DE2831579C3

DE2831579C3 - Tetrahydropyranylether von Daunomycin und Adriamycin, Verfahren zu ihrer Herstellung, sowie diese Verbindungen enthaltende pharmazeutische Zubereitungen

Info

Publication number: DE2831579C3
Application number: DE2831579A
Authority: DE
Inventors: Hiroshi Naganawa; Tomio Takeuchi; Kuniaki Tatsuta; Hamao Umezawa
Original assignee: Microbial Chemistry Research Foundation
Current assignee: Microbial Chemistry Research Foundation
Priority date: 1977-08-05
Filing date: 1978-07-18
Publication date: 1980-09-18
Also published as: NL7807906A; DK343878A; DK152677C; IE781566L; FI63420B; ATA561278A; GB2002754A; DE2831579B2; IT7868847A0; IT1160574B; DE2831579A1; HK18683A; IE47252B1; FI782388A; SE443565B; AU3844678A; NL174147B; ES472306A1; JPS5647194B2; FR2399439A1

Description

Eine Vielzahl von Anthracyclinglykosiden wird in der Literatur beschrieben. Erwähnt seien Daunomycin (US-PS 36 16 242 und GB-PS 10 03 383) sowie Adriamycin (US-PS 35 90 028 und 38 03 124). Die Verbindungen werden aus der Kulturbrühe bestimmter Streptomyces erhalten, besitzen ein breites Antitumorspektrum gegenüber verschiedenen experimentellen Tumoren iinrl werden klinisch als wirksame chemotherapeutische Mittel eingesetzt Trotz der Eignung von Adriamycin und Daunomycin als klinische Antitumormittel ist es bekannt, daß sie erhebliche Nebenwirkungen aufweisen, wie beispielsweise eine Alopezie, Leukopenie sowie KardiotoxizitäL

Aufgabe der Erfindung ist die Schaffung von neuen Verbindungen, denen, die vorstehend geschilderten Nachteile der bisher bekannten Substanzen nicht mehr anhaften.

Diese Aufgabe wird durch die Erfindung gemäß dem Patentanspruch gelöst.

Die erfindungsgemäßen Tetrahydropyranylether von Daunomycin und Adriamycin besitzen eine ausgeprägte Antitumoraktivität und dabei eine niedrige Toxizität.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen können nach dem Verfahren gemäß Patentanspruch 2 hergestellt werden. Zur Herstellung der Säureadditionssalze kann man anorganische oder organische Säuren verwenden, die insbesondere keine nichttoxischen Salze ergeben. Erwähnt seinen beispielsweise Schwefelsäure, Phosphorsäure, Chlorwasserstoffsäure, Bromwasserstoffsäure, Salpetersäure, phosphorige Säure, Essigsäure, Propionsäure, Maleinsäure, ölsäure, Palmitinsäure, Zitronensäure, Bernsteinsäure, Weinsäure, Fumarsäure, Glutaminsäure, Pantothensäure, uaurylsulfonsäure, Methansulfonsäure oder Naphthalinsulfonsäure.

Die Verbindungen der Formel (I) mit einem Tetrahydropyrany!oxy-R²-Substituenten existieren als individuelle Diastereomere (die willkürlich nachfolgend als Isomeres a und Isomeres b bezeichnet werden) und unterscheiden sich in der Konfiguration an der C-2-Stellung der Tetrahydropyranyloxygruppe oder liegen als Gemische derartiger Isomerer vor. Die μ Erfindung umfaßt sowohl die getrennten Diastereomeren als auch die Diastereomeren-Gemische.

Die Erfindung wird durch die Zeichnungen näher erläutert Es zeigt

7 i g. 1 das Infrarotabsorptionsspektrum (KBr) von 4'-O-Tetrahydropyranyldaunomycin (Isomeres a),

F i g. 2 das Infrarotabsorptionsspektrum (KBr) von 4'-0-Tetrahydropyranyldaunomycin (Isomeres b),

Fig.3 das Infrarotabsorptionsspektrum (KBr) von 4',14-Bis-(0-tetrahydropyranyl)-adriamycin (Isomeres a),

Fig.4 das Infrarotabsorptionsspektrum (KBr) von 4',14-Bis(CMetrahydropyranyl).adriamycin (Isomeres b),

Fig. 5 das Infrarotabsorptionsspektrum (KBr) von 14-O-Tetrahydropyranyladriamycin, μ Fig.6 das Infrarotabsorptionsspektrum (KBr) von 4'-O-Tetrahydropyranyladriamycin (Isomeres a),

Fig. 7 das Infrarotabsorptionsspektrum (KBr) von 4'-0-Tetrahydropyranyladriamycin (Isomeres b),

Fig,8 bis 14 Proton-NMR-Spektren (100 MHz, CDCI₃) der Verbindungen in der Reihenfolge, in welchen vorstehend ihre Infrarotabsorptionsspektren angegeben werden.

Adriamycin und Daunomycin, die Ausgangsmaterialien zur Herstellung der erfindungsgemäßen Verbindungen, lassen sich durch die Formeln wiedergeben.

O OH

Daunomycin

HO

NH₂

O OH

HO

Adriamycin

NH₂

Daunomycin besitzt zwei reaktive Hydroxylgruppen (ausschließlich der zwei phenolischen Hydroxylgruppen) an der C-9- und€-4'-Stellung, während Adriamycin drei reaktive Hydroxylgruppen (ausschließlich der zwei phenolischen Gruppen) an der C-9-, C-14- und C-4'-Stellung aufweist Unter geeigneten Bedingungen liegen Unterschiede bezüglich der Reaktivität der verschiedenen reaktiven Hydroxylgruppen in diesen Verbindungen vor, wobei diese Unterschiede zur Herstellung von geeigneten neuen Derivaten ausgenutzt werden können. Insbesondere dann, wenn die freie Base von Adriamycin oder Daunomycin oder ein Säureadditionssalz davon (beispielsweise das Hydrochlorid) in einem inerten organischen Lösungsmittel suspendiert oder aufgelöst und rrnt 3,4-Dihydro-2H-py ran in Gegenwart eines sauren Katalysators umgesetzt wird, verschiedene neue Tetrahydropyranylätherderivate der eingesetzten Glykoside gebildet werden. Die jeweils gebildeten Reaktionsprodukte, die Mengenverhältnisse der verschiedenen Produkte sowie die Reaktionsausbeuten schwanken in Abhängigkeit von M) den eingehaltenen Reaktionsbedingungen, beispielsweise in Abhängigkeit von dem Lösungsmittel, dem sauren Katalysator, dem Verhältnis der Reaktanten, der Temperatur, der Reaktionszeit.

Die Herstellung der erfindungsgemäßen Tetrahydrob5 pyranylether von Daunomycin und Adriamycin läßt sich durch die folgenden Reaktionsschemata veranschaulichen:

HO

+ O

NH,

Daunomycin

O OH

C-CH,

OH

NH₂

4'-0-PDa j 4'-0-PDb 1

Schema II

O OH

C-CH₂OH

OH

+ O

HO

NH₂

saurer
Katalysator

Adriamycin

Hydrolyse

oder

Alkoholysc

4',14-Bis-O-PAa 4',14-Bis-O-PAb

C-CH₂OH

4',14-Bis-O-PAa 4',14-Bis-O-PAb/

NH

Die Umwandlung einer reaktiven Hydroxylgruppe von Adriamycin oder Daunomycin in cine Tetrahydro pyranyloxygruppe erfolgt durch Veretherung. Das als Ausgangsmaterial dienende Glykosid kann in Form einer freien Base oder in Form eines Saureadditionssal- -. zes vorliegen.

Jedes nichtreak.tive organische Lösungsmittel kann für die Tetrahydropyranylierungsreaktion eingesetzt werden. Beispiele für geeignete Lösungsmittel sind Benzol, Toluol, Xylol, Dimethylformamid, Acetonitril ι» sowie Tetrahydrofuran. Das Reaktionslösungsmittel kann ein einfaches Lösungsmittel oder eine Lösungsmittelmischung sein. Ein besonders bevorzugtes Lösungsmittel besteht aus wasserfreiem Dimethylformamid.

Der saure Katalysator kann aus jeder organischen π Säure (beispielsweise Ameisensäure oder Trifluoressigsäure) oder anorganischen Säure (beispielsweise Chlorwasserstoffsäure oder Phosphorsäure) bestehen. Eine bevorzugte Klasse von sauren Katalysatoren sind die organischen Sulfonsäuren. Besonders bevorzugte Kata- 2» lysatoren sind die aromatischen Sulfonsäuren, wie p-Toluolsulfonsäure und Benzolsulfonsäure. Ein ganz besonders bevorzugter Katalysator ist p-Toluolsulfonsäure.

Die Reaktionstemperatur ist nicht kritisch. Gute r> Ergebnisse werden bei der Durchführung der Verätherungsreaktion bei Zimmertemperatur erzielt, wobei jedoch auch Temperaturen eingehalten werden können, die oberhalb oder unterhalb dieser Temperatur liegen.

Die Reaktionszeit schwankt in Abhängigkeit von den in jeweils ausgewählten Verfahrensbedingungen, beispielsweise der Temperatur, dem Katalysator, dem Lösungsmittel. Die Auswahl einer optimalen Reaktionszeit zur Gewinnung eines spezifischen Produktes oder einer Produktmischung kann durch Routineversuche r> unter Einsatz der nachfolgend beschriebenen Dünnschichtmethode ermittelt werden. Im allgemeinen liefern jedoch Reaktionszeiten von ungefähr 20 Stunden bis ungefähr 50 Stunden vorteilhafte Ergebnisse.

Wie bereits erwähnt, hängen die jeweiligen Reak- -to tionsprodukte und Reaktionsausbeuten von verschiedenen Faktoren ab, wie der Konzentration der Ausgangsmaterialien, dem Verhältnis der Reaktanten. Wird Daunomycin als Ausgangsmaterial verwendet, dann bestehen die Hauptprodukte aus 4'-O-Tetrahydropyra- π nyldaunomycin (abgekürzt 4'-O-PD) und 9-O-Tetrahydropyranyldaunomycin (abgekürzt 9-O-PD). Diese Produkte können in der Reaktionsmischung durch Kieselgeldünnschichtchromatographie unter Einsatz einer Mischung aus Chloroform, Methanol und Essigsäure ">o (80 : 20 : 4, Volumen/Volumen) als Entwickler entdeckt werden. Die Produkte erscheinen bei einem Rf-Wert von 0,74 (4'-0-PD) und 0,15 (9-O-PD).

Das Produkt 4'-0-PD wurde in zwei Komponenten mit Rf-Werten von 0,46 und 0,65 durch Kieselgeldünn-Schichtchromatographie unter Einsatz einer Mischung aus Chloroform und Methanol (10:1, Volumen/Volumen) getrennt- Diese Komponenten sind die Diastereomeren von 4'-O-PD. Die Komponenten mit den Rf-Werten von 0,46 und 0,65 wurden willkürlich als bo 4'-O-PDa (Isomeres a) bzw. 4'-O-PDb (Isomeres b) bezeichnet.

Wird Adriamycin als Ausgangsma'terial verwendet, dann bestehen die unter Einsatz der vorstehend geschilderten Kieselgeldünnschichtchromatographie ermittelten Produkte aus 14-O-Tetrahydropytanyladriamycin (I4-O-PA) mit einem Rr-Wert von 0,12, wobei zwei weitere Komponenten ermittelt werden, welche Diastereomere von 4',14-Bis(O-tetrahydropyranyl)-adriamycin sind, und zwar 4',14-Bis-(O-tetrahydropyranyl)-adriamyjin (Isomeres a), abgekürzt 4',14-Bis-OPAa bei einem Rf-Wert von 0,55, und 4',14-Bis-(O-tetrahydropyranyl)-adriamycin (Isomeres b), abgekürzt 4',14-Bis-O-PAb mit einem Rf-Wert von 0.73.

Das Diastereomeren-Gemisch aus 4',I4-Bis-O-PAa und 4',14-Bis-O-PAb kann auch in hoher Ausbeute durch Veretherung von 14-O-Tetrahydropyranyladriamycin oder eines Säureadditionssalzes davon mit 3,4-Dihydro-2H-pyran in einem inerten organischen Lösungsmittel sowie in Gegenwart eines sauren Katalysators hergestellt werden.

Durch Ausnutzung des Reaktivitätsunterschiedes zwischen der primären C-14-Hydroxylgruppe und der sekundären C-4-Hydroxylgruppe kann die Tetrahydropyranylgruppe an der C-14-Stellung von 4'.14-Di-O-PAa und 4',14-Di-O-PAb (oder ein Säureadditionssalz davon) in selektiver Weise durch Hydrolyse oder Alkoholvse entfernt werden, wobei in guter Ausbeute die entsprechenden Diastereomeren von 4'-0-PAa und 4'-0-PAb erhalten werden. Die 1 'mwandlung der Tetrahydropyranyloxygruppe in eine Hydroxygruppe kann beispielsweise durch Hydrolyse mit angesäuertem Wasser (beispielsweise unter Einsatz einer anorganischen oder organischen Säure) oder durch Alkoholyse mit einem Alkohol oder Phenol (beispielsweise einem Ci-C-Alkanol) durchgeführt werden. Eine geeignete Methode besteht in einer Behandlung mit einer verdünnten Essigsäurelösung oder p-Toluolsulfonsäure/ Methanol-Lösung bei Zimmertemperatur während einer Zeitspanne von ungefähr 30 Minuten bis 5 Stunden. Nebenreaktionen können dadurch auf einem Minimum gehalten werden, daß die Hydrolyse oder Alkoholyse im Dunkeln ausgeführt wird.

Die Produkte der Formel (I) können aus dem Reaktionsgemisch nach herkömmlichen Methoden isoliert werden. Die Produkte der Tetrahydropyranylierungsreaktion können durch Neutralisieren des Reaktionsgemisches mit einer basischen Substanz (beispielsweise einem Alkalimetallcarbonat oder -bicarbonat). Extrahieren des neutralisierten Reaktionsgemisches mit einem mit Wasser nicht mischbaren organischen Lösungsmittel ^eispieisweise Äihyiacetai, Cniuiumim. Methylenchlorid, Methylisobutylketon), Extrahieren des organischen Extraktes mit einer verdünnten wäßrigen Säure (organischer Säure oder anorganischer Säure). Neutralisieren der wäßrigen sauren Schicht mit einer basischen Substanz, Extrahieren der neutralisierten wäßrigen Schicht mit einem mit Wasser nicht mischbaren organischen Lösungsmittel und Konzentrieren des organischen Extrakts zur Trockne gewonnen werden. Das dunkelrote getrocknete Pulver, das auf diese Weise erhalten wird, kann durch Kieselgelsäulenchromatographie oder, im Falle einer kleinen Probe, durch präparative Dünnschichtchromatographie gereinigt werden. Die Produkte der Hydrolyse- oder Alkoholysereaktion können aus dem Reaktionsgemisch durch Neutralisieren mit einer basischen Substanz, Extrahieren des neutralisierten Reaktionsgemisches mit einem mit Wasser nicht mischbaren organischen Lösungsmittel und Konzentrieren des organischen Extrakts zur Trockne gewonnen werden.

Produkte, die in Form eines Gemisches von Diastereomeren (a und b Isomeren) erhalten werden, können in der vorstehend beschriebenen Weise durch Kieseigeldünrischichtchromatograpuie in die einzelnen Isomeren a und b in im wesentlichen reiner Form

Il

ge;i en."a werden.

Die nach den vorstehend beschriebenen Reaktionsmethoden erhaltenen Produkte kennen in Form der freien Base oder eines Säureadditionssalzes gewonnen werden. Die Salze werden nach Methoden gebildet, isoliert, gereinigt und formuliert, wie sie im allgemeinen auf dem Gebiet der Salzbildung von Antibiotika angewendet werden, wobei sie durch Gefriertrocknen oder durch Ausfällen erhalten werden. Produkte, die in Form eines Säureadditionssalzes anfallen, können in die entsprechende freie Base umgewandelt werden.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen besitzen folgende physikalisch/chemische Eigenschaften: sie existieren in fester Form als amorphes oder kristallines votes Pulver. Als freie Basen sind sie in Äthylacetut, Chloroform und Äthanol löslich und gering löslich in Wasser, η-Hexan, Petroläther Äthanollösungen sowie saure Lösungen der Verbindungen besitzen eine rote

ι Farbe, ergeben eine positive Ninhydrinreaktion und bedingen keine Reduktion von r ehling'scher Lösung. Die Fig. 1 bis 14 und die Tabelle I zeigen die Elementaranalysen, die Schmelzpunkte (Zersetzung), die spezifischen Drehungen (C = 0,2 in CHCU), das

ίο UV-Spektrum sowie das Spektrum im Sichtbaren (Methanol), das Infrarotabsorptionsspektrum (KBr-Preßling) sowie das NMR-Resonanzspcktrum (100 MHz₁CDCh)-

Tabelle I

Physikalisch-chemische Eigenschaften von Pyranyklerivaten

	Verbindungen	4'-OPDb	4'.14-BiS-C)-PAa	4',14-Bis-O-PAb
	C-O-PDa
	Analysewerte	C: 61,48(61,04)	C: 61.12 (60,89)	C: 61,25(60,89)
(1) Elementaranalyse	C: 60,82(61,04)	H: 6,37 ( 6,24)	H: 6,75 ( 6,50)	H: 6,81 ( 6,50)
	H: 6,27 ( 6,24)	N: 1,97 ( 2,22)	N: 1,86 ( 1.92)	N: 1,84 ( 1,92)
( ) berechnet %*	N- 2,24 ( 2,22)	611,70	711,83	711,83
(2) Molekulargewicht	611,70	190-193	180-186	178-182
(3) Schmelzpunkt	193-190	(Zersetzung)	(Zersetzung)	(Zersetzung)
( C)	(Zersetzung)	[a]^:,; + 162,5°	M?,⁴ + 25°	Ia]²J+ 125°
(4) Spezifische	[au + 125°
Dehnung
C = 0,2 CHCl-,		0,65	0,55	0,73
(5) R,-Wert**	0,46	222 s (330), 234,5	220 s G20), 234,5	220s (310), 234,5
(6) Absorptions	222 s (335), 234 (515)	(485)	(480)	(460)
spektrum im UV	252,5(350), 289(120)	252,5(350), 290(115)	253 (360), 290 (iiO)	253(350), 290(105)
und im Sichtbaren	480 (140), 496 (140)	480 (135), 498 (140)	480 s (145), 498 (155)	480 s (140), 497 (150)
(nm) (E! J in	532(80),576(15)	532(85), 576(20)	532 (110), 577 (40)	532(105), 576(40)
Methanol

* Berechnet als Monohydrat,
** Kieselgeldünnschichtchromatographie.

CHCl : CH₁OH = 10: 1 (V/V). 26 C.
Tabelle I (Fortsetzung)

Verbindungen

14-ö-PA

Analysewerte

4'-0-PAa

4'-0-PAb

(1) Elementaranalyse

( ) berechnet %*

(2) Molekulargewicht

(3) Schmelzpunkt (⁰C)

(4) Spezifische Drehung
C = 0,2 CHCl₃

C: 59,71 (59,52)
H: 6,23 ( 6,10)
N: 2,33 ( 2,17)

627,70

195-202
(Zersetzung)

[a]j* + 162,5°

C: 59,65 (59,52)
H: 6,33 ( 6,10)
N: 2,21 ( 2,17)

627,70

172-177
(Zersetzung)

[aß⁶+150°

C: 59,71 (59,52)
H: 6,24 ( 6,10)
N: 2,05 ( 2,17)

627,70

188-192
(Zersetzung)

150°

(5) Rr-Wert**

0,12

0,32

0,49

Tabelle I (Fortsetzung)

Verbindungen

H-O-PA

Analysewerte

4'-O-PAa

4'-O-PAb

(6) Absorptionsspektrum
im UV und im Sichtbaren (nm)
Ellin Methanol

220 s (340), 234 (530)
252,5 (400), 290 (115)
480 s (160), 497 (170)
532 (135), 577 (65)

* Berechnet als MonohydraL ** Kieselgeldünnschichtchromatographie. CHCI₃ : CH₃OH = 10 : 1 (V/V), 26C.

220 s (350), 234 (515)
252,5 (360), 290 (120)
480 (150), 497 (160)
532 (100), 577 (30)

220 s (365), 234 (480)
252 (350), 290 (110)
480s (135), 498 (140)
531,5 (100), 580 (45)

Was die Struktur der Verbindungen 4'-O-PDa, 4'-0-PDb, 4',14-Bis-O-PAa, 4',14-Bis-O-PAb, 14-O-PA, 4'-0-PAa und 4'-0-PAb gemäß vorliegender Erfindung betrifft, so läßt sich die Anzahl der Tetrahydropyranylgruppen, die mit den Verbindungen verknüpft sind, als entweder 1 oder 2 durch die Signalintensität des Methinpropons an der C-2-Stellung sowie des Methylenprotons an der C-3-, C-4-, C-5- und C-6-SteIlung der Tetrahydropyranylgruppe ermitteln. Die Bindeposition der Tetrahydropyranylgruppe kann durch chemische Verschiebung des C-4'-Protons in dem Daunosaminanteil in Richtung auf ein niedrigeres Feld (im Vergleich zu demjenigen von Daunomycin) infolge der Bildung der glykosidischen Bindung an der C-4'-Stellung analysiert werden.

Der Unterschied der Konfiguration zwischen 4'-O-PDa und 4'-O-PDb, 4'-O-PAa und 4'-0-PAb sowie 4',14-Bis-O-PAa und 4',14-Bis-O-PAb geht, wie man annimmt, auf den Unterschied der absoluten Konfiguration R und S an der C-2-Stellung der Tetrahydropyranylgruppe zurück, da die chemischen Verschiebungen und Kupplungskonstanten (J-Wert) an dem C-2- und 3-3-Pvoton erheblich voneinander differieren. Die absolute Konfuguration für die Isomeren a und b ist jedoch noch unbekannt Die Tabelle II zeigt die chemischen Verschiebungen (aus den Fig.8 bis 14) an der C-2-Stellung der Tetrahydropyranylgruppe sowie an dem C-4'-Proton des Daunosaminanteils.

Tabelle II	Proton	14-THP*	DS 4'**
Verbindungen	4'-THP*	(ppm)	(ppm)
	(ppm)	-	3,62
	4,38	-	3,64
4'-0-PDa	4,72	-	3,70
4'-0-PDb	4,36	-	3,70
4'-0-PAa	4,72	4,70	3,60
4'-0-PAb	4,38	4,72	3,66
4',14-Bis-O-PAa	4,72	4,71	3,48
4',14-Bis-O-PAb	-	-	3,49
14-O-PA	-
Daunomycin

THP: Chemische Verschiebung an dem C-2-Methin der substituierten Tetrahydropyranylgruppe.

DS4': Chemische Verschiebungen dem C-4'-Methin von Daunosamin.

Aus den vorstehenden Ausführungen geht hervor, daß die Strukturen der erfindungsgemäßen Verbindungen wie weiter oben angegeben sind.

Was die antiobiotische Aktivität betrifft, so besitzen die Verbindungen der Formel (I) eine antimikrobielle Aktivität gegenüber einer Vielzahl von pathogenen Mikroorganismen. Die minomalen inhibierenden Konzentrationen (bestimmt nach der Brüheverdünnungsmethode) repräsentativer Verbindungen gemäß vorliegender Erfindungen gehen aus der Tabelle III hervor.

Tabelle III Minimale inhibierende Konzentration (MlC, mcg/ml)

Testorganismen	Getestete Verbindungen	4'-O-PDb	4'-O-PAa	4'-O-PAb
	4'-O-PDa	6,25	6,25	6,25
Staph. aureus	6,25
FDA 209 P		3,12	6,25	6,25
Staph. aureus Smith	12,5	1,56	3,12	3,12
Bacillus subtilis	3,12
NRRLB-558		6,25	6,25	6,25
Bacillus cereus	6,25
ATCC 10 702		3,12	3,12	3,12
Bacillus megaterium	6,25
APF		0,39	0,78	0,78
Sarcina Iutea PCI 1001	0,39	1,56	3,12	3,12
Micrococcus flavus	0,78
FDA 16		0,78	3,12	3,12
Corynebacterium bovis	0,78
1810		> 50	>100	>100
Pseudomonas	>100
aeruminosa A3		>100	>100	>100
Escherichia coli NIHJ	>100	6,25	100	100
Mycobacterium	6,25
smegmatis ATCC 607		25	>100	> 50
Candida albicans	> 50

Wie aus der Tabelle III hervorgeht, eignen sich die erfindungsgemäßen Verbindungen als Antibiotika, insbesondere gegenüber grampositiven Bakterien.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen der Formel (I) zeigen eine ausgeprägte Antitumoraktivität mit niedriger Toxizität, wie aus Standardtests hervorgeht.

A. Die erfindungsgemäßen Verbindungen besitzen eine ausgeprägte inhibierende Wirkung auf das Wachstum sowie auf die Nukleinsäuresynthese von

LI2I0 Leukämiezellen in Kultur.

Beispielsweise wurden L1210-Zellen (5 · 10⁴ Zellen/ml) auf ein RPMI 1640 Medium (Roswell Park Memorial Institute 1640) aufgeimpft, das 20% Kälberserum enthielt und bei 37°C in Gegenwart von 0,1 und 0,5 μg/ml der erfindungsgemäßen Verbindungen in einem CO2-Inkubator gezüchtet. Die Anzahl der Zellen wurde periodisch gezählt und die Wachstumsinhibierungsrate (%)der Kontrolle ermittelt (vgl. Tabelle IV).

Tabelle IV

Wachstumsinhibierende Wirkung von Tetrahydropyranylderivaten auf L 1210 Zellen in Kultur

Verbindungen	Konzentration	0,5 ug/ml
	Inhibierungsralc (%)	95,0
	0.1	88,8
4'-0-PDa	79,2	72,7
4'-0-PDb	74,6	81.1
Daunomycin	68,8	92,9
4'-0-PAa	65,9	58,3
4'-0-PAb	78,1	80,8
14-O-PA	7,6	72,1
4',14-Bis-O-PAa	37.5	84,2
4',14-Bis-O-PAb	25,5
Adriamycin	70,7

Die Wirkung der erfindungsgemäßen Verbindungen auf die Nuklejnsäuresynthese wurde wie folgt untersucht:

1 · 10⁵ Zellen/ml von U 210 Zellen wurden in einem RPMI-Medium suspendiert, das 10% Kälberserum enthielt, bei 37°C während einer Zeitspanne von 1 bis 2 Stunden in einem COrlnkubator vorgezüchtet, worauf die erfindungsgemäßen Verbindungen dem Medium in verschiedenen Konzentrationen zugesetzt wurden.

idin (0,05 μα/ml) oder HC-jbymidin (0,05 μα/ml) zugesetzt, worauf bei 37° C während einer Zeitspanne von 60 Minuten bebrütet wurde, Trichloressigsäure (TCA) (10%) wurde dem Bebrütungsmedium zum Abstoppen der Reaktion und zum Ausfällen der säureunlöslichen Materialien zugesetzt, worauf der Niederschlag dreimal mit 5 bis 10% TCA, gelöst in Ameisensäure, gewaschen wurde. Die Radioaktivität wurde gemessen und als 50%ige Inhibierungskonzen-

Nach 15 Minuten dauernden Bebrütung wurde '⁴C-Ur- io tration des Einbaus zum Ausdruck gebracht

Tabelle V	¹⁴C-Thymidin-	Thymidin
	in Kultur	0,28
50%-Inhibierungskonzentration von	50% Inhibierungskonzentration,	0,32
und ^l4C-Uridineinbau in L 1210 Zellen	Uridin	0,70
Verbindungen	0,13	0,37
	0,20	0,50
4'-0-PDa	0,40	0,42
4'-0-PDb	0,20	0,55
Daunomycin	0,24	0,97
4'-Cr-PAa	0,17	2,1
4'-0-PAb	0,23
14-O-PA	0,24
4',14-Bis-O-PAa	0,50
4',14-Bis-O-PAb
Adriamycin

B. Beim Testen gegenüber verschiedenen experimen- 24 Stunden nach der Beimpfung wurden an die Mäuse

teilen Tiertumoren zeigen die erfindungsgemäßen 40 die erfindungsgemäßen Verbindungen intraperitoneal

Verbindungen eine ausgeprägte Antitumoraktivität mit einmal täglich während 10 aufeinanderfolgender Tage

einer verminderten Toxizität im Vergleich zu Adriamy- verabreicht, worauf während einer Zeitspanne von 45

ein und Daunomycin. Daher sind die Verbindungen Tagen beobachtet wurde. Die Antitumoraktivität geht

therapeutisch geeignet zur Inhibierung des Wachstums aus dem gesteigerten Verhältnis der Überlebenstage

von Säugetiertumoren. 45 (T/C, %) zu den Überlebenstagen von Kontrollmäusen,

beispielsweise wurden BDFi-Mäuse intraperitoneal die mit physiologischer Salzlösung gespritzt worden

mit 1 · lC-Zellen/Maus L1210 Leukämiezellen beimpft. sind, hervor. Die Ergebnisse zeigt die Tabelle VI.

Tabelle VI

Antitumoraktivität von Tetrahydropyranylderivaten (T/C, %)

Verbindungen	Dosis (mg/kg/Tag)	2,5	1,25	0,6	0,3	0,15
	5	>32O	122	115	96	90
4'-0-PDa	>320	256	122	115	103	90
4'-0-PDb	>320	173	180	187	120	127
4'-D-PAa	-	>360	>373	293	160	113
4'-0-PAb	>375	130	126	113	110	103
14-O-PA	142	115	109	96	103	96
4',14-Bis-O-PAa	154	109	103	103	96	115
4',14-Bis-O-PAb	161	231	218	230	165	128
Adriamycin	toxischer Tod

Aus cjen Ergebnissen bezüglich toxischem Tod und Körpergewictitsverlust der bei diesem Versuch eingesetzten Mäuse geht hervor, daß die erfindungsgemäßen Derivate eine Toxizität besitzen, die um ein Drittel bis die Hälfte niedriger ist aJs die Toxizität von Adriamycin und Daunomycin, den Ausgangsmaterialien gemäß vorliegender Erfindung.

C. Die gemäß A und B ersichtlichen ausgeprägten Antitumorwirkungen wurden durch die Stabilität der erfindungsgemäßen Verbindungen bei der Inaktivierung durch hepatische NADPH-Cytochrom-P450-Reduktase bestätigt NADPH-Cytochrom-P450-Reduktase, die aus einem Rattenleberhomogenat gereinigt worden war, wurde mit den erfindungsgemäßen Verbindungen bei 25° C während einer Zeitspanne von 25 Minuten in einer Stickstoffgasphase bebrütet Das dabei gebildete Produkt, und zwar 7-Desoxyaglykon, wurde ermittelt, wobei die Ergebnisse aus der Tabelle VII hervorgehen.

Tabelle VII	Produkt (nMol/Rohr)
	(7-DesoxygIykon)
Stabilität von Tetrahydropyranylderivaten gegenüber	37,3
Ratten-NADPH-Cytochrom-P450-Reduktase	46,6
Verbindungen	65,8
	10,9
4'-0-PDa	15,8
4'-0-PDb	18,4
Daunomycin	13,1
4'-0-PAa	15,8
4'-0-PAb	47,2
14-O-PA
4',14-Bis-O-PAa
4',14-Bis-O-P\b
Adriamycin

Zusammensetzung der Reaktionsmischung·.

NADPH 0,2 mM

Tris-HCl(pH8,0) O₁IM

Substrat 0,1 mM

Enzym 4,6 μg/ml

(Tris-HCI = Tris-(hyJroxymethyl)-aminomethan)

Die Verbindungen 4'-0-PDa, 4'-0-PDb, 4',14-Bis-O-PAa, 4',14-Bis-O-PAb, 14-O-PA, 4'-0-PAa und 4'-0-PAb sowie ihre Säureadditionssalze sind neue Antibiotika, die sich sowohl in der Human- als auch in der Veterinärmedizin eignen. Sie besitzen eine ausgeprägte inhibierende Wirkung gegenüber bösartigen Säugetiertumoren, und zwar sowohl gegenüber festen als auch aszitischen Typen.

Durch die Erfindung wird ferner eine pharmazeutische Zubereitung geschaffen, die aus einer therapeutisch wirksamen antimikrobiellen oder tumorinhibierenden Menge von 4'-O-PDa, 4'-O-PDb, 4',14-Bis-O-PAa, 4',14-Bis-O-PAb, 14-O-PA, 4'-O-PAa oder 4'-O-PAb oder einer Mischung davon oder einem Säureadditionssalz davon in Kombination mit einem pharmazeutischen Träger oder Verdünnungsmittel besteht. Derartige Zubereitungen können in ;eder pharmazeutischen Form hergestellt werden, die für eine parenteral Verabreichunggeeignetist.

Zubereitungen für eine parenteral Verabreichung

bestehen aus sterilen wäßrigen oder nichtwäßrigen Lösungen, Suspensionen oder Emulsionen. Sie können ferner in Form von sterilen festen Zubereitungen hergestellt werden, die in sterilem Wasser, in einer physiologischen Kochsalzlösung oder in einem anderen sterilen initiierbaren Medium unmittelbar vor der

ίο Verwendung aufgelöst werden können.

Die tatsächlich bevorzugten Dosierungsmengen schwanken in Abhängigkeit von der jeweils eingesetzten Verbindung, der jeweils formulierten Zubereitung, der Verabreichungsmethode sowie der jeweiligen

is Stelle, dem befallenen Säugetier sowie der behandelten Krankheit. Im allgemeinen werden die Verbindungen intraperitoneal, intravenös, subkutan oder lokal in nichtmenschliche Säugetiere sowie intravenös oder lokal in Menschen eingespritzt Viele Faktoren, welche die Wirkung des Wirkstoffes modifizieren, sind zu berücksichtigen, beispielsweise das Aijjr, das Körpergewicht, das Geschlecht, die Nahrung, die vV'rabreichungszeit der Verabreichungsweg, die Menge an Ausscheidung, der Zustand des Patienten, die Wirkstoffkombinationen, die Reaktionssensibilitäten sowie die Schwere der Krankheit Die Verabreichung kann kontinuierlich oder periodisch innerhalb der maximal tolerierten Dosis durchgeführt werden. Optimale Verabreichungsrate bei einer vorherbestimmten Kombination von Bedingungen

lassen sich unter Anwendung herkömmlicher Dosierungsermittlungstests unter Berücksichtigung der vorstehenden Richtlinien ermitteln.

Als antimikrobielle Mittel werden die Verbindungen im allgemeinen in der Weise verabreicht daß die Konzentration des Wirkstoffs größer ist als die minimale inhibierende Konzentration des jeweils behandelten Organismus.
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung.

B e i s ρ i e 1 1

4'-O-Tetrahydropyranyldaunomycin
(4'-0-PDa und 4'-OPDb)

Zu einer Lösung von 60 mg Daunomycinhydrochlorid in 5 ml wasserfreiem Dimethylformamid werden 1 ml 3,4-Dihydro-2H-pyran und eine katalytische Menge p-Toluolsulfonsäure gegeben. Nach Stehenlassen über Nacht bei Zimmertemperatur im Dunkeln wird das Reaktionsgemisch zu 20 ml einer wäßrigen 0,1 η

so Natriumhydrogencarbonatlösung gegeben und mit Chloroform (4-10 ml) extrahiert. Nachdem der Chloroformextrakt mit l%iger Essigsäurelösung (10 · 10 ml) extrahiert worden ist, wird die erhaltene saure wäßrifje Schicht mit Natriumhydrogencarbonat neutralisiert und dann mit Chloroform (10 · 20 ml) reextrahiert. Die CMoroformschicht wird über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und zur Trockne konzentriert. Die 44 mg des dabei erhaltenen Rückstandes werden auf eine preparative Kieselgeldünnschichtchromatographieplatte aufgebracht und mit einer Mischung aus Chloroform und Methanol (10:1), (V/V) entwickelt.

Kieselgelbanden, die einem Ri-Wert von 0,46 und 0,65 entsprechen, werden aus der Dünnschicht herausgekratzt, mit der Chloroform/Methanol-Mischung (10:1, V/V) eluiert und zur Trockne konzentriert. Jeder Rückstand wird in Methylcnchlorid aufgelöst, durch Zugabe von tert.-Butanol unter Kühlen eingefroren und

unter vermindertem Druck getrocknet. Man erhält 10,1 mg eines rötlich braunen Feststoffs aus 4'-0-PDa sowie 10,3 mg eines roten Feststoffs aus 4'-O-PDb aus den Fraktionen mit einem Rf-Wert von 0,46 bzw. 0,65.

4'-O-PDa und 4'-0-PDb sind Diastereornere von 4'-O-Tetrahydropyranyldaunomycin. Ihre physikalischchemischen Eigenschaften gehen aus der Tabelle I hervor.

Kieseigeidiinnschichtchromatographiemethode gemäO Beispiel 2 Chromatographien. Man erhält 8,4 mg eine; roten Feststoffes aus 4',14-Bis-O-PAa und 8,1 mg eine· roten Feststoffs aus 4',!4-Bis-O-PAb aus den Fraktioncr mit Ri-Werten von 0,55 bzw. 0,73. Die physikalisch-chemischen Eigenschaften fallen mit denjenigen dci Verbindungen, die gemäß Beispiel 2 erhalten worder sind, zusammen.

Beispiel 2 Beispiel 4

4',l4-O-Bis-(tetrahydropyranyl)-adriamycin

(4',14-Bis-O-PAa und 4',14-Bis-O-PAb) und

14-0-Tetrahydropyranyladriamycin (14-O-PA)

aus Adriamycin

Zu einer Lösung von 130 mg Adriamycinhydrochlorid in IO ml wasserfreiem Dimethylformamid werden 2 ml 3,4-Dihydro-2H-pyran und eine katalytische Menge ⁿ-Tc!i!c!Sw!fcnsäi2r° "sieben irisch S'eh^eri!^accTi ^lv**hrend einer Zeitspanne von 48 Stunden bei Zimmertemperatur wird das Reaktionsgemisch zu 20 ml einer wäßrigen 0,1 η Natriumhydrogencarbonatlösupg gegeben und mit 5 · 20 ml Äthylacetat extrahiert. Nach dem Extrahieren der Äthylacetatschicht mit einer l%igen Essigsäurelösung (4 · 40 ml) wird die wäßrige saure Schicht mit Natriumhydrogencarbonat neutralisiert und mit Chloroform (10 · 20 ml) extrahiert. Die Chloroformschicht wird über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und zur Trockne konzentriert. Die 160 mg des erhaltenen Feststoffs werden durch eine präparative Kieselgeldünnschichtchromatographie entwickelt und gereinigt, wobei eine Chloroform/Methanol-Mischung (10:1, V/V) verwendet wird. Die Banden bei Rf-Werten von 0,12 und 0,55 werden aus der Dünnschicht ausgekratzt und nach der Methode von Beispiel I gereinigt.

Man erhält 35 mg eines roten Feststoffs aus 14-O-PA, 16 mg eines roten Feststoffs aus 4',14-Bis-O-PAa und 14 mg eines roten Feststoffs aus 4',14-Bis-O-PAb aus den Fraktionen mit Rr-Werten von 0,12,0,55 bzw. 0,73.

4',14-Vis-O-PAa und 4',14-Bis-O-PAb sind Diastereomere von 4',14-Bis(O-Tetrahydropyranyl)-adriamycin. Ihre physikalisch-chemischen Eigenschaften gehen aus der Tabelle I hervor.

Beispiel 3

4',14-B:s(O-tetrahydropyranyl)-adriamycin aus
14-O-Tetrahydropyranyladriamycin

Zu einer Lösung von 35 mg 14-O-PA in 2 ml wasserfreiem Dimethylformamid werden 0,5 ml 3,4-Dihydro-2H-pyran und eine katalytische Menge p-Toluolsulfonsäure gegeben. Nach einem Stehenlassen während einer Zeitspanne von 40 Stunden bei Zimmertemperatur im Dunkeln wird das Reaktionsgemisch zu 10 ml einer wäßrigen 0,02 η Natriumhydrogencarbonatlösung gegeben und mit Äthylacetat (4 - 5 ml) extrahiert Nach dem Extrahieren der Äthylacetatschicht mit l%iger Essigsäurelösung (3 · 10 ml) wird die saure wäßrige Schicht mit Natriumhydrogencarbonat neutralisiert und mit Chloroform (5 10 ml) extrahiert Die Chloroformschicht wird über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und zur Trockne konzentriert.

Der erhaltene Rückstand wird unter Anwendung der 4'-O-Tetrahydropyranyladriamycin aus
4'-,14-Bis(O-tetrahydropyranyl)-adriamyci ι

a) 12,4 mg 4',14-Bis-O-PAa werden in 1,5 ml einer 10%igen Essigsäurelösung aufgelöst und 4,5 Stunden bei Zimmertemperatur im Dunkeln stehengelassen. Das Reaktionsgemisch wird zu !0 ml Wasser gegeben, mit Natriumhydrogencarbonatpulver neutralisiert und mit f^hlnmtnrm ti . 1 ζ mW Dvtrotiiprl

>o Die Chloroformschicht wird über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und zur Trockne konzentriert. Die 11 mg des erhaltenen Rückstands werden nach einer Kieselgeldünnschichtchromatographiemethode, wie sie vorstehend beschrieben worden ist, gereinigt,

2ϊ wobei eine Chloroform/Methanol-Mischung (10:1, V/V) verwendet wird. Die Hauptbande bei einem Rf-Wtrt von 0,32 wird ausgekratzt und mit der Chlorft'orm-Methanol-Mischung (10:1, V/V) eluiert. Das Eluat wird zur Trockne konzentriert. Der

in Rückstand wird in Methylenchlorid aufgelöst, wobei tert.-Butanol unter Kühlen zum Einfrieren zugesetzt wird und unter vermindertem Druck getrocknet. Man erhält 7 mg eines roten Feststoffs aus 4'-O-PAa. Die physikalischen Eigenschaften gehen aus der Tabelle I

π hervor.

b) 16 mg 4',14-Bis-O-PAb werden in 5 ml einer 0,05 η p-Toluolsulfonsäure/Methanol-Lösung aufgelöst und bei Zimmertemperatur während einer Zeitspanne von 1 Stunde im Dunkeln stehengelassen. Das Reaktionsgemisch wird mit 10 ml einer wäßrigen 0,01 η Natriumhydrogencarbonatlösung neutralisiert und mit Chloroform (4-10 ml) extrahiert. Die Chloroformschicht wird über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und gemäU (a) behandelt. Man erhält 7,2 mg eines roten Feststoffs von 4'-O-PAb, das einen Rf-Wert von 0,49 bei der Kieselgeldünnschichtchromatographie unter den vorstehend beschriebenen Bedingungen zeigt. Die physikalisch-chemischen Eigenschaften gehen aus der Tabelle I hervor.

4'-O-PAa und 4'-O-PAb sind Diastereomere von 4'-O-Tetrahydropyranyladriamycin.

Beispiel 5

Salzbildung

Als Beispiel für die Methoden, die man zur Herstellung von Säureadditionssalzen anwenden kann, kann die freie Base von 4'-O-PDa, 4'-OPDb, 4',14-Bis-O-PAa, 4',14-Bis-O-PAb, 14-O-PA, 4'-O-PAa oder 4'-OPAb in Äthylacetat aufgelöst werden, worauf ungefähr 1 Äquivalent HCl zugesetzt wird. Beim Gefriertrocknen wird das entsprechende Hydrochlorid erhalten.

Hierzu 14 Blatt Zeichnungen

Claims

Patentansprüche;

J, Tetrahydropyranylether von Daunomycin und Adriamycin der allgemeinen Formel

20

in der die Substituenten R¹ und R² folgende Bedeutungen und Zuordnungen haben:

R' Wasserstoff

Tetrahydropyranyloxy

Hydroxy

Tetrahydropyranyloxy R² Tetrahydropyranyl

Wasserstoff

Tetrahydropyranyl

Tetrahydropyranyl

in Form der sich in der Konfiguration "»η der C-2-Stellung der Tetrahydropyranyloxygruppe unterscheidenden Diastereomeren oder der Diastereomeren-Gemische sowie deren Säureadditionssalze.
2. Verfahren zur Herstellung der Verbindungen gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man Daunomycin oder Adriamycin in an sich bekannter Weise mit 3,4-Dihydro-2H-pyran in einem inerten organischen Lösungsmittel in Gegenwart eines sauren Katalysators umsetzt und gegebenenfalls eine Tetrahydropyranylgruppe durch partielle Hydrolyse oder Alkoholyse der gebildeten Bis-tetrahydropyranylverbindungen abspaltet, und die erhaltenen Tetrahydropyranylether isoliert und, gegebenenfalls nach Auftrennung in die jeweiligen Diastereomeren, gegebenenfalls in Säureadditionssalze überführt.
3. Pharmazeutische Zubereitungen, gekennzeichnet durch eine therapeutisch wirksam«: Menge einer Verbindung gemäß* Anspruch 1 in einem pharmazeutisch verträglichen Träger oder einem pharmazeutisch verträglichen Verdünnungsmittel.