DE2830327C3

DE2830327C3 - Verfahren zur mikrobiellen Herstellung von Alkoholoxidase

Info

Publication number: DE2830327C3
Application number: DE2830327A
Authority: DE
Inventors: Lothar Dr. Eggeling; Manfred Dr. Paschke; Hermann Prof. Dr. Sahm
Original assignee: Kernforschungsanlage Juelich GmbH
Current assignee: Forschungszentrum Juelich GmbH
Priority date: 1978-07-10
Filing date: 1978-07-10
Publication date: 1980-12-04
Also published as: US4250261A; SE7905926L; DE2830327B1; SE434164B; JPS6339231B2; JPS5519094A; DE2830327A1

Description

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur mikrobiellen Herstellung von Alkoholoxidase, bei dem fakultativ Methanol verwertender Hefe der Bezeichnung Hansenula polymorpha, die sich in einer anorganische Nährstoffe, Vitamine sowie als Kohlenstoff- und Energiequelle Methanol enthaltenden Nährlösung befindet, kontinuierlich weitere Nährlösung zugeführt wird, und bei dem aus dem so gebildeten Kulturmedium Zellmasse und somit in der Zellmasse enthaltene Alkoholoxidase in einer der zugeführten Menge der Nährlösung entsprechenden Menge entnommen wird, wobei die die Hefezellen enthaltende, in einem Reaktionsgefäß befindliche und einen pH-Wert von 4,0 bis 6,0 aufweisende Nährlösung auf einer Reaktionstemperatur von 25 bis 45°C gehalten und mit Luft oder einem Luft-Sauerstoffgemisch begast wird.

Das Enzym Alkoholoxidase katalysiert folgende Reaktion:

CH₁OH + O₂- HCHO + H₂O₂.

Dieses Enzym kann d.iher zur Gewinnung von Formaldehyd sowie von Wasserstoffperoxid aus Methanol verwendet werden. Es kann ferner zur analytischen Bestimmung der Alkohole Methanol, Äthanol, N-Propano! und N-Butanol eingesetzt werden, wobei als Meßeinrichtung beispielsweise Enzymelektroden Verwendungfinden.

Es ist bekannt, daß in Methanol verwertenden Hefen, wie Candida, Hansenula, Pichia und Torulopsis-Stämmen, beim Wachstum auf Methanol eine Flavin-Adenosin-Dinucleotid (FAD) enthaltende Alkoholoxidase induziert wird, welche die Oxidation des Methanols zu Formaldehyd im Stoffwechsel katalysiert.

Es ist ferner bekannt, zur Gewinnung des Enzyms Alkoholoxidase die Hefen Candida boidinii und Hansenula polymorpha zu verwenden. Dabei wird die Hefe Candida boidinii in batch-Kuhuren auf Mineralsalzmedium mit Methanol als Kohlenstoff-Energiequelle und den Vitaminen Biotin und Thiamin angezogen. Diese Methode ist jedoch wenig effektiv. Man hat daher auch, um eine höhere Zelldichte zu erzielen, im Laufe des Wachstums der Zellen dem Kulturmedium weiteres

ίο Methanol zugeführt (vergleiche hierzu Reuß M. et al. »Chemie-Ingenieur-Technik, 46, 669 [74]«). Nach Aufschluß der auf diese Weise herangezogenen Hefezellen erhält man eine spezifische Aktivität der Alkoholoxidase im Rohextrakt von 0,3 bis 1,0 Enzymeinheit pro mg Protein.

Bei der Gewinnung von Alkoholoxidase aus der Methanol verwertenden Hefe Hansenula polymorpha wurde das Kulturmedium unter kontinuierlicher Zuführung einer Nährlösung herangezogen, welche Methanol und die Vitamine Biotin und Thiamin enthält Die Menge an Alkoholoxidase beträgt bei diesem bekannten Verfahren bei einer Wachstumslimitierung durch die Kohlenstoffenergiequelle Methanol und bei einer Wachstumsrate von 0,16 h*¹ (dies entspricht VoIxVoI-¹Xh-¹) etwa 7% des Gesamtproteins, was einer spezifischen Aktivität im Rohextrakt von 2,5 bis 3,0 Enzymeinheiten/mg Protein entspricht. Bei einer Wachstumsrate von 0,03 h-¹ unter gleichen Kulturbedingungen lag die Alkoholoxidasemenge bei etwa 20% bezogen auf das Gesamtproteki, so daß die spezifische Aktivität im Rohextrakt 10 bis 11 Enzymeinheiten/mg Protein betrug (vergleiche van Dijken J. P. »Arch. Microbiol., 111,137 [76]«).

Die nach dem Aufschluß der Hefezellen zu deren Reindarstellung erforderliche Isolierung des Enzyms geschieht üblicherweise miitels Säulenchromatographie und Enzymfällung.

Es ist Aufgabe der Erfindung, ausgehend von dem bekannten Verfahren, bei dem die Hefe Hansenula polymorpha eingesetzt wird, ein Verfahren zur Herstellung von Alkoholoxidase zu schaffen, das eine höhere Ausbeute an Alkoholoxidase pro gebildetem Protein ergibt als dies nach den bekannten Verfahren möglich ist.

Die der Erfindung zugrunde liegende Aufgabe wird gemäß der Erfindung dadurch gelöst, daß die zusätzlich als Kohlenstoff- und Energiequelle wenigstens ein auf die Alkoholoxidase nicht katabolitreprimierend wirkendes Substrat, wie Glyzerin, Sorbit oder Xylose, in einer Konzentration von 0,1 bis 1,0% enthaltende Nährlösung mit einer Durchflußrate von 0,03 bis 0,15 h -' zugegeben wird. Die während der kontinuierlichen Prozeßführung, weiche unter chemostatischen Bedingungen erfolgt, dem Kulturmedium entnommene Zellmasse wird sodann in an sich bekannter Weise aufgeschlossen und das En?ym Alkoholoxidase isoliert.

Die erfindungsgemäße Verwendung eines Mischsubstrats, das aus Methanol und aus wenigstens einem auf die Alkoholoxidase nicht katabolitreprimierend wirkenden Substrat besteht, führt in überraschender Weise zu wesentlich höheren Enzymeinheiten. Dabei werden bei der Durchführung des Verfahrens gemäß der Erfindung Zellen produziert, die eine höhere Alkoholoxidase-Aktivität enthalten als Zellen, die nach den bisher bekannten Verfahren kultiviert werden. Dabei hat sich als vorteilhaft erwiesen, eine Nährlösung zu verwenden, die Phosphat, Nitrat oder Kalium in einer das Wachstum der Zellen limitierenden Dosierung enthält. Bei dieser

Verfahrensvariante werden noch höhere Ausbeuten an Alkoholoxidase erzielt

Ausführungsbeispiel 1

In ein 12-Liler-Gefäß, das ein Arbeitsvolumen von 7 Liter umfaßt, wurde eine Nährlösung folgender Zusammensetzung gegeben:

5,0 g/l	Xylose
4,0 g/I	Methanol
0,047 g/I	KH₂PO₄
0,013 g/l	NaH₂PO₄
0,125 g/l	Na₂SO₄
0,4 g/l	IC₂SO₄
0,5 g/l	(NH₄J₂SO₄
2,5 g/l	NH₄CI
0,05 g/l	MgSO₄ ■ 7 H₂O
0,7 g/l	NaCI
0,5 mg/1	H₃BO₃
0,04 mg/1	CuSO₄ · SH₂O
0,1 mg/1	K]
P,2 mg/1	FeCl₃ - 6 H₂O
0,4 mg/I	MnSO₄ ■ H₂O
0,4 mg/1	ZnSO₄ · 7 H₂O
0,2 mg/1	(NH₄)₆Mo₇O₂₄ ■
0,05 mg/1	Biotin
1,0 mg/1	Thiamin

4H₂O

Der pH-Wert der Nährlösung betrug 5,0; die Temperatur der Lösung lag bei etwa 37° C.

Die Nährlösung wurde mit einer Rate von 1 vvm (1 I/min · 1 Reaktorvolumen) belüftet und mechanisch mit einer Rührerdrehzahl von 1000 UpM gerührt In der in dem Reaktionsgefäß befindlichen Nährlösung wurde die Hefe Hansenula polymorpha der Stammnummer CBS 4732 kultiviert

Der in dem Reaktionsgefäß gebildeten Hefekuitur wurde sodann Nährlösung der vorgenannten Zusammensetzung in einer Zuflußrate von 0,05 h-¹ zugeführt

ίο und dem Reaktionsmedium in entsprechender Menge Zellmasse entnommen.

Bei dieser Verfahrensweise konnten zirka 30 000 Alkoholoxidase-Einheiten pro Liter Medium entnommen werden, was — auf Zellmasse bezogen — etwa 28 Einheiten/mg Protein entspricht.

Ausführungsbeispiel 2

Wie in Ausführungsbeispiel J beschrieben, wurde mit einer Nährlösung die der in Ausführungsbeispiel 1 weltgehend entsprach, anstelle voii 5,0 g/l Xylose jedoch 5 g/l Glyzerin enthielt, ein Kulturmedium gebildet.

Bei dieser Verfahrensweise konnten zirka 25 000 Alkoholoxidase-Einheiten pro Liter Medium gewonnen werden, was etwa 22 Einheiten/mg Protein entspricht.

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zur mikrobiellen Herstellung von Alkoholoxidase, bei dem fakultativ Methanol verwertender Hefe dur Bezeichnung Hansenula polymorpha, die sich in einer anorganische Nährstoffe, Vitamine sowie als Kohlenstoff- und Energiequelle Methanol enthaltenden Nährlösung befindet, kontinuierlich weitere Nährlösung zugeführt wird, und bei dem aus dem so gebildeten Kulturmedium Zellmasse und somit in der Zellmasse enthaltene Alkoholoxidase in einer der zugeführten Menge der Nährlösung entsprechenden Menge entnommen wird, wobei die die Hefezellen enthaltende, in einem Reaktionsgefäß befindliche und einen pH-Wert von 4,0 bis 6,0 aufweisende Nährlösung auf einer Reaktionstemperatur von 25 bis 45° C gehalten und mit Luft oder einem Luft-Sauerstoffgemisch begast wird, dadurch gekennzeichnet, daß die zusätzlich als Kohlenstoff- und Energiequelle wenigstens ein auf die Alkoholoxidase nicht katabolitreprimierend wirkendes Substrat, wie Glyzerin, Sorbit oder Xylose, in einer Konzentration von 0,1 bis 1,0% enthaltende Nährlösung mit einer Durchflußrate von 0,03 bis 0,15 h -' zugegeben wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Nährlösung Phosphat, Nitrat oder Kalium in einer das Wachstum der Zellen limitierenden Dosierung enthält.