DE3111593C2

DE3111593C2 - 3-Desoxy-3-[3-(2-chloräthyl)-3-nitrosoureido]-D-allopyranose, Verfahren zu ihrer Herstellung und diese Verbindung enthaltende Antitumormittel

Info

Publication number: DE3111593C2
Application number: DE3111593A
Authority: DE
Inventors: Kenichi Kamakura Kanagawa Edanami; Toshio Sagamihara Kanagawa Kuroda; Masahide Yokohama Kanagawa Yamada
Original assignee: WAKAMOTO PHARMACEUTICAL CO Ltd TOKYO JP
Current assignee: WAKAMOTO PHARMACEUTICAL CO Ltd TOKYO JP
Priority date: 1980-03-24
Filing date: 1981-03-24
Publication date: 1982-12-09
Also published as: JPS56158797A; JPS5940400B2; US4349546A; DE3111593A1; DE3152632C2

Description

OH
NH-C-N-CH₂CH₂Cl

Il I

O NO

10

2. Verfahren zur Herstellung der Verbindung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man in an sich bekannter Weise die Verbindung der Formel II

15

(II)

NH-C-NHCH₂CH₂Cl

20

25

30

35

mit einem Nitrosierungsmittel in Gegenwart einer Säure umsetzt.

3. Antitumormittel, gekennzeichnet durch einen Gehalt an der Verbindung gemäß Anspruch 1.

45

Es ist bekannt, daß zahlreiche Nitrosoharnstoff-Derivate antitumorale Wirkung zeigen. So sind beispielsweise 1 -(2-Chloräthyl)-2-(methylcyclohexyl)-1 -nitrosoharnstoff (Me-CCNU), t,3-bis-(2-Chloräthyl)-l-nitrosoharnstoff (BCNU) und l-^-ChloräthylJO-cydohexyl-i- so nitrosoharnstoff (CCNU) gegen Hirntumoren, Melanome, Lymphome im Frühstadium wirksam.

Weiter sind zahlreiche Verbindungen, wie Streptozotocin (J. Amer. Chem. Soc, (1967), Bd. 89, S. 4808), Chlorozotozin (J. Med. Chem., (1975) Bd. 18 (1), S. 104 und Glycopyranosidamin-Derivate (JP-OS 144 319/ 1979) als Zucker-Nitrosoharnstoff-Derivate mit antitumoraler Wirkung beschrieben.

Aus Chem. Abstracts, Bd. 92 (1980), 147 144 ist 3-[3-(2-Chloräthyl)-3-nitrosoureido]-3-desoxy- D-glucose als antikarzinogener Wirkstoff bekannt. Aus der DE-AS 25 35 048 sind 1-(2-Chloräthyl)-l-nitroso-3-glycosyl-harnstoffe bekannt. Glycosyl kann dabei unter anderem auch einen Allosylrest bedeuten. Ein konkretes Allosederivat ist aber nicht beschrieben. Bei sämtlichen, in dieser DE-AS konkret beschriebenen Verbindungen erfolgt die Verknüpfung des Glycosylrests in der 1 -Stellung (vgl. auch die Formel in Spalte 6, Zeile 65).

Die nachstehenden Vergleichsversuche 1 und 2 zeigen, daß die beanspruchte Verbindung in ihrer Antitumorwirkung zahlreichen bekannten Verbindungen, darunter auch den Verbindungen der beiden letztgenannten Dmckschriften, überlegen ist

Aufgabe der Erfindung ist es, eine neue Verbindung zur Verfügung zu stellen, die mit großer Sicherheit für normale Zellen eine hohe antitumorale Wirkung entfalten. Diese Aufgabe wird durch die Erfindung gelöst

Die Erfindung betrifft somit den in den Ansprüchen gekennzeichneten Gegenstand.

Beispiele für Nitrosierungsmittel sind Alkalimetallnitrite, wie Natriumnitrit und Kaliumnitrit, niedere Ester der salpetrigen Säure, wie Amylnitrit und Butylnitril, Distickstofftrioxid und Stickstofftetroxid. Bevorzugt sind Natriumnitrit und Kaliumnitrit.

Die Menge des eingesetzten Nitrosierungsmittels liegt bei 1 bis 5 Mol, vorzugsweise 1,1 bis 1,5 Mol pro Mol Verbindung der Formel II.

Beispiele für im erfindungsgemäßen Verfahren geeignete Säuren sind anorganische und organische Säuren, wie Trifluoressigsäure, Essigsäure, Ameisensäure und Chlorwasserstoffsäure. Bevorzugt ist Trifluoressigsäure.

Die Umsetzung erfolgt vorzugsweise bei einem pH-Wert von 1 bis 3. Bei Verwendung einer anorganischen Säure erfolgt die Reaktion jedoch vorzugsweise in einem Zweiphasensystem von Diäthyläther/Wasser oder Chloroform/Wasser. Die Reaktionstemperatur beträgt 0 bis 5°C, vorzugsweise etwa 2°C.

Die Reaktionszeit und der Reaktionsdruck sind nicht kritisch. Im allgemeinen erfolgt die Umsetzung innerhalb '/2 bis 1 Stunde unter atmosphärischem Druck.

Die Aufarbeitung des erhaltenen Produkts erfolgt auf übliche Weise durch Konzentrieren bei 20 bis 40, vorzugsweise 25 bis 3O⁰C. Zut Entfernung des Salzes folgt anschließend eine Behandlung mit einem lonenaustauscherharz, wie einem stark sauren Harz, beispielsweise Amberlite®lR 120(H®).

Die Reinigung erfolgt beispielsweise durch Chromatographie an Silicagel (WAKO®C-300) in an sich bekannter Weise.

Die Ausgangsverbindung der Formel Il kann durch Umsetzung von 3-Amino-3-desoxy-l,2,5,6-di-0-isopropyliden-«-D-allofuranose (vgl. Carbohydr. Rev., Bd., 6 (1968), S. 276) mit Chloräthylisocyanat hergestellt werden.

Die Verbindung der Formel 1 ist sicherer in der Anwendung als übliche Antitumormutel und ist insbesondere wirksam gegen Leukämie, Lewis-Lungenkarzinom und Melanom. Sie ist ein besonders sicheres Antitumormittel, da sie eine weit geringere Myelotoxizität zeigt als die bekannte Verbindung l-(2-Chloräthyl)-2-(4-methylcyclohexyl)-l -nitrosoharnstoff (Me-

CCNU). Das erfindungsgemäße Cytostatikum kann in üblicher Weise, beispielsweise peroral, intraperitoneal oder intravenös, verabreicht werden.

Es kann direkt oder als Gemisch mit pharmazeutisch üblichen Trägern und Hilfsstoffen zu den verschiedensten Präparaten, wie Tabletten, Pillen, Granulat, Puder, Kapseln, Sirupen und Injektionslösungen konfektioniert werden.

Die erfindungsgemäßen Antitumormittel eignen sich besonders zu Injektionspräparaten, da sie in Wasser löslich sind und Wasser aufgrund seiner niedrigen Toxizität gegenüber Lebewesen ein bevorzugtes Verdünnungsmittel ist.

IO

Für die Konfektionierung geeigneter Träger sind Polyvinylpyrrolidin, Natriumchondroitinsulfat, Gelatine, menschliches Serumalbumin, Dextran T-JO, Calciumgluconat, Calciumpantothenat, Calciumlactat, ^-Cyclodextrin, Lactose, Stärke, Magnesiumstearat, Talkum, pflanzliche öle. Carboxymethylcellulose, Propylenglykol, Hydroxypropylcellulose, Citronensäure, Natriumhydrogenphosphat. Mannit und Polyvinylalkohol.

Die Beispiele erläutern die Erfindung.

Beispiel 1

2,0 g 3-[3-(2-Chlorätbyl)-ureido]-3-desoxy-1,2,5,6-di-O-isopropyliden-a-D-allofuranose werden in 20 ml 85prozentige Trifluoressigsäure gelöst und auf 0 bis 5° C abgekühlt. Anschließend wird die Lösung mit 0,5 g Natriumnitrit versetzt und 1 Stunde gerührt Dann wird die Lösung bei Raumtemperatur unter vermindertem Druck konzentriert. Der ölige Rückstand wird in wenig Wasser gelöst und die Lösung durch eine mit Amberlite^eIR 120 (H®)-Harz gefüllten Säule gegeben. Anschließend wird mit Wasser eluiert, das dann unter vermindertem Druck konzentriert wird, wobei die Temperatur nicht mehr als 40° C betragen soll. Der ölige Rückstand wird in wenig Methanol gelöst und an 0,5 g Silicagel (WAKO®C-300) adsorbiert. Das Silicagel wird auf eine mit Silicagel gefüllte Säule aufgesetzt und mit einem Gemisch von Chloroform und Methanol im Volumenverhältnis 9 :1 eluiert. Das Eluat wird unter vermindertem Druck bei einer Temperatur von nicht mehr als 40° C konzentriert. Der Rückstand wird unter vermindertem Druck getrocknet. Es werden 0,5 g 3-[3-(2-Chloräthyl)-3-nitrosoureido]-desoxy- D-allose als hellgelbes Pulver erhalten (Ausbeute 31,3% d. Th.).

F.56bis59°C(Zers.)

[«] » + 20° (C= 1,09 CH₃OH).

Elementaranalyse für C₉Hi₆N₃O₇CI:
Ben: C 34,46 H 5,14 N 13,40%
gef.: C 34,25 H 5,03 N 13,12%

IR-Spektrum (KBr)

35 IR-Spektruim (KBr)
3390cm-'(v_N__H)
1690cm-'(*te-o)

NMR-Spektrum (CDCI₃-TMS)
OUO, 1,43.130(12 H.s χ 3,CH₃)
03,57(4H₁S₁CH₂₁CH₂Cl)
04,55(1 H₁ t,Ju = J_2J=4 Hz.H₂)
(55.50(1 H,d,J = 7Hz,NH)
05,75(1 H,d,Ju=4Hz,H,)
05,75(1 H, NH).

Die folgenden Tierversuche zeigen die antitumorale Wirkungen von 3-[3-(2-Chloräthyl)-3-nitrosoureido]-3-desoxy-D-allose(im folgenden kurzCNUA bezeichnet).

Versuch 1
Antileukämietest

a) Versuchstiere:

Etwa 6 Wochen alte CDF-Mäuse mit einem Gewicht von je 22 ± 1 g, wobei eine Versuchsgruppe aus 7 männlichen Mäusen besteht.

b) Versuchsmethode:

Je IxIO⁵ Leukämie L-1210-Zellen werden jeder Maus in das Abdomen implantiert. Nach 24 Stunden wird eine bestimmte Menge CNUA, in isotonischer Natriumchloridlösung gelöst, der Maus intraperitoneal, intravenös bzw. peroral verabreicht. Nach 60 Tagen werden die prozentuale Erhöhung der Lebensdauer und die Anzahl der überlebenden Tiere festgestellt.

c) Versuchsergebnisse:

Die Versuchsergebnisse sind in Tabelle I zusammengefaßt.

40

15OOcm-'(vN-o)

NMR-Spektrum (CH₃OD-TMS)
04,10(2 H, t, J = 6 Hz, N-CH₂-)
05,10(4/5 H,d,J,j = 6 Hz,J3-H,)
05,27(1/5 H,d,J_l.2 = 4Hz,a-H,)
08,50(1 H,d,J₃NM =9 Hz, NH)

Herstellung der Ausgangsverbindung

Tabelle I

45

50

Eine Lösung von 3,0 g S-oy^AediO isopropyliden-«-D-allofuranose in 50 ml wasserfreiem Aceton wird auf 0 bis 5° C abgekühlt und unter Rühren mit 2,0 ml 2-Chloräthylisocyanat versetzt. Nach weiterem einstündigem Rühren wird das Gemisch unter vermindertem Druck eingedampft. Der ölige Rückstand wird mit Diäthyläther digeriert und die gebildeten Kristalle abfiltriert. Nach dem Umkristallisieren werden 3,07 g 3-[3-(2-Chloräthyl)-ureido]-3-desoxy-l,2,5,6-di-O-isopropyliden-a-D-allofuranose erhalten (Ausbeute· 61%d.Th.).

F.: 157 bis 158,5° C

[*]» +40⁰CC=I₁CHCI₃)

65

Elementaranalyse für Ci

Ber.: C 49,38 H 6,91 N 7,68%
gef.: C 49,51 H 6,98 N 7,49%

Dosis	Verab	1-3	ILSb)	Zahl der
	reichungs-	-3		überlebenden
(mg/kg/Tag;i	art a)	-3	(%)	Tiere c)
11,3	ip, Tag	1-3	86	1/7
22,5	ip, Tag		157	3/7
45	ip, Tag		>757	7/7
60	ip, Tag	iv, Tag 1	>757	4/7
11,3	ip, Tag	iv, Tag 1	143	1/7
22,5	ip, Tag	iv, Tag 1	>757	5/7
45	ip, Tag	po, Tag 1	>757	5/7
60	ip, Tag	po, Tag 1	>757	4/7
5	iv, Tag	po, Tag 1	29	0/7
10	iv, Tag	po, Tag	43	0/7
20			86	1/7
40		>757	4/7
50		400	2/7
100		86	0/7
200	100	3/7
300	100	2/7
400	57	2/7

a) ip: = intraperitoneal

iv: = intravenös

po: = peroral

Tag 1: Der Wirkstoff CNUA wird 1 Tag, d. h. 24 Stunden nach der Implantation, von L-1210 verabfolgt Tag 1-3: Der Wirkstoff wird einmal täglich innerhalb von drei aufeinanderfolgenden Tagen verabtolgt.

b) ILS:

ILS

Die prozentuale Erhöhung der Überlebensdauer wird nach folgender Gleichung berechnet:

Durchschnittszahl der Überlebenstage - Durchschnittszahl der Überlebenstage in der behandelten Gnippe in der Kontrollgruppe

X JOO

Durchschnittszahl der Überlebenstage in der KontroUgruppe c) Zahl der überlebenden Tiere ist gleich die Anzahl Mäuse, die 60 Tage oder länger in der Gruppe überlebten.

Versuch 2	a) Versuchstiere:	20	Tabelle IH	Verab	ILS	Zahl	neun aufeinanderfolgenden
Antileukämietest	siehe Versuch i.			reichungs-		der über
	b) Versuchsmethode:		Dosis	art		lebenden
je einmal 10⁵ Leukämie P-388 Zellen werden in das Abdomen jeder Maus implantiert. Nach 24 Stunden				(%)	Tiere
wird eine bestimmte Menge CNUA als isotonische
Natriumchloridlösung jeder Maus verabfolgt. Es	25	mg/kg/Tag	ip, Tag 1		(1/7	Versuch 4
werden die prozentuale Erhöhung der Überlebens			ip, Tag 1		\JI I
dauer und die Anzahl der überlebenden Tiere nach			ip, Tag 1	ύ	0/7
60 Tagen festgestellt.			ip, Tag 1	68	2/7
c) Versuchsergebnisse:		10		>172	6/7
Die Versuchsergebnisse sind in Tabelle Π zusam	.JO	20	ip,Tag 1-9*)
mengefaßt.		40	ip,Tag 1-9*)	4	0/7
Tabelle II			ip,Tag 1-9*)	21	1/7
Dosis ILS Zahl der		2,23	iv, Tag 1	29	0/7
(mg/kg/Tag) (%) überlebenden	J5	4,45	iv, Tag 1	35	0/7
Tiere		6,67	iv, Tag 1	80	1/7
3,75 50 0/7		15	iv, Tag 1	>200	6/7
7,5 90 0/7	JA	30		>200	5/7
15 240 3/7	4 \)	40			bedeutet die kontinuierliche Gabe des Wirk-
30 >500 5/7		50		Stoffs einmal täglich während
45 >500 7/7		*) »Tag 1-9«	Tagen, beginnend am Tag 1.
60 >500 6/7	45

Versuch 3

	50

Untersuchung der therapeutischen Wirkung
auf Lewis-Lungenkarzinome

a) Versuchstiere:

Etwa 6 Wochen alte BDF-Mäuse mit einem Körpergewicht von 22±lg, in Gruppen von 7 männlichen Mäusen.

b) Versuchsmethode:

je 5xlO⁵ Lewis-Lungenkarzinomzellen werden jeder Maus unter die Haut implantiert. Nach 24 &o Stunden wird eine bestimmte Menge CNUA jeder Maus intraperitoneal bzw. peroral verabfolgt. Nach 60 Tagen werden die prozentuale Erhöhung der Überlebensdauer und die Anzahl der überlebenden Tiere bestimmt.

c) Versuchsergebnissc:

Die Versuchsergebnisse sind in Tabelle III zusammengefaßt.

Untersuchung der therapeutischen Wirkung
am Melanom

a) Versuchstiere:

6 Wochen alte BDF-Mäuse mit einem Körpergewicht von 22 ± 1 g, in Gruppen von je 7 männlichen Mäusen

b) Versuchsmethode:

Je 5 χ 10⁵ ß-16 Melanomzellen werden jeder Maus unter die Haut implantiert. Nach 24 Stunden wird eine bestimmte Menge CNUA intraperitoneal bzw. peroral verabreicht. Nach 60 Tagen werden die prozentuale Erhöhung der Überlebensdauer und die Anzahl der überlebenden Tiere festgestellt.

c) Versuchsergebnisse:

Die Versucnsersrebnisse sind in Tabelle IV zusam-

	31 11 593	ILS	5	Zahl der über lebenden Tiere
Tabelle IV		0		0/7
Dosis mg/ kg/Tag	Verab reichungs- art	16		0/7
5	Tag 1, ip	48	1/7
10	Tag 1, ip	60	2/7
20	Tag 1, ip	10	0/7
40	Tag 1, ip	25	0/7
1,12	Tag 1-9, ip	30	0/7
2,23"	Tag 1-9, ip	35	0/7
4,45	Tag 1 -9, ip	65	1/7
6,67	Tag 1—9, ip	155	1/7
20	Tag 1, iv	35	0/7
40	Tag 1, iv
60	Tag 1, iv
	Versuch

a) Versuchstiere:

100 mg/kg Äthylnitrosoharnstoff werden trächtigen DDY-Mäusen intraperitoneal 3 bis 4 Tage vor der Ankunft des Wurfs verabreicht. Nach der Geburt werden die mit einem Lungen-Aulotumor geborenen Mäuse als Versuchstiere in Gruppen von je 10 Mäusen verwendet.

b) Versuchsmethoden:

c)

Vier Wochen nach der Geburt wird eine bestimmte Menge CNUA intravenös bzw. peroral zu bestimmten Zeiten verabfolgt. Nach 9 Wochen wird der Bereich des Tumors bei jeder Maus gemessen und die prozentuale Hemmung berechnet.
Versuchsergebnisse:

Die Versuchsergebnisse sind in der Tabelle V-I zusammengefaßt.

Tabelle V-I	Zeitpunkt der	Dosis	Bereich des	Prozen
Ver	Verabreichung		Tumors	tuale
abrei	(Wochen nach			Hemmung
cht) ngs-	der Geburt)	(mg/kg)	(mm²±S.E.)
art		Kontrolle	1,45 ±0,30
	5,6	40X2	0,75±0,22^x)	49,2
	5,7	40X2	0,79 ± 0,3 l^x)	46,5
iv	5	40X1	0,91±0,81^xx)	37,2
		Kontrolle	1,41 ±0,44
	5, 6, 7, 8	133X4	0,78±0,22^x)	44,7
po		200X4	0,78±0,16^x)	44,7
		267X4	0,55±0,iS^x)	όί,ΰ
		333X4	0,66±0,14^x)	53,2

^x) ρ < 0,01.
^xx) ρ < 0,05.

Aus den vorstehenden Ergebnissen ist ersichtlich,daß 60 Lungen-Autotumor zeigt, in dem sie das Leben der

die erfindungsgemäße Verbindung CNUA eine starke Warmblüter mit derartigen Tumoren verlängert oder

antitumorale Wirkung gegenüber Leukämie L-1210, die Proliferation von Tumorzellen hemmt P-388, Lewis-Lungenkarzinom, /J-lö Meianom und

Toxizitätsbestimmung

Eine isotonische Lösung von CNUA in wäßrigem intravenös bzw. peroral verabreicht; die LDso-Wene

Natriumchlorid wird männlichen DDY-Mäusen mit sind in der Tabelle V-2 zusammengefaßt, einem Gewicht von je 20 bis 22,5 g intraperitoneal,

Tabelle	31 V-2	1	1	593	LD₅₀ (mg/kg)
Verab reichungsart			65,5 80 550
ip iv po

Vergleichsversuch 1

Es wird die Wirkung von CNUA und l-(2-ChloräthylJ-S-itrans^-methylcyclohexylJ-l-niirosoharnstoff (Me—CCNU) durch Zählung der peripheren Leukozyten untersucht,
a) Testtiere:

6 Wochen alte DDY-Mäuse mit einem Körpergewicht von je 22 ± 1 g, in Gruppen von 5 männlichen Mäusen.

b) Versuchsmethode:

CNUA und Me-CCNU werden am ersten Tag intraperitoneal verabfolgt. Anschließend wird der Schwanzvene in bestimmten Zeitabständen Blut entnommen, um die Leukozyten zu zählen. Die Ergebnisse sind in Tabelle VI zusammengefaßt. Der Wirkstoff wurde als isotonische Natriumchloridlösung verabreicht.

Tabelle VI

Periphere Leukozyten, gezählt nach der ip-Abgabe (%, basierend auf Kontrollversuch)

Verbindung	mg/kg	2. Tag	4. Tag	7. Tag	10. Tag	14. Tag
/-XIII A	30	84,0	82,2	85,6	84,7	159
	60	78,2	60,0	64,5	80,0	100
Me-CCNU	20 40	55,0 56,0	53,3 36,5	50,2 34,0	59,5 40,7	145 78,1

Wie die vorstehenden Ergebnisse zeigen, ist die b) Myelotoxizität von CNUA geringer als die von Me-CCNU.

Vergleichsversuch 2

Es wird die Wirkung von CNUA mit der von 3-[3-(2-Chloräthyl)-3-nitrosoureido]-3-desoxy-D-glucose (3-CNUG) und von 2-[3-(2-Chloräthyl)-3-nitrosoureidoj-2-desoxy-D-glucose (2-CNUG) verglichen. c)

a) Testtiere:

Mäuse vom DDY-Stamm mit einem Körpergewicht von 20 bis 22,5 g in Gruppen von 7 Tieren.

Tabelle VII

Versuchsmethode:

Jedes Versuchstier erhält eine intraabdominale Implantation von 1 χ 10⁵ Leukämie L-12 10-Zellen. 24 Stunden später wird eine bestimmte Menge der zu untersuchenden Verbindung als wäßrige Lösung peroral verabreicht. Nach 60 Tagen werden die prozentuale Erhöhung der Überlebensdauer (ILS) und die Anzahl der überlebenden Tiere ermittelt. Ergebnisse:

Die Ergebnisse sind in Tabelle VIl zusammengefaßt.

Verbindung

Dosis

(mg/kg)

Durchschnittliche Anzahl der Überlebens tage

Anzahl der

überlebenden

Tiere

CNUA	50	12	50
	75	14	75
	100	14	75
	150	34	325
	200	60	650
	300	60	650
•3-CNUG	100	11	38
	200	11	38
•♦2-CNUG	100	8	0
	200	9	13
Kontrolle	_	8	0

•3-CNUG: 3-[3-(2-ChIoräthyl)-3-nitrosoureido]-3-desoxy-D-glucose. •*2-CNUG: 2-[3-(2-Chloräthyl)-3-nitrosoureido]-2-desoxy-D-glucose.

0
0
1
3
6
5
1
0
0
0
0

Claims

Patentansprüche:

1. 3-Desoxy-3-[3-(2-chloräthyl)-3-nitrosoureido]-D-allopyranose der Formel I

HO

OH (I)