend aus in Anhydroglucoseeinheiten kondensierter Glucose. Komplette Hydrolyse von Stärkepolymer sollte zu Dextrose (Glucose) führen, und Stärke wird gebraucht, um Dextrose zu erzeugen, entweder als Endprodukt oder als Rohmaterial zur Herstellung von Fructose oder anderen Produkten.
Stärke kommt in der Natur in vielen Pflanzen in Form von diskreten Körnern vor, welche im wesentlichen unlöslich in Wasser bei Umgebungstemperatur sind. Teilweise aufgrund der Unlöslichkeit ist die kommerzielle Konvertierung von "Roh"- Stärke (Stärke in seiner Original körnigen Form) zu einer Lösung von Dextrose, oder zu Glucosesirup ist ein stark energieverbrauchender Prozeß.
In einem ersten Schritt der zur Zeit genutzten kommerziellen Prozesse wird ein wäßriges Gemisch von unverklebter Stärke erhitzt auf eine Temperatur höher als ihre Gelatinierungstemperatur mit einer Säure oder einem thermisch stabilen Enzympräparat. Der Sinn ist, die körnige Struktur der Stärke (das ist die Gelatinierung) aufzubrechen, die Stärke zu hydrieren und sie teilweise zu hydrolysieren und dabei ihre Viskosität zu reduzieren. Dies ist notwendig für Behandlungen bei sinnvollen Konzentrationen, gewählt zum Ausgleich der Viskosität, Kosten von entferntem Wasser und Bildung von gewissen unerwünschten Nebenprodukten. Ungeachtet vieler Vorschläge zum Betrieb auf andere Wege ist dieser erste Schritt von Teilhydrolyse genannt "Verdünnung" erhalten geblieben, ungeachtet seiner Kosten und Nachteile.
Nach der Verdünnung wird die Stärke umgewandelt zu Dextrose durch Hydrolyse in Gegenwart von verzuckernder Enzymglycoamylase (EC 3.2.1.3). Verdünnung von Stärke mit Säure, im allgemeinen bei Temperaturen in der Größenordnung von 120ºC ergibt Stärkefragmente und Repolymerisationsprodukte, welche resistent gegen die Hydrolyse durch Glucoamylase ist und reduziert den Ertrag. Diese Nebenprodukte bedingen Schwierigkeiten bei der Filtration, und sie interferieren bei der Kristallisation von Dextrose und bei der Umwandlung von Dextrose in Hoch- Fructosesirups, insbesondere wenn chromatographische Anreicherung genutzt wird. Farbkörper, Hydroxy- Methylfurfural und andere Abbauprodukte sind ebenfalls produziert, und diese müssen beim Raffinieren entfernt werden.
Enzymatische Verdünnung (mit Alpha-Amylase, EC 3.2.1.1) wird normalerweise bei Temperaturen zwischen 85ºC und 110ºC und höherem pH, als er in der Verzuckerungsreaktion genutzt wird, durchgeführt, jedoch ist ein Erhitzungsschritt über 120ºC normalerweise mit eingeschlossen, um eine komplette Dispergierung der Stärke zu erreichen und die Filtration, welche folgt, zu verbessern. Enzymatische Verdünnung reduziert aber verhindert nicht die Bildung von gleichen Typen von unerwünschten Nebenprodukten. Kühlung ist nach der Verdünnung bei allen Methoden erforderlich, da Glucoamylase ein relativ niedriges Temperaturoptimum besitzt. Einige dieser Probleme sind beschrieben in Walon, US-Patent 4,235,965, veröffentlicht 25. November 1980.
Ein anderer Nachteil des Verdünnungsprozesses ist die Notwendigkeit der Justierung des pH oder Säuregehalts. Die in weiten Kreisen genutzten Glucoamylasepräparate haben optimale pH-Werte unter 5,0, meistens zwischen 4,0 und 4,5. Wenn Säure zur Verdünnung von Stärke genutzt wird, muß der pH in diesem Bereich mit Alkali gebracht werden. Da Alpha- Amylase ein pH-Optimum über 5,0 hat, muß der pH auf das Optimum für Glucoamylase reduziert werden. In beiden Fällen fügt die Änderung im pH Ionen hinzu, welche später entfernt werden müssen.
Die vorliegende Erfindung ermöglicht die direkte Umwandlung von körniger Stärke, das ist Rohstärke in wäßrigem Gemisch (Suspension) zu Dextrose (Glucose) in Lösung. Dies wird erreicht durch die Benutzung eines neuen Enzympräparats mit einer einzigartigen Kombination von Eigenschaften. Dieses Enzympräparat ist gemacht von einer Anzahl von thermophilen und mesophilen Pilze, welche entdeckt und identifiziert worden sind. Das Enzympräparat ist bemerkenswert wegen seiner Fähigkeit, unlösliches Stärkegranulat direkt zu Dextrose umzuwandeln, bei Temperaturen unter der Eindickungstemperatur von Stärke bei Stärkekonzentrationen hoch genug für kommerzielle Glucoseproduktion und ohne einen Verdünnungs- oder Lösungszwischenschritt und ohne Verklebung und Verdickung der Stärke.

Zusammenfassung der Erfindung

In einem Aspekt stellt die Erfindung ein Enzympräparat zur Verfügung erhältlich von einer substantiell reinen Kultur eines Pilzorganismus, welcher ein Stamm von Humicola grisea var. thermoidae ist, wobei das Enzympräparat die Hydrolyse von körniger Stärke im wesentlichen direkt zu Glucose katalysiert, das Enzympräparat gekennzeichnet dadurch, daß
a) es katalysiert die Hydrolyse von körniger Stärke, suspendiert in Wasser bei einer Konzentration von 15 Gewichtsprozent Stärkesubstanz im wesentlichen vollständig zu löslichen Glucosesirupkörpern mit mindestens 97 Gewichtsprozent Glucose, Trockensubstanzbasis, wenn die Hydrolyse betrieben wird bei einem pH-Wert von 5,0-7,0 und einer Temperatur von 55ºC und ohne zugefügte Alphaamylase oder zugefügtes Nichtverzweigungsenzym der Pullulanase, Isoamylase oder Betamylasetyp,
b) es ist separierbar durch Carboxymethyl-Cellulose in eine erste nicht absorbierende Fraktion und eine zweite absorbierende proteinartige Fraktion, genannte erste nicht absorbierende Fraktion mit einer Glucoamylase verstärkenden Aktivität und genannte zweite absorbierende Fraktion mit einer Glucoamylase Enzymaktivität (EC 3.2.1.3), welche einen isoelektrischen Punkt von 8,0 oder höher besitzt.
In einem anderen Aspekt stellt die vorliegende Erfindung einen Pilzorganismus zur Verfügung, welcher vom Stamm von Humicola grisea var. thermoidae, hinterlegt unter der Referenz NRRL 15219, NRRL 15220, NRRL 15221, NRRL 15222, NRRL 15223, NRRL 15224 und NRRL 15225 oder einem genetisch veränderten Stamm, künstlich erhalten von einem der vorgenannten Organismen, und welcher die Fähigkeit besitzt, wenn er mit dem Standard-Kultur-Verfahren, wie es hierin definiert ist, kultiviert wird, ein Enzympräparat zu erzeugen, wie es in Anspruch 1 charakterisiert ist, mit einer RSH-(Rohstärkehydrolyse)Aktivität von 120 Einheiten pro ml oder mehr besitzt, geprüft mit dem Standard- Prüfungs-Verfahren Nr. 1, wie es hierin definiert ist.
In einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung eine Glucoamylasefraktion zur Verfügung, erhältlich von einer im wesentlichen reinen Kultur eines Pilzorganismus, welcher ein Stamm von Humicola grisea var. thermoidae ist, gekennzeichnet dadurch, daß er einen isoelektrischen Punkt von ungefähr 8,0 oder höher als 8,0 hat und fähig ist, an Carboxymethyl-Cellulose absorbiert zu werden und eine maximale Aktivität bei einem pH zwischen 5,0 und 7,0 zeigt.
In einem weitergehenden Aspekt stellt die Erfindung eine verstärkende Enzymfraktion zur Verfügung, welche gemeinsam mit einem Glykoamylaseenzym erhältlich ist von einer im wesentlichen reinen Kultur eines Pilzorganismus, welcher ein Stamm von Humicola grisea var. thermoidae ist, katalysiert die Hydrolyse von körniger Stärke, suspendiert in Wasser, bei einer Konzentration von 15 Gewichtsprozent Stärkesubstanz im wesentlichen vollständig zu löslicher Glucosesirupsubstanz mit mindestens 97 Gewichtsprozent Glucose auf Trockensubstanzbasis, wenn die Hydrolyse ausgeführt wird bei einem pH von 5,0-7,0 und einer Temperatur von 55ºC und ohne hinzugefügte Alpha-Amylase oder zugeführte nicht verzweigende Enzyme von Pullulanase, Isoamylase oder Beta-Amylasetypus.
Die Erfindung betrifft die Verlöslichung und Hydrolysierung von Rohstärke zur Erzeugung von Carbohydratverbindungen, vorzugsweise Glucose. Der Prozeß beinhaltet die Erzeugung einer Pilzfermentationsbrühe mit einem Gemisch von Enzymen, das dadurch gekennzeichnet ist, daß es ein Glucoamylaseenzym (EC 3.2.1.3) beinhaltet mit einem isoelektrischen Punkt von ungefähr pH 8,0 oder höher und ein proteinartiges Material mit Glucoamylase verstärkender Aktivität, welche, in Verbindung mit der Glucoamylase, die Auflösung von körniger Stärke katalysiert. Das Enzymgemisch ist weiterhin charakterisiert dadurch, daß die Glucoamylase an Carboxymethyl-Cellulosegel anhaftet, wobei das verstärkende Material (im nachfolgenden "verstärkender Faktor" genannt) nicht absorbiert ist durch den Carboxymethyl-Cellulose-Kationenaustauscher. Das Enzympräparat hat die Fähigkeit, beispielsweise körnige Stärke in einer 15%igen Stärkekörpersuspension in Wasser zu hydrolysieren zu einer Lösung von Sacchariden von mindestens 97% Dextrose auf Trockengewichtsbasis im wesentlichen ohne Stärkerückstand und weniger als 1% Trisaccharide und höhere Anhydroglucose-Polymere in Abwesenheit von unverzweigter Enzyme oder hinzugefügter Alpha-Amylase, wenn die Hydrolyse bei einem pH von ungefähr 5,0-7,0, dem Optimal-pH-Wert, ausgeführt wird.
Die Enzymmischung stellt ein extracelluläres Enzympräparat von gewissen Pilzen dar, insbesondere Pilze der Gattung Humicola. Eine bevorzugte Spezies der Gattung Humicola, von welcher das Enzymgemisch isoliert werden kann, ist Humicola grisea var. thermoidea. Mutanten dieser Spezies sind angeregt worden, welche eine Rohstärke hydrolysierende Aktivität zeigen, die stärker ausgeprägt ist, als die vom Wildtyp gezeigte.
Insbesondere sind mutantenreine Kulturen von Stämmen von H. grisea var. thermoidea NRRL 15219; NRRL 15220; NRRL 15221; NRRL 15222; NRRL 15223; NRRL 15224 und NRRL 15225 induziert worden. Die besonders bevorzugte Spezies hiervon ist NRRL 15219. Diese erzeugt Enzympräparate, welche immunologisch die gleichen sind, und die isolierte Glucoamylasefraktion und Verstärkungsfaktorfraktion auch in den korrespondierenden Fraktionen immunologisch paßt.
Eine effektive Menge von Fermentationsbrühe wird gebraucht zum Hydrolysieren von körniger Stärke in wäßriger Suspension, d. h. mit mindestens ungefähr 15% Stärke, ohne zugefügte Alpha-Amylase oder unverzweigte Enzyme zur Erzeugung von Sirup mit über 95% Dextrose an Trockensubstanzbasis.
Das in dem Enzympräparat dieser Erfindung gefundene Glucoamylaseenzym ist auch nützlich bei der Hydrolyse von verschiedenen Zwischenprodukten, welche aus körniger Stärke erhalten werden. Glucoamylase ist im allgemeinen gebraucht für die Hydrolyse von verdünntem Stärkehydrolysat, um Glucose zu erhalten. Die Glucoamylase dieser Erfindung hydrolisiert verdünntes Stärkehydrolysat zu Glucose in einer Weise ähnlich den bekannten Glucoamylasen. Jedoch hat die vorliegende Glucoamylase einen optimalen pH-Wert im Bereich von 5,0-7,0, verglichen mit einem optimalen pH- Wert von weniger als 5,0 und meist gebräuchlich von 4,0- 4,5 für weitestgehend genutzte Glucoamylasepräparate. Das höhere pH-Optimum der Glucoamylase dieses Enzympräparates reduziert die pH-Justierungen notwendigerweise in der verdünnten Stärke zum Glucoseumwandlungsprozeß. Der Gebrauch von Glucoamylasefraktion des Enzympräparats reduziert die Notwendigkeit zur Ionenentfernung, nachdem die Hydrolyse von verdünntem Stärkehydrolysat zu Glucose beendet ist.

Zeichnung

Die Figur ist ein Diagramm, welches die Änderungen im Dextroseinhalt und gelöster Stärke im Verlauf von vergleichbaren Hydrolysen unter Benutzung einer Alpha- Amylase/Glucoamylase-Kombination.

Detaillierte Beschreibung der bevorzugten Ausführung

In allen zuvor bekannten Prozessen wird die Hydrolyse von Stärke ausgeführt über die Bildung von löslichen Zwischenpolymeren von Glucose, Dextrin oder Oligosacchariden. Überraschenderweise zeigt das Enzympräparat dieser Erfindung die Fähigkeit, normalerweise unlösliche körnige Stärke direkt in Glucoselösung zu hydrolysieren, ohne zuerst lösliche Zwischenprodukte oder dextrinähnliche Stärkehydrolyseprodukte in Lösung zu erzeugen. Wenn sie sich bilden, erscheinen Zwischenhydrolyseprodukte in den Körnern zu bleiben, und der Dextrosegehalt der Lösungskörper ist zunächst im wesentlichen 100%, mit der Zeit etwas abnehmend aber immer noch über 90% bleibend bei sehr hohen Anfangsstärkekonzentrationen. Bei 16% anfänglicher Stärkekörperkonzentration verbleibt die Glucosekonzentration bei 99% und mehr von Sacchariden in Lösung. Typischerweise ist sogar bei 25% Stärkekörper der Glucosegehalt über 97% nach 24 Stunden und fällt in 72 Stunden auf 95% nach der Hydrolyse von über 80% der Stärke ab mit allmählichem Anstieg in Disacchariden (D.P.2 Anhydroglucosepolymere). Dies ist grundverschieden gegenüber vorhergehenden Prozessen, in welchen ein kontinuierlicher und allmählicher Anstieg im Dextrosegehalt von Körpern in Lösung stattfindet mit früher Bildung von löslichen Zwischenpolysacchariden oder Oligosaccharid- Ketten.
Das Enzympräparat dieser Erfindung wurde zuerst isoliert von einem Stamm von H. grisea var. thermoidea ATCC 16453 (Katalog 1982, S. 389). Dieser Organismus ist beschrieben in Cooney and Emerson, "Thermophilic Fungi" (1964, Freeman, San Francisco). Das empfohlene Kulturmedium (ATCC-Katalog, Supra) war Emerson YpSs-Agar, welcher lösliche Stärke beinhaltet (Cooney and Emerson, S. 13). Die Enzyme dieser Erfindung wurden zuerst gewonnen beim Wuchs dieser Kultur in einem flüssigen Medium aus Kornlauge, Mineralsalz, 0,1% klebender Stärke und 1-2% körniger Stärke nach einer Sterilisierung durch eine Übernachtlagerung unter Diäthyläther. Die klebende Stärke ist wesentlich ungünstiger als optimal für das Wachstum von Organismen, war jedoch ausreichend, um das Wachstum zu initialisieren. Es wurde bemerkt, daß die körnige Stärke abgebaut wurde.
Das auf diese Weise gemachte Enzym wurde erstmals durch Fällung getrennt mit der Nutzung von zwei Teilen von Isopropanol, hinzugefügt zu einem Teil von Wachstumsmedium. Dieses isolierte Enzym baute schnell körnige Stärke ab, um vorwiegend Glucose zu produzieren, sowohl bei pH 4,5 und überraschenderweise bei pH 6,0, ein pH, bei welchem Glucoamylase im allgemeinen als inaktiv angenommen wird. Das in einem Medium, welches körnige Stärke enthält, produzierte Enzym wurde verglichen mit einem Enzym, gemacht in einem Medium, welches nur klebende Stärke enthält. Das letztere wandelte körnige Stärke in Dextrose zu ungefähr 92% und das erstere zu ungefähr 96% um.

Beschreibung des Fachgebietes

Der Wunsch, Stärke direkt von seiner körnigen Form zu Dextrose (Glucose) umzuwandeln, war das Ziel vieler Forschungen, insbesondere bezogen auf die Stärke von Getreide (Mais), den Hauptquellen der Welt für Glucosesirup und kristalline Dextrose. Frühere Patente sind Leach et al US-Patent 3,922,196 und 3,922,197, veröffentlicht 25. November 1975 und Marshall US-Patent 4,234,686, veröffentlicht 18. November 1980 und 4,318,989, veröffentlicht 9. Mai 1982. Leach et al nutzte bakterielle Alpha-Amylase mit oder ohne Glucoamylase, um ein lösliches Teilhydrolysat zu erhalten, welches dann mit Glucoamylase in Dextrose umgewandelt werden konnte. Marshall nutzte ein Enzym, welches Pullulanase-Aktivität besaß und andere Amylasen mit nichtverzweigender oder dextrinierender Aktivität.
Andererseits wurden viele mehr oder weniger akademische Studien bei Verdünnungskonzentrationen durchgeführt. Es wird auf folgende Studien hingewiesen:
1) Ueda et al: "Raw Starch Digestion by Mold Glucoamylases and Debranching Enzymes" in Mechanisms of Saccharide Polymerization and Depolymerization, herausgegeben von J.J. Marshall (1980), S. 55-72; Trends in Biochemical Sciences (TIBS) (März 1981), S. 89-90; Staerke 33 (1981) 313-316; ibid. 32 (1980), S. 12-125; ibid. 31 (1979) S. 307-314; ibid. 28 (1976) S. 20-22; ibid. 27 (1975) S. 123-127; 2) Hayashida et al: Agrio. 8 Biol. Chem. 46 (1982) S. 83- 89; ibid. 39 (1975) 2093-2099;
3) Fuwa et al: "Degradation of Various Starch Granules by Amylases" in Marshall, supra, S. 73-100; und durch viele andere.
Diese zeigen einige Empfänglichkeit von körniger Stärke zu hydrolysieren durch viele Glucoamylasepräparate, jedoch kamen hohe Umwandlungen nur bei niedrigen Stärkekonzentrationen vor.
Die Enzyme, welche zur Erhöhung der Umwandlung von körniger Stärke durch Glucoamylase genutzt wurden, sind charakterisiert durch die Bildung von kurzkettigen Oligosacchariden, das sind Maltose, Moltotriose und Dextrine während der Hydrolyse. Eine vorhergehende Veröffentlichung (Wankhede et al, Staerke, 34 (1982) S. 309-312) betrifft die "synergistischen" Effekte von Alpha- Amylase oder Pullulanase (EC 3.2.1.41) auf Glucoamylase während der Verdauung von Rohstärke, jedoch sogar unter diesen Bedingungen in sehr verdünnten Suspensionen wurden weniger als 70% der Stärke in 60 Stunden umgewandelt.
Der Überblickartikel von Ueda, 1981 in TIBS, Supra, ist ein Überblick von Glucoamylasepräparaten für die Verdauung von Rohstärke in Anwesenheit von Hefe, um Alkohol zu machen. Es ist hingewiesen auf Glucoamylase, gewonnen von Schimmelpilzen, welchen Rohstärkeverdauungsfähigkeiten nachgesagt werden, zumindest in verdünnten Konzentrationen. Es wird hingewiesen auf Humicola lanuginosa, jedoch ist kein signifikanter Unterschied in der Aktivität seiner Glucoamylase gegeben. Dieser Überblick folgert auch, daß Glucose und Maltose die Verdauung von Rohstärke und die Absorption von Enzymen durch diese verhindern. Die durch Humicola lanuginosa produzierte Glucoamylase war Gegenstand einer Studie von Taylor et al (Carbohydrate Research, 61 (1978), S. 301-308), und die Eigenschaften von anderen Pilzen der Humicola-Gruppe, nämlich H. grisea var. thermoidea und H. insolens sind von Ellis (Trans. Br. Mycol. Soc. 78 (1982) S. 129-139) gegeben. Ein Überblick von einigen Eigenschaften von thermophilen Pilzen mit Hinblick auf pH- und Temperaturoptima ist durch Rosenberg in Can. J. Microbiol. 21 (1975) S. 1535-1540 gegeben. Dieser Artikel beinhaltet Daten von Mitgliedern der Humicola-Gruppe; es ist bemerkt, daß H. lanuginosa (ATCC 16455) die gleiche ist wie Thermomyces lanuginosa. Diese Artikel offenbaren nicht den Gebrauch von Glucoamylase, um körnige Stärke in Dextrose umzuwandeln.
US-Patent 4,247,637, veröffentlicht 27. Januar 1981 von Walon, zeigt einen Vergleich zwischen dem von Humicola lanuginosa (Thermomyces lanuginosa) produzierten Enzym und dem Enzym, welches in der Erfindung dieses Patentes beansprucht ist und durch einen Talaromycesstamm produziert ist. Das Patent offenbart, daß die Glucoamylase des T. lanuginosa-Organismus hitzestabilstes Glucoamylasepräparat zu dieser Zeit war, jedoch schnell bei einem pH von 6,0 und 70ºC inaktiv wurde. Der optimale pH und die optimale Temperatur des beanspruchten Enzyms in diesem Patent wurde mit 4,0 und 75ºC benannt, und die Werte für das Humicola- Species-Enzym waren 6,5 und 65ºC.
Im US-Patent 4,435,307, veröffentlicht 6. März 1984 von Barbesgaard et al, ist ein Cellulaseenzympräparat vom Humicola insolens, DSM 1800 offenbart. Die taxonomische Unterscheidung von H. insolens und H. grisea var. thermoidea ist als dubios bezeichnet, offensichtlich basierend auf einer oben zitierten Publikation von Ellis, der seine Behauptung auf Elektronenmikroskopie stützt. Cooney und Emerson in Thermophilic Fungi unterscheiden die beiden durch Farbe und durch die Abwesenheit von Phialosporen von H. insolens. Emersons Klassifikation ist offenbar basiert auf der Beobachtung, daß Chlamydosporen in H. grisea var. thermoidea einzeln getragen sind an kurzen lateralen Aleuriosporen und selten gefunden werden wie eingefügte Sporen. Untersuchungen von H. grisea var. thermoidea-Pilzen dieser Erfindung zeigten regelmäßig beide End-Aleuriosporen und eingefügte Chlamydosporen, die Meinung Emersons bestätigend. Der Ausdruck "eingefügt" wird angewandt auf eine Spore, welche sich in einem Filament oder Gespinst von Schimmelpilz entwickelt.
In Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung wird offengelegt, daß gewisse Pilze, insbesondere Mitglieder der Gattung Humicola ein Enzymgemisch von Proteinen (Enzympräparat) in die Fermentationsbrühe abgeben, welches rohe und körnige Stärke hydrolysiert, einschließlich gerader und verzweigt kettiger Stärke und die Stärke im wesentlichen bis zur Glucose hydrolysiert. Das Enzymgemisch ist charakterisiert durch den Einschluß von Glucoamylaseenzym (EC 3.2.1.3) mit einem isoelektrischen Punkt höher als pH 8,0 und einem proteinartigen Material mit glucoamylase-verstärkender Aktivität, welche in Zusammenarbeit mit der Glucoamylase die Auflösung von körniger Stärke katalysiert. Das Enzymgemisch ist ferner dadurch charakterisiert, daß die Glucoamylase an Carboxymethyl-Cellulose-Kationenaustauscher anhaftet, während das verstärkende Material (im nachfolgenden "Verstärkungsfaktor") nicht absorbiert wird von dem Carboxymethyl-Cellulose-Gel. Das Enzymgemisch hat die Fähigkeit, z. B. körnige Stärke in einer 15%igen Stärkekörpersuspension in Wasser zu hydrolysieren zu einer Lösung von Sacchariden von mindestens 97% Glucose, bezogen auf Trockensubstanzbasis, ohne wesentliche Stärke zu hinterlassen und weniger als 1% Trisaccharide und höhere Anhydroglucosepolymere in Abwesenheit von nichtverzweigenden Enzymen oder zugefügter Alpha-Amylase, wenn die Hydrolyse ausgeführt ist bei einem pH von ungefähr 5,0 bis 6,5, dem optimalen pH-Wert.
Obwohl die Rohstärke hydrolysierende enzymatische Aktivität zuerst in einem Wildtyp der Humicola-Spezies gefunden wurde, sind verschiedene Mutanten künstlich induziert worden mit einem verbesserten Ertrag der Rohstärke hydrolysierenden (RSH) enzymatischen Aktivität im Vergleich zu bekannten Wildtypen. Mutantenstämme, welche, wenn sie keimen und in Fermentation gebraucht werden, wie es nachfolgend beschrieben ist, Brühen erzeugen mit RSH- enzymatischer Aktivität von 120 Einheiten pro ml und aufwärts, wenn sie, wie nachfolgend beschrieben, untersucht werden. Erhöhte enzymatische Aktivität von Brühen, welche durch Mutantenstämme erzeugt sind, können von erhöhter Enzymproduktion durch individuelle Organismen und/oder von erhöhtem Wachstum der Spezies unter Keimungs- und Fermentationsbedingungen herrühren. Bei den meisten Mutanten, soweit sie erschlossen sind, scheint es, daß der Anstieg an abgesonderten Enzymen primär von gesteigerter Enzymproduktion durch die individuellen Organismen herrührt, als von schnellerem Wachstum der Organismen. Dies ist zufällig beachtet worden, da eine höhere Enzymproduktion erreicht wurde durch die Benutzung von einer ähnlichen Menge von Carbohydrat-Fütterungsmenge, das ist Stärke während der Fermentation, um die Brühe zu erzeugen.
Mutantenstämme, welche eine Brühe mit erhöhter RSH- Aktivität produzieren, repräsentieren eine erhöhte Fähigkeit zur vollen Kommerzialisierung des Prozesses der vorliegenden Erfindung. Obwohl Wildtyppilze eine Brühe produzieren, welche RSH-Aktivität besitzt, ist die Menge der Produktion im allgemeinen geringer als wünschenswert für eine Stärkehydrolyse im großen Maßstab. Ein Pilz genutzt für die Produktion einer RSH-Enzymmixtur produziert vorzugsweise eine Brühe, welche eine Aktivität von 250 Einheiten pro ml oder größer besitzt.
Mutationen können angeregt werden über eine Vielzahl von bekannten Methoden, einschließlich der Behandlung mit mutagenen Chemikalien und Bestrahlungen verschiedener Typen. Mehrere nutzvolle Humicola-Mutanten sind in dieser Weise entwickelt worden. Mutantenspezies sind ausgewählt für ihre Fähigkeit, hohe Titer von RSH-Aktivität zu produzieren und auch für andere wünschenswerte Charakteristiken. Weiterhin sind anscheinend nutzvolle Mutanten mindestens dreimal passagiert worden, um die Stabilität ihrer gewünschten genetischen Charakteristik sicherzustellen.
Zusätzlich zur Produktion hoher Enzymtiter ist es wünschenswert, daß eine Spezies bei relativ hohen Temperaturen wächst und hierin sind mesophile Pilze, welche bei einer Temperatur von 37ºC-40ºC und thermophile Pilze, welche bei einer Temperatur von 40ºC-50ºC wachsen, bevorzugte Spezies zur Produktion des RSH-enzymatischen Gemisches. Ein wichtiger Vorteil von temperaturtoleranten Pilzen ist, daß wenn sie bei relativ hohen Temperaturen wachsen, kontaminierende Pilze oder andere kontaminierende Organismen, die bei solchen Temperaturen nicht überleben können, ausgelöscht werden. Ein weiterer Vorteil des Wuchses bei erhöhten Temperaturen ist, daß diese Organismen dazu tendieren, schneller zu wachsen und damit höhere Titer des RSH-Enzympräparats produzieren.
Das Enzymgemisch, welches RSH-Aktivität wie oben beschrieben zeigt, wird genutzt in einem Verfahren zur Erzeugung von Dextrose direkt von Rohstärke. Das Verfahren schließt die Keimung von Pilzsporen, eine Fermentation unter Nutzung von gekeimten Pilzen, eine Trennung der Fermentationsbrühe von den kultivierten Organismen und die Hydrolyse von Rohstärke unter Benutzung der getrennten Brühe ein. Auch wenn Dextrose erzeugt wird, wenn Rohstärke mit dem Pilz, welcher die RSH-Enzymmischung produziert, fermentiert wird, so ist der Ertrag von Dextrose relativ gering, vermutlich weil die Dextrose, welche produziert wird, durch die Kultur verbraucht wird. Aus diesem Grund erscheint die Trennung der enzymatisch aktiven Brühe zum Gebrauch in der Hydrolyse der Rohstärke notwendig für einen guten Dextroseertrag. Weiterhin, auch wenn die Pilze mesophil oder thermophil sind und bei relativ erhöhten Temperaturen wachsen, zeigt das Enzymgemisch eine maximale katalytische Aktivität bei Temperaturen über den für das Wachstum der Organismus förderlichen Temperaturen, nämlich ungefähr 55ºC. Durch Trennung des brühe-erzeugenden Fermentationsschrittes von dem enzymatischen Hydrolyseschritt kann die Temperatur sowohl für den Fermentationsschritt als auch für den enzymatischen Hydrolyseschritt optimiert werden. Zusätzlich erlaubt die Trennungsprozedur das Entfernen von Organismen, Sporen und anderen Kontaminationen, welche die Farbe und Qualität des resultierenden Dextrosesirups beeinträchtigen können.
Das Verfahren beginnt mit der Keimung von Pilzen aus Sporen, um eine Impfung für die nachfolgende Fermentation zu produzieren. Ein steriles Substrat wird zur Verfügung gestellt, welches Quellen von Carbohydrat beinhaltet, wie verdünnte Stärke, wobei das Carbohydrat zwischen 10 und ungefähr 40 Gewichtsprozent des Substrates ausmacht. Der pH des Mediums wird zwischen ungefähr 4,5 und ungefähr 7,0 bei vorzugsweise zwischen ungefähr 5,0 und ungefähr 6,5 eingestellt. Das Substrat wird mit genügend Impfstoff geimpft, um zwischen 50 000 und 500 000 Sporen pro ml Medium zur Verfügung zu stellen. Die Sporen keimten für einige Tage, typischerweise zwischen ungefähr 3 und 7 Tagen, bei einer für die Keimung der individuellen Spezies oder Art günstigen Temperatur. Die gekeimten Pilze können bis zum Gebrauch gekühlt gelagert werden.
Die gekeimten Sporen werden genutzt als eine Impfung für das Fermentationsmedium, welches ein Carbohydrat-Substrat beinhaltet. Typischerweise wird ein steriles, flüssiges Fermentationsmedium zur Verfügung gestellt, in welches die gekeimten Pilze geimpft werden. Das flüssige Medium stellt ein Carbohydrat zur Verfügung, welches sowohl eine niedrige Konzentration von pastöser Stärke als auch eine Quelle von anderen Nährsubstanzen einschließlich Proteinen und Vitaminen enthält. Das flüssige Medium stellt auch Stickstoff zur Verfügung. Kornlauge ist eine bevorzugte Nährstoffquelle, welche relativ billig ist. Das flüssige Medium ist auch gepuffert auf einen pH zwischen ungefähr 4,5 und ungefähr 7,0 und vorzugsweise zwischen ungefähr 5,0 und 6,5 mit anorganischem Salz, welches dem Pilzwachstum zuträglich ist. Zusätzlich können antibakterielle Agensien, wie Penicillin G und Oxytetracycline hinzugefügt werden. Das gesamte Fermentationsmedium beinhaltet vorzugsweise zumindest etwas Rohstärke. Die Rohstärke wird vorzugsweise dem flüssigen Medium hinzugefügt, nachdem das flüssige Medium beimpft worden ist.
Die Rohstärke, welche dem Fermentationsmedium hinzugefügt wird, scheint die Produktion von der RSH-Enzymmischung zu induzieren. Das heißt, die gleiche Spezies oder Sorte von Pilz produziert einen höheren Titer von RSH-Aktivität, wenn zumindest etwas Rohstärke im Fermentationsmedium präsent ist, als wenn keine Rohstärke präsent ist.
Die Fermentation wird ausgeführt bei Temperaturen, welche dem Wachstum des Pilzes zuträglich ist, und vorzugsweise ist die Temperatur optimiert auf die spezielle Spezies oder Sorte. Vorzugsweise wird die Fermentationsmischung kontinuierlich gerührt und mit Luft durchsetzt. Die Fermentation wird ausgeführt für eine Zeitperiode, welche genügend ist für die Kultur, um einen substantiellen Titer von Enzymgemisch in die Brühe abzugeben, typischerweise zwischen ungefähr 24 und ungefähr 84 Stunden.
Nach der Fermentation wird die Brühe getrennt von den festen Materialien, wie dem Mycelia. Die Trennung kann durchgeführt werden durch Filtration, Zentrifugation oder andere bekannte Techniken, welche geeignet sind zur Trennung von Festkörpern von der Flüssigkeit. Die getrennte Enzymbrühe ist geeignet zur Hydrolysierung von Rohstärke ohne weitere Reinigung. Es wurde gefunden, daß die Enzymproduktion dazu tendiert, ein Maximum zu erreichen, wenn der Fermentationsprozeß ungefähr 48 Stunden andauert. Wenn der Fermentationsprozeß länger andauert, ergibt sich keine Erhöhung der Enzymproduktion, und sie kann sich sogar verringern.
Die getrennte Fermentationsbrühe ist nutzbar ohne weitere Reinigung, um Rohstärke zu hydrolysieren, und es ist im allgemeinen am ökonomischsten, die rohe Brühe ohne Reinigung zu benutzen. Die Rohstärke wird in einer wäßrigen Lösung zur Verfügung gestellt, und für die effiziente Produktion von Glucose ist der Rohstärkegehalt mindestens bei etwa 15 Gewichtsprozent Trockensubstanz Stärke und vorzugsweise bei mindestens 25% Trockenstärkesubstanz und kann bis zu ungefähr 60% Trockenstärkesubstanz betragen. Der optimale pH für die Hydrolyse liegt um 6,0, jedoch kann die Hydrolyse ausgeführt werden bei jedem pH im Bereich von 5,0 bis 7,0. Die optimale Temperatur für die Hydrolyse mit der RSH- enzymatischen Mixtur ist ungefähr 55ºC, jedoch ist die enzymatische Aktivität verloren bei Temperaturen über ungefähr 60ºC. Bei niedrigeren Temperaturen bis zu 0ºC findet Hydrolyse statt, jedoch bei sich verringernden niedrigen Raten. Im allgemeinen wird davon ausgegangen, daß Hydrolyse bei ungefähr 40ºC oder mehr für eine effiziente Glucoseproduktion durchgeführt werden sollte. Die Brühe wird zu der Lösung hinzugefügt, um zwischen ungefähr 10 bis ungefähr 300 Einheiten Enzymaktivität pro Gramm Stärke und vorzugsweise zwischen 25 und ungefähr 100 Einheiten von Enzymaktivität pro Gramm Stärke zu erhalten. Ein niedriger Enzymtiter produziert natürlich die Glucose relativ langsam. Andererseits erscheint die Glucosemenge, die pro Enzymeinheit produziert wird, nicht linear miteinander zu gehen, und hohe Enzymtiter produzieren proportional weniger Dextrose je Einheit als es gemäßigte Titer tun. Entsprechend wird ein Enzymtiter ausgewählt, welcher Glucose in relativ schneller Rate produziert und auch bei einer im allgemeinen optimalen Rate pro Enzymeinheit.

Enzymcharakteristiken

Das Enzympräparat dieser Erfindung katalysiert die Hydrolyse von körniger Stärke sowohl in isolierter Form, in Form von trockengemahlenen Produkten, als auch in der Matrix von Pflanzengewebe. Es ist genutzt worden, die Reststärke von Kornkleie, welche im nassen Kornmahlprozeß getrennt wurde, zu entfernen. Das Enzym ist nutzbar für die Hydrolyse von Getreidestärke, wie Korn (Mais), Weizen, Reis und aus Wurzel- und Knollenstärke, wie weiße oder süße Kartoffeln, und Tapioca, als auch gerad- und verzweigtkettige Stärkemoleküle, das ist Amylose und Amylopectin, sowohl in isolierten Fraktionen oder aus wachsiger Stärke oder hochamyloser Kornstärke. Wegen seiner Glucoamyloseaktivität kann das Enzym dieser Erfindung genutzt werden in der Hydrolyse von pastöser Stärke, löslicher Stärke, Niedrig-D.E.-Stärkehydrolysate (das sind, D.E. von 2 bis 20) und andere stärkeähnliche Glucosepolymere.

Gewinnung und Fraktionierung von Enzymen

Ein besonderer Aspekt dieser Erfindung ist die Anwesenheit des Verstärkungsfaktors, welcher zugefügt zur Glucoamylse die Hydrolyse von körniger Stärke möglich zu machen erscheint. Der Verstärkungsfaktor, wie er aus einem gereinigten Enzympräparat fraktioniert wird, ist eine Mischung, welche Proteine von unbestimmter Struktur mit Komponenten, welche durch ihre enzymatische Aktivität identifiziert worden sind, enthält.
Das Enzympräparat dieser Erfindung wird gewonnen aus einem Fermentationsmedium durch Filterung oder Zentrifugierung, um die Mycelia, Debris oder andere Rückstände zu entfernen. Wenn die Lösung konzentriert wird, wird der pH des Filtrats auf den Wert 6 eingestellt, und es wird konzentriert durch Vakuumverdampfung oder Ultrafiltration. Anstelle des Konzentrierens des Enzympräparats kann es bei 4ºC ausgefällt werden mit Aceton (Volumen für Volumen) oder mit Diammoniumsulfat (50% der Sättigung) und durch Zentrifugation gewonnen werden. Die Acetonfällung ist bevorzugt. Für einen Fachmann ist es offensichtlich, daß es andere Methoden zur Gewinnung des Enzympräparates gibt.
Zur Reinigung der Rohstärke hydrolysierenden ("RSH")- Aktivität wird zum Studium Aceton gefälltes Enzym mit Diäthylaminoäthyl-Cellulose ("DEAE") behandelt. Anders als alle wesentlichen anderen Glucoamylasepräparate ist das Enzympräparat dieser Erfindung nicht durch DEAE-Glucose absorbiert (Whatman vorgequollene DEAE-Cellulose DE-52 wurde genutzt); statt dessen wird das inaktive Protein entfernt, wodurch die Konzentrierung der gewünschten Aktivität (Glucoamylse und Verstärkungsfaktor) im Ausfluß. Das Verfahren ist ähnlich effektiv, wenn es in einer Säule oder in Fraktionen bei einem pH von ungefähr 5,0 bis 7,0 (vorzugsweise 6,5 bis 7,0) ausgeführt wird mit einem Zuwachs an spezifischer Aktivität (Einheiten pro Gramm oder Einheiten pro Milliliter) von 2- bis 4,5-fach. Der Zuwachs ist zumindest teilweise dem Entzug von inaktivem Protein zuordenbar. Das Erzeugnis ist bezeichnet als "gereinigtes" Enzympräparat.
Um die Fraktion, welche den Verstärkungsfaktor beinhaltet, zu trennen, wurde das gereinigte Enzympräparat einer Kationenaustausch-Chromatographie ausgesetzt unter Benutzung von Carboxymethyl-Cellulose als absorbierendes Medium. Glucoamylaseenzym ist stark absorbiert als ein einzelnes Proteinband, welches mit gelöstem Natriumchlorid ausgelöst werden kann, und die Fraktion, welche den Verstärkungsfaktor beinhaltet, ist nicht absorbiert.
Der "Verstärkungsfaktor" ist die Fraktion des Enzympräparats, welcher nicht aus dem gereinigten Enzympräparat durch Säulenchromatographie absorbiert ist, unter Benutzung von Carboxymethyl-Cellulose- Ionenaustauschmaterial unter folgenden Bedingungen:

Säule:

2,5 cm·13,4 cm Whatman CM-52 Carboxymethyl-Cellulose, ausgewogen mit 10 mM Sodiumphosphatpuffer, pH 6,8.

Probe:

50 ml gereinigtes Enzympräparat, 0,43 mg/ml Protein, 40 Einheiten pro ml oder äquivalent.

Wäsche:

110 mls 10 mM Sodiumphosphat, pH 6,8.

Linearer Gradient:

400 ml von 10 mM Sodiumphosphat, pH 6,8, 0- 0,5 M Sodiumchlorid, initialisierte folgende Wäsche.

Flußrate:

2 ml/Minute.

Fraktionsvolumen:

9 ml bis 12 ml.
Der Verstärkungsfaktor ist elutiert während der Säulenwaschung, während die Glucoamylase streng absorbiert ist. Glucoamylase ist elutiert durch den linearen Gradienten zwischen 50 mM und 200 mM Sodiumchlorid. Die Gewinnung ist über 80% Glucoamylaseeinheiten bei einer Konzentration von ungefähr 0,1 mg Protein pro Milliliter. Jede Fraktion kann vorbehandelt werden durch Frieren oder durch Gefriertrocknen.
Die Trennung der Proteinkomponenten der Verstärkungsfraktion durch Techniken, genannt "Chromato- Fokussierung" ("Chromatofocusing with Polybuffer and PBE", Pharmacia Fine Chemicals, Nov. 1980), und das Testen zeigte folgende Aktivitäten: Alpha-Glucosidase, Beta-Glucosidase, Cellulase, Glucoamylase, Alpha-Amylase und Xylanase. Das folgende wurde nicht entdeckt: Beta-Amylase, Pullulanase, Isoamylase, Protease, Dextranase, Isomaltase, Fructosyltransferase, Invertase und Alpha-1,6- Galactosidase. Bei relativ niedrigem Level von Alpha- Amylase wurde auch Aktivität abgeleitet dem verstärkten Effekt von Calciumionen, Hemmung durch EDTA, Verlust von Aktivität, wenn der pH unter 5 reduziert wurde (Alpha- Amylase denaturiert) und Aktivität gegen Amylopectin (wachsige Stärke). Die Saccharide, produziert von Stärke durch Wirkung des Verstärkungsfaktors alleine, sind völlig unterschiedlich von den Sacchariden, produziert durch Alpha-Amylase: ungefähr 1/3 Dextrose, 1/3 Polysaccharide, (D.P. 10 oder mehr) und D.P. 3 Saccharideinhalt höher als D. P. 2 (keine Alpha-1,6-Verkettungen). Alpha-Amylase erzeugt keine Dextrose. Weiterhin, unabhängig gemessene Alpha- Amylase-Aktivität ist sehr niedrig, wesentlich niedriger als es für die Fähigkeit des Enzympräparats dieser Erfindung zur Hydrolyse der Stärke in körniger Form ohne substantielle Bildung von löslichen kurzkettigen Polysacchariden gezählt werden kann. Dies ist hierin nachfolgend weiter gezeigt.
Daß der Verstärkungsfaktor keiner der bekannten Carbohydraseenzyme ist, ist gezeigt durch die Daten in Tabelle 1, in welcher der Verstärkungsfaktor verglichen ist mit der Alpha-Amylase, Pullulanase und Isoamylase, ebenso mit der Glucoamylase. Die genutzten Substrate waren Lintner Stärke (löslich), Sigma (Schutzmarke)-Kartoffel- Amylopectin, Kartoffel-Amylose und -Pullulan. Die Enzyme waren Thermamyl 120L bakterielle Alpha-Amylase, Hayashibara-Isoamylase und Novo Pullulanase SP 247. Alle Hydrolysen wurden ausgeführt bei einem pH von 5,5 und 50ºC für 30 Minuten bei einer Substratkonzentration von 1%, ausgenommen dem Amylopectin, welches bei 0,5% genutzt wurde, da das gelieferte Produkt eine relativ hohe Zuckerreduzierung zeigte. Die Reduzierung von Zucker wurde gemessen durch das Somogyi-Nelson-Verfahren (Starch and Its Derivatives, Radley, Editor, 4th Ed. S. 431) und Dextrose wurde bestimmt auf einem Yellow Springs Instrument Industrial Analyzer. Das Verhältnis der Zuckerreduktion zu Dextrose sollte bei 1,0 für Glucoamylase auf Stärke liegen. Die freien Stellen in der Tabelle zeigen, daß, wenn Amylose oder Amylopectin genutzt wurde, kein Dextrose gefunden wurde, und daß, wenn Pullulan benutzt wurde, keine Reduktion des Zuckers gefunden wurde. Tabelle 1 Verhältnis Zuckerreduktion zu Dextrose Lösliche Stärke Amylopectin Amylose Pullulan Verstärkungsfraktion Glucoamylasefraktion Alpha-Amylase Isoamylase Pullulanase

Optimaler pH und pH-Stabilität

Der Bereich für das Enzympräparat dieser Erfindung in der Hydrolyse von körniger Stärke ist 5,0 bis 7,0 mit einer maximalen Aktivität bei einem pH von 5,5 bis 5,6. Die Werte wurden bestimmt mit 0,69 und mit 2,5 Enzymaktivitätseinheiten pro ml, reagiert mit 17% (Gewicht/Volumen) körniger Kornstärke bei 49ºC und einer Stunde in Sodiumacetatpuffer bei einem pH unter 6,0 und in Sodiumphosphatpuffer bei einem pH von 6,0 und darüber. Unaufgelöste Stärke wurde durch Zentrifugation getrennt und die Reaktion wurde gestoppt durch Verdünnung und Erhitzen des Überstands.
Die pH-Stabilität des vorliegenden Enzympräparats wurde gemessen durch Halten eines pH-Wertes von 2 bis 8 für eine Stunde bei 25ºC und für 20 Minuten bei 50ºC. Bei beiden Temperaturen wurde über 90% der Aktivität erhalten in einem pH-Bereich von 5 bis 8, und der stabilste Bereich ist pH 6-7.
Die Aktivität des Enzyms dieser Erfindung in verdünnter Stärke (D.E. 10 Maltodextrin) ist etwas geringer als Glucoamylase von A. niger, A. oryzae, R. niveus bei pH 4,5. Unter einem pH von 5,0 ist die Verstärkungsfaktoraktivität verloren, so daß das Enzym dieser Erfindung in seiner Aktion auf körnige Stärke ähnlich anderen Glucoamylasepräparaten ist.

Thermische Stabilität

Die thermische Stabilität des Enzympräparats in Abwesenheit von Stärke wurde gemessen zwischen 50 und 60ºC durch Halten einer Probe des Enzympräparats wie es ist bei einem pH 6,7 für 20 Minuten bei jeder Temperatur und untersucht durch Nutzung von 10 D.E. Maltodextrin. Über 90% der Aktivität ist verblieben bei 53ºC und über 55% verblieb bei 57ºC, verglichen mit Proben, welche bei Raumtemperatur gehalten wurden.

Wirkungsweise der Hydrolyse

Das Enzympräparat dieser Erfindung unterscheidet sich von bekannten Enzymkompositionen, die zur Stärkehydrolyse genutzt werden, insbesondere für körnige Stärke in der Wirkungsweise der Hydrolyse, wie es bestimmt wurde von den gebildeten löslichen Sacchariden. In der vorliegenden Erfindung sind während der ersten Stunden der Hydrolyse im wesentlichen nur Saccharide in Lösung, nämlich Dextrose (Glucose), das heißt auf Trockensaccharidfeststoffbasis, die Lösung ist im wesentlichen 100% Glucose. Der Anfangsphase der Lösung der Stärke folgend erscheint ein allmählicher Anstieg von höheren Sacchariden, anscheinend gebildet durch die Rekombination oder Repolymerisation von Glucose. Am Ende von 24 Stunden kann der Glucosegehalt von einem 50%igen oder höherem wäßrigen Stärkegemisch von 100% bis 97-98%, bezogen auf Trockensubstanzbasis, reduziert werden mit allmählich weiterem Absinken auf 96 bis 97% nach 48 Stunden und 95-96% nach 72 Stunden. Im Gegensatz dazu zeigt eine typische Hydrolyse von körniger Stärke mit einer Kombination von Alpha-Amylase und Glucoamylase einen Dextrosegehalt von weniger als 90% nach 24 Stunden, steigend auf 92 bis 93% nach 72 Stunden und endend auf einer Höhe unter 95%. Dies ist graphisch gezeigt in Fig. 1, und Details sind hier im Beispiel 5 später gegeben.
Wie es gut bekannt ist, produziert die Hydrolyse von Stärke in Anwesenheit von Glucoamylase, wenn sie für ausgedehnte Zeitperioden fortgeführt wird, eine Spitze in der Dextrosekonzentration. Unter kommerziellen Bedingungen bei Benutzung von 10-20 Einheiten von Glucoamylase pro Gramm ist normalerweise der maximale Dextrosegehalt erreicht in ungefähr 48 bis 72 Stunden, und danach erniedrigt sich der Glucosegehalt langsam entsprechend der stattfindenden Repolymerisation, um Kurz-Ketten-Anhydroglucosepolymere zu produzieren, welche resistent auf die Hydrolyse sind. Das vorliegende Enzympräparat hat diese Spitze nicht; statt dessen zeigen die frühesten Messungen von Dextrosegehalt von Stärkehydrolysat im wesentlichen 100% Dextrose, und es gibt nur ein geringes Abklingen der Konzentration, wie es in Fig. 1 dargestellt ist.
Dreißig Einheiten von Enzym aus dieser Erfindung pro Gramm Stärke resultierten in einer kompletten Auflösung von körniger Stärke bei 16% Festkörpern in 48 Stunden bei einem pH von 5,7 und 55ºC. Das Saccharid in Lösung ist über 95% Dextrose, und keine stärkeähnliche Substanz ist meßbar durch die Antwort auf Iodin wie Stärke antwortet, das heißt, es gibt kein Anhydroglucosepolymer, welches einen Iodinkomplex bildet.

Isoelektrischer Punkt

Der isoelektrische Punkt der Glucoamylasefraktion des Enzyms dieser Erfindung ist höher als der gemessene der meisten anderen Glucoamylasepräparate. Die isolierte Glucoamylasefraktion hatte einen isoelektrischen Punkt über pH 8,0. Die gemessenen Werte für die drei Enzympräparate A. niger, A. oryzae und R. niveus waren 3,7, 3,4 und 7,7 (Literaturwerte: 3,4 bis 4,0, 3,4 bis 3,5 und 8,7 bis 8,8). Die gemessenen isoelektrischen Punkte wurden bestimmt mit dem Isogel Agarose Isoelectric Focusing-Verfahren ("A Step by Step Guide to Isogel Agarose Isoelectric Focusing". FMC Marine Colloids Division BioProducts, Januar 1980).

Molekulargewicht

Mit Hilfe von SDS Polyacrylamidgel elektrophoretischer Methode von Laemmli (Nature, 227 (1970) S. 680 ff.) wurde die Glucoamylase und die Verstärkungsfaktorfraktion aufgelöst, und die Molekulargewichte wurden bestimmt. Die benutzten Gels waren 7% und 10% Acrylamid, jedes mit 2,7% kreuzverbindend. Das Glucoamylaseenzym-Molekulargewicht wurde bestimmt als 64.300, und das Molekulargewicht von den drei Hauptkomponenten des Verstärkungsfaktors wurde gemessen mit 87.300, 72.500 und 52.200.

Empfindlichkeit auf Metallionen

Die getesteten Metallionen waren Calcium, Chrom, Eisen, Zink, Magnesium, Mangan, Nickel. Der einzige beobachtete Effekt auf die Hydrolyse von körniger Stärke war eine leichte Erhöhung der Rate durch Calciumionen, jedoch fand dieses nur in der Anfangsphase der Hydrolyse statt.

Morohologie

Wie oben bemerkt, wurde die erste Probe von Enzymen dieser Erfindung isoliert von Humicola grisea var. thermoidea ATCC 16453, ein in der Literatur beschriebener Organismus. ATCC 16453 wurde stufenweise mutiert, indem er und seine Abkömmlinge N-Methyl-N'-Nitro-N-Nitrosoguanidin oder einem keimtötenden Ultraviolettlicht (253 nm Wellenlänge) ausgesetzt wurden. Proben von ATCC 16453 und jedem der entwickelten Mutanten wurden gezüchtet auf YpSs-Agar mit der folgenden Zusammensetzung:
Hefeextrakt (Difco) 4,0 gm
K&sub2;HPO&sub4; 1,0 gm
MgSO&sub4;·7H&sub2;O 0,5 gm
Lösbare Stärke 15,0 gm
Destilliertes Wasser 1000 ml
Agar (Difco) 15 gm
Die Morphologie der Mutanten, hergeleitet von diesem Organismus unterscheidet sich von dem von ATCC 16453 in den folgenden Eigenschaften:

Rasen:

Während ATCC 16453 dunkelgrau mit gewellter Oberfläche ist und etwas unregelmäßige Furchen mit relativ gut definierten Ecken in den Agar schneidet, zeigen die Mutanten die folgende Charakteristiken, alle mit einer höheren Pigmentierung als ATCC 16453 (mehr schwarz):
NRRL 15219 - braungrau mit ruhiger Oberfläche und schmalen Furchen.
NRRL 15220 - graubraun mit ruhiger Oberfläche und weniger gefurcht als ATCC 16453.
NRRL 15221 - braun schattiert bis grau mit leicht welliger Oberfläche.
NRRL 15222 - grau mit relativ breiteren Furchen, tendierend zur gewellten Oberfläche.
NRRL 15223 - grau mit Brauntönung und ruhiger Oberfläche mit leichter Faltung; der Rasen nicht komplett ineinanderfließend.
NRRL 15224 - leicht grau mit diskreten Kolonien und der Rasen nicht ineinanderfließend.
NRRL 15225 - dunkelgrau bis schwarz, rauh, Oberfläche wächst nicht ineinanderfließend, Pigment im Agar.

Rückseite:

Während ATCC 16453 dunkelbraun bis grau und pfirsichfarben bei 30ºC war, zeigen die Mutanten das folgende, alle haben mehr Pigmentierung (schwarz) als ATCC 16453:
NRRL 15219, - 221 und -223 - dunkelgrau bis schwarz.
NRRL 15220 und -224 - grau bis schwarz.
NRRL 15222 - grau bis schwarz, nahezu schwarz.
NRRL 15225 - schwarz.

Aleuriosporen und Chlamydosporen:

Die Mutanten waren ununterscheidbar vom Originalstamm von ATCC 16453, und die klassische Beschreibung von Emerson und Cooney (Thermophilic Fungi, Chapter 8) wurde bestätigt. Vergleiche von Stämmen von Humicola insolens (ATCC 16454 und ATCC 22082), gewachsen unter den gleichen Bedingungen, zeigten, daß sie den Beschreibungen in Emerson und Cooney entsprachen.

Temperaturgrenzen:

Beobachtungen wurden an Beispielen gemacht, die für fünf Tage auf Agar der zuvor genannten Zusammensetzung wuchsen bei Temperaturen von 25, 30, 37, 42, 45, 50 und 55ºC. Die Beobachtungen sind dargestellt in den folgenden Wuchs- und Sporenbildungstabellen. In der Kopfzeile bedeutet "gutes Wachstum" einen üppigen Rasen, "mäßiges Wachstum" etwas weniger und "leicht" beschreibt ein Wachstum, bei welchem die Platte nicht komplett überdeckt ist. Bei keiner der Proben wurde ein Wachstum bei 55ºC beobachtet. Die Menge der Sporenbildung wuchs schnell mit der Temperatur und beeinflußte dramatisch die Farbe (Pigmentierung) von beidem, der Kolonien und des Mediums. Starke Sporenbildung erzeugte grau bis schwarz. Die Worte "nicht sichtbar" bezogen sich auf ein Wachstum mit geringer oder keiner Pigmentierung, das bedeutet meistens weiß, während der Ausdruck "leicht" genutzt ist, um solche Platten zu bezeichnen, welche eine leichte Pigmentierung zeigten, welche gewöhnlich gelbbraun erschien. Einfluß der Temperatur (ºC) auf das Wachstum (Wuchstemperaturen: 25, 30, 37, 42, 45, 50, 55*) Wuchsrate Stamm keine leicht mäßig gut mäßig leicht ATCC NRRL * unter diesen Bedingungen wurde kein Wachstum bei allen Proben bei 55ºC beobachtet. Einfluß der Temperatur (ºC) auf die Sporenproduktion (Sporenbildungstemperaturen: 25, 30, 37, 42, 45, 50) Sporenproduktionsrate Stamm nicht sichtbar leicht mäßig stark mäßig leicht nicht sichtbar ATCC NRRL * Der Ausdruck "nicht sichtbar" wird gebraucht, um auszudrücken, daß kein Wachstum und auch keine Pigmentierung bestand; wo die Temperatur nicht benannt ist, wurde weder Wachstum noch Sporen beobachtet.
Mit den oben beschriebenen Ausnahmen waren alle der Mutanten ähnlich dem Orginalstamm ATCC 16453. Voll entwickelte Sporen waren Globos oder Subglobos. Entsprechend dem gesteigerten Wachstum des Mycelienrasens
TEXT FEHLT
entwickeln. Die Sporen-Kolbenflaschen werden bis zum Gebrauch gekühlt.
Fermenterimpfung ist vorbereitet in 500 ml Schüttelkolben durch Mischung von 100 ml von sterilem Impfmedium der gleichen Zusammensetzung mit einem Volumen von Sporenmedium, welches ungefähr 300 Millionen Sporen entspricht. Das angesetzte Impfmedium wird für 16 Stunden bei 42ºC geschüttelt, und die resultierende Impfung wird mit 5 Volumenprozent auf 10 Liter sterilem Wachstumsmedium in einem 14-Liter-Fermenter mit einer Luftguelle und einem Rührer hinzugefügt.
Ein Flüssigfermentationsmedium hat die folgende Zusammensetzung:
Kornsudflüssigkeit 2,0%
K&sub2;HPO&sub4; 0,15%
MgSO&sub4;·7H&sub2;O 0,05%
Pastöses Kornmehl 0,10%
Wasser ad 100%
Nach der Sterilisation wird jeweils ein Gramm von Penicillin G und Oxytetracyclin dem Fermenter hinzugefügt. Wenn die Impfung hinzugefügt ist, werden ebenfalls 100 Gramm von sterilem körnigen Kornmehl in das Medium gemischt.
Der Fermenter wird bei 42ºC gehalten, anfänglich mit eingeschaltetem Rührer bei 500 U/min und einem Luftfluß durch das Wachstumsmedium von 0,5 Volumen/Volumen/Minute (vvm). Nach 18 Stunden, werden 200 Gramm sterilem Kornmehl und 200 ml steriler Kornsudflüssigkeit dem Fermenter hinzugefügt. Der Luftfluß und die Rührgeschwindigkeit werden erhöht um ungefähr 1,8 vvm und 60 Upm. In der 26. Stunde werden 100 g von sterilem Kornmehl in den Fermenter hinzugefügt. Die Fermentation ist beendet nach 73 Stunden.
TEXT FEHLT
eine internationale Einheit der Enzymaktivität bestimmt werden. Eine Einheit der Aktivität ist die Menge von Enzym, welche 1 Mikromol von Dextrose pro Minute unter Versuchsbedingungen produziert.
Eine andere Methode wird gebraucht, um Effekte zu vermeiden, die bedingt sind durch das körnige Stärkesubstrat (Änderung in der Rate mit der Konzentration, Schwierigkeiten beim Mixen und Reinigen des Hydrolyzats, usw.). Für die Zwecke dieser Erfindung ist diese Methode identifiziert als Standardversuchsverfahren Nr. 2. Hierauf wird auch Bezug genommen als 10 D.E. Maltodextrintest. Dies ist ein Screeningtest, welcher das 10 D.E. Maltodextrin benutzt als ein Substrat anstatt der körnigen Stärke. Ein Zentel Milliliter von Enzympräparat, gelöst wenn nötig, mit 0,06-1,1 Einheiten wird hinzufügt auf 0,9 ml Substratlösung, welche bei 50ºC für 5 Minuten vorerhitzt wurde. Die Substratlösung besteht aus 40 Volumenteilen 0,25 M Sodiumacetatpuffer (pH 5,5) und 50 Volumenteilen von 4 gewichtsprozentigem 10 D.E. Maltodextrin in Wasser. Die Substratlösung wird für 5 Minuten bei 50ºC gehalten, bevor die Enzymlösung hinzugefügt wird. Nach 10 Minuten wird die Reaktion gestoppt durch Eingießen in ein vorerhitztes 16 mm Röhrchen und Erhitzen in einem 100ºC-Wasserbad für 6 Minuten. Die Glucose wird bestimmt durch eine geeignete Methode, wie z. B. das Glucosereagenzkit 15-UV von Sigma Chemical oder mit einem Instrument, wie z. B. der Technicon Autoanalyzer. Eine Leerprobe zur Bestimmung der Glucose bei Nullzeit wird mitgefahren. Das Ergebnis ist korrekt für jede Verdünnung der Probe. Die Einheiten werden bezeichnet als 10 D.E. Einheiten oder 10 D.E. Maltodextrineinheit.

RSH-Aktivität einiger verbesserter Mutanten

Unter Benutzung des oben beschriebenen Standardkulturverfahrens und des Standardversuchsverfahrens Nr. 1 wurde gefunden, daß gewisse Mutanten höhere Titer an RSH-Enzymaktivität produzieren, als es der Wildtyp ATCC 16453 produzierte, wie es in der nachfolgenden Tabelle gezeigt ist:

Einheiten/ml

ATCC 16453 80
NRRL 15219 286
NRRL 15220 172
NRRL 15222 152
Es kann gesehen werden, daß diese Mutanten eine RSH- Aktivität zeigen, die ungefähr 2- bis ungefähr 3 1/2mal so groß ist wie die des Wildtyps.
Die folgenden Beispiele werden gezeigt, um die Methoden und Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung zu illustrieren mit dem Verständnis, daß die Erfindung nicht auf die offenbarten Details beschränkt ist. Die in den Spezifikationen und Ansprüchen gezeigten Prozentangaben, Teile und Verhältnisse sind auf das Gewicht bezogen, und die Temperaturen in ºC angegeben, falls es nicht anders angezeigt ist.
TEXT FEHLT
Das Flüssigfermentermedium hat die folgende Zusammensetzung:
Kornsudflüssigkeit 2,0%
K&sub2;HPO&sub4; 0,15%
MgSO&sub4;·7H&sub2;O 0,05%
Pastöses Kornmehl 0,10%
Wasser ad 100%
Nach der Sterilisation wurde jedem Fermenter ein Gramm von Penicillin G und Oxytetracyclin hinzugefügt. Wenn die Impfung hinzugefügt wurde, wurden 100 g von sterilem körnigen Kornmehl ebenfalls dem Medium beigemischt.
Jeder Fermenter wurde bei 42ºC gehalten, anfangs mit einem Rührer bei 500 Upm und einem Luftfluß durch das Wachstumsmedium entsprechend 0, 5 Volumen/Volumen/Minute (vvm). Nach 18 Stunden wurden 200 g steriles Kornmehl und 200 g steriler Kornsudflüssigkeit jedem Fermenter hinzugefügt. Luftfluß und Rührgeschwindigkeit wurden gesteigert auf ungefähr 1,6 bis 2,2 vvm und 600 Upm. In der 26. Stunde wurden 100 g steriles Kornmehl einem Fermenter hinzugefügt. Die Fermentation war beendet nach 73 Stunden.
Die Enzymbrühe jedes Fermenters wurde gefiltert, um die Mycelien und andere feste Materialien zu entfernen. Die gefilterte Brühe wurde gesammelt und eingefroren zur Speicherung. Aufgetaute Enzymlösung wurde zentrifugiert, um alle gebildeten Feststoffe zu entfernen. Die Aktivität der gefilterten Brühe war 183 Einheiten pro ml, gemessen mit der oben beschriebenen Methode, unter Benutzung von 10 D.E. Maltodextrin (Standardversuchsverfahren Nr. 2).
Das Enzym wurde genutzt bei einer Rate von 50 10 D.E. Einheiten pro Gramm von Stärke, um körnige Kornstärke in einem wäßrigen Gemisch von 26% Trockensubstanz zu hydrolysieren. Das Gemisch beinhaltete 100 ppm von Calciumionen mit 0,02% Propylparaben und 0,1% Methylparaben, hinzugefügt als Konservierung (ppm basiert auf Gemischgewicht). Der pH und die Temperatur wurden gehalten bei 6,0 und 55ºC für 96 Stunden unter konstantem Rühren. Die Ergebnisse sind in der Tabelle 2 dargestellt. Tabelle 2 Reaktionszeit (Stunden) Gelöste Stärke Sirupdextrosegehalt (% Trockensubstanzbasis - dsb)

Beispiel 2

H. Grisea var. thermoidea, ATCC 16543, wurde auf Agar (pH 7) mit folgender Zusammensetzung ausgestrichen:
Hefeextrakt 0,2%
Fleischextrakt 0,2%
Malzextrakt 0,3%
Bacto agar Difco 1,5%
Lintner-Stärke 1,0%
Wasser ad 100%
Bedeckte Platten wurden umgekehrt und bei 42ºC für 5-6 Tage gehalten; sie wurden gekühlt zur Lagerung bis zum Gebrauch.
Die Fermenterimpfung wurde präpariert durch Hinzufügen von Sporen zum Impfmedium mit der Rate von ungefähr einer Viertel Platte pro 500 ml Kolben, welcher 100 ml des Mediums beinhaltet und Mischen mit einem Schüttler. Das Impfmedium hat folgende Zusammensetzung:
Isoliertes Holzwollesaatprotein
ProfloTM* 3,0%
Kornmehl 3,0%
* Traders Protein Division of Traders Oil Mill Company
2 Sätze von Kolben wurden präpariert, einer sterilisiert, nachdem das Kornmehl hinzugefügt wurde (um die Kornmehlstärke zu gelatinieren), und der andere wurde sterilisiert bevor steriles Kornmehl hinzugefügt wurde, welches damit intakte Stärkekörnchen besitzt. Die Kolben wurden geschüttelt bei 42ºC für 16 Stunden, und die Impfung wurde unter Kühlung gespeichert.
5 Volumenprozent von jeder Impfung wurden auf 10 l sterilem Wuchsmedium in einem 14 Liter-Fermenter hinzugefügt, welcher eine Luftquelle und einen Rührer besitzt. Das Fermentermedium beinhaltete lediglich 4% Proflo isoliertes Protein der Holzwollesaat in Wasser. Zur Zeit der Hinzufügung der Impfung wurden 100 g von sterilem körnigen Kornmehl hinzugefügt, was jeweils am Ende der 18. und 24. Stunde wiederholt wurde. Jeder Fermenter wurde bei 42ºC anfangs mit einem Rührer bei 500 Upm und einem Luftfluß von 0,5 vvm gehalten. Nach 18 Stunden wurde der Luftfluß und die Rührergeschwindigkeit erhöht auf ungefähr 1,6 bis 2,2 vmm und 600 Upm. Die Fermentation wurde beendet nach 72 Stunden.
Die Enzymbrühe aus dem Fermenter wurde behandelt wie in Beispiel 1. Ihre Aktivität war 29 10 D.E. Einheiten pro Milliliter, gemessen wie in Beispiel 1.
Das Enzym wurde genutzt bei einer Rate von 15 10 D.E. Einheiten pro Gramm, um körnige Kornstärke in einem wäßrigen Gemisch von 26% Trockensubstanz zu hydrolysieren. Das wäßrige Gemisch beinhaltete 0,02% Propylparaben und 0,1% Methylparaben, welches zur Konservierung hinzugefügt wurde (% basierend auf Gemischgewicht). Der pH und die Temperatur wurden gehalten bei 6,0 und 55ºC für 96 Stunden mit konstantem Rühren. Die Ergebnisse sind in der Tabelle 3 dargestellt Tabelle 3 Reaktionszeit (Stunden) Gelöste Stärke Sirupdextrosegehalt (% Trockensubstanzbasis - dsb)

Beispiel 3

Dieses Beispiel zeigt den Effekt des Verstärkungsfaktors auf die Aktivität der Glucoamylase gemäß dieser Erfindung bei der Hydrolyse von körniger Stärke und verdünnter Stärke (10 D.E. Maltodextrin). Ein Prozent körnige Stärkesuspension wurde einer Hydrolyse ausgesetzt bei 50ºC und pH 5,5 mit 2 10 D.E. Einheiten von Glucoamylase, fraktioniert wie oben beschrieben aus dem Enzympräparat dieser Erfindung. Eine Lösung des Verstärkungsfaktors wurde der Stärkesuspension in den in der Tabelle 4 gezeigten Mengen hinzugefügt. Der Dextroseinhalt wurde gemessen über eine Periode von vier Stunden. Die Vier-Stunden-Ergebnisse (Tabelle 4) zeigen klar den Effekt des verstärkenden Enzyms auf die Glucoamylase bezüglich der Auflösung granularer Stärke und deren Umwandlung in Dextrose. Tabelle 4 hinzugefügte Verstärkungsfraktion Glucose Unfraktioniertes Enzym Glucoamylasefraktion Gemischte Fraktion
Ein ähnlicher Test wurde durchgeführt unter Benutzung von 2,5 bis 2,8 10 D.E. Einheiten von Glucoamylase in 17%iger (w/v) körniger Stärkesuspension unter essentiell gleichen Reaktionsbedingungen für sechs Stunden. Die drei getesteten Beispiele waren unfraktionierte Enzyme dieser Erfindung, isolierte Glucoamylasefraktion und isolierte Glucoamylasefraktion, zu welcher Verstärkungsfaktor (13 Mikrogramm Protein) hinzugegeben wurde. Die Dextrosekonzentrationen der Flüssigkeit waren 72,16 und 76 mg/ml.
Zum Vergleich wurden Beispiele von bekannten kommerziellen Glucoamylasepräparaten verglichen unter Benutzung eines optimalen pH von 4,4 und optimalen Temperaturen für jedes Beispiel entsprechend den Angaben des Lieferanten. Diese waren Aspergillus niger von Boehringer Mannheim und Aspergillus oryzae und Rhizopus niveus von Sigma Chemical. Die ersten zwei wurden getestet bei 60ºC und das letzte bei 50ºC unter Benutzung von 1% wäßriger Lösung mit körniger Stärke, wie oben, für eine Zeitdauer von vier Stunden. Diese drei wurden verglichen bei 2,4 Einheiten, 1,7 Einheiten und 2,0 Einheiten gegen 2,4 Einheiten von gereinigtem, jedoch unfraktioniertem Enzym dieser Erfindung. Der Glucosegehalt der Zusammensetzungen war 0,7, 1,7, 1,2 und 5,0 mg/ml und zeigte die Effektivität des Enzyms der vorliegenden Erfindung auf körnige Stärke. Im Gegensatz hierzu, wenn der gleiche Test ausgeführt wurde mit löslichem 10 D.E. Maltodextrin, erreichten alle vier Enzympräparate 95% Dextrose in 1,5 Stunden, im wesentlichen den gleichen Endpunkt zur gleichen Zeit.

Beispiel 4

Dieses Beispiel zeigt den Gebrauch des Glucoamylasepräparats dieser Erfindung für die Hydrolyse von B-Grad Weizenstärke. Diese Stärke wird erhalten als ein Resultat der Fraktionierung von Weizenstärke durch Zentrifugation in zwei Fraktionen, gefolgt vom Trennen von Gluten. Diese B-Grad-Stärke ist cremgefärbt, resistent gegen Angriffe durch Alpha-Amylase und schwierig zu behandeln in Prozessen, welche eine Hochtemperaturbehandlung von Stärke benötigen, wie in einem "jet"-Kocher (Dampfeinspritzungserhitzer).
Eine wäßrige Lösung von körniger B-Grad Weizenstärke mit 26% Festanteilen und einem pH von 5,5 wurde gerührt bei 55ºC für 24 Stunden in Anwesenheit von 15 10 D.E. Einheiten Enzympräparat pro Gramm Stärke. Der von den übrigbleibenden Festkörpern getrennte Sirup beinhaltete 95,7% Dextrose, und es wurden 64% der Stärke aufgelöst. Nach 96 Stunden betrug der Dextrosegehalt 95,3% und ungefähr 43,0% der Stärke waren aufgelöst. Bei 30 10 D.E. Einheiten pro Gramm Stärke waren die entsprechenden Ergebnisse 95,7% Dextrose mit 71% Auflösung von Stärke nach 24 Stunden und 94,4% Dextrose und 78% Auflösung bei 48 Stunden.
Unter den gleichen Bedingungen mit 34,3% Stärke Festkörper, ergaben 15 10 D.E. Einheiten pro Gramm 96% Dextrose im Sirup mit 54% Auflösung bei 24 Stunden und 95,2% Dextrose mit 57% Auflösung in 48 Stunden, wenn die Umwandlung beendet wurde. Mit 20 10 D.E. Einheiten pro Gramm wurde ein Dextrosegehalt von 95,1 und 94,2% bei einer Auflösung von 55 und 58% am Ende von 24 und 48 Stunden erreicht.

Beispiel 5

Dieses zeigt einen wichtigen und nicht offensichtlichen Unterschied zwischen dem Enzym dieser Erfindung und bekannten Verfahren, in welchem ein Glucoamylasepräparat gebraucht wurde mit einem Alpha-Amylasepräparat, um körnige Stärke in Glucose umzuwandeln. Der Unterschied erscheint in der Saccharidenverteilung der gebildeten Produkte durch die Hydrolyse. Die Daten zeigen auch den großen erreichten Fortschritt durch die Nutzung des Enzympräparats dieser Erfindung.
Ein Enzympräparat dieser Erfindung (erhalten von ATCC 16453, NRRL 15219) wurde zu 15 10 D.E. Einheiten pro Gramm Stärke auf eine 26%ige Trockensubstanz wäßrige Lösung von körniger Stärke mit 50 ppm Calciumionen hinzugefügt. Proben wurden nach 24, 48 und 96 Stunden genommen. Die Daten sind dargestellt in Fig. 1 (gestrichelte Linien). Die Analyse der Flüssigkeit (Trockensubstanzbasis) ist gegeben in Tabelle 5. Die Stärkefestkörperkonzentration nahm von 26% auf ungefähr 9% ab. Bei Wiederholung des Experiments mit 22,5 10 D.E. Einheiten Enzymprogramm war der Stärkerückstand reduziert auf 6%.
Bei 16% Festkörper war der Dextrosegehalt über 97% am Ende von 24 Stunden, und der Stärkerückstand war weniger als 1%; in vielen Versuchen wurde kein bestimmbarer Rückstand mehr gefunden.
Ein vergleichbares Experiment wurde ausgeführt unter Benutzung von 0,275% von Novo Thermamyl 60L bakterielle Alpha-Amylase, zusammen mit 0,275% von Miles Laboratories Diazyme L-100 Glucoamylasepräparat, beide basierten auf einem Stärketrockengewicht in einer wäßrigen Kornstärkelösung bei 27,5% Trockensubstanz. Ein pH von 5,5 und eine Temperatur von 60ºC wurden für 120 Stunden gehalten, Proben wurden in 24 Stundenintervallen genommen.
Diese Ergebnisse sind dargestellt in Fig. 1 (durchgehende Linie) und in Tabelle 5. Die Alpha-Amylase ist hergestellt von Bacillus licheniformis und hat einen optimalen pH von 5,5 bei 60ºC. Die Glucoamylase ist von einem Stamm der Aspergillus, identifiziert in der Literatur als aus der A. niger-Gruppe (Smith et al., Staerke 28 (1976) s. 243-249). Der pH von 5,5 wurde als optimal unter diesen Bedingungen für die Auflösung von Stärke angenommen. Es wurde beobachtet, daß der Glucosegehalt in der flüssigen Phase bei niedrigerem pH höher war, jedoch weniger Stärke aufgelöst wurde. Wie Fig. 1 zeigt, besteht ein allmählicher Anstieg im Dextrosegehalt (Trockensubstanz basierend auf löslichem Saccharid) im Gegensatz zur vorliegenden Erfindung, in welcher der Dextrosegehalt mit der Zeit abnimmt. Die Alpha-Amylase-Glucoamylase Kombination läßt 16% von Stärke am Ende von 42 Stunden und 14% von Stärke nach 120 Stunden zurück. Tabelle 5 Stunden Dextrose und darüber Enzym dieser Erfindung Alpha-Amylase/Glucoamylase
Die Daten aus Fig. 1 und Tabelle 5 demonstrieren klar einen fundamentalen Unterschied in der Weise, in welcher das Enzym dieser Erfindung operiert, um zu hydrolysieren und körnige Stärke aufzulösen: Die gebildeten löslichen Saccharide sind mehr als 95% Dextrose für die ersten 24 Stunden, im wesentlichen ohne Bildung von D.P. 3 und höherer Glucosepolymere. Es wird angenommen, daß der Anstieg in D.P.2 Sacchariden ein Ergebnis der Repolymerisation ist. Im Gegensatz erreichen typische Glucoamylasepräparate mit Alpha-Amylase als mitwirkendes Enzym zur Lösung von körniger Stärke keine 90% Dextrose in 24 Stunden und verbessern sich allmählich auf 94 bis 95% nach 96 Stunden. Die relativ hohe Produktion von D.P.3 und höheren Sacchariden mit einem Erreichen eines wesentlich höheren Endwertes als in der vorliegenden Erfindung sind ebenfalls wesentlich.
Einige Vorteile der vorliegenden Erfindung können nun besser eingeschätzt werden. Rohstärke eher als pastöse Stärke ist ein Substrat für die Glucosebildung unter Benutzung des Enzympräparats, erzeugt durch ausgewählte Pilze. Durch Eliminierung der Notwendigkeit, die Stärke zu pastieren, wird eine wesentliche Energiereduktion realisiert. Das Enzympräparat ist nutzvoll, um wäßrige Lösungen von Rohstärke mit hohem Gewichtsprozentanteil von Stärke zu hydrolysieren, wobei eine relativ konzentrierte Glucoselösung erzeugt wird, welche weniger Energie für das Entfernen von Wasser benötigt, als es eine verdünntere Lösung tut. Vom Start der Hydrolyse an beinhaltet das Produkt im wesentlichen gelöste Glucose. Besonders wichtig ist die Tatsache, daß das Enzympräparat sehr niedrige Konzentrationen von Grenzdextrinen und Trisacchariden erzeugt. Diese Substanzen tragen nicht zur Süßigkeit von Glucose oder abgeleiteten Produkten bei, wie z. B. hochfruktoses Sirup und können sogar die Süßigkeit reduzieren. Daher ist das Enzympräparat ideal von praktisch jedem Standpunkt aus zur Erzeugung von Glucose aus Stärke. Die Mutantenspezies, die entwickelt wurden, welche einen hohen Titer des Enzymgemisches produzieren, verbessern die Anwendungsmöglichkeiten des Enzympräparats für eine kommerzielle Produktion von Glucose.
Während die Erfindung mit Hilfe von bevorzugten Ausführungen beschrieben wurde, können offensichtliche Modifikationen, die dem Fachmann geläufig sind, gemacht werden, ohne aus dem Bereich der vorliegenden Erfindung herauszugehen. Beispielsweise wird erwartet, daß verbesserte Mutanten kontinuierlich entwickelt werden, welche sehr hohe Enzymtiter produzieren. Es ist ebenfalls anzunehmen, daß sobald mehr bekannt wird über die Natur der Enzyme, welche in der RSH-Enzymmischung beinhaltet sind, die Gene, welche die Enzyme produzieren, geklont werden und entsprechend eingesetzt werden durch rekombinante DNA- Technologie in anderen Organismen. Für die Zwecke der Erfindung wird angenommen, daß verbesserte Mutanten oder rekombinierte Organismen, welche das gleiche Enzymgemisch produzieren, als äquivalent zu den beschriebenen Organismen angenommen werden.

Weitere Merkmale der Erfindung

In dem Verfahren zur Erzeugung eines Enzympräparats zur Hydrolyse körniger Stärke von Pilzorganismen, kann das Carbohydratsubstrat Rohstärke einschließen, um den Pilzorganismus zur Abgabe höherer Enzympräparattiter zu induzieren, und das Medium kann eine Nährstoffquelle beinhalten, welche Vitamine und Proteine zur Verfügung stellt, vorzugsweise Kornsudflüssigkeit. Das Medium kann eine Stickstoffquelle und anorganische Salze, welche vorteilhaft für das Wachstum des Pilzorganismus sind, beinhalten.
In dem Verfahren zur Erzeugung von Glucose aus körniger Stärke wird das Enzympräparat vorzugsweise auf körnige Stärke in Wasser angewandt, um zwischen ungefähr 25 bis ungefähr 300, noch besser zwischen ungefähr 50 bis ungefähr 100 Rohstärke hydrolysierende Einheiten pro Gramm Stärke zur Verfügung zu stellen. Das wäßrige Gemisch beinhaltet vorzugsweise zwischen ungefähr bis ungefähr 60 Gewichtsprozent körnige Stärke.
Obwohl die in hohem Maße bevorzugten Pilzorganismen die NRRL 15219, NRRL 15220 und NRRL 15222-Stämme sind, sind ebenfalls Organismen bevorzugt, die im allgemeinen bei 37ºC und darüber wachsen.
Die Glucoamylasefraktion der Erfindung ist vorzugsweise die Carboxymethyl-Cellulose-absorbierte Fraktion des Enzympräparats dieser Erfindung. Die verstärkende Enzymfraktion ist vorzugsweise die Fraktion des Enzympräparats dieser Erfindung, welche nicht durch die Carboxymethyl-Cellulose absorbiert wird.
In dem Verfahren dieser Erfindung zur Erzeugung von Glucose aus verdünntem Stärkehydrolysat, hat die verdünnte Stärkehydrolysatflüssigkeit vorzugsweise ein D.E. von 1 bis 25, besser 5 bis 15, einen pH von 5 bis 7, einen Festgehalt von ungefähr 15 bis 60% Stärke auf Trockensubstanzbasis, und die Hydrolyse des Stärkehydrolysats findet bei Temperaturen über ungefähr 55ºC statt.

Claims

1. Ein Enzympräparat erhältlich von einer substantiell reinen Kultur eines Pilzorganismus, welcher ein Stamm von Humicola grisea var. thermoidae ist, wobei das Enzympräparat die Hydrolyse von körniger Stärke im wesentlichen direkt zu Glucose katalysiert, das Enzympräparat gekennzeichnet dadurch, daß

a) es katalysiert die Hydrolyse von körniger Stärke, suspendiert in Wasser bei einer Konzentration von 15 Gewichtsprozent Stärkesubstanz im wesentlichen vollständig zu löslichen Glucosesirupkörpern mit mindestens 97 Gewichtsprozent Glucose, Trockensubstanzbasis, wenn die Hydrolyse betrieben wird bei einem pH-Wert von 5,0-7,0 und einer Temperatur von 55ºC und ohne zugefügte Alphaamylase oder zugefügtes Nichtverzweigungsenzym der Pullulanase, Isoamylase oder Betamylasetyp,

b) es ist separierbar durch Carboxymethyl-Cellulose in eine erste nicht absorbierende Fraktion und eine zweite absorbierende proteinartige Fraktion, genannte erste nicht absorbierende Fraktion mit einer Glucoamylase verstärkenden Aktivität und genannte zweite absorbierende Fraktion mit einer Glucoamylase Enzymaktivität (EC 3.2.1.3), welche einen isoelektrischen Punkt von 8.0 oder höher besitzt.

2. Ein Enzympräparat gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Stamm einer der Organismen ist, die unterlegt sind unter der Kultursammlung von Referenzen ATCC 16453, NRRL 15219, NRRL 15220, NRRL 15221, NRRL 15222, NRRL 15223, NRRL 15224 und NRRL 15225, oder es ist ein genetisch veränderter Stamm künstlich erhalten von einem der genannten Organismen und besitzt die Fähigkeit, ein Enzympräparat zu erzeugen, wie es in Anspruch 1 charakterisiert ist.

3. Ein Prozeß zur Erzeugung eines Hydrolyseenzympräparats körniger Stärke von einem Pilzorganismus, beinhaltend:

(i) Keimung von Sporen eines Pilzorganismus, welcher ein Stamm von Humicola grisea var. thermoidae ist, welcher ein Enzympräparat abscheidet, wie es in Anspruch 1 beansprucht ist,

(ii) Fermentierung eines Carbohydratsubstrats mit vorgenanntem gekeimten Pilzorganismus in einem Wuchsmedium zur Erzeugung einer Brühe mit genanntem abgeschiedenen Enzym, und

(iii) Trennung des genannten Enzympräparats von genanntem fermentierten Pilzorganismus, wobei das granulare Stärkehydrolyseenzympräparat erhalten wird.

4. Ein Verfahren gemäß Anspruch 3, wobei der Pilzorganismus ein Stamm ist, welcher hinterlegt ist unter der Referenz ATCC 16453, NRRL 15219, NRRL 15220, NRRL 15221, NRRL 15222, NRRL 15223, NRRL 15224 und NRRL 15225, oder einem genetisch verändertem Stamm, welcher künstlich erhalten wird von einem der oben genannten Organismen und welcher die Fähigkeit zur Erzeugung eines Enzympräparates, wie es in Anspruch 1 charakterisiert ist, besitzt.

5. Ein Prozeß zur Glucoseerzeugung aus körniger Stärke, gekennzeichnet durch das Hinzufügen eines Enzympräparates, wie es in Anspruch 1 oder 2 beansprucht ist, zu einem Gemisch von körniger Stärke in Wasser, um die gleiche Glucose zu hydrolysieren.

6. Ein Pilzorganismus vom Stamm von Humicola grisea var. thermoidae, hinterlegt unter der Referenz NRRL 15219, NRRL 15220, NRRL 15221, NRRL 15222, NRRL 15223, NRRL 15224 und NRRL 15225 oder einem genetisch veränderten Stamm, künstlich erhalten von einem der vorgenannten Organismen, und welcher die Fähigkeit besitzt, wenn er mit dem Standard-Kultur-Verfahren, wie es hierin definiert ist, kultiviert wird, ein Enzympräparat zu erzeugen, wie es in Anspruch 1 charakterisiert ist, mit einer RSH-(Rohstärkehydrolyse)Aktivität von 120 Einheiten pro ml oder mehr besitzt, geprüft mit dem Standard-Prüfungs-Verfahren Nr. 1, wie es hierin definiert ist.

7. Eine Glucoamylaseenzymfraktion, erhältlich von einer im wesentlichen reinen Kultur eines Pilzorganismus, welcher ein Stamm von Humicola grisea var. thermoidae ist, gekennzeichnet dadurch, daß er einen isoelektrischen Punkt von ungefähr 8,0 oder höher als 8,0 hat und fähig ist, an Carboxymethyl-Cellulose absorbiert zu werden und eine maximale Aktivität bei einem pH zwischen 5,0 und 7,0 zeigt.

8. Ein Prozeß zur Glucoseerzeugung von einem verdünnten Stärkehydrolysat, beinhaltend die Zugabe einer Enzymfraktion, wie es in Anspruch 7 beansprucht ist, zu einer verdünnten Stärkehydrolysatflüssigkeit, um die gleiche Glucose zu hydrolysieren.

9. Eine verstärkende Enzymfraktion, welche gemeinsam mit einem Glykoamylaseenzym erhältlich ist von einer im wesentlichen reinen Kultur eines Pilzorganismus, welcher ein Stamm von Humicola grisea var. thermoidae ist, katalysiert die Hydrolyse von körniger Stärke, suspendiert in Wasser, bei einer Konzentration von 15 Gewichtsprozent Stärkesubstanz im wesentlichen vollständig zu löslicher Glucosesirupsubstanz mit mindestens 97% Gewichtsprozent Glucose auf Trockensubstanzbasis, wenn die Hydrolyse ausgeführt wird bei einem pH von 5,0-7,0 und einer Temperatur von 55ºC und ohne hinzugefügte Alpha-Amylase oder zugeführte nicht verzweigende Enzyme von Pullulanase, Isoamylase oder Beta-Amylasetypus.