DE3308688C2

DE3308688C2 -

Info

Publication number: DE3308688C2
Application number: DE19833308688
Authority: DE
Inventors: Erich Dipl.-Ing. 6507 Ingelheim De Martin
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1983-03-11
Filing date: 1983-03-11
Publication date: 1988-04-14
Also published as: DE3308688A1

Description

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zum Konser vieren von isolierten Organen und Geweben gemäß dem Oberbegriff des Anspruchs 1.The invention relates to a method for the consumer four of isolated organs and tissues according to the preamble of claim 1.

Eine schnelle Unterkühlung oder ein schneller Gefrierprozeß von biologischem Gewebe und Organen ist für die Erforschung von Gefriermethoden zum Lagern von Organen für die Organtrans plantation von größter Bedeutung. Darüber hinaus ermöglicht ein solches Verfahren das Studium schnell ablaufender Stoff wechselvorgänge in gesamten Organen oder einzelnen Zellen. Nebenbei dient es zugleich als Präparationstechnik für raster elektronenmikroskopische Untersuchungen.A quick hypothermia or a quick freezing process of biological tissue and organs is for research of freezing methods for organ storage for organ trans plantation of paramount importance. It also enables such a process studying fast-moving material change processes in entire organs or individual cells. Besides, it also serves as a preparation technique for grids electron microscopic examinations.

Es ist wichtig, daß das Unterkühlen und Gefrieren von lebender biologischer Substanz extrem schnell erfolgt, damit das Wasser aus der physiologischen Lösung der intra- und extrazellulären Lösungsbestandteile nicht ausgefriert und die Restlösung keine Zunahme der Konzentration erfährt (Dehydratation). Eine Ver änderung der Lösungskonzentration würde zu einer osmotischen Druckdifferenz und zu Zerstörungen und Denaturierung der Zellen führen. Auch spielt die Bildung von zellzerstörenden Auskri stallisierungen eine Rolle, die bei langsamer Einfriergeschwin digkeit zu großen Kristallstrukturen mit nadelförmigen Auswüch sen führt, die das Zellgewebe zerstören. It is important that the supercooling and freezing of living biological substance takes place extremely quickly so the water from the physiological solution of the intra- and extracellular Solution components not freeze out and the remaining solution none Experiencing an increase in concentration (dehydration). A ver changing the solution concentration would become an osmotic Pressure difference and to destruction and denaturation of the cells to lead. The formation of cell-destroying Auskri also plays installations play a role in slow freezing ability to large crystal structures with acicular outgrowth leads which destroy the cell tissue.

Die herkömmlichen Methoden, ein Organ oder ein biologisches Gewebe mittels seines vaskulären Netzes zu unterkühlen, werden durch ein Durchströmen mit einer unterkühlten Perfusionslösung bewirkt. Die Abkühlung sowie die Abkühlgeschwindigkeit ist jedoch einerseits durch den Gefrierpunkt der Lösung und an dererseits durch die steigende Viskosität bei abnehmenden Temperaturen begrenzt.The traditional methods, an organ or a biological To supercool tissue using its vascular network by flowing through with a supercooled perfusion solution causes. The cooling as well as the cooling rate is however on the one hand by the freezing point of the solution and on on the other hand due to the increasing viscosity with decreasing Limited temperatures.

Mit dieser Methode der sogenannten "Kühlperfusion" kann das biologische Gewebe oder ein Organ nicht bis zum Gefrier punkt abgekühlt werden.With this method of so-called "cooling perfusion" this can be done biological tissue or an organ not to freeze point cooled.

Die klassische Methode, einem Körper seine Wärme und Schmelz wärme durch die Oberfläche zu entziehen, ist nur bei klein sten biologischen Substanzen wie Spermatozoen, Zellen, Haut teilen usw. so schnell möglich, daß die oben beschriebenen Effekte nicht auftreten. Bei räumlich größeren Gewebeteilen oder Organen wird die Abkühl- und Einfriergeschwindigkeit bei dem Wärmeentzug durch die Oberfläche mit zunehmender Größe geringer und erfüllt schon bei Abmessungen bis zu 1 mm nicht mehr die obigen Anforderungen.The classic method of giving a body its warmth and enamel Extracting heat through the surface is only small most biological substances such as spermatozoa, cells, skin share etc. as quickly as possible that the above Effects do not occur. With spatially larger tissue parts or organs becomes the rate of cooling and freezing with the removal of heat by the surface with increasing Size smaller and already meets dimensions up to 1 mm no longer meets the above requirements.

Aus der DE-AS 24 73 812 ist es bekannt, das zu konservie rende isolierte Organ zunächst mit einer Perfusionslösung blutfrei und anschließend mit Helium bei einem Druck von etwa 100 Torr wasserfrei zu spülen. Anschließend wird das isolierte Organ mit Helium bis auf etwa 50 Torr gefüllt, wobei dieser Druckwert entsprechend der Organstabilität ausgewählt wird. Das isolierte Organ, in diesem Falle eine Niere, wird verschlossen und dann in einen Behälter mit Stickstoff eingebracht und bei einem Überdruck von 2 atü gelagert. Der Behälter mit dem aufgenommenen Organ wird in flüssige Luft getaucht, so daß eine Lagertemperatur von unter -120°C erreicht wird. From DE-AS 24 73 812 it is known to conserve that isolated organ with a perfusion solution blood-free and then with helium at a pressure from about 100 Torr to rinse water-free. Subsequently the isolated organ is reduced to about 50 with helium Torr filled, this pressure value accordingly organ stability is selected. The isolated Organ, in this case a kidney, is closed and then placed in a container with nitrogen and stored at an overpressure of 2 atm. The container with the absorbed organ is in liquid air submerged so that a storage temperature of below -120 ° C is reached.

Mit diesem bekannten Verfahren kann ein für die Langzeit konservierung von Organen zwingend erforderliches schnel les Abkühlen nicht erreicht werden, da die Kühlwirkung der flüssigen Luft nur durch Konvektion innerhalb des Behäl ters zu dem Organ gelangen kann. Aus dem gleichen Grunde kann die dem Organ entzogene Wärme nur durch Konvektion über den einhüllenden Stickstoff entzogen werden.With this known method one can be used for the long term Preservation of organs is essential The cooling cannot be achieved because the cooling effect of the liquid air only by convection inside the container ters can get to the organ. For the same reason the heat extracted from the organ can only be obtained by convection withdrawn over the enveloping nitrogen.

Gemäß der DE-PS 22 41 698 wird zur Konservierung eines isolierten Organes dieses in einer flüssigen Perfusionslö sung gelagert. Diese Perfusionslösung kann mit Hilfe einer Perfusatpumpe intervallartig durch das Organ geleitet werden, wobei die Perfusatpumpe durch Kohlendioxidgas betrieben wird, welches aus dem als Kühlmittel eingesetz ten Trockeneis entsteht. Dieses Verfahren, bei dem im übrigen auch nicht der zeitliche Verlauf der Abkühlung geregelt werden kann, ist nur im Zusammenhang mit flüssigen Perfusionslösungen möglich und nur für eine hypothermische Kurzzeitlagerung des Organes bei Temperatu ren etwas über dem Gefrierpunkt der Perfusionslösung geeignet. Eine Absenkung der erzielbaren Kühltemperatur unter diesen Temperaturwert ist nicht möglich, da entweder das Perfusat gefriert oder schon vorher durch die größer werdende Viskosität der Perfusionslösung die Gefäße des zu konservierenden Organs zerstört werden. Bei diesem bekann ten Verfahren soll im wesentlichen eine bessere Handhabung beim Transport von Frischorganen erzielt werden, nicht jedoch eine optimale rasche Abkühlung und eine damit mögliche Langzeitkonservierung von Organen bzw. Geweben bei sehr tiefen Temperaturen.According to DE-PS 22 41 698 for the preservation of a isolated organ in a liquid perfusion solution solution stored. This perfusion solution can be done with the help of a Perfusate pump passed through the organ at intervals be, the perfusate pump by carbon dioxide gas is operated, which is used as a coolant dry ice is formed. This procedure, in which the chronological course of the cooling does not remain can only be regulated in connection with liquid perfusion solutions possible and only for one hypothermic short-term storage of the organ at temperatu or slightly above the freezing point of the perfusion solution suitable. A reduction in the achievable cooling temperature below this temperature value is not possible because either the perfusate freezes or already through the larger one increasing viscosity of the perfusion solution the vessels of the conserving organ are destroyed. With this, The main aim of the process is to improve handling not be achieved when transporting fresh organs however, an optimal rapid cooling and one with it possible long-term preservation of organs or tissues at very low temperatures.

In der DE-OS 19 38 275 ist ein ähnliches Verfahren zum Konservieren eines Organes mit Hilfe einer Perfusions methode angegeben. Auch für dieses Verfahren gelten ähnliche Überlegungen wie zu der DE-PS 22 41 698.
In DE-OS 19 38 275 a similar method for preserving an organ using a perfusion method is specified. Similar considerations apply to this method as to DE-PS 22 41 698.

Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, bei der Abkühlung von Organen bzw. Geweben eine schnelle Abkühlung bzw. einen schnellen Gefrierprozeß zu erreichen, wobei insbesondere der Kältetransport zu dem zu konservie renden Organ und der Wärmeabtransport von dem zu konser vierenden Organ verbessert werden sollen, um auf diese Weise eine stabile Langzeitlagerung des Organes bzw. Gewebes zu ermöglichen.The invention is therefore based on the object Cooling of organs or tissues means rapid cooling or to achieve a quick freezing process, in particular the cold transport to the to conserve organ and the heat dissipation from the consumer Fourth organ should be improved on this Way a stable long-term storage of the organ or To enable tissue.

Diese Aufgabe ist für ein Verfahren der in Rede stehenden Art durch die im kennzeich nenden Teil des Patentanspruchs 1 angegebenen Maßnahmen gelöst.This task is for a procedure of the type in question by the in the characteristic specified part of claim 1 Measures solved.

Bei dem zugrunde liegenden Verfahren wird anstelle der Per fusionslösung ein unterkühltes komprimiertes Gas (Helium) verwendet. Durch die Verwendung eines Gases entfallen die Probleme durch den zu hohen Gefrierpunkt der Perfusionslö sung und deren steigenden Viskosität bei sinkenden Tempera turen. Damit die Wärmetransporteigenschaften des persuff lierten Gases verbessert werden, wird dieses komprimiert.In the underlying process, instead of Per fusion solution a supercooled compressed gas (helium) used. The use of a gas eliminates the Problems due to the too high freezing point of the perfusion solution solution and its increasing viscosity as the temperature drops doors. So that the heat transport properties of the persuff gated gas are improved, this is compressed.

Ältere und neuere Forschungsergebnisse haben gezeigt, daß biologisches Gewebe bei Drucken bis zu 700 bar überlebt.Older and newer research has shown that biological tissue survives at pressures up to 700 bar.

Damit sich der Kompressionsdruck nicht auf die feinen Gefäß wände auswirkt, spielt sich das Verfahren in einem Autoklaven, in dem das biologische Objekt von allen Seiten von diesem Druck umgeben wird, ab. Der Durchströmungsdruck in den Ge fäßen wird unabhängig vom Umfelddruck innerhalb des Auto klaven durch ein kleines Gebläse erzeugt. Da Gas keine Transporteigenschaften für Nährstoffe hat, geht dem hier beschriebenen Verfahren eine Kühlperfusion mit einer Nährlösung voraus. Bei dieser Vorkühlung wird das Organ auf etwa 4 bis 7°C abgekühlt, so daß der Stoffwechsel hierbei auf einige Prozent gedrosselt ist. Die Persuffla tion mit unterkühltem Gas folgt jetzt unmittelbar.So that the compression pressure does not affect the fine vessel the process takes place in an autoclave, in which the biological object from all sides of this Pressure is surrounded. The flow pressure in the Ge capturing becomes independent of the ambient pressure inside the car slave generated by a small fan. Because gas has no transport properties for nutrients A cooling perfusion with a method described here Nutrient solution ahead. With this pre-cooling the organ cooled to about 4 to 7 ° C so that the metabolism is throttled to a few percent. The Persuffla tion with supercooled gas now follows immediately.

Im einzelnen spielt sich ein Unterkühlungsprozeß wie folgt ab: Aus dem Vorratsbehälter 14, Fig. 1, 2 für Perfusions lösung wird diese durch das hydrostatische Druckgefälle über das Funktionsventil 10 durch den Vorkühler 9 über das innere Funktionsventil 8 in die Gefäße eingeleitet. Bei der Niere wird über die Nierenschlagader das gesamte vaskuläre Netzwerk durchströmt. Die Perfusionslösung tritt dann aus der Nierenvene aus und wird durch das an der tiefsten Stelle des Autoklaven liegende Abflußventil 15 aus diesem entfernt. Das Widerstandselement 17 ist hierbei verschlossen. Beim Herzen wird hierzu analog die Lösung in die obere Hohlvene und die Lungenvene eingeleitet und tritt aus der Lungenarterie und der Aorta aus. Das Widerstandselement 5 gleicht die Druckver teilung aus, die aus den verschiedenen Innenwiderständen der linken und rechten Herzhälfte entstehen. Die Widerstände 6 und 7 dienen zum Aufbau eines Druckes, der alle Hohlräume insbesondere die Ventrikel in ihrer anatomisch richtigen Form hält. Nach Erreichen der Vorkühltemperatur wird das Funktionsventil 10 so geschaltet, daß das Gas aus dem Hochdruckbehälter 12 über das Reduzierventil 13 über den Druckregler 11 durch den Temperaturregler 9 in den Autoklaven einströmen kann und dort zu den Gefäßanschlüssen gelangt. Gleichzeitig wird der sich im Autoklaven befind liche Kühler 2 eingeschaltet. Nach diesem Trockenspülvor gang wird das Ventil 15 geschlossen, so daß sich jetzt der Innendruck von 500 bis 700 bar im Autoklaven aufbaut. Das Funktionsventil 8 trennt jetzt die Verbindung zur äußeren Gasleitung von den Orangen ab und schaltet die Eintritts leitung für das Organ direkt an das Gebläse 3. In detail, a supercooling process takes place as follows: From the reservoir 14 , Fig. 1, 2 for perfusion solution, this is initiated by the hydrostatic pressure drop through the function valve 10 through the precooler 9 through the inner function valve 8 into the vessels. In the kidney, the entire vascular network flows through the renal artery. The perfusion solution then emerges from the renal vein and is removed by the drain valve 15 located at the lowest point of the autoclave. The resistance element 17 is closed here. In the case of the heart, the solution is analogously introduced into the superior vena cava and pulmonary vein and emerges from the pulmonary artery and the aorta. The resistance element 5 compensates for the pressure distribution that arise from the various internal resistances of the left and right half of the heart. The resistors 6 and 7 serve to build up a pressure which keeps all cavities, in particular the ventricles, in their anatomically correct shape. After reaching the pre-cooling temperature, the functional valve 10 is switched so that the gas from the high-pressure container 12 can flow through the reducing valve 13 through the pressure regulator 11 through the temperature regulator 9 into the autoclave and reaches the vessel connections there. At the same time the cooler 2 located in the autoclave is switched on. After this dry flushing operation, the valve 15 is closed, so that the internal pressure of 500 to 700 bar is now built up in the autoclave. The function valve 8 now disconnects the connection to the outer gas line from the oranges and switches the inlet line for the organ directly to the blower 3 .

Dieser treibt das jetzt durch den Kühler 2 tiefgekühlte Gas durch das vaskuläre Netzwerk mit einem geringen Druck, der durch die Belastbarkeit der Gefäßwände gegeben ist. Um die optimale Unterkühlungsgeschwindigkeit zu erreichen, werden bei den Organen alle inneren und äußeren Flächen mit unterkühltem Gas beaufschlagt.This drives the now frozen gas through the cooler 2 through the vascular network at a low pressure, which is given by the resilience of the vessel walls. In order to achieve the optimal supercooling rate, all internal and external surfaces of the organs are exposed to supercooled gas.

Bei der Niere wird deshalb ein Druckgefälle Δ P 1 im vasku lären Netzwerk ein Druckgefälle Δ P 2 im Nephron und ein Druckgefälle Δ P 3 vom Nierenbecken zum Außenraum mit den Wi derstandselementen (16; 17 u. 18) erzeugt.In the kidney, therefore, a pressure drop Δ P 1 in the vascular network, a pressure drop Δ P 2 in the nephron and a pressure drop Δ P 3 from the kidney pool to the outside with the resistance elements ( 16; 17 and 18 ) are generated.

Durch die hier als Bypass wirkende Unterkanäle 19 wird über das Widerstandselement 17 das Nierenbecken zusätzlich beaufschlagt und zwar so, daß das Druckgefälle Δ P 1 = Δ P 2 + Δ P 3 bleibt.Due to the subchannels 19 acting here as a bypass, the kidney pelvis is additionally acted upon via the resistance element 17 in such a way that the pressure drop Δ P 1 = Δ P 2 + Δ P 3 remains.

Die äußere Oberfläche der Niere wird durch Konvektion durch den an die Form der Niere angepaßten Kühler 2 gekühlt.The outer surface of the kidney is cooled by convection through the cooler 2 which is adapted to the shape of the kidney.

Beim Herzen ist der Vorgang analog. Das Druckgefälle zur Er haltung der natürlichen anatomischen Form wird durch die Widerstandselemente 6 und 7 erzeugt, während das Widerstands element 4 die verschiedenen Strömungswiderstände der linken und rechten Herzkammer ausgleicht.The process is analogous for the heart. The pressure drop to maintain the natural anatomical shape is generated by the resistance elements 6 and 7 , while the resistance element 4 compensates for the different flow resistances of the left and right ventricles.

In Fig. 3 ist eine Variante dieses Verfahrens dargestellt und wird für den Fall angewendet, bei dem das biologische Gewebe keine für eine Persufflation geeigneten Gefäße besitzt.A variant of this method is shown in FIG. 3 and is used for the case in which the biological tissue has no vessels suitable for persufflation.

Hier wird das dünne, flächige Gewebeelement (21) an seinen Ober flächen (über Kanäle 22, 24, 25) sowie durch eine Direktdurchflutung (über Kammer 23 und Kanal 22) gekühlt. Wegen der feinen atomaren Struktur des Heliumgases ist dieses in der Lage, das biologische Gewebe bis zu einigen mm Dicke direkt zu durchströmen und auch subzelluläre Bereiche zu durchdringen.Here, the thin, flat fabric element ( 21 ) is cooled on its upper surfaces (via channels 22, 24, 25 ) and by direct flooding (via chamber 23 and channel 22 ). Because of the fine atomic structure of the helium gas, it is able to flow directly through the biological tissue up to a few mm thick and also to penetrate sub-cellular areas.

Claims

1. A method for preserving isolated organs or tissues, the organ or tissue being pre-cooled by cooling perfusion with a nutrient solution, rinsed dry with helium and cooled in an autoclave, characterized in that precooling and rinsing take place in the autoclave, followed by helium in the autoclave an internal pressure of 500 to 700 bar is built up, the helium is deep-frozen by a cooler inside the autoclave and at the same time circulated with a blower to flow around and through the organ or tissue.

2. The method according to claim 1, characterized in that the cooled one for cooling flat tissue samples compressed helium on the bottom and top of the tissues sample is passed, and that to maintain a flow of compressed helium through the tissues sample between the two sides of the tissue sample Pressure drop is generated.