DE2858733C2

DE2858733C2 -

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Publication number: DE2858733C2
Application number: DE2858733A
Authority: DE
Inventors: Anthony Charles Henley-On-Thames Oxfordshire Gb Richardson; Percy Francis George Ickenham Uxbridge Gb Praill; Robert Graham Northwood Gb Price
Original assignee: National Research Development Corp UK
Current assignee: BTG International Ltd
Priority date: 1977-11-01
Filing date: 1978-10-31
Publication date: 1990-03-01
Anticipated expiration: 1998-11-01
Also published as: IT1109621B; WO1979000255A1; CA1181331A; US4318986A; GB2079450B; EP0007372A1; BE871717A; GB2008103A; GB2079450A; DE2857145T1; CH651068A5; IT7869517A0; GB2008103B; CA1190223A; NL7810846A; DK484278A; JPS54500072A; JPH0238199B2; CH651319A5; DE2857145C2

Description

Das Vorhandensein oder die Abwesenheit von bestimmten Enzymen in physiologischen Proben, z. B. Urin- oder Serumproben von menschlichen Patienten, ist ein wertvoller Indikator für Krankheiten oder Unregelmäßigkeiten in dem betreffenden Organismus, z. B. für Organfehlfunktionen bei Menschen. So sind z. B. erhöhte Gehalte des Enzyms N-Acetyl-β-D-glucosaminidase (NAG), das im Urin von Nierenübertragungspatienten ausgeschieden wird, ein frühes Anzeichen für eine bevorstehende Abstoßung der transplantierten Niere. Daneben sind die erhöhten Werte eine allgemeine Anzeige für Nieren- und andere Krankheiten. Derzeit geht man beim üblichen klinischen NAG-Nachweis so vor, daß man eine Urinprobe mit dem 4-Methylumbelliferylglykosid-Substrat des Enzyms, das sich unter Freisetzung des entsprechenden Umbelliferons umsetzt, inkubiert, und daß man das gebildete Umbelliferon fluorimetrisch überwacht. Alternativ kann man ein Nitrophenylglykosidsubstrat, p-Nitrophenyl-2-acetamido-2-deoxy-β-glucopyranosid, verwenden, das sich mit dem Enzym unter Freisetzung von p-Nitrophenol umsetzt, welches kolorimetrisch überwacht wird. Diese Bestimmungsmethoden erfordern jedoch die Verwendung von komplizierten spektrophotometrischen Vorrichtungen und sie sind nur dann für den Gebrauch geeignet, wenn der Zugang zu gut eingerichteten Laboratorien besteht.

Es wurden nun Verbindungen entwickelt, die in manchen Fällen als Enzymsubstrat eingesetzt werden können, ohne daß die Verwendung einer komplizierten Überwachungsvorrichtung erforderlich ist.

Gegenstand der Erfindung sind die in Anspruch 1 angegebenen Verbindungen und ihre Verwendung als Enzymsubstrat.

Vorteilhafte Ausführungsformen sind in den Unteransprüchen angegeben.

Beim Verfahren für die Analyse eines Enzyms wird die das Enzym enthaltende Probe mit einer der Verbindungen inkubiert, die als Enzymsubstrat mit den Enzym reagiert. Bei der Reaktion wird eine Verbindung gebildet, die analysiert wird. Die genannte Verbindung ist per se dazu imstande, ein visuelles Signal zu erzeugen, das leicht durch das Auge direkt oder bei alkalischer Behandlung wahrnehmbar ist.

Die Verbindungen nach der Erfindung entsprechen der allgemeinen Formel

in der
S′ der Enzymsubstratteil in Form einer Phosphat-, Diphosphat- oder Sulfatgruppe, oder Glykosylgruppe ist und
R¹, R², R³ und R⁴ jeweils für H, OCH₃ oder NO₂ stehen.

Sie sind allgemein bei der Analyse von Enzymen anwendbar, wobei der Restteil des Enzymsubstrats entsprechend dem besonderen Enzym, das analysiert werden soll, variiert wird. Typischerweise sind die Enzyme, die mit den erfindungsgemäßen Verbindungen analysiert werden können, katabolische Enzyme, wie solche, die eine wichtige Rolle beim Abbau der Makromoleküle von Zellgeweben besitzen. Beispiele von Enzymen, die analysiert werden können, sind saure und alkalische Phosphatasen, Phosphordiesterasen und Sulfatasen und die entsprechenden Verbindungen enthalten geeignete Phosphat-, Diphosphat- und Sulfatester-Enzymsubstrate. Die erfindungsgemäßen Verbindungen sind insbesondere für die Analyse von Glykosidasen geeignet, wobei der Enzymsubstratteil S′ charakteristischerweise ein entsprechender Glykosylkohlehydratsubstituent, wie α- oder β-Glucopyranosyl-, Galactopyranosyl- oder Mannopyranosylsubstituent ist. Es wurde beispielsweise gefunden, daß die Verbindung besonders geeignet ist für die Analyse von N-Acetyl- β-D-glucosaminidase (NAG), bei der S′ für einen 2-Acetamido-2-deoxy-b-D-glucopyranosylrest steht.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen können allgemein für Analyseverfahren, die auf das Vorhandensein von Enzymen und die Überwachung ihrer Konzentrationsgehalte gerichtet sind, angewendet werden. So können sie beispielsweise zur Diagnose von entsprechenden Defekten oder Krankheiten angewendet werden. Beispielsweise kann der NAG-Gehalt von Urin zur frühen Feststellung von Nierenerkrankungen untersucht werden, im speziellen Fall als frühe Anzeige einer Nierenabstoßung bei Nierenübertragungspatienten. Es kann auch die Abwesenheit von Enzymen bestimmt werden, die beispielsweise bestimmte genetische Störungen anzeigen kann. Allgemein können die erfindungsgemäßen Verbindungen auch geeignete Werkzeuge zur Verwendung in der biochemischen und der medizinischen Forschung ergeben.

Die bei der enzymatischen Hydrolyse freigesetzten 4-Hydroxy-ω-nitrostyrolverbindungen der allgemeinen Formel II:

in der R¹, R², R³ und R⁴ wie zuvor definiert sind, zeigen allgemein überraschende und hocherwünschte Farbeigenschaften, die sie für enzymatische Analyseverfahren besonders geeignet machen. Es ist festgestellt worden, daß die Verbindungen der Formel II bei alkalischen Bedingungen typischerweise eine stark rote Farbe aufweisen, im Gegensatz zu der schwach orange- gelben Färbung von p-Nitrophenol. Weiterhin haben sie Absorptionsmaxima (λ _max), die in unerwarteter Weise signifikant höher liegen als diejenigen von p-Nitrophenol (∼400 unter alkalischen Bedingungen). Diese intensiveren Farbeigenschaften sind vermutlich auf die Bildung eines Radikalions zurückzuführen, das nach dem untenstehenden Schema als Ergebnis eines Oxidationsprozesses erhalten wird.

Das Vorliegen von elektronenabgebenden Substituenten, wie Methoxygruppen, angrenzend an den Hydroxylsubstituenten scheint die Bildung dieses Radikalions zu stabilisieren. Dies zeigt sich durch die Farbeigenschaften der 3-Methoxy- und insbesondere der 3,5- Dimethoxyanalogen der untenstehenden Formeln III und IV, die aus besonders bevorzugten Verbindungen abgespalten werden.

Somit haben die Monomethoxyverbindung III und die Dimethoxyverbindung IV Absorptionsmaxima (λ _max) von 506 und 530 mit Extinktionskoeffizienten (ε) von 24 600 und 22 300 in einem Puffer bei pH 8,8. Sie zeigen bei diesen Bedingungen zufriedenstellende scharlachrote Färbungen.

Beispiele für erfindungsgemäß zu verwendende Reagentien werden nachfolgend die Formeln B bis E angeben.

Die Verbindungen

sind für die Bestimmung von (B) sauren oder alkalischen Phosphatasen, (C) Phosphodiesterasen, (D) Arylsulfatasen und (E) Glykosidasen geeignet. R in der Formel E bedeutet eine Glykosylgruppe, z. B. einen a- oder β-Glucopyranosyl-, -Galactopyranosyl- oder -Mannopyranosylrest.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen können aus Vanillin oder ähnlichen Materialien auf Hydroxybenzaldehydbasis, z. B. p-Hydroxybenzaldehyd oder Salicylaldehyd, durch Nitromethylierung oder Nitroethylierung des entsprechenden Addukts aus Substrat und Vanillin oder aus Substrat und einer ähnlichen Verbindung hergestellt werden. Vorzugsweise werden dabei mild-alkalische Bedingungen angewendet.

Die zu untersuchenden Proben liegen zweckmäßig in fließfähiger Form vor und schließen Proben, die physiologische Flüssigkeiten, wie Serum oder Urin, enthalten, ein.

Es können auch andere geeignete Proben untersucht werden, beispielsweise Proben, die sich von Zellhomogenaten ableiten, beispielsweise Proben, wie sie üblicherweise bei der Untersuchung von genetischen Störungen verwendet werden.

Die Verbindung und die Probe werden miteinander inkubiert, beispielsweise die Probe und die die Verbindung enthaltende Lösung miteinander vermischt und bei geeigneten Bedingungen über einen geeigneten Zeitraum zur Umsetzung gebracht. Vorzugsweise liegt die Inkubationstemperatur über etwa 30°C z. B. bei etwa 30 bis etwa 40°C. Bei diesen Bedingungen ist gewöhnlich eine Inkubationszeit von bis zu etwa 30 Minuten, z. B. von etwa 10 bis 15 bis zu etwa 30 Minuten zufriedenstellend. Die erfindungsgemäße Verbindung kann auch in Verbindung bzw. Vergesellschaftung mit einem inerten Material in fester Phase, z. B. Celluloseteilchen, wie mikrokristalline Cellulose, beispielsweise darin absorbiert, verwendet werden. Hierdurch können mit Vorteil Probleme überwunden werden, die von einer Unlöslichkeit oder schlechten Löslichkeit der erfindungsgemäßen Verbindung herrühren. Die Verbindung kann auch in Verbindung bzw. Vergesellschaftung mit einem porösen festen Trägermaterial, beispielsweise Papier, verwendet werden, um ein geeignetes Testpapier oder Eintauchstäbchen für einen einfachen Tauchtest zu ergeben.

Üblicherweise folgt auf die Inkubation bei der der Enzymsubstratteil S′ abgespalten wird, eine alkalische Behandlung, die vorteilhafterweise zur Entwicklung von gefärbten visuellen Signalen führt. Die alkalische Behandlung kann die Zugabe von Alkali zu der Lösung, die die freigesetzte Verbindung enthält, sein. Vorzugsweise kann sie darin bestehen, daß die Lösung, die die Verbindung enthält, mit einem Festphasenreagens, z. B. einem Absorptionsmittel, in Kontakt gebracht wird, welches gleichzeitig eine alkalische Umgebung für die Verbindung schafft. So wird beispielsweise die Lösung, die die Verbindung enthält, mit einem anionischen Austauschermaterial, das vorzugsweise eine neutrale Farbe hat, z. B. weiß, oder nur leicht gefärbt ist und das in seiner freien Basenform, z. B. in der Hydroxyl- (OH⁻)-Form vorliegt, in Berührung gebracht.

Die Konzentration der erfindungsgemäßen Verbindung, beispielsweise in Verbindung mit Inertmaterial in fester Phase, kann in gewünschter Weise variiert werden, beispielsweise entsprechend der Schwellenkonzentration des Enzyms, das überwacht werden soll. Eine Erhöhung der Konzentration der erfindungsgemäßen Verbindung gestattet im allgemeinen die Erfassung von niedrigeren Schwellenkonzentrationen des Enzyms.

Das visuelle Signal, beispielsweise die Farbveränderung, die durch die freigesetzte Substanz erzeugt wird, schafft in vorteilhafter Weise ein rasches und einfaches Mittel zum Nachweis des Vorhandenseins des Enzyms in der Probe im Vergleich zu bislang verwendeten Methoden, bei denen komplizierte Überwachungsvorrichtungen erforderlich sind. Weiterhin kann die Intensität des erzeugten visuellen Signals, z. B. der Farbe, als grobe visuelle Anzeige der Konzentration des in der Probe vorhandenen Enzyms genommen werden. Wenn jedoch genauere Messungen erforderlich sind, können die erfindungsgemäßen Verbindungen spektrophotometrisch, beispielsweise in herkömmlicher Weise, überwacht werden. So kann beispielsweise die erzeugte Farbe unter Verwendung eines Kolorimeters, gewöhnlich nach Einstellung des pH-Werts auf 8,5 bis 9,5 mit einem geeigneten Puffer, bestimmt werden. Bei solchen Methoden können die erfindungsgemäßen Verbindungen geeigneter sein als entsprechende bekannte Reagentien, z. B. p-Nitrophenol- und o-Nitrophenolsubstrate.

Die Erfindung wird in den Beispielen erläutert. Die Beispiele 1 bis 3 beziehen sich auf die Herstellung von erfindungsgemäßen Enzymsubstraten und ihrer Komponenten, Beispiel 4 erläutert die Verwendung eines erfindungsgemäßen Enzymsubstrats in Kombination mit einem Festphasenmaterial und die Verwendung dieses Produkts.

Beispiel 1 Herstellung von Nitrostyrylglykosiden zum Nachweis und zur Bestimmung von entsprechenden Glykosidasen I. Herstellung der Hydroxybenzaldehydglykoside

Als erste Stufe der Herstellung der erfindungsgemäßen Nitrostyrylglykosidenzymsubstrate werden die entsprechenden Hydroxybenzaldehydglykoside hergestellt.

Eine Lösung des entsprechenden Glykopyranosylhalogenids (70 mmol) in Aceton (200 ml) wurde mit einer Lösung des entsprechenden p-Hydroxybenzaldehyds (100 mmol) in 1 m Natronlauge behandelt und das entstehende Gemisch 16 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Hierauf wurde das Reaktionsgemisch mit Wasser verdünnt, bis sich das Produkt abschied. Kristalline Glykosidprodukte wurden direkt abfiltriert und nicht-kristalline Produkte wurden durch Chloroformextraktion in üblicher Weise isoliert.

Nach dem Abfiltrieren der kristallinen Produkte konnte ein weiteres Produkt aus den Mutterlaugen durch Extraktion mit Chloroform oder Dichlormethan gewonnen werden.

Nachstehend werden die Ergebnisse bei der Herstellung einer Reihe von Hydroxybenzaldehydglykosiden angegeben.

(a) 4-(2-Acetamido-3,4,6-tri-O-acetyl-2-deoxy-α-D- glucopyranosyloxy)-3-methoxybenzaldehyd wurde in 55%iger Ausbeute aus 2-Acetamido-3,4,6-tri- O-acetyl-2-deoxy-α-D-glucopyranosylchlorid erhalten.
Fp 220 bis 221°C (Ethanol)
[α]_D = -13,5°
(c = 1; DMSO).
(b) 4-(2-Acetamido-3,4,6-tri-O-acetyl-2-deoxy-α-D- glucopyranosyloxy)-benzaldehyd wurde in analoger Weise in 47%iger Ausbeute erhalten.
[α]_D = -19°
(c = 1; CHCl₃).
(c) 4-(2-Acetamido-3,4,6-tri-O-acetyl-2-deoxy-α-D- glucopyranosyloxy)-3,5-dimethoxybenzaldehyd wurde in ähnlicher Weise in 15%iger Ausbeute erhalten.
Fp 239 bis 240°C (Methanol)
[α]_D = +3,8°
(c = 1,2; DMSO).
(d) 4-(2,3,4,6-Tetra-O-acetyl-α-D-glucopyranosyloxy)- 3-methoxybenzaldehyd wurde aus 2,3,4,6-Tetra-O- acetyl-α-D-glucopyranosylbromid in 62%iger Ausbeute erhalten.
Fp 235 bis 136°C (Ethanol)
[α]_D = -24,2°
(c = 1,1; CHCl₃).
(e) 4-O-(2,3,4,6-Tetra-O-acetyl-b-D-galacto- pyranosyloxy)-3-methoxybenzaldehyd wurde aus 2,3,4,6-Tetra-O-acetyl-α-D-galactopyranosylbromid anfänglich als Sirup (47%) erhalten, der kristallisierte und mit Schwierigkeiten aus Ethanol/Ether/Leichtbenzin umkristallisiert wurde.
Fp 148 bis 149°C
[α]_D = -4,4°
(c = 1,1; CHCl₃).
(f) 4-(2,3,4,6-Tetra-O-acetyl-α-D-mannopyranosyloxy)- 3-methoxybenzaldehyd wurde als Sirup in 14%iger Ausbeute aus 2,3,4,6-Tetra-O-acetyl-α- D-mannopyranosylbromid (15) erhalten.
[α]_D = +15,9°
(c = 1,4; CHCl₃).

II. O-Deacetylierung von Hydroxybenzaldehydglykosiden

In der nächsten Stufe der Herstellung der Nitrostyrylenzymsubstrate wurden bestimmte Hydroxybenzaldehydglykoside durch Behandlung mit methanolischem Natriummethoxid O-de-acetyliert. Lösungen der acetylierten Glykoside (15 mmol) in Methanol (50 bis 500 ml) wurden mit 1 m methanolischer Natriummethoxidlösung (0,5 bis 2 ml) behandelt und die Lösungen wurden 20 bis 30 Minuten bei Raumtemperatur oder solange, bis die Reaktion beendigt war, stehen gelassen. Letzteres wurde durch TLC-Analyse festgestellt. Die Lösungen wurden sodann durch Kissen mit Silicagel geleitet, um Natriumionen zu entfernen, und sodann zur Trockene eingedampft.

Nachstehend werden die für verschiedene Glykoside erhaltenen Ergebnisse angegeben:

(a) 4-(2-Acetamido-2-deoxy-a-D-glucopyranosyloxy)- 3-methoxybenzaldehyd kristallisierte direkt aus dem Reaktionsgemisch in 90%iger Ausbeute.
Fp = 199 bis 200°C (Zers.)
[α]_D = -20°
(c = 1; DMSO).
(b) 4-(β-D-Glucopyranosyloxy)-3-methoxybenzaldehyd wurde in 85%iger Ausbeute als weißes Pulver erhalten.
Fp 188 bis 190°C
[a]_D = +2,2°
(c = 0,7; DMSO).
(c) 4-(α-D-Galactopyranosyloxy)-3-methoxybenzaldehyd wurde als weißes Pulver in 15%iger Ausbeute erhalten.
Fp = 204 bis 206°C
[α]_D = +4,8°
(c = 1,1; DMSO).
(d) 4-(α-D-Mannopyranosyloxy)-3-methoxybenzaldehyd wurde in kristalliner Form in 64%iger Ausbeute erhalten.
Fp = 196 bis 197°C (Ethanol)
[α]_D = +119,6°
(c = 1; DMSO).

III. Nitromethylierung der Hydroxybenzaldehydglykoside

Als nächstes wurden sowohl acylierte als auch deacetylierte Hydroxybenzaldehydglykoside, die wie oben hergestellt worden waren, zu den entsprechenden Nitrostyrylglykosiden nitromethyliert.

Nitromethan (16 ml), Ammoniumacetat (8 g) und Essigsäure (4 ml) wurden unter Rühren zu einer Lösung oder Suspension des entsprechenden Glykosids (20 mmol) in Ethanol (150 bis 200 ml) gegeben. Das Gemisch wurde bei Raumtemperatur über einen Zeitraum von etwa 20 bis zu etwa 250 Stunden, gewöhnlich etwa 20 Stunden, gerührt. In den meisten Fällen schied sich das Produkt aus dem Reaktionsgemisch aus und wurde isoliert; in manchen Fällen wurde das Produkt durch Zugabe von Wasser ausgefällt und anschließend entweder abfiltriert oder mit Chloroform oder einem anderen Lösungsmittel extrahiert.

Alternativ wurde das oben beschriebene Reaktionsgemisch 15 bis 45 Minuten am Rückfluß gekocht, wobei ähnliche Ausbeuten der Produkte, oft sogar mit verbesserter Reinheit, erhalten wurden.

Nachstehend sind die bei der Herstellung von verschiedenen Nitrostyrylglykosiden erhaltenen Ergebnisse angegeben, zusammen mit der angewandten Methode; entweder Methode (A), bei Raumtemperatur, oder Methode (B), unter Rückfluß.

(a) 4-(2-Acetamido-3,4,6-tri-O-acetyl-2-deoxy-β-D- glucopyranosyloxy)-3-methoxy-ω-nitrostyrol wurde mit 88% durch Methode (A) und mit 76% durch Methode (B) als gelber kristalliner Feststoff erhalten.
Fp 239 bis 240°C
[α]_D = -6,9°
(c = 1,15; DMSO).
(b) 4-(2-Acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyloxy)- 3-methoxy-ω-nitrostyrol wurde durch Methode (B) in 76%iger Ausbeute als hellgelber Feststoff erhalten.
Fp 200 bis 201,5°C (Zers.)
[α]_D = -1,4°
(c = 0,9; DMSO).
(c) 4-(2-Acetamido-3,4,6-tri-O-acetyl-2-deoxy-β-D- glucopyranosyloxy)-l-nitrostyrol wurde durch Methode (B) als sehr hellgelber Feststoff erhalten.
Fp 258 bis 259°C
[α]_D = -14,3°
(c = 1,1; CHCl₃).
(d) 4-(2,3,4,6-Tetra-O-acetyl-β-D-glucopyranosyloxy)- 3-methoxy-ω-nitrostyrol wurde durch Methode (A) als cremiger gelber Feststoff in 96%iger Ausbeute erhalten.
Fp 192 bis 194°C
[α]_D = -12,4°
(c = 1,2; CHCl₃).
(e) 4-(2,3,4,6-Tetra-O-acetyl-β-D-galactopyranosyloxy)- 3-methoxy-l-nitrostyrol wurde durch Methode (A) in 25%iger Ausbeute nach Extraktion aus dem Reaktionsgemisch mit Dichlormethan und Chlormatographie auf einer Kieselgelsäule unter Verwendung von Ether/Leichtbenzin als Elutionsmittel erhalten.
Fp 148 bis 149°C
[α]_D = -4,4°
(c = 1,1; CHCl₃).
(f) 4-β-D-Galactopyranosyloxy-3-methoxy-ω-nitrostyrol wurde durch Methode (A) in Form von hellgelben Kristallen in 69%iger Ausbeute erhalten.
Fp 212 bis 214°C
[α]_D = +1,3°
(c = 1,5; DMSO).
(g) 4-(2,3,4,6-Tetra-O-acetyl-α-D-mannopyranosyloxy)- 3-methoxy-ω-nitrostyrol wurde durch Methode (A) als hellgelber amorpher Feststoff erhalten.
Fp 131 bis 132°C
[a]_D = -15,7°
(c = 0,8; CHCl₃).

IV. O-Deacetylierung von Nitrostyrylglykosiden

Schließlich wurden O-acetylierte Nitrostyrylglykoside, die auf die obige Weise hergestellt worden waren, deacetyliert.

Eine Lösung oder Suspension des entsprechenden O- acetylierten Nitrostyrylglykosids (2 mmol) in Methanol (150 ml) wurden unter Rühren mit 1 m methanolischer Natriummethoxidlösung (2,5 ml) behandelt. Das Gemisch wurde bei Raumtemperatur 10 bis 20 Minuten gerührt und sodann durch ein Kissen aus Silicagel geleitet, um Natriumionen zu entfernen. Das Silicagel wurde gut mit Methanol gewaschen und das mit den Waschwässern kombinierte Filtrat wurde zur Trockene eingedampft. Der resultierende Feststoff wurde unter Zuhilfenahme von etwas Ethanol abfiltriert. Untenstehend sind die Ergebnisse angegeben.

(a) 4-(2-Acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyloxy)- 3-methoxy-ω-nitrostyrol wurde als hellgelbes amorphes Pulver in quantitativer Ausbeute erhalten. Das Produkt konnte nicht zufriedenstellend umkristallisiert werden, ohne daß eine gewisse Zersetzung bewirkt wurde.
Fp 198 bis 199°C (Zers.)
[α]_D = -7,8°
(c = 1,4; DMSO).
(b) 4-β-D-Glucopyranosyloxy-3-methoxy-ω-nitrostyrol wurde in 77%iger Ausbeute in Form von gelben Kristallen hergestellt.
Fp 140 bis 141°C
[α]_D = -8,7°
(c = 1; DMSO).
(c) 4-α-D-Mannopyranosyloxy-3-methoxy-ω-nitrostyrol (23) wurde als amorpher, hygroskoper oranger Feststoff erhalten.
[a]_D = +80,1°
(c = 0,8; DMSO).

Die auf die obige Weise hergestellten Glykoside sind zur Verwendung für den Nachweis und die Bestimmung der entsprechenden Glykosidasen geeignet. Typischerweise setzen die Glykoside die entsprechende Hydroxynitrostyrylverbindung durch Umsetzung mit dem entsprechenden Enzym frei, wodurch das leicht wahrnehmbare visuelle Signal, allgemein eine Rotfärbung, erhalten wird.

Ein inertes Material in fester Phase kann mit den auf die obige Weise hergestellten Glykosiden oder anderen Enzymsubstraten gemäß der Erfindung imprägniert werden. So wird z. B. die erforderliche Menge mikrokristalline Cellulose zu dem auf die obige Weise hergestellten Silicagel-Eluat gegeben. In einem Rotationsverdampfer wird zur Trockene eingedampft und der erhaltene Feststoff mit einem Mörser und einem Pistill zu einem feinen Pulver vermahlen.

Beispiel 2 Herstellung von Esterderivaten von 4-Hydroxy-ω- nitrostyrolen zum Nachweis und zur Bestimmung der entsprechenden Esterasen

Ein Bereich von Esterderivaten von 4-Hydroxy-ω- nitrostyrolen wurde zur Verwendung in erfindungsgemäßen Enzymsubstraten zum Nachweis und zur Bestimmung der entsprechenden Esterasen hergestellt.

(1) 4-(β-Nitroethenyl)-3-methoxyphenylphosphat (als Mononatriumsalz-monohydrat)

Zu einer stark gerührten eisgekühlten Lösung von Phosphorylchlorid (6,2 g, 40 mmol) in Pyridin (40 ml) wurde tropfenweise im Verlauf von 45 Minuten eine Lösung von 4-Hydroxy-3-methoxy-ω-nitrostyrol (7,8 g, 40 mmol) in Pyridin (20 ml) gegeben. Das Reaktionsgemisch wurde sodann durch tropfenweise Zugabe von wäßrigem Pyridin (50 ml, enthaltend 10% Wasser) zersetzt. Während dieser Zeit schied sich etwas Feststoff ab. Die tropfenweise Zugabe von 2m-Natronlauge (20 ml, 40 mmol) führte zunächst zu einer klaren Lösung und dann zur Abscheidung eines amorphen Mononatriumsalzes als Hydrat (7,1 g, 59%), Fp<250°C.

Das Salz ist in Wasser wenig löslich und zum Nachweis und zur Bestimmung von Phosphatasen geeignet.

(2) 4-(β-Nitroethenyl)-3-methoxyphenylphosphat (als Dinatriumsalz)

Die obige Reaktion (1) wurde wiederholt, mit der Ausnahme, daß das Zersetzte Reaktionsgemisch in eine konzentrierte Lösung von Natriumhydroxid (6 g) in Wasser gegossen wurde. Das Produkt schied sich am Anfang als Öl ab, das sich zu einem amorphen Feststoff (11 g, 86%), Fp<250°C, verfestigte. Es war in Wasser stärker löslich als das Mononatriumsalz und es löste sich leicht in siedendem Wasser unter geringer Zersetzung auf. Beim Abkühlen wurde es wieder ausgefällt, wodurch ein hellgelber Feststoff erhalten wurde. Eine 2mmolare Lösung des Dinatriumsalzes konnte leicht hergestellt werden.

Beispiel 3

Es wurde ebenfalls eine Reihe von Hydroxy-ω-nitrostyrolen hergestellt, um die Farbeigenschaften dieser Verbindungen zu bestimmen und zu vergleichen. Es handelt sich um Beispiele für Verbindungen, die bei der Umsetzung des erfindungsgemäßen Enzymsubstrats mit dem entsprechenden Enzym gebildet werden können.

Es wurde folgende allgemeine präparative Methode angewendet: Der entsprechende Hydroxybenzaldehyd (40 mmol) wurde in Ethanol (200 ml) aufgelöst und die Lösung mit Ammoniumacetat (12 g), Nitromethan (32 ml) und Essigsäure versetzt. Das Reaktionsgemisch wurde entweder über Nacht bei Raumtemperatur gerührt oder 15 bis 60 Minuten am Rückfluß erhitzt. In einigen Fällen kristallisierte das ω-Nitrostyrol aus dem abgekühlten Reaktionsgemisch oder es kristallisierte bei Zugabe von Wasser zu dem abgekühlten Reaktionsgemisch. Wenn kein kristallines Produkt durch diese Methode isoliert werden konnte, wurde das Produkt mit Ether extrahiert und der Extrakt mit Wasser gut gewaschen, getrocknet (MgSO₄) und zur Trockene eingedampft. Die Ausbeuten, die Schmelzpunkte und die Spektraleigenschaften der verschiedenen Hydroxy-ω-nitrostyrolverbindungen wurden durch herkömmliche Methoden bestimmt. Die entsprechenden Werte sind nachstehend angegeben, wobei die Spektraleigenschaften als Absorption (λ _max) in Ethanol und TRIS- Puffer mit pH 8,8 und als Extinktionskoeffizient (ε) bei pH 8,8 angegeben sind.

(1) 4-Hydroxy-3-methoxy-ω-nitrostyrol, Fp 164 bis 166°C (Ethanol), wurde in 75%iger Ausbeute erhalten. Die Substanz hatte einen g _max-Wert (Ethanol) von 380 und einen λ _max-Wert (TRIS 8,8) von 506 mit einem ε-Wert von 20 900.
(2) 4-Hydroxy-l-nitrostyrol, Fp 185 bis 186°C (wäßriges Ethanol), wurde in 52%iger Ausbeute erhalten. Die Substanz hatte einen λ _max-Wert (Ethanol) von 358 und einen g _max-Wert (TRIS 8,8) von 460 mit einem ε-Wert von 24 627.
(3) 4-Hydroxy-3,5-dimethoxy-ω-nitrostyrol, Fp 184 bis 186°C (Ethanol), wurde in 72%iger Ausbeute erhalten. Die Substanz hatte einen λ _max-Wert (Ethanol) von 385 und einen λ _max-Wert (TRIS 8,8) von 530 mit einem e-Wert von 22 330.
(4) 4-Hydroxy-3-nitro-ω-nitrostyrol, Fp 132 bis 133°C, wurde in 57%iger Ausbeute erhalten. Die Substanz hatte einen λ _max-Wert (Ethanol) von 320 und einen λ _max-Wert (TRIS 8,8) von 405 mit einem ε-Wert von 7400.
(5) 4-Hydroxy-3-methoxy-2-nitro-ω-nitrostyrol, Fp 188 bis 189°C (wäßrige Essigsäure), wurde in 42%iger Ausbeute erhalten. Die Substanz hatte einen λ _max-Wert (Ethanol) von 400 und einen λ _max-Wert (TRIS 8,8) von 436 mit einem ε-Wert von 14 000.
(6) 4-Hydroxy-3-methoxy-5-nitro ω-nitrostyrol, Fp 170 bis 171°C (wäßrige Essigsäure), wurde in 67%iger Ausbeute erhalten. Die Substanz hatte einen λ _max-Wert (Ethanol) von 334 und einen λ _max-Wert (TRIS 8,8) von 415 mit einem ε-Wert von 5200.
(7) 2-Hydroxy-3-methoxy-ω-nitrostyrol, Fp 138 bis 139°C (wäßriger Ethanol), wurde in 38%iger Ausbeute erhalten. Die Substanz hatte einen λ _max-Wert (Ethanol) von 322 und einen g _max-Wert (TRIS 8,8) von 492 mit einem Extinktionskoeffizienten ε von 7380.

Die auf die obige Weise hergestellten Hydroxy-ω-nitrostyrole sind typischerweise gefärbte Verbindungen, die das leicht wahrnehmbare visuelle Signal der erfindungsgemäßen Enzymsubstrate liefern können. Besonders bevorzugte Verbindungen sind die 3-Methoxy- und 3,5-Dimethoxyverbindungen (1) und (3), die unterscheidbare tiefrote Färbungen bei alkalischen Bedingungen liefern. Im allgemeinen haben die ω-Nitrostyrolverbindungen ausgeprägt verbesserte Farbeigenschaften gegenüber der hellorange-gelben Färbung von p-Nitrophenol (λ _max Ethanol 320, λ _max TRIS 8,8 400 mit ε=15 000). Dies ist vermutlich auf die Bildung von Radikalionen mit den Nitrostyrylverbindungen zurückzuführen. Die Existenz solcher Radikalionen wird durch die ESR-Spektren der Nitrostyrylverbindungen gestützt. So gab z. B. die 3,5-Dimethoxyverbindung (3) in Lösung DMSO, zu der ein Tropfen einer 1m-Natriummethoxidlösung zugesetzt worden war, ein starkes ESR-Spektrum, das 7 Signale für die sechs Methoxyprotonen im Verhältnis von 1 : 6 : 15 : 20 : 15 : 6 : 1 mit einem kalkulierten Splitting von 0,680 Gauß und 3 Signale für die zwei aromatischen Protonen im Verhältnis 1 : 2 : 1 mit einem kalkulierten Splitting von 1,74 Gauß enthielt. Für die Ethylprotonen wurden keine Signale beobachtet.

Beispiel 4 Bestimmung von N-Acetylglucosaminidase (NAG) in Urin

100 mg mikrokristalline Cellulose, enthaltend etwa 3% 4-(2-Acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyloxy)-3- methoxy-ω-nitrostyrol, Substrat für NAG, hergestellt gemäß Beispiel 1, wurden in einem kleinen Proberöhrchen aus Kunststoff mit frischem Urin (1 ml) von Körpertemperatur oder von gelagertem Urin, der auf 35 bis 38°C vorerwärmt worden war, behandelt. Der Röhrcheninhalt wurde 15 bis 30 Minuten bei 30 bis 35°C, z. B. 20 Minuten bei 37°C, inkubiert und sodann durch eine kurze Säule (etwa 3×0,6 cm) von faseriger DEAE-Cellulose in einer Pasteur-Pipette, die am Boden mit Baumwollwolle verschlossen war, perkolieren gelassen. Das Vorhandensein von NAG in der Urinprobe zeigte sich durch Entwicklung eines karminroten Bandes etwa 0,5 cm unterhalb der Spitze der DEAE- Cellulosesäule an. Manchmal bildete sich ein breites hellbraunes Band oberhalb des karminroten Bandes, das auf Urochrom zurückzuführen war, welches im Urin enthalten war. Bei einigen wenigen Patienten, die Nierentransplantate hatten, wurde ein sich schnell bewegendes braun-malvenfarbiges Band beobachtet, das vermutlich auf die Medikation des Patienten zurückzuführen war. Weiterhin bildete sich bei Diabetikern oder bei Kindern, die niedrige Elektrolytkonzentrationen im Urin haben, das rote Band an der oberen Oberflächengrenzfläche der DEAE-Cellulose und es war in seiner Natur stärker dispergiert. Der letztgenannte Effekt kann durch Zusatz von entsprechenden Mengen an Elektrolyten zum Enzymsubstrat überwunden werden. In allen Fällen ist jedoch die Breite und die Intensität des roten Bandes ungefähr proportional zu der Konzentration von NAG in dem Urin.

Unter Verwendung von 3% Glykosid auf Cellulose ergab normaler Urin (etwa 40 bis 75 nmol/ml NAG) ein enges, schwach kompaktes rotes Band, jedoch lieferten abnormale Urine (<200 nmol/ml NAG) intensiv breitere Bänder, die sich mit steigenden NAG-Konzentrationen intensivierten. Bei den gleichen Testbedingungen ergaben Wasser und Urin, der zur Zerstörung von NAG gekocht worden war, negative Ergebnisse.

Bei einer Abwandlung der Grundbestimmung wurden 8% Glykosid auf Cellulose anstelle des 3%-Glykosid- Materials verwendet. Die Untersuchung ergab, daß das Material eine NAG-Erfassungsschwelle von etwa 20 bis 30 nmol/ml hatte. Bei der abgewandelten Verfahrensweise lieferte normaler Urin intensivere Bänder, als auf die obige Weise beobachtet wurden. Dies zeigt den Weg an, auf dem es möglich ist eine Erfassungsschwelle durch Variierung der Menge des verwendeten Glykosidsubstrats auszuwählen, wobei gleichzeitig auch die Temperatur und die Inkubationszeit beachtet werden.

Claims

1. Nitrostyryl-Derivate der allgemeinen Formel in der
S′ ein Enzymsubstratteil in Form einer Phosphat-, Diphosphat- oder Sulfatgruppe oder einer Glykosylgruppe ist und
R¹, R², R³ und R⁴ jeweils für H, OCH₃ oder NO₂ stehen.

2. Verbindungen nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß S′ eine α- oder β-Glucopyranosyl-, -Galactopyranosyl- oder -Mannopyranosylgruppe oder die 2- Acetamido-2-deoxy-β-D-glucosylgruppe ist.

3. Verwendung der Verbindungen nach Anspruch 1 oder 2 zur Freisetzung von 4-Hydroxy-3-methoxy-ω-nitrostyrol oder 4-Hydroxy-3,5-dimethoxy-ω-nitrostyrol bei der Reaktion mit einem Enzym.