DE2941080C2 - - Google Patents

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Cyclosporin G-Derivate der Formel I,

bedeutet, ein Verfahren zu ihrer Herstellung und sie enthaltende pharmazeutische Zubereitungen gemäß den vorstehenden Patentansprüchen.

Aus der DE-OS 26 48 121 sowie aus der US-PS 41 17 118 sind bereits Cyclosporinderivate bekannt. Die Cyclosporinderivate der vorliegenden Erfindung unterscheiden sich von den vorbekannten Cyclosporinen durch eine überraschende Überlegenheit hinsichtlich ihrer pharmakologischen Eigenschaften.

Die Züchtung läßt sich nach an sich bekannten Methoden für die Züchtung von analogen Stämmen, z. B. wie in Beispiel 1 beschrieben, durchführen.

Ein bevorzugtes Cyclosporin G produzierender Stamm ist der Stamm NRRL 8044 der Pilzspecies Tolypocladium inflatum Gams. Eine Kultur davon wurde beim United States Department of Agriculture (Northern Research and Development Division), Peoria, III., USA unter der Kulturnummer NRRL 8044 deponiert. Eine andere Kultur davon wurde beim Formentation Research Institute, Image, Chiba City, Japan, unter der Kulturnummer FRI FERM-P No. 2796 deponiert. Dieser Stamm wurde vormals der Pilzspecies Trichoderma polysporum (Link ex. Pers.) zugeordnet und ist z. B. in der GB-PS 14 91 509 beschrieben.

Für die Herstellung von Cyclosporin G lassen sich auch Stämme der Pilzspecies Tolypocladium inflatum Gams verwenden, wie sie z. B. durch Selektion oder Mutation des Pilzstammes NRRL 8044 unter der Einwirkung von Ultraviolett- oder Röntgenstrahlen oder durch Anwendung anderer Maßnahmen, z. B. durch Behandlung von Laboratoriumskulturen mit geeigneten Chemikalien, gewonnen werden können.

Cyclosporin G wird in an sich bekannter Weise isoliert, z. B. wie in Beispiel 1 beschrieben. Hierbei kann Cyclosporin G abgetrennt werden von gleichzeitig vorhandenen Naturprodukten, z. B. das weniger polares Cyclosporin D, das etwas polares Cyclosporin A (auch bekannt als S 7481/F-1), das polarere Cyclosporin B (auch bekannt als S 7481/F-2) und das noch polares Cyclosporin C.

Die Hydrierung von Cyclosporin G läßt sich nach an sich bekannten Methoden ausführen, z. B. durch katalytische Hydrierung.

Als Lösungsmittel kommen vorzugsweise Äthylacetat oder niedere aliphatische Alkohole, wie z. B. Methanol, Äthanol, Isopropanol, in Frage. Die Hydrierung erfolgt zweckmäßigerweise im neutralen Bereich bei Temperaturen zwischen 20 und 30°C und bei Atmosphärendruck oder wenig erhöhtem Druck. Als Katalysator kommt Platin, vorzugsweise Palladium, z. B. Palladium auf Kohle, in Frage.

Die Umlagerung von Cyclosporin G läßt sich nach an sich bekannten Methoden ausführen, vorzugsweise durch Säurebehandlung, beispielsweise mit starken organischen Säuren, z. B. mit Trifluoressigsäure, vorzugsweise Methansulfonsäure oder p-Toluolsulfonsäure.

Die Menge der starken Säure, die zur Isomerisierung angewendet wird, liegt vorzugsweise zwischen 1 und 4 Mol pro Mol Cyclosporin G.

Als Lösungsmittel kommen niedrige Alkohole, z.B. Methanol, halogenierte Kohlenwasserstoffe, z. B. Chloroform oder Äther, z. B. Dioxan, in Frage.

Die Reaktionstemperatur kann zwischen 20 und 65°C, vorzugsweise von 45 bis 55°C variieren.

Cyclosporin G, Dihydrocyclosporin G und Isocyclosporin G zeichnen sich durch interessante chemotherapeutische und pharmakologische Eigenschaften aus und können daher als Heilmittel verwendet werden.

Insbesondere zeichnen sich Cyclosporin G, Dihydrocyclosporin G und Isocyclosporin G durch eine immunosuppressive und entzündungshemmende Wirkung aus.

Cyclosporin G zeichnet sich durch eine ausgezeichnete Wirkung bei der Freund-Adjuvans-Arthritis aus. Bei der etablierten Arthritis übertrifft die Verbindung in ihrer Wirkungsstärke mit einer ED₅₀ von 10 mg/kg p. o. die strukturell verwandte, in der US-PS 41 17 118 beschriebene Verbindung S 7481/F-1, Cyclosporin A (ED₅₀ = 25 mg/kg p. o.).

Außerdem zeichnet sich Cyclosporin G durch eine starke immunosuppressive Wirkung aus. Im Lymphozytenstimulationstest nach Jánossy und Greaves [Clin. exp. Immunol. 9, 483 (1971) und 10, 525 (1972), zum Beispiel, wird in vitro eine 96%ige Hemmung der Proliferationsrate von mit Concanavalin A stimulierten Lymphozyten aus Mäusemilz bei einer Konzentration von 0,1 µg/ml festgestellt (Hemmung der Proliferationsrate mit Cyclosporin A: -78%).

Dihydrocyclosporin G zeichnet sich durch eine gute antiarthritische Wirkung aus (ED₅₀ = 27 mg/kg p. o. bei der etablierten Freund-Adjuvanus-Arthtritis). Von besonderem Interesse ist aber die relativ schwache Immunosuppressive Wirkung dieser Verbindung (Hemmung der Proliferationsrate im Lymphozytenstimulationstest: 51%. Diese Eigenschaft ist von großer Wichtigkeit, da von einem Antiarthritikum erwartet wird, daß es die Lymphozyten möglichst unbeschädigt läßt.

Isocyclosporin G ist in seiner antiarthtritischen und immunosuppressiven Wirkung mit Cyclosporin G vergleichbar.

Als Heilmittel können Cyclosporin G, Dihydrocyclosporin G und Isocyclosporin G allein oder in geeigneter Arzneiform mit pharmazeutisch indifferenten Hilfsstoffen verabreicht werden.

In den nachfolgenden Beispielen erfolgen alle Temperaturangaben in Celsiusgraden.

Beispiel 1 Cyclosporin G

500 Liter einer Nährlösung, die pro Liter 40 g Glucose, 2,0 g Natriumcaseinat, 2,5 g Ammoniumphosphat, 5 g MgSO₄ · 7 H₂O, 2 g KH₂PO₄, 3 g NaNO₃, 0,5 g HCl, 0,01 g FeSO₄ und entmineralisiertes Wasser enthält, werden mit 50 Liter einer Vorkultur des Stammes NRRL 8044 angeimpft und in einem Stahlfermenter unter Rühren (170 UPM) und Belüftung (1 Liter Luft/Min./Liter Nährlösung) 13 Tage bei 27° inkubiert (siehe DE-OS 24 55 859).

Die Kulturbrühe wird mit der gleichen Menge n-Butylacetat ausgerührt, nach Abtrennung der organischen Phase wird diese im Vakuum konzentriert und der Rohextrakt durch 3stufige Verteilung zwischen Methanol-Wasser (9 : 1) und Petroläther entfettet. Die methanolische Phase wird abgetrennt, im Vakuum konzentriert und das Rohprodukt durch Zugabe von Wasser ausgefällt. Das nach der Filtration gewonnene Material wird an der 5- bis 7fachen Menge Sephadex LH-20 mit Methanol als Elutionsmittel chromatographiert. Die Spitzenfraktionen werden anschließend an Kieselgel 60, Korngröße 0,063-0,2 mm (Merck) mit Hexan-Aceton (2 : 1) chromatographiert, wobei die zuerst eluierten Fratkionen vorwiegend Cyclosporin A und Cyclosporin D enthalten, die später eluierten Anteile vorwiegend Cyclosporin C. Zur weiteren Reinigung werden die Cyclosporin A- und D-haltigen Fraktionen aus der 2- bis 2,5fachen Menge Aceton bei -15° kristallisiert und anschließend durch zweimalige Chromatographie an Kieselgel 60, Korngröße 0,063-0,2 mm (Merck) weiter aufgetrennt, wobei die mit Hexan-Aceton (2 : 1) zuerst eluierten Fraktionen Cyclosporin D in stark angereicherten Form enthalten. Diese werden in der doppelten Aceton gelöst und bei -15° krsitallisieren lassen. Das dabei erhaltene Rohkristallisat besteht aus sehr stark angereichertem Cyclosporin D, die Mutterlauge enthält neben Cyclosporin D noch weitere Komponenten, so Cyclosporin G. Zur Gewinnung von Cyclosporin G wird die zur Trockne verdampfte Mutterlauge an Kieselgel 60, Korngröße 0,063-0,2 mm (Merck) mit wassergesättigtem Essigester chromatographiert, wobei die zuerst eluierten Fraktionen Cyclosporin D enthalten, und die später eluierten Fraktionen Cyclosporin G im Gemisch neben weiteren Komponenten. Zur weiteren Anreicherung wird das Gemisch zuerst an Kieselgel 60, Korngröße 0,063-0,2 mm (Merck) mit Chloroform-Methanol (98 : 2) und anschließend zur Auftrennung mit Hexan-Aceton (2 : 1) chromatographiert; dabei enthalten die späteren eluierten Fraktionen Cyclosporin G in sehr stark angereicherter Form. Zur Reingewinnung werden die Cyclosporin G-Anteile zweimal aus Äther-Petroläther (1 : 1) bei Raumtemperatur kristallisiert; sie liefern dünnschichtchromatographisch-einheitliches, reines (Reinheitsgrad <95%) Cyclosporin G als farblose Polyeder vom Smp. 193-194° (nach Trocknen der Kristalle im Hochvakuum bei 80° während 2 Stunden).

[α] = -245° (c = 1,00 in Chloroform)
-191° (c = 1,04 in Methanol)

UV-Spektrum in Methanol: Endabsorption
IR-Spektrum in Methylenchlorid: siehe Fig. 1
¹H-NMR-Spektrum in CDCl₃, 90 MHz, Tetramethylsilan als interner Standard: siehe Fig. 2.
Bruttoformel: C₆₃H₁₁₃N₁₁O₁₂

Beispiel 2 Dihydrocyclosporin G

700 mg Palladium-Kohle (10% Palladium) werden in 20 ml Äthanol während 30 Minuten vorhydriert. Zu dieser Suspension des Palladiumkatalysators wird die Lösung von 4,55 g Cyclosporin G in 60 ml Äthanol zugegeben und darauf bei 21° und einem Druck von 742 mm Quecksilbersäule bis zur beendeten Wasserstoffaufnahme hydriert. Anschließend filtriert man vom Katalysator ab und dampft das Filtrat im Vakuum bei 20 bis 40° zur Trockene ein. Der Rückstand besteht aus dünnschichtchromatographisch einheitlichen Dihydrocyclosporin G in Form eines weißen amorphen Pulvers vom Smp. 150-153° (nach Trocknen im Hochvakuum während 4 Stunden bei 80°).

Bruttoformel: C₆₃H₁₁₅N₁₁O₁₂
[α] = -232° (c = 0,64 in Chloroform)

UV-Spektrum in Methanol: Endabsorption
IR-Spektrum in Methylenchlorid: siehe Fig. 3
¹H-NMR-Spektrum in CDCl₃, 90 MHz, Tetramethylsilan als interner Standard: siehe Fig. 4.

Beispiel 3 Isocyclosporin G

Zur Lösung von 6,08 g Cyclosporin G in 40 ml absolutem Dioxan gibt man die Lösung von 1,20 g Methansulfonsäure in 20 ml Dioxan und hält das Gemisch bei 50° unter Feuchtigkeitsausschluß. Der Fortgang der Reaktion wird im Dünnschichtchromatogramm verfolgt [Polygram® SIL G-Folien, Chloroform-Methanol-Eisessig (90 : 6 : 4), Joddampf zur Sichtbarmachung]. Nach 16 Stunden wird auf Raumtemperatur gekühlt. Durch Zufügen von 1,13 g wasserfreiem Natriumacetat wird die Säure abgestumpft, nach Rühren während 45 Minuten das ausgeschiedene Salz abgenutscht und das Filtrat im Vakuum bei 45° eingedampft. Die 8,1 g Rückstand werden an 500 g Kieselgel, Merck, Korngröße 0,063-0,2 mm, chromatographiert, wobei zur Elution Chloroform-Methanol (98 : 2) dient. Die praktisch aus reinem Isocyclosporin G bestehenden Fraktionen werden vereinigt, im Vakuum bei 50° eingedampft und der Rückstand aus Äther bei +7° kristallisiert, wobei Isocyclosporin G vom Smp. 143-146° anfällt.

Bruttoformel: C₆₃H₁₁₃N₁₁O₁₂
[α] = -196° (c = 0,72 in Chloroform)
-128° (c = 0,73 in Methanol)

UV-Spektrum in Methanol: Endabsorption
IR-Spektrum in Methylenchlorid: siehe Fig. 5
¹H-NMR-Spektrum in CDCl₃, 90 MHz, Tetramethylsilan als interner Standard: siehe Fig. 6.

Claims (3)

1. Cyclosporin G-Derivate der allgemeinen Formel I,

2. Verfahren zur Herstellung der Cyclosporin G-Derivate nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man jeweils in an sich bekannter Weise den Stamm NRRL der Pilzspecies Tolypocladium inflatum Gams in Gegenwart eines Nährmediums züchtet, das entstandene Cyclosporin G isoliert, gegebenenfalls hydriert oder einer Umlagerung unterwirft.

3. Pharmazeutische Zubereitungen, enthaltend ein Cyclosporin G-Derivat nach Anspruch 1 allein oder mit pharmazeutisch indifferenten Hilfsstoffen.