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DE3026044A1 - PARENTERAL VACCINE FOR CATTLE AGAINST INFECTIOUS CATTLE RHINOTRACHEITIS - Google Patents

PARENTERAL VACCINE FOR CATTLE AGAINST INFECTIOUS CATTLE RHINOTRACHEITIS

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Publication number
DE3026044A1
DE3026044A1 DE19803026044 DE3026044A DE3026044A1 DE 3026044 A1 DE3026044 A1 DE 3026044A1 DE 19803026044 DE19803026044 DE 19803026044 DE 3026044 A DE3026044 A DE 3026044A DE 3026044 A1 DE3026044 A1 DE 3026044A1
Authority
DE
Germany
Prior art keywords
ibr
virus
vaccine
aqueous solution
cattle
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
DE19803026044
Other languages
German (de)
Inventor
Harold Wayne Dr Med Lupton
David Ellsworth Prof Reed
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
University of Iowa Research Foundation UIRF
Original Assignee
University of Iowa Research Foundation UIRF
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by University of Iowa Research Foundation UIRF filed Critical University of Iowa Research Foundation UIRF
Publication of DE3026044A1 publication Critical patent/DE3026044A1/en
Withdrawn legal-status Critical Current

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Description

Die Erfindung betrifft einen Impfstoff für infektiöse Rinderrhinotracheitis (IBR), der durch Extraktion mit einem nichtionischen Detergens aus mit IBR-Virus infizierten Zellen isoliert wird. Das extrahierte, virale Umhüllungsprotein kann in injizierbarer Dosisform durch Vermischen mit einem Ölartigen Adjuvans zubereitet werden. Der Impfstoff ergibt einen hohen Gehalt an Antikörper-Ansprechen und mit ihm kann man das Verbreiten des Virus von infizierten Tieren nach der Immunisierung vermeiden.The invention relates to a vaccine for infectious bovine rhinotracheitis (IBR) obtained by extraction with a nonionic detergent from cells infected with IBR virus is isolated. The extracted viral envelope protein can be mixed into injectable dosage form be prepared with an oily adjuvant. The vaccine gives a high level of antibody responses and with it one can spread the virus from infected ones Avoid animals after immunization.

Die infektiöse Rinderrhinotracheitis (IBR) wurde erstmals als differenzierte Krankheit von Vieh und insbesondere Rindvieh während der 50er Jahre erkannt. In Übereinstimmung mit den Eigenschaften anderer Herpes-Viren vermehrt sich das IBR-Virus (IBRV) innerhalb eines großen Bereichs von Zellarten und ergibt verschiedene Krankheitsmanifestationen, die u.a. Krankheiten des Atemtrakts, Konjunktivitis, Vulvoyaginitis, Fehlgeburten, Balanoposthitis, Meningoencephalitis, Krankheiten des Verdauungstraktes und tödliche systemische Infektionen verursachen. IBR ist jedoch hauptsächlich als Krankheit des Atemtrakts bekannt, die sich durch Tracheitis, Rhinitis und Fieber auszeichnet. IBR-Infektion ist die häufigste, diagnostizitierte Ursache von Fehlgeburten bei trächtigen Rindern; vergl. Kirkbride et al., J.Am. Vet.Med.Assoc, 162, 556-560 (1973). Das Virus wird leicht übertragen und ist auf der ganzen Welt verbreitet. Einige Rinder entwickeln eine latente Infektion, die reaktiviert werden kann.Infectious bovine rhinotracheitis (IBR) was first recognized as a differentiated disease of livestock and, in particular, cattle recognized during the 50's. In accordance with the properties of other herpes viruses, it multiplies the IBR virus (IBRV) within a wide range of cell types and gives rise to various manifestations of disease, diseases of the respiratory tract, conjunctivitis, vulvoyaginitis, Miscarriages, balanoposthitis, meningoencephalitis, Cause digestive tract diseases and fatal systemic infections. However, IBR is primary known as a respiratory tract disease characterized by tracheitis, rhinitis, and fever. IBR infection is the most common diagnosed cause of miscarriage in pregnant cattle; See Kirkbride et al., J. Am. Vet. Med. Assoc, 162, 556-560 (1973). The virus is easily transmitted and spread around the world. Some Cattle develop a latent infection that can be reactivated.

Die Kontrolle von IBR basiert hauptsächlich auf der Impfung, und eine Anzahl unterschiedlicher Arten von IBR-Impfstofffen wurde entwickelt; vergl. Kahrs, J.Am.Vet.Med.Assoc., 171, 1055-1060(1977). Diese umfassen parenterale und intranasale Impfstoffe, die beide lebende, abgeschwächte IBRV ausnutzen. Die parenteralen Impfstoffe, die normalerweiseThe control of IBR is mainly based on vaccination, and a number of different types of IBR vaccine monkeys was developed; see Kahrs, J.Am.Vet.Med.Assoc., 171, 1055-1060 (1977). These include parenteral and intranasal vaccines, both of which are live, attenuated IBRV exploit. The parenteral vaccines that normally

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intramuskulär verabreicht werden, können eine Fehlgeburt bei trächtigen Rindern verursachen und sind daher bei trächtigem Rindvieh kontraindiziert. Weiter kann die Impfung von säugenden Kälbern, die trächtige Rinder benutzen, eine Fehlgeburt, bedingt durch das Ausbreiten des Virus durch die geimpften Kälber, bewirken. Intranasale Impfstoffe sind in dieser Hinsicht sicherer und ergeben humorale Antikörper bei Titern, die mit denen der intramuskulären Impfstoffe vergleichbar sind. Bei der Verabreichung intranasaler Impfstoffe treten jedoch Schwierigkeiten auf. Der Kopf muß festgehalten oder befestigt werden, und man muß sorgfältig darauf achten, daß der Impfstoff tief in beide Nasenlöcher verabreicht wird. Die geimpften Tiere besitzen weiterhin die Neigung, den Impfstoff herauszublasen, wenn sie nach der Impfung schnaufen.given intramuscularly can cause miscarriage in pregnant cattle and are therefore in pregnant cattle Cattle contraindicated. Further, vaccination of lactating calves using pregnant cattle can be one Cause miscarriage due to the spread of the virus through the vaccinated calves. Intranasal vaccines are safer in this regard and give humoral antibodies at titers equal to those of the intramuscular vaccines are comparable. However, there are difficulties in administering intranasal vaccines. The head must restrained or fastened, and care must be taken to keep the vaccine deep in both nostrils is administered. The vaccinated animals continue to have a tendency to blow out the vaccine when after puffing after the vaccination.

Der Grad der Wirksamkeit der bekannten Impfstoffe ist variabel und die Dauer des Schutzes beschränkt» Man nimmt im allgemeinen an, daß die intramuskuläre Impfung einen besseren Schutz während längerer Dauer ergibt als die intranasale Impfung. Bei der intranasalen Impfung verlangt die übliche Praxis eine jährliche Wiederimpfung, während nur eine gelegentliche Wiederimpfung bei den intramuskulären Impfstoffen empfohlen wird. Es wurden weiterhin inaktivierte IBR-Impfstoffe entwickelt, aber hinsichtlich ihrer Wirksamkeit gibt es Widersprüchlichkeiten. Die jährliche Wiederimpfung wird empfohlen. Weitere Nachteile des inaktivierten Impfstoffes sind die Gefahr einer tödlichen Hyperempfindlichkeitsreaktion (Anaphylaxe) und die nicht tödliche Urticaria.The degree of effectiveness of the known vaccines is variable and the duration of protection limited »It is generally assumed that intramuscular vaccination is one gives better protection for longer periods than intranasal vaccination. In the case of intranasal vaccination, the common practice an annual revaccination while only occasional revaccination is recommended with the intramuscular vaccines. There were still inactivated IBR vaccines developed, but in terms of their effectiveness there are contradictions. Annual re-vaccination is recommended. Other disadvantages of the inactivated Vaccine are at risk of fatal hypersensitivity reaction (Anaphylaxis) and the non-fatal urticaria.

In der Vergangenheit wurden keine Subeinheits-IBR-Impfstoffe beschrieben. Es wurde jedoch ein Subeinheits-Versuch bei der Herstellung einiger anderer Virusimpfstoffe geprüft; vergl. Rubin et al., Progr. Med.Virol., 21, 144-157 (1975).There have been no subunit IBR vaccines in the past described. However, a subunit trial in the manufacture of some other viral vaccines has been considered; See Rubin et al., Progr. Med. Virol., 21, 144-157 (1975).

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Cappel berichtet über Versuche mit einem Subeinheits-Impfstoff von Herpes simplex-Virus bei Kaninchen; vergl. Arch. Virol. 52, 29-35 (1976). Es wurde gefunden, daß der Subeinheits-Impfstoff so wirksam ist, wie die Immunisierung mit lebenden oder UV-inaktivierten Herpes simplex-Viren. Ähnlich berichten Cox et al. Über Versuche mit einem Subeinheits-Impfstoff für Menschenbabies; vergl. Infect, and Immun., 16, 753-754 (1977). Sowohl Cappel als auch Cox et al. arbeiten mit Extrakten von nichtionischen Detergentien der Viren, da es bekannt ist, daß nichtionische Detergentien Umhüllungsglokoproteine der Viren solubilisieren können; vergl. Helenius et al., Solubilization of Membranes by Detergents, Bioehem. et Birphys.Acta, 415, 29-79 (1975). Sokal gibt jedoch als allgemeine Regel ah, daß Subeinheits-Impfstoffe,die lösliche Antigene enthalten, eine spezifische Immunogenizität oder eine φezifische Schutzwirkung ergeben, die wesentlich geringer ist als die der Virionvakzine; vergl. Sokal,Vaccines of the Future: Immunogenicity of Viral Components, Kapitel 9, Seiten 129-135» in Viruses and Immunity, Koproski, 1975, Academic Press, Inc..Cappel reports on trials with a subunit vaccine from herpes simplex virus in rabbits; see Arch. Virol. 52: 29-35 (1976). It was found that the subunit vaccine is as effective as immunization with live or UV-inactivated herpes simplex viruses. Similarly, Cox et al. About trials with a subunit vaccine for human babies; See Infect, and Immun., 16, 753-754 (1977). Both Cappel and Cox et al. work with extracts of non-ionic detergents of the viruses, since it is known that non-ionic detergents Can solubilize envelope glycoproteins of the virus; See Helenius et al., Solubilization of Membranes by Detergents, Bioehem. et Birphys. Acta, 415, 29-79 (1975). However, Sokal gives as a general rule ah that subunit vaccines that contain soluble antigens, result in a specific immunogenicity or a specific protective effect, which is much lower than that of the virion vaccine; See Sokal, Vaccines of the Future: Immunogenicity of Viral Components, Chapter 9, pages 129-135 »in Viruses and Immunity, Koproski, 1975, Academic Press, Inc ..

Die vorliegende Erfindung beruht auf der Erkenntnis, daß Mittel gefunden wurden, mit denen man IBR-Impfstoffe herstellen kann, die ein wesentlich höheres Antikörper-Ansprechen zeigen als irgendwelche im Handel erhältliche oder neu erforschten IBR-Impfstoffe. Die erfindungsgemäß hergestellten Impfstoffe können ein höheres Antikörper-Ansprechen ergeben als das, das man bei Rindvieh feststellt, welches von natürlichen IBR-Infektionen genesen ist.The present invention is based on the finding that means have been found to make IBR vaccines that show a significantly higher antibody response than any commercially available or newly researched IBR vaccines. The vaccines prepared according to the invention can give a higher antibody response than that found in cattle that have recovered from natural IBR infections.

Die erfindungsgemäßen Impfstoffe werden aus virulentem IBRV, wie aus Feldisolaten von IBRV, oder im wesentlichen nichtabgeschwächtem IBRV hergestellt. Das IBR-Virus vermehr sich in seiner natürlichen oder virulenten Form in einem Zellmediumgemisch, das die Vermehrung des Virus aktiviert. NachThe vaccines according to the invention are made from virulent IBRV, as from field isolates from IBRV, or essentially non-attenuated IBRV manufactured. The IBR virus reproduces in its natural or virulent form in a cell medium mixture, that enables the virus to multiply. To

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der Vermehrung werden die infizierten Zellen von dem Gemisch abgetrennt und mit einer wäßrigen Lösung aus einem nichtionischen Detergens extrahiert. Man erhält eine wäßrige Lösung aus dem antigenen Protein. Der nichtsolubilisierte Rückstand wird von der überstehenden Lösung abgetrennt, die dann als antigener Bestandteil des Impfstoffs verwendet wird. Das lösliche Antigen in wäßriger Lösung wird bevorzugt mit einem geeigneten Adjuvans vermischt, wobei man einen parenteralen Impfstoff in injizierbarer Dosisform erhält. Ölartige Adjuvantien sind bevorzugt, wie Freund«s unvollständiges Adjuvans.the multiplication, the infected cells are separated from the mixture and extracted with an aqueous solution of a nonionic detergent. An aqueous solution is obtained from the antigenic protein. The unsolubilized residue is separated from the supernatant solution, which then used as the antigenic component of the vaccine. The soluble antigen in aqueous solution is preferred mixed with a suitable adjuvant to produce a parenteral vaccine in injectable dosage form. Oily adjuvants are preferred, such as Freund's Incomplete Adjuvant.

Bei einem wirksamen Dosisgehalt zusammen mit einem geeigneten Adjuvans kann ein Antikörper-Ansprechen erhalten werden, das gegenüber der Krankheit Immunität verleiht und das ebenfalls die Entwicklung von IBR-Infektionen verhindert. Dies wird durch die Tatsache angezeigt, daß geimpfte Tiere, wenn sie mit lebenden, virulenten IBRV in Berührung kommen, das Virus nicht aufnehmen bzw. verbreiten. Diese Tatsache ist sehr unerwartet, da eine Virusverbreitung immer festgestellt wird, wenn Kälber, die mit einem vorhandenen Impfstoff geimpft werden, gefordert bzw. härteren Bedingungen ausgesetzt werden, und es gibt keine bekannten Literaturstellen, die nahelegen, daß die Verhinderung der IBR-Virusausbreitung durch Impfung ermöglicht wird. Das geimpfte Rindvieh entwickelt keine Läsionen oder klinische Zeichen von IBR-Krankheit. At an effective dose level together with an appropriate adjuvant, antibody response can be obtained, which confers immunity to the disease and which also prevents the development of IBR infections. this is indicated by the fact that when vaccinated animals come into contact with live, virulent IBRV, the Do not absorb or spread virus. This fact is very unexpected as virus spread has always been detected is when calves vaccinated with an existing vaccine are challenged or exposed to tougher conditions and there is no known literature suggesting that preventing the spread of IBR virus is made possible by vaccination. The vaccinated cattle did not develop lesions or clinical signs of IBR disease.

Die erfindungsgemäßen Impfstoffe können bei trächtigen Tieren, bei säugenden Kälbern und bei Kälbern mit mütterlichen Antikörpern verwendet werden. Die Impfstoffe sind frei an aktivem IBR-Virus und verursachen daher keine Infektion oder Übertragung von IBRV. Da die Impfstoffe eine begrenzte antigene Zusammensetzung aufweisen, können serologische Tests entwickelt werden, um Vakzinate von infizierten Tie-The vaccines according to the invention can be used in pregnant animals, in suckling calves and in calves with maternal Antibodies can be used. The vaccines are free of active IBR virus and therefore do not cause infection or transfer of IBRV. Because the vaccines have a limited antigenic composition, serological Tests are being developed to detect vaccinates from infected animals

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ren zu unterscheiden. Dies ist mit derzeit erhältlichen IBR-Impf stoff en nicht möglich. Insbesondere kann der erfindungsgemäße Impfstoff bei einem lokalen oder nationalen Ausrottungsprogramm verwendet werden, da die Kontrolle der Virusausrottung wesentlich ist für die Kontrolle der Virusübertragung. Die derzeit verfügbaren IBR-Impf stoffe verhindern die Ausrottung der Viren oder das Auftreten latenter Infektionen nicht.to distinguish between them. This is not possible with currently available IBR vaccines. In particular, the inventive Vaccine to be used in a local or national eradication program as the control of the Virus eradication is essential to control virus transmission. Prevent the IBR vaccines currently available virus eradication or latent infections do not occur.

Bei der Durchführung der vorliegenden Erfindung kann irgendein virulenter Stamm von infektiösem Rinderrhinotracheitis-Virus (IBRV) verwendet werden. Beispielsweise kann der Cooper-Stamm verwendet werden, der als IBR-angreifendes Virus von Veterinary Services Laboratory, U.S.D.Α., Ames, Iowa, erhältlich ist. Virulente IBRV-Stämme können von anderen Quellen, wie der American Type Culture Collection, erhalten werden. Beispielsweise ist ATCC Nr. VR-188 geeignet. Alternativ können Feldisolate von IBRV infizierten Rindern gesammelt werden, wobei sichergestellt ist, daß solche Isolate vollständig virulent sind. Solche virulenten Stämme können jedoch einer Zahl von in vitro-Zelldurchgängen unterworfen werden, während sie ihre Virulenz beibehalten, was durch die Fähigkeit angezeigt wird, Rindvieh zu infizieren und klinische Anzeichen von IBR, z.B. durch eine durchschnittliche Körpertemperaturerhöhung von über 39,60C (103,50F) zu ergeben.Any virulent strain of infectious bovine rhinotracheitis virus (IBRV) can be used in the practice of the present invention. For example, Cooper strain available as IBR-attacking virus from Veterinary Services Laboratory, USDΑ., Ames, Iowa, can be used. Virulent IBRV strains can be obtained from other sources such as the American Type Culture Collection. For example, ATCC No. VR-188 is suitable. Alternatively, field isolates from IBRV infected cattle can be collected, ensuring that such isolates are completely virulent. However, such virulent strains can a number of subject in vitro cell passages are, while maintaining their virulence, which is indicated by the ability to infect cattle and clinical signs of IBR, for example, by an average body temperature increase of about 39.6 0 C ( 103.5 0 F).

Virulente IBRV vermehren sich durch Zellkultur. Vorzugsweise werden Rinderzellen verwendet, die IBR-Virus zu einem höheren Titer vermehren können, wie Rinderlungenzellen, Nierenzellen, Testikelzellen usw.. Ausgewählte Linien von Rinderzellen, die für die in vitro-Kultur geeignet sind, können verwendet werden, obgleich auch gute Ergebnisse mit frisch gesammelten Zellen erhalten werden. Für die Zwecke der Virusvermehrung werden die Zellen mit einem geeigneten Nährmedium vereinigt, das das Wachstum der Viren zu einemVirulent IBRV multiply through cell culture. Preferably bovine cells are used, the IBR virus to one higher titers, such as bovine lung cells, kidney cells, testicle cells, etc. Selected lines of Bovine cells suitable for in vitro culture can be used, albeit with good results freshly collected cells can be obtained. For the purposes the virus multiplication, the cells are combined with a suitable nutrient medium, the growth of the virus to one

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höheren Titer aktiviert. Beispielsweise kann das Grundmedium Eagle's minimum essential medium (MEM) enthalten. Zur Aktivierung der viralen Vervielfältigung ist die Einarbeitung eines fötalen Kalbseruras (FCS) bevorzugt. Beispielsweise kann man 10% FCS für das Zellwachstum verwenden. Man kann auch einen 5% FCS-Gehalt für die Erhaltung der Zellen nach der Infektion verwenden, während sich das Virus vervielfältigt. Innerhalb von 24 Stunden nach der Inokulation mit dem IBRV werden die Zellen abgetötet und die Vermehrung des Virus ist beendigt. Das gewünschte virale Umhüllungsprotein ist mit den Zellmembranen assoziiert, wo es gesammelt wurde, bevor es in IBR virale Teilchen überführt wurde.higher titer activated. For example, the basic medium can contain Eagle's minimum essential medium (MEM). Incorporation of a fetal calf serura (FCS) is preferred to activate viral replication. For example, you can use 10% FCS for cell growth. A 5% FCS content can also be used to maintain cells after infection while the virus is replicating. Within 24 hours after inoculation with the IBRV, the cells are killed and the virus has stopped replicating. The desired viral envelope protein is associated with cell membranes where it was collected before being converted into IBR viral particles.

Nach Beendigung der Vermehrung werden die Zellen bevorzugt von den flüssigen Medien abgetrennt. Bei einem Verfahren kann dies durch Zentrifugieren erfolgen. Beispielsweise werden die Zellen aus dem Zellkulturmedium heraus isoliert, indem man 60 min bei 100 000 χ g zentrifugiert. Die abgetrennten Zellen werden dann mit einem nichtionischen Detergens extrahiert, das das virale Umhüllungsprotein, das an der Membran assoziiert ist, solubulisiert und das IBR-Virus inaktiviert. Die Zellpellets können dann in Wasser, das das nichtionische Detergens für die Solubilisierung enthält, erneut suspendiert werden. Es können Detergenskonzentrationen von 0,5 bis 5% verwendet werden. Die nichtionischen Detergentien, von denen gefunden wurde, daß sie für die Solubilisierung eines viralen UmhüTlungsglykoproteins geeignet sind, sind bevorzugt. Beispielsweise kann Triton X-100 (Octylphenoxy-polyäthoxyäthanol) verwendet werden. Dieses nichtionische Detergens wird von Rohm & Haas Co., Philadelphia, Pennsylvania, hergestellt und und ist im Handel von Sigma Chemical Co., St.Louis, Missouri, erhältlich. Nonidet P 40 ist ein anderes nichtionisches Detergens, das in der Literatur als geeignet für die selektive Auflösung viraler Umhüllungsproteine beschrieben wurde. Nonidet P 40When the growth is complete, the cells are preferred separated from the liquid media. In one method, this can be done by centrifugation. For example the cells are isolated from the cell culture medium by centrifuging at 100,000 χ g for 60 min. The severed ones Cells are then extracted with a nonionic detergent that contains the viral envelope protein that attaches to associated with the membrane, solubilizes and inactivates the IBR virus. The cell pellets can then be placed in water that containing the nonionic detergent for solubilization must be resuspended. There can be detergent concentrations from 0.5 to 5% can be used. The nonionic detergents found to work for solubilization of a viral enveloping glycoprotein are preferred. For example, Triton X-100 (octylphenoxy-polyethoxyethanol) can be used. This nonionic detergent is manufactured and sold by Rohm & Haas Co., Philadelphia, Pennsylvania available from Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri. Nonidet P 40 is another nonionic detergent that has been described in the literature as being useful for the selective dissolution of viral envelope proteins. Nonidet P 40

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wird, von BDH Chemicals Ltd., Poole, England, hergestellt und in den V.St.A. von Gallard-Schlesinger Chemical Mfg. Corp., Carle Place, New York, vertrieben. Solche nichtionischen Detergentien solübilisieren virale Umhüllungsproteine, ohne daß sie die Proteine beachtlich denaturieren. is manufactured by BDH Chemicals Ltd., Poole, England and in the V.St.A. from Gallard-Schlesinger Chemical Mfg. Corp., Carle Place, New York. Such nonionic detergents solubilize viral envelope proteins without significantly denaturing the proteins.

Die Behandlung der wäßrigen Detergenslösung mit den zellularen Membranen kann durch mechanische Zerbrechung oder Dispersion der Zellen aktiviert werden. Beispielsweise können die resuspendierten Zellen durch eine Homogenisierungsvorrichtung geleitet werden. Sie können auch einer Beschallung unterworfen werden, wodurch die Behandlung der zellularen Membran und des IBR-Virus mit dem nichtionischen Detergens begünstigt wird. Von dem gewünschten viralen Umhüllungsprotein wird aus den IBR viralen Teilchen selbst nur sei"-·· wenig erhalten, aber eine vollständige Inaktivierung des IBR-Virus ist wünschenswert. Es ist bevorzugt, die Behandlung bei einem neutralen oder etwas alkalischen pH-Wert, wie einem pH-Wert im Bereich von 6,0 bis 9,0, durchzuführen. Ein geeigneter Puffer kann in der wäßrigen Lösung enthalten sein, um den gewünschten pH-Wert aufrechtzuerhalten. Das für die Extraktion verwendete Wasser ist bevorzugt steriles, entionisiertes Wasser. Die Extraktion kann in 1 bis 2 Stunden beendigt sein. Beispielsweise kann mit einer Homogenisierung und/oder Beschallung und einem fortgesetzten Rühren der Zellsuspension in dem wäßrigen Detergens die Extraktion in einer Stunde beendigt sein* Bevorzugt wird die Suspension bei einer Temperatur unter 10°C während der Extraktion gehalten, wie bei einer Temperatur von etwa 4°C. Nach Beendigung der Extraktion wird der Rückstand aus festem Material von der Überstehenden Lösung aus solubilisiertem Protein abgetrennt. Beispielsweise kann die Abtrennung durch Zentrifugieren erfolgen. Die Zelldebris kann durch Zentrifugieren bei 100 000 χ g während 60 min pelletisiert werden.Treatment of the aqueous detergent solution with the cellular Membranes can be activated by mechanical disruption or dispersion of the cells. For example the resuspended cells can be passed through a homogenizer. You can also do one Sonication, whereby the treatment of the cellular membrane and the IBR virus with the nonionic detergent is favored. Of the desired viral envelope protein is obtained from the IBR viral particles themselves only slightly, but completely inactivated of the IBR virus is desirable. It is preferred to treat at a neutral or slightly alkaline pH, such as a pH in the range of 6.0 to 9.0. A suitable buffer can be in the aqueous Solution must be included to maintain the desired pH. The water used for the extraction is preferably sterile, deionized water. The extraction can be completed in 1 to 2 hours. For example can with homogenization and / or sonication and continued stirring of the cell suspension in the aqueous Detergent the extraction will be completed in an hour * Preferably the suspension is at a temperature below Maintained 10 ° C during the extraction, such as a temperature of about 4 ° C. After the extraction is finished the solid matter residue is separated from the solubilized protein supernatant solution. For example the separation can be carried out by centrifugation. The cell debris can be removed by centrifugation at 100,000 χ g during Pelletized for 60 min.

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Der Extrakt aus subviralem Protein, der so erhalten wird, kann direkt zur Herstellung der Impfstoffe verwendet werden. Es ist jedoch bevorzugt, daß er, wenn er eine ausreichende Konzentration an Protein enthält, mit einem Adjuvans vermischt wird, so daß eine injizierbare Dosisform von Impfstoff erhalten wird. Die pro Dosis verwendete Menge sollte wirksam sein, um die IBR-Krankheit zu verhindern, entweder durch eine einzige Injektion oder durch zwei aufeinanderfolgende Injektionen. Beispielswelse kann der Extrakt 3 bis 6 mg extrahierte Proteinfeststoffe/ml enthalten. Die injizierbare Dosisform des Impfstoffs kann hergestellt werden, indem man gleiche Teile eines geeigneten Adjuvans und des subviralen Proteinextrakts, wie erhalten (ohne Konzentrierung) , vermischt. Obgleich der Impfstoff (Proteinextrakt mit Adjuvans) 0,5 bis 10 mg/ml Gesamtprotein (Feststoffbasis) enthalten kann, wird er normalerweise eine Menge im Bereich von 1 bis 6 mg/ml extrahiertes Protein enthalten. Beispielsweise wird, wenn die Dosis des Impfstoffs 2 ml betragen soll, die Gesamtdosis dann 2 bis 12 mg Gesamtprotein sein, wie eine Gesamtdasis von 2 bis 8 mg.The subviral protein extract obtained in this way can be used directly in the manufacture of the vaccines. However, it is preferred that if it contains a sufficient concentration of protein it be mixed with an adjuvant so that an injectable dosage form of vaccine is obtained. The amount used per dose should be effective to prevent IBR disease, either by a single injection or by two consecutive injections. For example, the extract may contain 3 to 6 mg extracted protein solids / ml. The injectable dosage form of the vaccine can be prepared by mixing equal parts of a suitable adjuvant and the subviral protein extract as received (without concentration). Although the vaccine (protein extract with adjuvant) may contain 0.5 to 10 mg / ml of total protein (solids basis), it will normally contain an amount in the range of 1 to 6 mg / ml of extracted protein. For example, if the dose of vaccine is to be 2 ml, then the total dose will be 2 to 12 mg total protein, such as a total basis of 2 to 8 mg.

Gegebenenfalls kann das antigene Protein konzentriert oder vor der Herstellung des Impfstoffs gewonnen werden, wie durch Aussalzen oder Ultrafiltration. Wenn das antigene Protein in fester Form gewonnen wird, wird es bevorzugt in Wasser in der gewünschten Konzentration für die Einarbeitung in den Impfstoff erneut suspendiert« Wie zuvor angegeben, wird die Lösung aus viralem UmhUllungsprotein dann mit einem geeigneten Adjuvans vermischt. Da das Antigen in Lösung ist, ist es bevorzugt, die wäßrige Lösung mit einem Adjuvans des Öltyps zu vermischen. Beispielsweise kann man Freund's Unvollständiges Adjuvans verwenden. Dieses Adjuvans kann aus einer technischen Quelle, wie von Difco Laboratories, Detroit, Michigan, bezogen werden, oder es kann hergestellt werden, indem man Mannit-monooleat mitOptionally, the antigenic protein can be concentrated or obtained prior to the manufacture of the vaccine, such as by salting out or ultrafiltration. If the antigenic protein is obtained in solid form, it is preferred in Water resuspended at the desired concentration for incorporation into the vaccine «As previously indicated, the solution of viral envelope protein is then mixed with a suitable adjuvant. Since the antigen is in Solution, it is preferred to mix the aqueous solution with an oil-type adjuvant. For example, you can Use Freund's Incomplete Adjuvant. This adjuvant may or may be obtained from an engineering source such as Difco Laboratories, Detroit, Michigan can be made by using mannitol monooleate

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Paraffinöl in Volumenanteilen von 1,5:8,5 vermischt. Der entstehende Impfstoff ist eine Wasser-in-Öl-Emulsion, wobei das Antigen in dispergierter Wasserphase vorliegt. Obgleich die Verhältnisse von Adjuvans zu Proteinextrakt stark variieren können, sind etwa gleiche Verhältnisse bevorzugt. Paraffin oil mixed in proportions by volume of 1.5: 8.5. The resulting vaccine is a water-in-oil emulsion, whereby the antigen is present in a dispersed water phase. Although the proportions of adjuvant to protein extract can vary widely, roughly the same ratios are preferred.

Die erfindungsgemäßen Impfstoffe sind besonders für Vieh, insbesondere Rindvieh, geeignet, und sie können Kälbern und trächtigen Kühen verabreicht werden. Die Impfstoffe können ebenfalls mit anderen Rinderspecies, wie Ochsen oder Wasserbüffel, verwendet werden. Das Volumen der indizierbaren Dosis kann variieren, wie ein Volumen von 1 bis 4 ml. Eine 2 ml Dosis ist jedoch geeignet. Bei der Verabreichung des Impfstoffs kann man eine einzige Injektion verabreichen, es ist jedoch bevorzugt, zwei aufeinanderfolgende Injektionen pro Tier zu verabreichen. Beispielsweise kann man eine 2 ml Dosis, die 4 bis 8 mg Gesamtprotein enthält, zweimal in Intervallen von 30 Tagen verabreichen. Die Krankheit wird verhindert und die übertragung des IBR-Virus durch Virusverbreitung wird ebenfalls verhindert. Dadurch wird die IBR-Infektion wirksam kontrolliert. The vaccines of the invention are particularly useful for livestock, especially cattle, and can be used on calves and pregnant cows. The vaccines can also be used with other beef species such as ox or water buffalo. The volume of the indexable Dose can vary, such as a volume from 1 to 4 ml. However, a 2 ml dose is suitable. When administering A single injection of the vaccine can be given, but two consecutive injections are preferred To give injections per animal. For example, you can get a 2 ml dose that contains 4 to 8 mg of total protein Administer twice at 30-day intervals. The disease is prevented and the transmission The IBR virus through virus spread is also being used prevented. This effectively controls IBR infection.

Bei der Entwicklung und der Prüfung der erfindungsgemäß hergestellten Impfstoffe werden die folgenden Materialien und Verfahren verwendet.The following materials will be used in developing and testing the vaccines made in accordance with the present invention and method used.

Virus - der virulente Cooper-Stamm vpn IBRV wird beim 8. Durchgangswert von der National Veterinary Services Laboratory, Ames, Iowa, erhalten. Der Cooper-Stamm wird zweckdienlicherweise als angreifender Stamm verwendet. Er wird zweimal in Rinderlungenzellen (BLU) durchgeführt und ein Vorratspool bzw. eine Stocklösung, die 1,0 χ 10 plättchenbildende Einheiten (PFU)/ml enthält, wird bei -700C gefroren. Virus - The virulent Cooper strain vpn IBRV is obtained at the 8th pass from the National Veterinary Services Laboratory, Ames, Iowa. The Cooper strain is conveniently used as the attacking strain. It is performed twice in bovine lung cells (BLU) and contains a storage pool or a stock solution containing 1.0 χ 10 plate forming units (PFU) / ml, is frozen at -70 0 C.

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3Q260U3Q260U

Zellkulturverfahren - Die bei der vorliegenden Untersuchung verwendeten Zellkulturen werden in Eagle's minimum essential medium (MEM) (Eagle's minimalem wesentlichem Medium), ergänzt mit 10% bestrahltem, fötalem Kälberserum (FCS) (in der Wärme 30 min bei 56°C inaktiviert), 0,5% Lactalbuminhydrolysat und Antibiotika (100 IE Penicillin, 100/Ug Kanamycinsulfat und 100/Ug Streptomycinsulfat pro ml), gezüchtet« Das Medium wird mit 0,i6%igem Natriumbicarbonat und 8 mMol N-2-Hydroxyäthylpiperazin-N'-2-äthansulfonsäure (HEPES) gepuffert. Die Kulturen werden bei 37°C in einer 5%igen CO2-AtmoSphäre inkubiert. Cell culture method - The cell cultures used in the present study are in Eagle's minimum essential medium (MEM), supplemented with 10% irradiated fetal calf serum (FCS) (inactivated in the heat for 30 min at 56 ° C), 0 , 5% lactalbumin hydrolyzate and antibiotics (100 IU penicillin, 100 / Ug kanamycin sulfate and 100 / Ug streptomycin sulfate per ml), cultured «The medium is grown with 0.16% sodium bicarbonate and 8 mmol N-2-hydroxyethylpiperazine-N'-2- Ethanesulfonic acid (HEPES) buffered. The cultures are incubated at 37 ° C. in a 5% CO 2 atmosphere.

Virusisolierung - Nasale Sekretionen werden für die Virusisolierung gesammelt, indem man ein 15 cm mit Watte bf4ecktes Stäbchen in seiner vollen Länge in die linke ventrale Nasenmeatus einführt und das Stäbchen dreht, bis es gesättigt ist. Die Wattetupfer werden in 1,0 ml MEM, das die Antibiotika (200 IE Penicillin, 2QOyUg Kanamycinsulfat, 200/Ug Streptomycinsulfat und 15/Ug Amphoteracin B/ml) enthält, eingetaucht und 30 min bei 4°C gehalten. Die Wattetupfer werden dann aus dem Medium entnommen und das Medium wird bei -7O°C gefroren, bis es zum Kultivieren verwendet wird. Virus Isolation - Nasal secretions are collected for virus isolation by inserting a full length 15 cm rod covered with cotton wool into the left ventral nasal meatus and rotating the rod until saturated. The cotton swabs are immersed in 1.0 ml MEM, which contains the antibiotics (200 IU penicillin, 2QOyUg kanamycin sulfate, 200 / Ug streptomycin sulfate and 15 / Ug amphoteracin B / ml) and kept at 4 ° C. for 30 minutes. The cotton swabs are then removed from the medium and the medium is frozen at -7O ° C until it is used for culturing.

Die plättchenbildenden Einheiten des Virus in Proben werden bestimmt durch Inokulation doppelter Kulturen von BLU-Monoschichten mit Reihen zehnfacher Verdünnungen (in MEM) für 3ede Probe Die Inokula werden 60 min adsorbiert, die Monoschichten werden mit MEM gewaschen und mit 1% Agarose, die MEM, 5% FCS und Antibiotika enthält, bedeckt. Die Kulturen werden 72 h bei 370C in einer 5%igen C02-Atmosphäre inkubiert. Die Kulturen werden mit 1Obigem gepuffertem Formalin fixiert. Die Agaroseschicht wird entfernt und der Zellfilm wird mit Kristallviolett angefärbt. Der Virustiter wird durch Zählen der PFU bestimmt.The platelet-forming units of virus in samples are determined by inoculating duplicate cultures of BLU monolayers with series of ten-fold dilutions (in MEM) for each sample. The inocula are adsorbed for 60 min, the monolayers are washed with MEM and washed with 1% agarose, the MEM, Contains 5% FCS and antibiotics, covered. The cultures are incubated for 72 h at 37 ° C. in a 5% CO 2 atmosphere. The cultures are fixed with the above buffered formalin. The agarose layer is removed and the cell film is stained with crystal violet. The virus titer is determined by counting the PFU.

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Plättchenreduktions-Neutralisationstests - Anti-IBR-Serum-Neutralisationstiter werden durch Plättchenreduktions-Neutralisationstests bestimmt. Zweifache Serumverdünnungen von in der Wärme inaktiviertem Serum (30 min bei 56°C) werden mit gleichen Volumen MEM, das 1000 PFU IBRV/ml enthält, vermischt und 60 min bei 370C inkubiert. Monoschichten von BUJ-Zellen in 35 mm 6-Löcher-Kunststoffgewebekulturplatten werden mit 0,2 ml Serum-Virus-Gemisch inokuliert. Nach der Adsorption des Serum-Virus-Gemisches während 60 min bei 370C werden die Kulturen mit MEM gewaschen und mit · 1% Agarose, enthaltend MEM, FCS und Antibiotika, belegt. Die Kulturen werden 72 h bei 370C inkubiert und dann mit 10% gepuffertem Formalin fixiert. Die Agaroseschicht wird entfernt und die Zellfilme werden mit Kristallviolett angefärbt. Der Serumneutralisationstiter ist der reziproke Wert der höchsten Serumverdünnung, die die Plättchenzählung um mindestens 50% reduziert. Platelet Reduction Neutralization Tests - Anti-IBR serum neutralization titers are determined by platelet reduction neutralization tests. Two-fold dilutions of serum in the heat inactivated serum (30 min at 56 ° C) are contains with equal volume of MEM containing 1000 PFU IBRV / ml, mixed and incubated for 60 min at 37 0 C. Monolayers of BUJ cells in 35 mm 6-well plastic tissue culture plates are inoculated with 0.2 ml of serum virus mixture. After the serum-virus mixture has been adsorbed for 60 minutes at 37 ° C., the cultures are washed with MEM and coated with 1% agarose containing MEM, FCS and antibiotics. The cultures are incubated for 72 h at 37 ° C. and then fixed with 10% buffered formalin. The agarose layer is removed and the cell films are stained with crystal violet. The serum neutralization titer is the reciprocal of the highest serum dilution that reduces the platelet count by at least 50%.

Proteinbestimmun^ - Der Proteingehalt wird nach dem Verfahren von Lowry et al, J. Biol.Chem., 193, 265-275, (1951), mit Rinderserumalbumin als Standard analysiert. Der Proteingehalt der Proben, die nichtionisches Detergens enthalten, wird unter Verwendung eines modifizierten Lowry-Verfahrens, wie es in Anal.Bioehem., 86, 346-356 (1977), beschrieben wird, bestimmt. Protein determination - The protein content is analyzed according to the method of Lowry et al, J. Biol. Chem., 193, 265-275, (1951), with bovine serum albumin as the standard. The protein content of samples containing nonionic detergent is determined using a modified Lowry method as described in Anal.Bioehem., 86, 346-356 (1977).

Die Herstellung der erfindungsgemäßen Impfstoffe und die bei der Untersuchung der Impfstoffe erhaltenen Ergebnisse sind in den folgenden Beispielen erläutert.The preparation of the vaccines according to the invention and the Results obtained in examining the vaccines are illustrated in the following examples.

Beispiel 1example 1 Herstellung der ImpfstoffeManufacture of vaccines

Rinderlungenzellen (BLU) werden in 490 cm Zylinderflaschen vermehrt, bis sich Monoschichten ausbilden. Die Monoschichten werden infiziert, indem man das Medium entfernt undBovine lung cells (BLU) are placed in 490 cm cylinder bottles increased until monolayers form. The monolayers are infected by removing the medium and

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und 5 ml Stock-IBRV, hergestellt, wie oben beschrieben, zugibt. Nach 60 min Adsorption wird das Inokulum entfernt, die Monoschicht wird mit MEM gewaschen und 30 ml Erhaltungsmedium (MEM, enthaltend 5% FCS) werden zugegeben. Die Zellen werden bei 37°C unter Drehen (1 U/min) inkubiert, bis eine cytopathische Wirkung (CPE) vollständig ist (ungefähr 24 h). Die infizierten BÜJ-Zellen werden von der Oberfläche der Zylinderflasche mit einem Kautschukspatel abgekratzt. Das Zellen-Medium-Gemisch wird 1 h bei 100 000 χ g zentrifugiert. Die entstehenden Pellets werden unter Verwendung einer Modifizierung des Verfahrens von Vestergaard et al, J. Virol., 24, 87-90(1977), solubilisiert. Die Pellets werden in 0,010 Mol Glycin-0,038 Mol Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan (Tris) (pH = 9,o), enthaltend 0,5$ Triton X-100 (1 ml/Zylinderflasche), suspendiert. Das Gemisch wird mit einer Homogenisierungsvorrichtung homogenisiert und mit zwei 20 sec-Zyklen mit einer Beschallungsvorrichtung in einer Einstellung von 90%Wirksamkeit beschallt. Das Gemisch kann 1 h bei 4°C reagieren, wobei konstant mit einem magnetischen Rührer gemischt wird. Das Gemisch wird 1 h bei 100 000 χ g zentrifugiert und das überstehende Material wird als Impfstoff geerntet. Der Impfstoff wird bei -700C bis zur Verwendung gelagert. Der Impfstoff wird mit einem gleichen Volumen Freund1S Vollständigem oder Freund1S Unvollständigem Adjuvans vermischt und mit 200 Schlägen in einer Adjuvans-Mischvorrichtung emulgiert. Ein zweiter Untereinheits-Impfstoff wird unter Verwendung einer Modifizierung des obigen Verfahrens hergestellt. Die Extraktionslösung ist 2,5% Nonidet P-40 (NP-40) in destilliertem Wasser, hergestellt wie von Martin et al. in Infect. Immun., 5» 248 bis 254 (1972), beschrieben.and add 5 ml of stock IBRV prepared as described above. After 60 min of adsorption, the inoculum is removed, the monolayer is washed with MEM and 30 ml of maintenance medium (MEM, containing 5% FCS) are added. The cells are incubated at 37 ° C with rotation (1 rpm) until cytopathic effect (CPE) is complete (approximately 24 hours). The infected BÜJ cells are scraped off the surface of the cylinder bottle with a rubber spatula. The cell-medium mixture is centrifuged at 100,000 g for 1 hour. The resulting pellets are solubilized using a modification of the method of Vestergaard et al, J. Virol., 24, 87-90 (1977). The pellets are suspended in 0.010 mol of glycine-0.038 mol of tris (hydroxymethyl) aminomethane (Tris) (pH = 9.0) containing 0.5% of Triton X-100 (1 ml / cylinder bottle). The mixture is homogenized with a homogenization device and sonicated with two 20 sec cycles with a sonication device at a setting of 90% effectiveness. The mixture is allowed to react for 1 hour at 4 ° C., constant mixing with a magnetic stirrer. The mixture is centrifuged at 100,000 χ g for 1 hour and the supernatant is harvested as a vaccine. The vaccine is stored at -70 0 C until use. The vaccine is mixed with an equal volume of Freund 1 S Complete or Freund 1 S Incomplete Adjuvant and emulsified at 200 strokes in an adjuvant mixer. A second subunit vaccine is prepared using a modification of the above procedure. The extraction solution is 2.5% Nonidet P-40 (NP-40) in distilled water, prepared as described by Martin et al. in Infect. Immun., 5248-254 (1972).

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Beispiel 2Example 2

Bestimmung der Antigenizität des ImpfstoffsDetermination of the antigenicity of the vaccine

Triton X-1OO solubilisierter IBR-Subeinheits-Impfstoff und Zellkontrollpräparationen werden 10 IBR sero-negativen Rindern in zwei intramuskulären Dosen in Intervallen von 20 Tagen, wie in Tabelle A angegeben, verabreicht. Die Tiere werden täglich während der Untersuchung für klinische Anzeichen der Krankheit beobachtet. Die rektalen Temperaturen werden 3 Tage vor der Impfung und 10 Tage nach der Impfung aufgezeichnet. Nasale Sekretionen werden für die Virusisolierung vor der Impfung und an den Tagen 2, und 7 nach der Impfung isoliert. Die Serumproben werden in wöchentlichen Intervallen isoliert.Triton X-100 solubilized IBR subunit vaccine and cell control preparations are 10 IBR sero-negative cattle in two intramuscular doses at intervals of 20 days as indicated in Table A, administered. The animals are examined daily for clinical Signs of the disease observed. The rectal temperatures will be 3 days before vaccination and 10 days after recorded after vaccination. Nasal secretions are used for virus isolation prior to vaccination and on days 2, and 7 isolated after vaccination. The serum samples are isolated at weekly intervals.

Versuch 1Attempt 1

Bestimmung der Subeinheitsimpfstoff-AntigenizitätDetermination of subunit vaccine antigenicity

Während der Untersuchung sind alle 10 Tiere bei diesem Versuch klinisch normal. Die rektalen Temperaturen nach der Impfung liegen innerhalb von +10C der Temperaturen, die vor der Impfung aufgezeichnet wurden. Aus den Nasalsekretionen wurden vor oder nach der Impfung keine Viren isoliert. Die Serumneutralisationstiter sind in Tabelle B aufgeführt.During the study, all 10 animals are clinically normal in this trial. The rectal temperatures after vaccination are within +1 0 C of the temperatures recorded before vaccination. No viruses were isolated from the nasal secretions before or after vaccination. The serum neutralization titers are listed in Table B.

Tabelle ATable A.

Impfungsschema für die Bestimmung der Antigenizität von Triton X-100.solubilisiertem IBR-SubeinheitsimpfstoffVaccination scheme for the determination of the antigenicity of Triton X-100. Solubilized IBR subunit vaccine

Kalb Nr. Impfstoff Dosis(ml)/ Impfung(2) Calf No. Vaccine Dose (ml) / Vaccination (2)

1 Zellenvergleich ohne Ad^uvans ι1 Cell comparison without Ad ^ uvans ι

2 Zellenvergleich mit Adjuvans 22 Comparison of cells with adjuvant 2

3 IBR-Subeinheit ohne Adjuvans 13 IBR subunit without adjuvant 1

4 w 14 w 1

5 M 25 M 2

6 ·· m 26 m 2

7 IBR-Subeinheit mit Adöuvansu; 27 IBR subunit with Adöuvans u; 2

8 " 28 "2

9 ·· 49 ·· 4

10 » 4, 10 » 4,

(1) Freund1s Vollständiges Adjuvansj (2) 1 ml ohne Adjuvans und 3e 2 ml mit Adjuvans, enthaltend 4,4 mg extrahiertes Protein.(1) Freund 1 s Complete Adjuvantj (2) 1 ml without adjuvant and 3e 2 ml with adjuvant containing 4.4 mg of extracted protein.

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Tabelle BTable B.

Serumneutralisationstiter nach der intramuskulären Verabreichung von Triton X-100 solubilisiertem IBR-SubeinheitsimpfstoffSerum neutralization titre after intramuscular administration of Triton X-100 solubilized IBR subunit vaccine

Kalbcalf Impfstoffvaccine (ml)(ml) )) T"T " Serumneutralisationstiter^ 'Serum neutralization titer ^ ' 77th Nr.No. Wochen nach der Impfung (3)Weeks after vaccination (3) 2 3 4 5b2 3 4 5b

11 Zellenvergleich ohne AdjuvansCell comparison without adjuvant 11 <2<2 <2<2 <2<2 <2<2 <2<2 <2<2 <2<2 22 11 mit Adjuvans 11 with adjuvant 22 <2<2 <2<2 <2<2 < 2<2 < 2<2 <2<2 <2<2 33 IBR-Subeinheit ohne AdjuvansIBR subunit without adjuvant 11 <2<2 <2<2 «^2«^ 2 < 2<2 < 2<2 ^2^ 2 <2<2 44th IlIl 11 <2<2 <2<2 ^2^ 2 < 2<2 ^ 2^ 2 <2<2 < 2<2 VJlVJl IlIl 22 <2<2 88th 44th 88th 22 22 22 66th IlIl 22 <2<2 44th 44th 88th 88th 88th 44th 77th IBR-Subeinheit mit Adjuvanst2i IBR subunit with adjuvant t2i 22 <2<2 44th 88th 128128 128128 128128 128128 88th IlIl 22 ^2^ 2 88th 1616 10241024 512512 512512 512512 99 IlIl 44th <2<2 6464 128128 512512 512512 512512 512512 1010 IlIl 44th LZLZ 6464 6464 10241024 10241024 512512 512512

(1) Der Titer ist als reziproker Wert der höchsten Serumverdünnung, die die Plättchenzählung um mindestens 50% reduziert, angegeben(1) The titer is the reciprocal of the highest serum dilution that the platelet count around at least 50% reduced, indicated

[2) Freundfs Vollständiges Adjuvans[2) Freund's complete adjuvant f

3) die zweite Impfstoff^Dosis wird nach 3 Wochen verabreicht
4 vergl. Tabelle A
3) the second dose of vaccine will be given after 3 weeks
4 see Table A.

Beispiel 5 Bestimmung des ImmunschutzesExample 5 Determination of immune protection

20 IBR-seronegative Kälber (3 bis 6 Monate alt) werden beliebig in fünf Gruppen (jeweils 4 in einer Gruppe) geteilt und in getrennten, verschlossenen, isolierten Räumen während der Untersuchung gehalten. Die Kälbergruppen werden mit 1 bis 5 bezeichnet und intramuskulär,- wie in Tabelle C erläutert, geimpft. 30 Tage nach der Impfung verabreicht man den Kälbern ein Standard-Angriffsvirus-Inokulum (1 χ 10 PFU Cooper Stamm IBR, 10. Durchgang). Eine mit Gas angetriebene Atomisiervorrichtung wird verwendet, um in jedes Nasenloch 2 ml Inokulum abzugeben*Any 20 IBR-seronegative calves (3 to 6 months old) are allowed divided into five groups (4 in each group) and kept in separate, locked, isolated rooms during kept the investigation. The calf groups are numbered 1 to 5 and are intramuscular - as in Table C. explained, vaccinated. Administered 30 days after vaccination a standard attack virus inoculum (1 × 10 PFU Cooper strain IBR, 10th pass) is given to the calves. One with Gas powered atomizer is used to deliver 2 ml of inoculum into each nostril *

Die Kälber werden täglich auf klinische Anzeichen der Krankheit 7 Tage vor der Impfung bis zum Ende der Untersuchung geprüft. Die rektalen Temperaturen werden 3 Tage vor der Impfung, während 10 Tagen folgend auf jede Impfung, und während 14 Tagen nach dem Angriff aufgezeichnet. Die nasalen Sekretionen werden für die Virusisolierung dreimal vor der Impfung und täglich während 7 Tagen nach der Anfangsimpfung jeder Gruppe gesammelt. Nach dem Angriff werden die Nasalsekretionen bei den folgenden Zeiten gesammelt: 5 min nach dem Angriff; 15 min Intervalle während 1 h nach dem Angriff; stündliche Intervalle während 15 h nach dem Angriff? 18, 20, 22 und 24 h nach dem Angriff; und in 24 h-Intervallen während 14 Tagen nach dem Angriff. Die Serumproben werden dreimal vor der Impfung und in wöchentlichen Intervallen nach der Impfung gesammelt.The calves are examined daily for clinical signs of the disease 7 days before vaccination until the end of the examination checked. Rectal temperatures are measured 3 days prior to vaccination, for 10 days following each vaccination, and recorded for 14 days after the attack. The nasal Secretions are collected for virus isolation three times prior to vaccination and daily for 7 days after the initial vaccination of each group. Be after the attack the nasal secretions collected at the following times: 5 minutes after the attack; 15 min intervals for 1 hour after the attack; hourly intervals during 15 h after the attack? 18, 20, 22 and 24 hours after the attack; and in 24 hour intervals for 14 days after the attack. the Serum samples are collected three times before vaccination and at weekly intervals after vaccination.

Nach der Impfung zeigen 4 von vier Kontrollkälbern und 5 von zwölf geimpften Kälbern gehärtete Schwellungen an den Stellen der Impfstoffinokulation und ein fieberartiges Ansprechen (40 bis 41,10C), das 1 bis 3 Tage andauert. Eine tiefe intramuskuläre Inokulation und ein Vermeiden eines "Impfloches" verhindert die Reaktion bei der zweiten Impfung.After inoculation of 4 show four control calves and 5 of twelve vaccinated calves cured swelling at the locations of Impfstoffinokulation and a fever-like response (40 to 41.1 0 C), continues the 1 to 3 days. Deep intramuscular inoculation and avoidance of a "vaccination hole" prevents the reaction at the second vaccination.

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In Tabelle D sind die Serumneutralisationstiter nach der Impfung land nach dem Angriff dargestellt.Table D shows the serum neutralization titers after Vaccination land depicted after the attack.

Nach einem intranasalen Angriff mit IBRV sind alle Kälber in den Gruppen 2, 3, 4 und 5 klinisch normal mit Ausnahme der Kälber 5i 10 und 11, die eine milde Infektion des Atemtraktes entwickeln. Klinische Anzeichen der Krankheit umfassen erhöhte Temperatur, intranasale Herpes-Bläschen und fibrino-necrotisches nasales Exsudat. Der klinische Verlauf Der klinische Verlauf der Krankheit, der bei den Kälbern 10 und 11 beobachtet wird, zeichnet sich durch erhöhte Temperatur aus, die über die Resolution der intranasalen Läsionen und nasalen Exsudate anhielt. Die Temperatur kehrt auf die Grundlinienwerte 24 h nach Beginn der Antibiotika-Therapie, 9 Tage nach dem Angriff, zurück. Das Kalb 20 stirbt am 38. Tag nach der Impfung wegen Ursachen, die mit dem Versuch nichts zu tun haben. Eine Obduktion zeigt keine Anzeichen der Krankheit oder irgendeine Läsion an der Impfstelle. Das Aussetzen eines Angriffs der Kontrollkälber ergibt eine ernste Erkrankung der Atemwege, die sich durch erhöhte Temperatur (bis zu 41,70C) und die Bildung ausgedehnter fibrino-necrotischer Plättchen an der Nasenschleimhaut auszeichnet.After an intranasal attack with IBRV, all calves in groups 2, 3, 4 and 5 are clinically normal with the exception of calves 5, 10 and 11, which develop mild respiratory tract infection. Clinical signs of the disease include elevated temperature, intranasal herpes vesicles, and fibrino-necrotic nasal exudate. The Clinical Course The clinical course of the disease observed in calves 10 and 11 is characterized by elevated temperature that persisted over the resolution of intranasal lesions and nasal exudates. The temperature returns to baseline values 24 hours after the start of antibiotic therapy, 9 days after the attack. Calf 20 dies on the 38th day after vaccination due to causes unrelated to the attempt. An autopsy shows no signs of the disease or any lesion at the vaccination site. Exposing an attack, the control calves results in a serious respiratory disease, which is characterized by prolonged elevated temperature (up to 41.7 0 C) and the formation fibrino-necrotischer platelets to the nasal mucosa.

Aus den Nasalsekretionen wird vor oder nach der Impfung kein Virus isoliert. Bei den Gruppen 2 und 3 wird das Angriffs - Inokulumvirus 5 und 15 min nach dem Angriff isoliert; es konnte jedoch aus den Nasalsekretionen der Kälber 30 min nach dem Angriff nicht mehr isoliert werden. Das Angriffs-Inokulumvirus konnte aus Nasalsekretionen von Kälbern in den Gruppen 4 und 5 5 min nach dem Angriff des Inokulums nicht mehr isoliert werden. Nach der anfänglichen Clearance des Angriffs-Virusinokulums konnte das Virus aus den Nasalsekretionen 18 h nach dem Angriff bei den' Gruppen 2 und 3 und 22 h bei den Gruppen 4 und 5 iso-No virus is isolated from the nasal secretions before or after vaccination. For groups 2 and 3 this will be Attack inoculum virus isolated 5 and 15 minutes after attack; however, it could no longer be isolated from the nasal secretions of the calves 30 minutes after the attack. The attack inoculum virus could be found in nasal secretions from calves in groups 4 and 5 5 min after attack of the inoculum can no longer be isolated. After the initial clearance of the attack virus inoculum, it could Virus from the nasal secretions 18 h after the attack in groups 2 and 3 and 22 h in groups 4 and 5 iso-

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liert werden. In Tabelle E sind Einzelheiten bei der Ausbreitung des Virus in Nasalsekretionen für die Tage 1 bis 14 nach dem Angriff aufgeführt. Das Virus wird aus den Kälbern 13, 14, 17, 18 oder 19 nach Beginn des intranasalen Angriffs nicht isoliert.be lured. See Table E for details on the spread of the virus listed in nasal secretions for days 1 to 14 after the attack. The virus gets from the calves 13, 14, 17, 18 or 19 not isolated after the intranasal attack started.

Tabelle CTable C.

Impfungsschema für die Bestimmung der Wirksamkeit von Triton X-100 und NP-40 solubilisierten IBR-subviralen ImpfstoffenVaccination regimen for determining the efficacy of Triton X-100 and NP-40 solubilized IBR subvirals Vaccines

Impfstoff Impfstoff-Vaccine vaccine

dosis (1)dose (1)

Triton X-100 solubilisier- 1 ter ZellenvergleichTriton X-100 solubilized cell comparison

Triton X-100 IBR-Subeinheit 1Triton X-100 IBR subunit 1

NP-40 IBR-Subeinheit 1NP-40 IBR subunit 1

Triton X-100 IBR-Subeinheit 2Triton X-100 IBR subunit 2

NP-40 IBR-Subeinheit 2NP-40 IBR sub-unit 2

(1) Jede Dosis enthält 1 ml Zeilextrakt und 1 ml Freund*s Unvollständiges Adjuvans; jeweils 1 ml des Triton X-100-Extraktes enthält 3»5 mg Protein und bei dem NP-40-Extrakt enthält jeweils 1 ml 5,8 mg Protein. Die zweite Impf dosis wird nach 30 Tagen verabreicht.(1) Each dose contains 1 ml of cell extract and 1 ml of Freund * s Incomplete Adjuvant; 1 ml each of the Triton X-100 extract contains 3 »5 mg of protein and the NP-40 extract contains 1 ml each of 5.8 mg protein. The second dose is given after 30 days.

Gruppegroup Kalbcalf bisuntil Nr.No. Nr.No. bisuntil 11 11 bisuntil 44th 22 55 bisuntil 88th 33 99 bisuntil 1212th 44th 1313th 1616 55 1717th 2020th

030066/0733030066/0733

Tabelle D Serumneutralisationstiter nach der intramuskulären .Verabreichung"von Triton X-100 und Table D Serum neutralization titers following intramuscular "administration" of Triton X-100 and

Gruppe/Group/ 11 NP-40 solubulisiertem IBR-subviralem ImpfstoffNP-40 solubilized IBR subviral vaccine ÖÖ Serumneutralisationstiter'Serum neutralization titre WochenWeeks nachafter der Impfungthe vaccination 55 bb 77th 256256 512512 88th -- 512512 Wochen nachWeeks after d.Angriffd.Attack 512512 οο Tier NrAnimal no Subeinheits-Subunit 22 33 10241024 10241024 10241024 (3)(3) 512512 roro Impfstoffvaccine <2<2 VV 256256 128128 128128 11 22 256256 σ>σ> Gruppegroup <2<2 <2<2 < 2 < 2 < 2 < 2 128128 128128 128128 128128 οο 11 Vergleichcomparison < 2<2 <2<2 <2<2 4. 2 4. 2 < 2<2 <2<2 1616 22 22 <2<2 < 2 < 2 <2<2 <2<2 <2<2 512512 512512 512512 <2<2 3232 512512 33 ^ 2^ 2 <2<2 <2<2 <2<2 256256 256256 256256 <2<2 1616 512512 44th <2L<2L <2<2 256256 256256 128128 <2<2 3232 256256 Gruppegroup <2<2 1616 1616 3232 - nicht anwendbar- not applicable (2)(2) 256256 55 Triton X-100Triton X-100 <2<2 <2<2 88th 1616 1616 128128 512512 66th 33 1 Dosis1 dose 22 88th 1616 1616 256256 512512 77th <2<2 44th 1616 3232 3232 512512 ωω 88th <2<2 22 128128 512512 OO Gruppegroup <2<2 6464 3232 6464 99 NP-40NP-40 <2<2 22 3232 3232 6464 128128 256256 σ>σ> 1010 44th 1 Dosis1 dose <2<2 <2<2 6464 3232 6464 128128 512 ,512, σ>σ> 1111 22 6464 3232 6464 256256 512512 ^*^ * 1212th <2<2 44th 256256 256256 1024 !S1024! S οο Gruppegroup <2<2 1616 6464 3232 10241024 II. caapprox 1313th Triton X-100Triton X-100 <2<2 22 1616 3232 6464 256256 512512 ωω 1414th 55 2 Dosen2 cans <2<2 22 88th 88th 88th 128128 512512 1515th 22 88th 1616 1616 6464 1616 <2<2 22 256256 128128 Gruppegroup <2<2 88th 3232 3232 256256 1717th NP-40NP-40 <2<2 22 88th 6464 6464 256256 256256 1818th 2 Dosen2 cans < 2<2 22 3232 3232 6464 128128 256256 1919th <2<2 1616 1616 1616 128128 2020th 22 128128

Tabelle E Virusisollerung nach dem intranasalen Angriff von Kälbern, die mit Triton X-100 und NP-40 solubilisiertem IBR subviralem Impfstoff geimpft worden sind Table E Virus isolation after intranasal attack in calves vaccinated with Triton X-100 and NP-40 solubilized IBR subviral vaccine

Gruppe/ Tier Nr. Group / animal no.

Subeinheitsimpf stoff Subunit vaccine

Virustiter *■' 2 3 4 Virus titer * ■ ' 2 3 4

Tage nach dem AngriffDays after the attack

7 8 9 10 11 12 15 147 8 9 10 11 12 15 14

Gruppe 1 VergleichGroup 1 comparison

4 Gruppe 2 Triton X-100 5 1 Dosis4 Group 2 Triton X-100 5 1 dose

Gruppe 3 NP-40 91 DosisGroup 3 NP-40 91 dose

Gruppe 4 Triton X-100 13 2 DosenGroup 4 Triton X-100 13 2 cans

Gruppe 5 NP-40 17 2 Dosen 18Group 5 NP-40 17 2 cans 18

3,83.8 5,35.3 7,47.4 7,07.0 6,76.7 5,85.8 5,55.5 3,23.2 2,52.5 2,32.3 5,05.0 5,75.7 7,27.2 7,37.3 6,06.0 6,26.2 6,06.0 3,03.0 3,03.0 4,84.8 6,86.8 7,07.0 6,86.8 6,36.3 5,95.9 4,04.0 3,73.7 5,75.7 7,77.7 7,37.3 7,07.0 6,06.0 5,55.5 3,43.4 3,03.0 «.«. .... 3,03.0 5,05.0 5,85.8 - ,7-, 7 5,95.9 " -- 3,03.0 3,73.7 5,55.5 6,06.0 5,35.3 5,05.0 -- -- 2,32.3 2,32.3 4,24.2 6,76.7 5,65.6 5,85.8 4,04.0 -- -- 2,92.9 1,81.8 1,51.5 mmmm -- 1,01.0 4,64.6 4,84.8 5,05.0 3,23.2 4,34.3 2,52.5 - 1,31.3 1,71.7 4,04.0 3,03.0 4,74.7 4,04.0 1,81.8 -- 1,01.0 3,43.4 4^74 ^ 7 5,25.2 4,54.5 4,54.5 1,61.6 -- 1,01.0 3,53.5 5,85.8 6,06.0 6,06.0 4,54.5 2,72.7 --

1,5 1,9 1,21.5 1.9 1.2

2,3 1,62.3 1.6

2,9 2,62.9 2.6

3,7 4,6 5,6 4,8 1,5 -3.7 4.6 5.6 4.8 1.5 -

3,0 2,93.0 2.9

Fußnoten zu Tabelle DFootnotes to Table D

(1) Der Titer wird ausgedrückt als der reziproke Wert der höchsten Serumverdünnung, die die Plättchenzählung um mindestens 5O# verringert.(1) The titer is expressed as the reciprocal of the highest serum dilution that the platelet count decreased by at least 50 #.

(2) Das Kalb starb am 58. Tag nach der Impfung.(2) The calf died on the 58th day after vaccination.

(3) Intranasaler Angriff mit 1 χ 10 PFU Cooper-Stamm IBR-Virus, verabreicht 30 Tage nach der letzten Impfstoff dosis.(3) Intranasal attack with 1 10 PFU Cooper strain IBR virus given 30 days after the last dose of vaccine.

Fußnoten zu Tabelle EFootnotes to Table E

(1) Virustiter als 1Og10 plättchenbildende Einheiten/Nasal-Wattebausch .(1) Virus titer as 10 g 10 platelet-forming units / nasal cotton ball.

(2) Wenn keine Werte angegeben sind, wurde kein Virus beobachtet.(2) If no values are given, no virus was observed.

Der Ausdruck "Verhinderung der IBR-Krankheit" bedeutet, daß der Impfstoff die Rinder gegenüber der Entwicklung klinischer Anzeichen der Krankheit schützt, wenn sie mit virulentem IBR-Virus angegriffen werden. Bei Vieh, insbesondere bei Rindvieh, ist das hauptsächliche klinische Anzeichen der Krankheit eine Temperaturerhöhung auf 39,7°C (1O3,5°F) oder höher während 2 oder mehrerer Tage. Geimpftes Vieh nach dem Angriff kann, obgleich es keine klinischen Anzeichen der Krankheit zeigt, virulentes IBR-Virus beherbergen, wodurch eine Infektion auf andere, nichtgeimpfte Rinder übertragen werden kann. Wenn daher in der vorliegenden Anmeldung von "Verhinderung oder Prophylaxe der IBR-Infektion" gesprochen wird, bedeutet dies, daß der Impfstoff ebenfalls eine Verbreitung des Virus verhindert wie auch gleichzeitig die Krankheit verhindert. Dieses Ergebnis ist neu und überraschend. The term "preventing IBR disease" means that The vaccine protects the cattle from developing clinical signs of the disease when they are virulent IBR virus are attacked. In livestock, especially cattle, the main clinical sign is the Illness an increase in temperature to 39.7 ° C (1O3.5 ° F) or higher for 2 or more days. Vaccinated cattle after the attack may, although there are no clinical signs of Disease shows harboring virulent IBR virus, causing infection to be transmitted to other, non-vaccinated cattle can be. Therefore, when "prevention or prophylaxis of IBR infection" is spoken of in the present application, it means that the vaccine is also one Prevents the spread of the virus as well as preventing the disease at the same time. This result is new and surprising.

Ende der Beschreibung.End of description.

■4■ 4

030066/0733030066/0733

Claims (10)

PatentansprücheClaims 1. Parenteraler Impfstoff in injizierbarer Dosisform für die Prophylaxe bei Rindern von infektiöser Rinderrhinotracheitis (IBR), dadurch gekennzeichnet, daß er ein IBR virales Umhüllungsprotein in einer Menge, die wirksam ist, die IBR Krankheit zu verhindern, enthält, wobei das virale Umhüllungsprotein durch Vermehrung virulenter IBR-Viren in einem Zell-Mediumgemiseh,das die Vermehrung des Virus aktiviert, Abtrennung der infizierten Zellen aus dem Gemisch, Behandlung der zellularen Membran der abgetrennten Zellen mit einer wäßrigen Lösung eines nichtionischen Detergens unter Bildung einer wäßrigen Lösung des viralen Umhüllungsproteins und Abtrennung der wäßrigen Lösung von dem nichtsolübilisierten Rückstand erhalten worden ist.1. Parenteral vaccine in injectable dosage form for prophylaxis in cattle of infectious bovine rhinotracheitis (IBR) characterized in that it contains an IBR viral envelope protein in an amount effective to prevent IBR disease, the viral envelope protein by replication virulent IBR viruses in a cell medium mixture that activates the replication of the virus, separation of the infected cells from the mixture, treatment of the cellular membrane of the separated cells with an aqueous solution of a nonionic detergent to form an aqueous solution of the viral envelope protein and separation of the aqueous solution has been obtained from the unsolubilized residue. 030066/0733030066/0733 TELEFON (ΟΒΘ) 22 28 62 TELEX 0S-2Q3B0 TELEGRAMME MONAPHT TELEKOP1ERER TELEPHONE (ΟΒΘ) 22 28 62 TELEX 0S-2Q3B0 TELEGRAMS MONAPHT TELEKOP1ERER 2. Parenteraler Impfstoff nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die injizierbare Dosis ein Adjuvans für die Aktivierung des immunogenen Ansprechens der Rinder auf das virale Umhüllungsprotein enthält.2. Parenteral vaccine according to claim 1, characterized in that the injectable dose is an adjuvant for activating the cattle immunogenic response to the viral envelope protein. 3. Parenteraler Impfstoff in injizierbarer Dosisform für die Immunisierung von Vieh, insbesondere Rindvieh, gegen infektiöse Rinderrhinotracheitis (IBR) und für die Verhinderung einer Übertragung von IBR infektiösem Virus, dadurch gekennzeichnet, daß er eine wäßrige Lösung aus einem viralen IBR-Umhüllungsprotein im Gemisch mit einem mit Wasser unmischbaren öladjuvans enthält, wobei die Impfstoff dosis eine wirksame Menge an viraler Umhüllung für die IBR-Immunisierung und Prophylaxe der IBR-Virusausbreitung umfaßt:und aufeinanderfolgend in zwei Dosisformen pro Tier verabreicht wird, wobei das virale Umhül-lungsr ·._ protein erhalten worden ist durch Vermehrung virulenter IBR-Viren in einem Zellmedium, das die Vermehrung des Virus aktiviert, Abtrennung der infizierten Zellen aus dem Gemisch, Behandlung der zellularen Membranen aus abgetrennten Zellen mit. einer wäßrigen Lösung von nichtionischem Detergens unter Bildung einer wäßrigen Lösung aus viralem Umhüllungsprotein und Abtrennung der wäßrigen Lösung von dem nichtsolubilisierten Rückstand.3. Parenteral vaccine in injectable dosage form for the immunization of livestock, especially cattle, against infectious bovine rhinotracheitis (IBR) and for the prevention of transmission of IBR infectious virus, characterized in that it is an aqueous solution of a viral IBR envelope protein in admixture with a Water-immiscible oil adjuvant containing the vaccine dose an effective amount of viral coating for IBR immunization and prophylaxis of IBR virus spread comprises: and administered sequentially in two dosage forms per animal, the viral enveloping agent · ._ protein has been obtained by replicating virulent IBR viruses in a cell medium that allows the virus to replicate activated, separation of the infected cells from the mixture, treatment of the cellular membranes from separated ones Cells with. an aqueous solution of nonionic detergent to form an aqueous solution of viral envelope protein and separate the aqueous solution from the unsolubilized residue. 4. Parenteraler Impfstoff nach Anspruch 3t dadurch gekennzeichnet, daß die abgetrennte, wäßrige Lösung von Untereinheitsprotein im Impfstoff ohne Konzentrierung des Proteins darin verwendet wird.4. Parenteral vaccine according to claim 3t, characterized in that the separated, aqueous solution of subunit protein is used in the vaccine without concentrating the protein therein. 5. Parenteraler Impfstoff nach Anspruch 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, daß jede der Dosisformen ein Volumen von im wesentlichen 2 ml aufweist und daß jede Dosis 4 bis 8 mg Gesamtprotein enthält.5. Parenteral vaccine according to claim 3 or 4, characterized in that each of the dosage forms has a volume of essentially 2 ml and that each dose contains 4 to 8 mg of total protein. 030068/0733030068/0733 6. Parenteraler Impfstoff nach Anspruch 3> A oder 5, dadurch gekennzeichnet, daß er frei von aktivem IBR-Virus ist.6. Parenteral vaccine according to claim 3> A or 5, characterized in that it is free from active IBR virus is. 7. Verfahren zur Verhinderung von Infektionen von Vieh, insbesondere Rindvieh, durch infektiöses Rinderrhinotracheitis-Virus (IBR-Virus) und Übertragung des IBR-Virus durch Virusverbreitung, dadurch gekennzeichnet, daß man mindestens zwei aufeinanderfolgende Dosen des Impfstoffs verabreicht, der eine Menge an viralem IBR-Umhüllungsprotein enthält, die die Krankheit wirksam verhindert, wobei das virale Umhüllungsprotein erhalten worden ist durch Vermehrung virulenter IBR-Viren in einem Zellmediumgemisch, das die Vermehrung des Virus aktiviert, Abtrennung der infizierten Zellen aus dem Gemisch, Behandlung der zellularen Membranen der abgetrennten Zellen mit einer wäßrigen Lösung eines nichtionischen Detergens unter Bildung einer wäßrigen Lösung aus viralem Umhüllungsprotein und Abtrennung der wäßrigen Lösung von dem nichtsolubilisierten Rückstand.7. A method for preventing infection of cattle, especially cattle, by infectious bovine rhinotracheitis virus (IBR virus) and transmission of the IBR virus by virus spread, characterized in that at least two consecutive doses of the vaccine containing an amount of IBR viral envelope protein are administered which effectively prevents the disease, the viral envelope protein having been preserved by replication of virulent IBR viruses in a cell medium mixture that activates the replication of the virus, separation the infected cells from the mixture, treating the cellular membranes of the separated cells with a aqueous solution of a nonionic detergent to form an aqueous solution of viral envelope protein and separating the aqueous solution from the unsolubilized residue. 8. Verfahren nach Anspruch 7» dadurch gekennzeichnet, daß der Impfstoff ein Adjuvans für die Aktivierung des immunogenen Ansprechens enthält.8. The method according to claim 7 »characterized in that the vaccine is an adjuvant for the activation of the contains immunogenic response. 9. Verfahren nach Anspruch 7 oder 8, dadurch gekennzeichnet, daß jede der Dosen 4 bis 8 mg Gesamtprotein enthält. 9. The method according to claim 7 or 8, characterized in that each of the doses contains 4 to 8 mg of total protein. 10. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß sich der Impfstoff weiter dadurch auszeichnet, daß er frei an aktivem IBR- Virus ist.10. The method according to claim 7, characterized in that the vaccine is further characterized in that it is free of active IBR virus. Q30068/0733Q30068 / 0733
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