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N-(4-Aminobcnzoyl)-aminoessigsure zur Stabilisierung von
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Technetium-99m-Präparaten, stabilisierte Injektionspräparate und Verfahren
zu ihrer Herstellung Die vorliegende Erfindung betrifft eine Substanz, durch die
Technetium-99m-haltige Injektionslösungen stabilisiert werden können.
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In der nuklearmedizinischen Diagnostik ist Technetium-99mwegen seiner
günstigen physikalischen Eigenschaften (kurze Halbwertzeit von 6 Stunden, »-Energie
von 140 keV und Fehlen einer Korpuskularstrahlung) und der damit verbundenen geringen
Strahlenbelastung zum wichtigsten Radionuklid geworden.
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Technetium-99m, das sich aus Nuklidgeneratoren gewinnen läßt, liegt
zunächst als Pertechnetat vor, das zur szintigraphischen Abbildung der Schilddrüse
und des Gehirns geeignet ist. Die Szintigraphie anderer Organe mittels Technetium-99m
gelingt mit Hilfe bestimmter Trasportsubstanzen", die einerseits in der Lage sind,
Technetium zu binden, und andererseits das Radionuklid im Zielorgan mit hoher Selektivität
anzureichen. Zur Markierung der organspezifischen "Transportsubstanz" mit Technetium-99m
muß das aus dem Nuklidgenerator eluierte Pertechnetat zuerst in eine niedrigere
Oxidationsstufe übergeführt werden. In dieser reduzierten Form bildet Technetium
mit der organspezifischen Susbtanz mehr oder weniger stabile Verbindungen. Die Reduktion
des Pertechnetats (Tc04 ) erreicht man entweder durch chemische Reduktionsmittel
oder durch elektrolytische Methoden. In der Praxis verwendet man fast ausschließlich
Zinn-II-Salze, wie Zinn-II-chlorid, -fluorid, -oxid oder -tartrat, wobei besonders
das Chlorid bevorzugt wird.
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Das Zinn-II-Salz liegt im allgemeinen zusammen mit der organspezifischen
Substanz in lyophilisierter Form vor,wodurch
diese Präparate haltbar
gemacht und monatelang unverändert aufbewahrt werden können. In der Klinik muß der
Anwender z-ur Herstellung des Tc-99m-markierten Injektionspräparats dann nur eine
aus dem Nuklidgenerator eluierte sterile Lösung des Pertechnetats mit der benötigten
Tc-99m-Aktivität zusetzen.
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Diese Injektionslösungen -sind im Gegensatz zum noch nicht markierten,
aus organspezifischer Komponente und Zinn-II-Salz bestehenden Lyophilisat, nur einige
Stunden haltbar. Das hängt weniger mit der relativ kurzen Halbwertszeit des Technetium-99m
als mit der Stabilität der Zinn-II-Ionen in der Lösung zuszen. Es ist bekannt, daß
Zinn-II-Verbindungen in neutraler wäßriger Lösung relativ rasch hydrolysiertwerden.
Da die Injektionslösungen physiologisch verträglich sein sollen, liegt ihr pH-Wert
im allgemeinen zwischen 5 und 8, d.h. in einem Bereich, in dem Zinn-II nicht besonders
stabil ist.
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In den Tc-99m-Präparaten muß aber die organspezifische Substanz gegenüber
dem als reduzierendem Agens wirkenden Zinn-II immer im Überschuß vorliegen, da die
diagnostische Brauchbarkeit des Radiopharmakons vom Mengenverhältnis der Komponenten
entscheidend beeinflußt wird. Ist der Zinn-II-Gehalt in einer Markierungseinheit
zu hoch, dann kann unter Umständen nicht mehr alles Zinn komplex gebunden sein,
und es kommt zur Bildung von reduziertem, jedoch nicht am Wirkstoff gebundenen Technetium.
Diese als "Kolloid" bezeichnete Verunreinigung bildet sich dadurch, daß Zinn-Ionen
beim pH-Wert der Eluate, der in der Regel zwischen 5 und 6 liegt, schwer lösliches
Zinnhydroxid bilden, das in koiloidaler Form vorliegt. Das bei der Reduktion unter
diesen Bedingungen entstehende Technetiumdioxid fällt zusammen mit dem Zinnhydroxid
aus, und es kommt zu einer erhöhten Anreicherung von Technetium-99m in Leber und
Milz.
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Umgekehrt wurde, wenn die Menge an Zinn-lT in der Injektionslösung
nicht ausreichend wäre, noch Pertechnetat vorhanden sein, das die szintigraphische
Organdarstellung durch Anreicherung im Magen und in der Schilddruse stören kann.
Folgendes Beispiel zeigt, daß üblicherweise in einer Tc-99m-Markierungseinheit ein
genügend hoher Überschuß an Zinn-II vorhanden ist, durch den das zugesetzte Pertechnetat
quantitativ 12 reduziert wird. 37 MBq (1 mCi) Tc-99m enthalten ca. lo -6 Atome,
entsprechend einer Menge von 1,92 x lo 6 gMol oder 190 pg. Geht man davon aus, daß
je nach Präparat bei der Markierung 185 - 7.400 MBq (5 - 200 mCi) eingesetzt werden,
dann finden die chemischen Reaktionen mit Technetiummengen von einigen ng statt.
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Der in der europäischen Patentschrift 00 02 485 beschriebenen Aarkienmgseinheit
fur die SkeJettzintigraphie, die aus 13 mg 3,3-Diphosphono-1,2-propandicarbonsäure-tetranatriumsalz
als organpfl ichtiger Komponente und o,2 mg Zinn-lT als reduzierendem Agens besteht,
werden 10 ml Generatoreluat mit einer Aktivitätskonzentration von 740 MBq (20 mCi)
pro ml zugesetzt. Die injektionsfertige Lösung enthält so mit den 7.400 MBq (200
mCi) 4 x lo 4 Mol bzw. 40 ng Tc-99m. Das aus einem Nuklidgenerator gewonnene Technetium-99m
ist jedoch nicht trägerfrei, da einerseits Molybdän-99 zu 14 % direkt zum Tc-99
zerfällt und andererseits aus dem gebildeten Tc-99m ständig durch radioaktiven Zerfall
Tc-99 entsteht. Bei täglicher Elution liegen pro Atom Tc-99m noch rund 2,5 Atome
Tc-99 vor, die an allen chemischen Prozessen genauso teilnehmen wie Tc-99m. Das
heißt, ein Teil des Zinn-II in der Markierungseinheit wird zur Reduktion des diagnostisch
nicht nutzbaren Tc-99-Pertechnetats verbraucht.
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Im obigen Beispiel liegen demnach die drei Komponenten des injektionsfertigen
Radiopharmakons Technetium (1,4 nMol), Zinn (1,7 WMol) und 3,3-Diphosphono-l,2-propandicarbonsäuretetranatriumsalz
(34 RMol) im molaren Verhältnis 1 : l.200 : 24.ooo
vor. Da für die
Reduktion des Pertechnetats zum positiv 4-wertigen Technetium 3 Atome Zinn-II pro
2 Atomen Tc-VII benötigt werden, stellen die in der Markierungseinheit vorhandenen
0,2 mg Zinn-II einen Soo-fachen Überschuß dar.
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Dieser hohe Überschuß des Zinn-II gegenüber Technetium, der bei fast
allen Tc-99m-Präparaten die Regel ist, garantiert eine Tc04 -freie Injektionslösung,
die meistens auch mehrere Stunden stabil ist. Voraussetzung für die Stabilität des
Tc-99m-Injektionspräparates ist die Anwesenheit von Zinn-II in der Lösung. Wird
das Zinn-II in der Injektionslösung aber nach mehr oder weniger kurzer Standzeit
durch Hydrolyse verbraucht, dann kann unter dem Einfluß von geringen Mengen Luftsauerstoff
aus dem reduzierten Technetium in der Lösung durch Reoxidation wieder Pertechnetat
entstehen.
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Man hat versucht, durch Zusatz von Antioxidantien eine Reoxidation
des Technetium in Iniektionspräparaten zu verhindern.
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So wurden zum Beispiel Ascorbinsäure, Gentisinsäure bzw.
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Nitrit zur Stabilisierung von Tc-99m-Präparaten vorgeschlagen (vgl.
z.B. deutsche Offenlegungsschrift 26 18 337, europäische Patentanmeldungen mit den
Veröffentlichungs-Nr. 00 04 684 und 00 46 067). Davon werden Gentisin- und Ascorbinsäure
bereits in manchen Handelspräparaten als Stabilisatorzusätze verwendet.
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Untersuchungen mit diesen Substanzen zeigten jedoch, daß ihre Wirksamkeit
bei Verwendung hoher Tc-99m-Aktivitätskonzentrationen gering ist. Manche Tc-99m-Präparate,
vor allem die zur Skelettszintigraphie verwendeten Diphosphonate, werden oft unter
Verwendung hoher Aktivitätskonzentrationen markiert.
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Durch Verteilung des Inhalts einer Markierungseinheit auf möglichst
viele Patienten versucht man, die Kosten pro Untersuchung zu senken. Dafür müssen
hohe Tc-99m-Aktivitäten pro Markierungseinheit zugesetzt werden, und es wird naturgemäß
eine längere Anwendungsdauer der Injektionsiösung, möglichst über einen vollen Arbeitstag,
angestrebt.
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Wie umfangreiche eigene Untersuchungen ergaben, nimmt die Stabilität
einer Tc-99m-Injektionslösung bei Zugabe steigender Tc-99m-Aktivitäten ab. So wurde
bei dem oben erwähnten Knochendiagnostikum 3,3-Diphosphono-1,2-propandicarbonsäure
(DPD) gefunden (Tab. 1), daß bei Zugabe von 3.700 MBq Tab. 1: Einfluß der zugesetzten
Tc-99m-Aktivitätsmenge auf den Zinn-II-Gehalt und den Pertechnetatanteil in der
Markierungseinheit 3,3-Diphosphono-1,2-propandicarbonsäure (DPD) in Abhängigkeit
von der Zeit nach Präparation mit je 5 ml Eluat
| Zinn-II-Gehalt nach Pertechnetatanteil in |
| Präparation (h) in pg der Lösung nach PrRparation |
| (h) in % |
| MBq 0 2 5 8 0 2 5 8 |
| 1.850 200 168 137 108 <1 <1 <1 <1 |
| 3.700 200 152 119 88 <1 c1 <1 c1 |
| 7.400 200 136 84 30 <1 <1 <1 2 |
| 11.100 200 115 48 elo <1 <1 <1 4 |
| 14.800 200 96 <1o - <1 <1 3 8 |
Zinn-lT-Bestimmung durch jodometrische Titration Messung des Tc-99m-Pertechnetatanteils
durch Papierchromatographie (Whatman-Papier No. 1; Methanol:Wasser = 8:2) (loo mCi)
pro Markierungseinheit nach 8-stündiger Standzeit noch genügend Zinn-II-Ionen vorhanden
waren, um das Auftrete? von Pertechnetat in der Lösung zu verhindern. Dagegen zeigte
sich, daß bei Verwendung von 14.800 MBq (400 mCi) in 5 ml Generatoreluat bereits
5 Stunden nach der Präparation alles Zinn-II verbraucht und in der Lösung naturgemäß
freies Pertechnetat nachweisbar war.
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Unter dem Einfluß hoher Tc-99m-Aktivitäten kommt es in der Injektionslösung
zu einer beschleunigten strahlenchemischen Oxidation der als reduzierende Komponente
vorhandenen Zinn-II-Ionen. Bei der Suche nach einem wirksameren Stabilisator wurde
in
der N- (4-Aminobenzoyl) -aminoessigsäure (4-Aminohippursäure) überraschend eine
Substanz gefunden, durch die auch hohe Tc-99m-Aktivitätskonzentrationen enthaltende
Injektionslösungen über einen längeren Zeitraum nach Präparierung haltbar gemacht
werden können.
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Die Erfindung betrifft daher die N-(4-Aminobenzoyl)-aminoessigsäure
sowie ihre physiologisch verträglichen Salze als Stabilisator für Zinn-II-Verbindungen
enthaltende Tc-99m-Injektionspräparate sowie ein Verfahren zur Herstellung stabilisierter,
Tc-99m-markierter Radiodiagnostika, bei dem N- (4-Aminobenzoyl) -aminoessigsäure
als zusätzliche Komponente entweder der inaktiven Markierungseinheit oder zusammen
mit der Technetium-99m-Pertechnetatlösung der zu markierenden Substanz zugesetzt
wird.
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Bei Zusatz des Stabilisators zur inaktiven Markierungseinheit wird
entweder der Stabilisator dem Gernisch aus organspezifischer Komponente und Zinn-II-Verbindung
vor der Abfüllung zugesetzt und die erhaltene Lösung portionsweise abgefüllt sowie
lyophilisiert oder der lyophilisierte Inhalt einer Abfüllung (Markierungseinheit)wird
zuerst in stabilisatorhaltiger physiologischer Kochsalz]ösung gelöst und dann durch
Zugabe der TC-99m-Pertechnetatlösung markiert.
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Da durch. einen zu hohen Anteil der Stabilisatorkomponente die Organverteilung
des Technetiums-99m-Präparats verändert werden kann, ist es zweckmäßig, ein molares
Verhältnis von Zinn-II zu Stabilisator von 1 : 10 nicht zu überschreiten.
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Verteilungsstudien an Ratten zeigten, daß bei einem molaren Verhältnis
von Zinn-lT zu N- (4-Aminobenzoyl) -aminoessigsäure von 1:10 bis 1:30, die als reduzierende
bzw. stabilisierende Komponenten der knochenpflichtigen Tc-9 9m-Diphosphono-1 ,
2 -propandicarbonsäure (DPD) zugesetzt wurden, die Skelettspeicherung dieses Tc-99m-Komplexes
deutlich auf Kosten einer verstärkten renalen Ausscheidung verringert war.
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Optimal, und für die Stabilisierung auch bei Zugabe sehr woher Tc-99m-Aktivitäten
(bis zu 18.500 MBq) aureichend, ist ein Molverhältnis Zinn-II zu N-(4-Aminobenzoyl)-ainoessigsäure-von
1:2 bis 1:6, so daß eine für die Anwendung beim Menschen geeignete Abfüllung (Markierungseinheit)
sinnvollerweisezusätzlich 0,6 - 2 mg Stabilisator zu der organspezifischen "Transportsubstanz"
enthält, wenn das ebenfalls darin enthaltene reduzierende Agens (Sn ) in einer Menge
von rund 0,2 mg vorliegt.
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Für die Herstellung einer Markierungseinheitowird entweder N-(4-Aminobenzoyl)-aminoessigsäure
direkt oder, da es in Wasser leichter löslich ist, vorteilhafter das Natriumsalz
eingesetzt.
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Beispiel 1: Zu 4 ml Pertechnetatlösung, die 14.800 MBq (400 mCi) Tc-99m
enthalten, gibt man 1 ml einer physiologischen NaCl-Lösung (pH N 7), in der 2 mg
N-(4-Aminobenzoyl)-aminoessigsäure-natriumsalz gelöst sind. Diese Lösung wird einer
lyophilisierten Markierungseinheit, bestehend aus 13 mg 3,3-Diphosphono-1,2-propandicarbonsäure-tetranatriumsalz
und o,2 mg Zinn-II, zugesetzt. Nach 16-stündiger Standzeit wird mit physiologischer
NaCl-Lösung auf eine Konzentration von o,2 mg Diphosphonat/ml verdünnt und jeweils
o,o5 ml (13 ßg) pro Ratte iv.
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appliziert. Parallel dazu wird das gleiche Präparat, jedoch ohne Zusatz
der N-(4-Aminobenzoyl)-aminoessigsäure als Stabilisator, mit 14.800 MBq Tc-99m markiert,
nach gleicher Standzeit verdünnt und in analoger Konzentration Ratten injiziert.
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Die Organverteilung in jeweils 3 Ratten wurde 2 Stunden nach Injektion
bestimmt. Folgende Werte (in % der applizierten Dosis, vgl. Tab. 2) zeigen den deutlichen
Unterschied in der Organverteilung zwischen dem stabilisatorhaltigen und -freien
Tc-99m-Präparat, wobei die erhöhten Anreicherungen in Magen und Schilddrüse auf
die Anwesenheit von Pertechnetat in der Injektionslösung hinweisen:
Tab.
2:
| Tc-99m-DPD |
| mit Stabilisator ohne Stabilisator |
| Knochen/g 4,36 3,92 |
| Blut/ml o,o18 o,o68 |
| Muskel/g o,oo5 o,o40 |
| Leber o,19 0,58 |
| Lunge o,o71 o,o96 |
| Nieren o,58 1,20 |
| Darm o,88 3,26 |
| Magen o,15 2,86 |
| Schilddrüse o,o18 o,o61 |
Beispiel 2: Eine Markierungseinheit, bestehend aus 7,2 mg Natriumpyrophosphat und
1,o8 mg SnC12, wird in 2 ml physiologischer NaCl-Lösung (pHrr/ 7), die N-(4-Aminobenzoyl)-aminoessigsäure-natriumsalz
in einer Konzentration von 1 mg/ml enthält, gelöst.
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Unmittelbar darauf werden 8 ml Pertechnetatlösung mit 12.950 MBq (350
mCi) zugesetzt und anschließend in bestimmten Zeitintervallen Proben aus dem Markierungsansatz
entnommen, die papierchromatographisch auf freies Pertechnetat geprüft werden. Die
Prüfung erfolgt auf Whatman-l-Papier unter Verwendung von Methanol:Wasser = 8:2
(v/v) als mobiler Phase.
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Das mit einem Rf-Wert von o,6 vom Tc-99rn-I'yrophosphat (Rf - O) abgetrennte
Pertechnetat wird mit Hilfe eines Radiochromatographen bestimmt. Ein unter gleichen
Bedingungen markiertes Pyrophosphat, dem jedoch kein Stabilisator zugesetzt wurde,
enthält bereits, wie aus der Tabelle 3 ersichtlich, nach relativ kurzer Standzeit
Pertechnetat:
Tab. 3:
| Zeit nach % Pertechnetat in Tc-99m-Pyrophosphat |
| Präparation (h) mit Stabilisator ohne Stabilisator |
| o,5 <1 *1 |
| 2 <1 <1 |
| 4 <1 1 |
| 6 <1 3 |
| 8 <1 7 |
| 12 cl 10 |
Beispiel 3: 2 g Methylendiphosphonsäure (MDP) und 218 mg N-(4-Aminobenzoyl)-aminoessigsäure-natriumsalz
werden zusammen in 3 ml bidest. Wasser gelöst und mit ca. 27 ml 1 N-Natronlauge
auf einen pH-Wert von 6,5 eingestellt. Unter Luftausschluß werden 56 mg Zinn-II-oxid
der Lösung zugesetzt. Nach vollständiger Auflösung des SnO wird mit 70 ml Wasser
verdünnt und die sterilfiltrierte Lösung in o,5 ml-Portionen in mit flüssigem Stickstoff
vorgefrorene Rollrandfläschchen vereinzelt und gefriergetrocknet. Die Abfüllungen
werden mit Stickstoff überlagert und verschlossen.
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Durch jodometrische Titration untersuchte Proben zeigten nach mehrwöchiger
Lagerzeit einen unveränderten Gehalt von 0,2 mg Zinn-II pro Abfüllung. Das mit Tc-99m-Pertechnetatlösungen
hoher Aktivitätskonzentrationen versetzte Präparat war auch nach 8-stündiger Standzeit
frei von Pertechnetat und zur szintigraphischen Skelettdarstellung geeignet.
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Beispiel 4: Unter luftfreien Bedingungen löst man bei Raumtemperatur
in 26 ml 2 N-Natronlauge 9o mg reinstes Zinn-II-oxid. In die Natriumstannitlösung
läßt man unter Rühren eine Lösung, bestehend aus 4 g 3,3-Diphosphono-1,2-propandicarbonsäure
(DPD)
und 260 mg N-(4-Aminobenzoyl)-aminoessigsäure in 2c ml bidest.
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Wasser, zufließen. Die klare Lösung wird mit sterilem Waser auf ein
Gesamtvolumen von 200 ml verdünnt und anschließend in o,5 ml-Portionen in mit flüssigem
Stickstoff vorgekühlte Rollrandfläschchen abgefüllt. Nach der Gefriertrocknung werden
die Gläschen unter Vakuum verschlossen.
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Es wurden, wie unter Beispiel 1 beschrieben, Tierversuche mit dem
Tc-99m-DPD durchgeführt, wobei nach 16-stündiger Standzeit der Injektionslösungen
und 2 Stunden nach iv.-Applikation des Präparats folgende Ergebnisse erhalten wurden
(in % der applizierten Dosis): Knochen Leber Nieren Schilddrüse Magen Blut 44,9
o,2o o,48 o,o14 o,26 o,22