DE3010400A1

DE3010400A1 - Verfahren zur klinischen trennung von (alpha) - und (beta) -lipoproteinen

Info

Publication number: DE3010400A1
Application number: DE19803010400
Authority: DE
Inventors: Craig L Bentzen
Original assignee: Symphar SA
Current assignee: Symphar SA
Priority date: 1979-10-22
Filing date: 1980-03-18
Publication date: 1981-04-23
Also published as: WO1981001199A1; US4309188A; GB2061282A; GB2061282B; EP0039346A1

Description

Zusammenfassung

Die Erfindung betrifft ein Trennungsverfahren, bei dem eine Serum- oder Plasmaprobe auf eine Mikrosäule aufgegeben wird, die einen Träger enthält, an dem ein sulfatiertes Polysaccharid, vorzugsweise Heparin, !covalent gebunden ist, so daß die ß-Lipoproteine aus der Probe entfernt werden, indem sie an diesen Liganden gebunden werden, wonach die Mikrosäule mit einer ersten Pufferlösung von bestimmtem pH-Wert gewaschen und das Eluat, das eine erste Fraktion der Probe darstellt, die den o(-Lipoproteinanteil enthält, gesammelt wird. Danach wird die Mikrosäule mit einer zweiten Pufferlösung von bestimmtem pH-Wert gewaschen, so daß die an den Liganden gebundenen ß-Lipoproteine in Freiheit gesetzt und eine zweite Fraktion, die den ß-Lipoprotein-Anteil der Probe enthält, gewonnen wird. Danach ist es möglich, das o(- und ß-Lipoprotein-cholesterin getrennt sowie die entsprechenden o(/ ß-Verhältnisse von Phospholipiden, Triglyceriden und verschiedenen Apoporteinen zu bestimmen und die entsprechenden o( /ß-Verhältnisse zu berechnen, die sämtlich für die klinische Diagnostik nützliche Daten darstellen und die Erzielung eines vollständigen Lipoprotein-Profils gestatten.

Die Erfindung betrifft außerdem einen Geräte- und Reagentiensatz, der in einem transportablen Kasten sämtliche zurleichten und raschen Durchführung des Verfahrens erforderlichen Gerätschaften und vorbereiteten Reagentien umf a ßt.

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur klinischen Trennung von o( -Lipoproteinen (der Hauptkomponente der Lipoproteine mit hoher Dichte (HDL)) und ß-Lipoproteinen (der Hauptkomponente der Lipoproteine mit sehr geringer Dichte (VLDL) sowie der Lipoproteine mit niedriger Dichte (LDL)) im Serum oder Plasma unter Verwendung von Mikrosäulen. Die Erfindung betrifft außerdem einen Geräte- und Reagentiensatz, der die Materialien und Produkte zur Durch-

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&AD nt-,,

C _

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führung der erwähnten Trennung und der entsprechenden Analyse umfaßt.

Das Verfahren zur Trennung von o(- und ß-Lipoproteinen in zwei getrennte, lösliche Fraktionen ermöglicht es, unmittelbar ein vollständiges Profil der beiden Hauptklassen der Lipoproteine aufzustellen, indem man in den entsprechenden Fraktionen die Konzentrationen an Cholesterin, Phospholipiden, Triglyceriden und Apoproteinen feststellt. Im Fall von Cholesterin kann das erhaltene Verhältnis von o( -Lipoproteincholesterin (im folgenden als d LP-c bezeichnet) zu ß-Lipoproteincholesterin (im folgenden als ß LP-c bezeichnet) ■■ außerdem

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vom Kliniker als wichtige diagnostische Kennzahl verwendet werden (Castelli et al. Circulation 55, 767, 1977).

Außerdem sind Veröffentlichungen bekannt, die die an Boden gewinnende Konzeption unterstützen, daß die entsprechenden o( /ß-Verhältnisse von Phospolipiden, verschiedenen Apoproteinen und Triglyceriden ein Maß für die Membranbeweglichkeit (membrane fluidity) und den Lipidumsatz darstellen (A. Casu, Italian Journal Biochemistry 28, 26, 1979; Alaupovic et al., Abst. American Society for the Study of Atherosclerosis 33rd, 2, 1979). Daher kann das Gesamtlipoproteinprofil dazu benutzt werden, das Vorhandensein oder die Wirksamkeit von Einzelfaktoren zu bewerten, die für die Entwicklung von Artheriosklerose und Krankheiten der Herzkranzgefäße verantwortlich sind, sowie als Verfahren zur überwachung von therapeutischen Erfolgen.

Das herkömmliche Verfahren zur Auftrennung der Lipoproteine ist die Ultrazentrifugierung gemäß R.J. Havel et al, J. Clin. Invest. 34, 1345, 1955), die durch BECKMAN als das System zur Aufstellung eines Lipoproteinprofils ("Lipoprotein Profiling System") weiterentwickelt worden

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ist. Die Nachteile dieses Verfahrens bestehen darin, daß es zeitraubend und kostspielig (aufwendige Einrichtung für die Ultrazentrifugierung) ist und daß ihm die Spezifität mangelt, da die Auftrennung lediglich aufgrund der Dichte erfolgt (S. Eisenberg, Atherosclerosis Reviews, Band 1, Seite 23, 1976, Ed. R. Paoletti und A.M. Goho Jr., Raven Press, New York). Außerdem können durch die ultrazentrifugierung die physikalischen sowie die chemischen Eigenschaften der Lipoproteine verändert werden (R.W. Mahley und K.S. Holcombe, J. of Lipid Rs. 18, 314, 1977).

Eine zweite Art bekannter Auftrennungsverfahren bedient sich immunologischer Methoden, wie beispielsweise der radialen Immunodiffusion (R.S. Lee, Sciences 169, 492, 1970 der sogenannten Raketenimmunoelektrophorese (rocket immunoelectrophoresis; P.N. Durrington et al., Clin. Chem. Acta 71, 95, 1976) sowie der Radioimmunoassays (RIAs). Jedoch sind sämtliche derartige immunologische Verfahren ebenso kostspielig (spezialisierte Einrichtungen) und zeitaufwendig, und in manchen Fällen fehlt auch dem Antikörper die Spezifität, so daß das Verfahren nicht zur Herstellung einer relevanten chemischen Kennzahl verwendet werden kann. Da außerdem das Verfahren zur Herstellung der Antikörper kompliziert und aufwendig ist, ist auch der Preis für Antihumanlipoprotein hoch.

Weiter ist ein Verfahren zur Bestimmung von HDL-Cholesterin bekannt, bei dem die Apoproteine und ß-Proteine (apo-ß-containing lipoproteins) durch zweiwertige Kationen und Polysaccharide ausgefällt werden, beispielsweise durch MnCl₂ und Natriumheparin (A.S. Bachorik et al., Clin. Chem. 22, 1828, 1976 und S.R. Srinivasan et al.. Arch. Biochem. Biophys. 170, 334, 1975). Dieses Verfahren ist billig und schnell/ jedoch besteht sein Hauptnachteil darin, daß ihm die Spezifität der Ausfällung fehlt. Beispielsweise haben Srinvasan und Mitarbeiter gefunden, daß bei Erhöhung der Mn -Konzentration eine Ausfällung

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der o( -Lipoproteine (HDL) erfolgen kann. Außerdem zeigen jüngere Arbeiten von G.R. Warnick und J.J. Albers, J. of Lipid Res. 19, 65, 1978 und Clin. Chern. 25/4, 596, 1979, daß die Sedimentierung von ß-Lipoproteinen aus Plasmaproben von Patienten mit überhöhtem Triglyceridgehalt im Blut unvollständig ist, wenn die normalen Konzentrationen an Mn -Heparin angewandt werden.

Neuerliche Arbeiten haben außerdem bestätigt, daß HDL-Cholesterin ein unabhängiger, das Risiko verringernder Faktor ist. D.h., daß Personen mit hohen HDL-Cholesterin-Werten besonders wenig an Herzkranzgef'ißerkrankunqen leiden(S. Eisenberg, Atherosclerosis Reviews, Band 1, Seite 23, 1976, Ed. R. Paoletti und A.M. Goho Jr., Raven Press, New York) . Je mehr man sich der Bedeutung des o( -Lipoprotein-Cholesterins als eines unabhängigen negativen Risikofaktors für HerzkranzgefMßerkrankungen bewußt wird, desto mehr besteht ein Bedürfnis nach einem selektiven, raschen und billigen Verfahren zur Auftrennung und quantitativen Erfassung von o( -Lipoproteinen, das selbstverständlich auch weiter die individuelle quantitative Erfassung des Ohole sterins vom ß-Lipoproteintyp in einem zweiten Hauptschritt des Verfahrens gestattet. Tatsächlich werden erhöhte Werte für ß-Lipoprotein-Cholesterin bei der Entwicklung von Herzkranzgefäßerkrankungen beobachtet, die häufig mit schlechten Ernährungsgewohnheiten vergesellschaftet sind (J.W. Gofman et al., Circulation 34, 679, 1966).

Es wurde nun ein einfaches, rasch arbeitendes und billiges Mikrosäulenverfahren zur klinischen Auftrennung von o( - und ß-Lipoproteinen im Serum oder Plasma gefunden, das auf der Spezifität von sulfatierten Polysacchariden und insbesondere von Heparin hinsichtlich der Bindung der Lipoproteine vom ß-Typ beruht.

Gegenstand der Erfindung ist daher ein Verfahren zur klinischen Trennung von o( - und ß-l«ipoproteinen im Serum oder Plasma, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man

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eine Serum- oder Plasmaprobe auf eine Mikrosäule aufbringt, die einen Träger enthält, der ein sulfatiertes PoIysaccharid, vorzugsweise Heparin, gebunden enthält, so daß die ß-Lipoproteine von der Probe entfernt werden, indem man sie an den Liganden bindet, anschließend die Mikrosäule mit einer ersten Pufferlösung von bestimmtem pH-Wert wäscht und das Eluat, das eine erste Fraktion mit dem o( -lipoprotein-Anteil der Probe enthält, sammelt und anschließend die Mikrosäule mit einer zweiten Pufferlösung von bestimmtem pH-Wert wäscht, so daß die an den Liganden gebundenen ß-lipoproteine in Freiheit gesetzt und eine zweite Fraktion, die den ß-Lipoprotein-Anteil der Probe enthält, gewonnen wird.

Das Verfahren läßt sich auf die Bestimmung des Verhältnisses von o( -Üpoprotein-Cholesterin zu ß-Lipoprotein-Cholesterin anwenden, das als diagnostische Kennzahl in der Klinik verwendbar ist.

Weiter läßt sich das erfindungsgemäße Verfahren auf die quantitative Bestimmung von o( - und ß-Lipoprotein-Lipiden sowie Proteinkomponenten, wie Phospholipiden, Triglyceriden, Λρο-C-III- und Apo-E-proteinen, anwenden, die die Herstellung eines vollständigen Lipoproteinprofils erlauben, das in der klinischen Diagnostik ebenfalls von großem Wert.ist.

Gegenstand der Erfindung ist schließlich ein Geräte- und Reagentiensatz zur Durchführung des Trennungsverfahrens, der in einem transportablen Kasten ein Gestell, eine Anzahl Mlkrosäulen mit einem sulfatierten Polysaccharid, vorzugsweise Heparin, das an einen unlöslichen Träger gebunden ist und ggf. mit einem besonderen inerten Filterschwamm an Ort und Stelle gehalten wird, sowie Behälter umfaßt, die geeignete, vorgewogene Chemikalien zur Herstellung der entsprechenden Pufferlösungen enthalten . Der Träger, der mit dem Liganden kovalent gebunden ist, besteht vorzugsweise aus Agarose, wie beispielsweise

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Sepharose.

Typischerweise ist das Heparin, das an den aus Aqarose bestehenden Träger gebunden ist, in einer Menge von 6 bis 10 mg Trockengewicht Heparin (vom Schwein), entsprechend etwa 150 USP-JA-Einheiten/mg, auf 1 g Feuchtgewicht Agaröse vorhanden.

Im folgenden bezeichnen die Lösungen A und B Lösungen mit unterschiedlicher Konzentration an Natriumchlorid, beispielsweise für A in einem Bereich von 0,140 bis 0,165 M und für Lösung B in einem Bereich von 0,5 bis 1,5 M; die Lösungen enthalten Puffersalze wie Natriumphosphate, die einen pH-Wert-Bereich von 6,0 bis 6,5 erzeugen.

Die Erfindung wird im folgenden anhand von Beispielen näher erläutert.

Beispiel 1

In einem Gestell wurden Mikrosäulen mit Sepharose als Träger, an dem 0,6 % Heparin kovalent gebunden sind, senkrecht aufgestellt und vorbereitet, indem man sie mit jeweils mit 3 - 5 ml der Pufferlösung A (pH - 6,2; mit 0,15 M Natriumchlorid) wusch und abtropfen ließ, bis keine Lösung mehr auf der Oberseite des Trägers zurückgeblieben war.

Danach wurden 50(_yjl der zu analysierenden Serum- oder Plasmaprobe auf jede Säule aufgebracht und vollständig in den Träger eindringen gelassen.

Danach wurden 2 ml der Pufferlösung A auf die Säule aufgegeben und das gesamte Eluat gesammelt. Das gesammelte Eluat (2,5 ml) enthielt die o( -Lipoproteine der Probe (Röhre 1; d -Fraktion).

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Danach wurden 3 ml der Pufferlösung B (pH = 6,5; mit 0,5 M Natriumchlorid) durch die Säule hindurchgegeben und in ein weiteres Auffanggefäß (Röhre 2) eluiert; diese Lösung enthielt die Lipoproteine vom ß-Typ (ß-Fraktion).

Um das Verhältnis d. LP-c/ßLP-c zu erhalten, werden je nach der angewandten Cholesterinbestimmungsmethode entsprechende aliquote Mengen aus den Röhren 1 und 2 entnommen und auf ihren Cholesteringehalt analysiert. Die meisten Arten der Cholesterinbestimmungen können verwendet werden, beispielsweise die Bestimmung von Cholesterin durch die enzymatische Cholesterinoxydase-Reaktion gemäß R.J. Henry und M. Henry, Clin. Chem. 2.Aufl., 1440, 1974, Harper und Row Publ., New York), die mit Hilfe von beispielsweise dem Produkt 14350 der Merck Diagnostika oder dem Produkt 172626 der Böhringer-Diagnostic s ablaufen gelassen werden kann.

Aus dem folgenen Beispiel geht die Spezifität des Verfahrens gemäß der Erfindung zur Erzeugung entsprechender Lipoprotein-Profil-Daten hervor, die klinisch verwendet werden können.

Beispiel 2

Frisches menschliches Serum wurde von einem normalen Individuum erhalten. Die o( - und ß-Fraktionen wurden sieben aufeinanderfolgende Tage lang täglich genau in der Weise erhalten, wie oben beschrieben.

Cholesterin (c)

Zur Aufstellung des Verhältnisses wurden jeweils 100/Ul der o( - und ß-Fraktionen mit jeweils 2 ml des Cholesterinreagenzes gemäß "Cholesterol Monotest" (Chod-PaP-Methode) Nr. 237 574 (Böhringer Mannheim) vermischt.

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Nach 30 Minuten Bebrüten bei Raumtemperatur wurde das Umsetzungsgemisch in einer 1-cm-Küvette bei einem Quecksilberlicht von 546 nm spektrophotometrisch ausgewertet. Gesamtcholesterin: 0,02 ml + 2 ml Reagenz = O.D.x 924 = c.mg/dl

o( : 0,100 ml + 2 ml Reagenz = >0.D. χ 924 = c. mg/dl

On ν Q94 ν ^

ß : 0,100 ml + 2 ml Reagenz => ■ = c. mg/dl

ί , D

Blindprobe: 0,1 ml Lösung A + 2 ml Reagenz

Die Einzelergebnisse in mg pro 100 ml, die statistische Auswertung und die entsprechenden Verhältnisse d / ß für den siebentägigen Versuch wurden in der folgenden Tabelle 1-A zusammengefaßt.

Phospolipide (PL)

Die Phospholipidwerte (PL) wurden sowohl in den d - als auch in den ß-Fraktionen unter Anwendung des Kombi nationsjtestes Phosphor/Phospholipid Nr. 124 974 der Firma Böhrinqor bestimmt. 1 ml jeder Fraktion wurde mit 4 ml 20%iger TrJ-chloressigsäure vermischt, um sämtliche Lipoproteine auszufällen. Die Röhrchen wurden 15 Minuten bei 3000 U/min zentrifugiert, wonach die überstehende Flüssigkeit abpipettiert wurde. Jedem Röhrchen wurden 0,5 ml Perchlorsäure und 0,2 ml Wasserstoffperoxid zugesetzt und das Ganze 20 Minuten auf 180 bis 200°C in einem Heizblock erhitzt. Nach Abkühlen der Röhrchen wurden 2 ml destilliertes Wasser, 1 ml 0,28 N Ammoniumvanadat (Lösung 1) und 1 ml 2,5 N Ammoniummolybdat (Lösung 2) zugesetzt und das Ganze vermischt. Nach 10 Minuten Bebrüten bei Raumtemperatur wurde das Unisetzungsgemisch in einer 1-cm-Küvette bei 405 nm Quecksilberlicht abgelesen.

Gesaintphospholipide:

0,01 ml Probe «> ^{x 12}'⁵ " ^C

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d -PL : 1,0 ml Probe => x 12,5 = c.mg/dl

ß-PL : 1,0 ml Probe = > x 15,0 = O.D. *= optische Dichte

Die Einzelergebnisse in mg/100 ml, die statistische Auswertung und die entsprechenden Verhältnisse o( / ß für den siebentägigen Versuch sind in der folgenden Tabelle I-B zusammengefaßt.

Triglyceride (TG)

Die Triglycerldwerte (TG) wurden sowohl in der o( - als auch in der ß-Fraktion unter Anwendung des Kombinationstestes Triglyceride Nr. 126 012 der Firma Böhringer bestimmt. Eine Menge von 20 ml jeder der Fraktionen o( und ß wurde mit 1 ml vorbereitetem Reagenz (1+2+3)vermischt und das Ganze 10 Minuten bei Raumtemperatur bebrütet, wonach eine erste optische Dichte (E..) bei einem Quecksilberlicht von 340 nm gemessen wurde. Danach wurden 5 ml des Reagenzes 4 zugesetzt und das Ganze weitere 10 Minuten bei Raumtemperatur bebrütet, wonach eine zweite optische Dichte (E₂) gemessen wurde. Für eine als Bezugssubstanz dienende Blindprobe wurden zugleich die optischen Dichten ER₁ und ER₉ erhalten.

Gesamt-TG : 0,020 ml Probe = >4E~4ER χ 711 = mg/dl o( -TG : 0,200 ml Probe = > ^E-JßR χ 355,5 = gl/dl ß -TG : 0,200 ml Probe = > 4E-^ER χ 426,6 = mg/dl

Die Einzelergebnisse in mg/100 ml, die statistische Auswertung sowie die entsprechenden Verhältnisse o( /ß für den fünftägigen Versuch sind in der folgenden Tabelle I-C zusammengefaßt.

Apoproteine

Die Bestimmung der verschiedenen Apoproteine, d.h". A-I, A-II, B, C-I, C-II, C-III und E, kann durch Elektroimmunoassay, Radioimmunoassay und Bestimmungen aufgrund der

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radialen Iinmunodif fusion durchgeführt werden, wenn entsprechendes Antiserum zur Verfügung steht, wobei nach den allgemeinen Vorschriften vorgegangen wird, die von der Alaupovic-Gruppe angewandt werden (Curry et al., Clin. Chem. 24 (2), 280, 1978) .

TABELLE I

A. CHOLESTERIN

Test (Tag)	Gesamt-C,	o( C (mg/100	ßC ml)	o(/ ß- Index	Gewinnunq
1	230,5	66	161	0,415	98,4
2	231	73	175	0,42	107,2
3	241	73	170	0,43	99,5
4	241	70	170	0,41	98,6
5	229	69,5	164	0,42	1O1,6
6	240	74	166	0,44 *	99,7
7	245	71	17 3^5	„°χ41	⁹⁸JL⁹
Mittelwert	236,8	70,9	168,5	0,42	100,5
	+ 6,4	+ 2,7	± ⁵	± 1r1	+ 3,1

B. PHOSPHOLIPIDE

Test (Tag)	Gesamt-PL	d PL	ßPL	98	o(/ ß -	• %
		(mg/100	ml)	94,5	Index	Gewinnunq
1	217	118	96	1,2	1OO
2	212	111	95,5	1,17	97
3	215	105,5	115,5	1 ,09	94
4	220	119	116	1,24	97,5
5	265	143,5	118,5	1,24	98
6	270	136	104,8	1,17	93,5
7	260	141	+ 11,1	1,19	100
Mittelwert	237	124,8	1,18	97,1
	+ 26,4	+ 15,2	+0,05	+ 2,4

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C. TRIGLYCERIDE

Test (Tag)	Gesamt-TG	o( TG (mg/100	BTG ml)	αί/ß- Index	% Gewinnur
1	67,5	27	34	0,79	90
2	74,6	25	39,6	0,63	87
3	72,5	25,5	39	0,65	90
4	87	27	40,5	0,66	78
5	86	25	40,5	0,61	76
Mittelwert	77,5	25,9	38,7	0,668	84
	+ 8,6	+ 1,09	J₁ 2,4	+ 0,07	+ 6,7

Die Verteilung und Zusammensetzung der Lipoproteine b.ei verschiedenen Krankheitszuständen beim Menschen wurde bereits 1955 von Havel, R.J. et al. (J.Clin. Invest. 34, 1345, 1955) untersucht. Bei der Untersuchung ihrer Ergebnisse (siehe folgende Tabelle II) wird klar, daß Änderungen in der Zusammensetzung und Verteilung (Verhältnis) von Lipiden, insbesondere von Cholesterin und Phospolipiden, unter den Hauptlipoproteinklassen kennzeichnend für bestimmte Krankheitszustände sind.

Selbstverständlich kann der Geräte- und Reagentiensatz gemäß der Erfindung auch die notwendigen Reagentien für eine derartige Bestimmung, wie oben beschrieben, enthalten,

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TABELLE H⁺

Diagnose LP-Cholesterin- LP-Phospolipid-

Index Index

α( LP- X	Normal	-c/ß LP-c 100	O( LP-PL/ß LP-PL
Nach Myocardinfarkt	38,5	1,21
Idiopathische Hyperlipid- ämie	25,9	0,77
Xanthoma tendinasum	7,8	0,4 3
Nephrotisches Syndrom	18,1	0,55
Infektiöse Hepatitis	8,2	0,13
Obstruktiver Ikterus	5,6	0,21
Primäre biliäre Zirrhose	7,1	0,27
4,0	0,11

Ergebnisse nach Havel et al. JCI 34, 1345, 1955

Die Erfindung führt zu den folgenden Vorteilen, insbesondere hinsichtlich der eingangs erwähnten bekannten Verfahren.

Die Abtrennungsmethode ist billig, da die Mikrosäulen mindestens 20 bis 30mal regeneriert werden können und keine weiteren Ausgaben für Geräte entstehen. Beispielsweise sind keine Einrichtungen zum Abtrennen der Lipoproteine, wie beispielsweise Zentrifugen oder Elektrophorese-Apparate, erforderlich.

Die Abtrennungsmethode ist rasch, da mindestens 30 Proben zur gleichen Zeit angesetzt werden können, und erfordert 4 5 Minuten bis zum Erhalt der o( - und ß-Fraktionen und anschließend 0,5 bis 2 Stunden je nach dem durchzuführenden Test (Cholesterin 30 Minuten).

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Sowohl o( - als auch ß-Lipoproteine bleiben in Lösung, wodurch eine unmittelbare Analyse der entsprechenden isolierten Lipid- und Proteinkomponenten ermöglicht wird (dies ist bei den Fällungsmethoden nicht der Fall)*

Das Volumen der benötigten Plasmaprobe ist gering (etwa 500 ml).

Das Verfahren ist zuverlässiger hinsichtlich der Erzielung eines genauen und reproduzierbaren Wertes für das Verhältnis von o( zu ß (nicht allein durch mathematische Subtraktion oder Vergleich mit Gesamtserumwerten).'

o( LP

Der - '- -Index ist für den Kliniker wertvoll zur Beurteilung der Herzkranzgefäßbedingungen des einzelnen Patienten. Ein einfaches Screening für viele Individuen und Patienten erlaubt eine frühere" Diagnosestellung sowie wahrscheinlich den Beginn der erforderlichen diätetischen oder therapeutischen Maßnahmen.

Die Ausrüstung zur Durchführung des TrennungsVerfahrens ist sehr einfach, billig und kann in Form eines Satzes in einem transportablen Kasten zusammengefaßt werden.

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Claims

■'.""; - 30 i U400 I'M. NlANWA. I ΕΠ^ίΐ! ΠιρΙ.-Ιημ.. Dipl.-Wiilsili -Ιιιρ SYMPHAR S.A. licieUeraiiija 15 81)00 München 1W 6, Chemin des Carpieres Telefon 08ι>/< >5 7(> is 1219 LE LIGNON, Genf/Schweiz Verfahren zur klinischen Trennung von o( - und ß-Lipoproteinen Patentansprüche

1. Verfahren zur klinischen Trennung von o( -Lipoproteinen und ß-Lipoproteinen im Serum oder Plasma, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Serum- oder Plasmaprobe auf eine Mikrosäule aufgibt, die einen Träger enthält, der ein sulfatiertes Polysaccharid gebunden enthält, so daß die ß-Lipoproteine aus der Probe entfernt werden, indem man sie an diesen Liganden bindet, anschließend die Mikrosäule mit einer ersten pH-Wert-Pufferlösung wäscht und das die erste Fraktion darstellende Eluat, das den ei -Lipoprotein-Anteil der Probe enthält, sammelt und daß man die Mikrosiiule weiter mit einer zweiten pH-Wert-Pufferlösunq wäscht, um die an den Liganden gebundenen ß-JLipoproteine in Freiheit zu setzen und eine zweite Fraktion, die den ß-Lipoprotein-Anteil der Probe enthält, zu gewinnen.

2. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , daß man als sulfatiertes Polysaccharid, das kovalent an den Träger gebunden ist, etwa 0,6 bis 1 ,JD Gewichtsprozent Heparin verwendet.

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3. Verfahren gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeic] η e t , daß man als Träger einen solchen vom Agarosetyp verwendet.

4. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeicl net, daß man als erste und zweite Lösungen 0,140 bis 0,165 M bzw. 0,5 bis 1,5 M Natriumchlorid mit einem Gehall an Puffersalzen von insbesondere Natriumphosphat verwendet, wodurch ein pH-Wert-Bereich von G,O bis 6,¹S erzielt wird.

5. Verfahren gemäß Anspruch 4, dadurch gekennzeicl net, daß man als erste Lösung eine solche vom pH-Wert von etwa 6,2 und als zweite Lösung eine solche vom pH-Wert von etwa 6,5 verwendet.

6. Anwendung des Trennungsverfahrens gemäß Anspruch 1 zur getrennten Bestimmung von o( -Lipoproteincholesterin und ß-Lipoproteincholesterin bzw. zur Berechnung des entsprechenden o( /ß-Verhältnisses als eines klinischen diagnostischen Indexes.

7. Anwendung des Trennungsverfahrens gemäß Anspruch 1 zur getrennten Bestimmung von o( -Lipoproteinphospholipid und ß-JLipoproteinphospholipid bzw. zur Berechnung des entsprechenden o( /ß-Verhältnisses als eines klinischen diagnostischen Indexes.

8. Anwendung des Trennungsverfahrens gemäß Anspruch 1 zur getrennten Bestimmung von d. -Lipoproteintriglyceriden und ß-Lipoproteintriglyceriden bzw. zur Berechnung des entsprechenden o( /ß-Verhältnisses als eines klinischen diagnostischen Indexes.

9. Geräte- und Reagentiensatz zur Durchführung des Trennungsverfahrens gemäß^'Anspruch 1, bestehend aus einem Halterungsgestell, einer Anzahl Mikrosäulen mit einem sulfatierten Polysaccharid, das an einen unlöslichen

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R,A,D ORIStINAL

einer Träger gebunden ist, und Behältern mit/ersten und einer zweiten pH-Wert-gepufferten Lösung in einem transportablen Kasten.

10. Geräte- und Reagentiensatz gemäß Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet , daß die Mikrosäulen ein Filter in Form eines inerten Schwammes aufweisen, um den Träger an Ort und Stelle zu halten.

11. Geräte- und Reagentiensatz gemäß Anspruch 9 oder 10, dadurch gekennzeichnet , daß etwa 0,6 bis 1,0 Gewichtsprozent Heparin als sulfatiertes PoIysaccharid kovalent an den Träger gebunden sind.

12. Geräte- und Reagentiensatz gemäß Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß der Träger in den Säulen vom Agarosetyp ist.

13. Geräte- und Reagentiensatz gemäß Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß die erste und zweite gepufferte Lösung 0,140 bis 0,165 M bzw. 0,5 bis 1,5 M Natriumchlorid ist, die Puffersalze, insbesondere Natriumphosphat enthält,die einen pH-Wert-Bereich von 6,0 bis 6,5 erzeugen.

14. Geräte- und Reagentiensatz gemäß Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß er außerdem Behälter mit Reagentien zur Durchführung von Cholesterin-, Phospholipid- und bzw. oder Triglyceridbestimmungen enthält.

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