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Verfahren zur Gewinnung von intravenös-verträglichen
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Gammaglobulinen Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung
von iv-verträglichen Gammaglobulinen aus einem Gammaglobulin-Rohniederschlag von
Blut, der mittels üblicher Fällmethoden wie durch Cryo-Athanol-Fraktionierung gewonnen
wurde, durch Unlöslichmachen des antikomplementären Gammaglobulin-Anteils in einer
wäßrigen Lösung des Rohniederschlages durch Bindung desselben an ein wasserlösliches
Polymer und anschließendes Ausfällen der unlöslichen Bestandteile.
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Zu den im Plasma des Blutes gelösten Stoffen gehören u.a die Gammaglobuline,
die für die Behandlung und Prophylaxe von Infektionen eingesetzt werden. Zur Isolierung
der Gammaglobuline müssen möglichst alle anderen im Plasma vorhandenen Substanzen
entfernt werden, damit es möglichst rein zur Verfügung steht.
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Zur Fällung und Isolierung von Gammaglobulinen aus Blut bedient man
sich insbesondere eines unter dem Namen "COHN-Methode" bekannten Verfahrens (COHN
et al., J. Amer. Chem. Soc., Vol. 68, pp. 459 ... 475; Vol. 72, pp. 465 ... 474).
Dieses Verfahren geht aus von einem aus verschiedenen Blutproben gemischten Plasma.
Es ist im Prinzip eine fraktionierte Fällung unter verschiedenen Konditionen. Bei
der ersten Stufe wird bei -3 0C und einem pH-Wert von 7,2 bei einer Xthanolzugabe
von 8 % zunächst als
erstes Sediment vornehmlich Fibrinogen abgeschieden.
Die überstehende Flüssigkeit wird in einer zweiten Stufe mit etwa 19 % Äthanol bei
pH 5,6 gefällt. Der Niederschlag enthält vorwiegend Gammaglobulin. Zur Reinigung
dieses, als COHN-Fraktion II-III bezeichneten Niederschlages wird dieser wieder
aufgelöst und zunächst bei pH 5 und 8 % Äthanol erneut gefällt.
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Der verbleibende überstand wird dann mit 25 % Äthanol bei pH 7, 2
erneut gefällt. Der dabei entstehende Rohniederschlag besteht aus mindestens 90
% Gammaglobulinen. Der Niederschlag wird in einer geeigneten Pufferlösung aufgenommen
und steht nach Sterilfiltration für die Anwendung am Menschen bereit.
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Es hat sich gezeigt, daß in zahlreichen Fällen Gammaglobulin-Präparate,
die auf die vorbeschriebene oder andere Weise gewonnen wurden, antikomplementär
wirksam sind, so daß bei intravenöser Verabreichung durch körpereigene Reaktionen
Komplikationen entstehen.
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Es ist daher bereits versucht worden, die Intravenösverträglichkeit
von Gammaglobulinen durch weitere Reinigung des Rohniederschlages zu erhöhen. Es
sind verschiedene Verfahren bekannt, die antikomplementäre Wirksamkeit (ÅCA) wirksam
auszuschließen, sei es durch physikalische, sei es durch chemische Methoden.
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Als Beispiele seien aus der Literatur genannt: 1. Behandlung mit geeigneten
Enzymen, z. B. Plasmin; 2. Hydrolyse bei hoher Wasserstoffionenkonzentration (z.
B.
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bei pH 4.0); 3. Modifizierung mit B-PropiOlacton.
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Weitere Verfahren finden sich abgehandelt in der Beschreibungseinleitung
zur GB-PS 1 372 953. In dieser Patentschrift wird im Gegensatz zu dem bisher angeführten
Stand der Technik ein Verfahren zur Gewinnung von iv-verträglichen Gammaglobulinen
beschrieben, bei dem aus dem Gammaglobulin-Rohes niederschlag die ACA entfernt wird,
inSdemYdurch ein wasserlösliches Salz bzw. ein wasserlösliches lineares, fadenförmiges,
ungeladenes Polymer zu einem unlöslichen Komplex gebunden und ausgefällt wird. Als
Polymer wird insbesondere Polyäthylenglykol mit einem Molekulargewicht von 6.000
in einer Menge von 4,5 ... 7 g/100 ml Lösung verwendet, die mindestens 3 g Gammaglobulin/100
ml Lösung enthalten muß.
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Anstelle des PEG werden als Fällungsmittel auch wasserlösliche lineare
ungeladene Fadenpolymere in äquivalenten Mengen vorgeschlagen, wobei Dextran, Polyvinylalkohol,
Polyvinylpynblidon, Nonylphentläthoxilat und Polyalcylenglykol genannt, jedoch keine
Beispiele angegeben werden.
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Es zeigt sich jedoch, daß trotz der fraktionierten Fällung mit PEG
immer noch ACA im gereinigten Gammaglobulin vorhanden ist. Es wird daher vorgeschlagen,
einen weiteren Aussalzschritt zur ACA-Entfernung anzuschließen. Die Notwendigkeit
des weiteren Aussalzschrittes ergibt sich aus der mangelnden Selektivität des PEG,
wobei bei der ACA-Fällung auch natives Gammaglobulin mitfällt bzw. bei der anschließenden
Fällung des nativen Gammaglobulin noch mitgefälltes ACA-Material vorhanden ist.
Aus diesem Grunde ist der Anteil nativer Moleküle im gewonnenen Produkt nicht 100
%.
Demgegenüber stellt sich die Aufgabe, aus dem Gammaglobulin-Rohniederschlag
mit hoher Ausbeute Gammaglobuline zu gewinnen deren Anteil an nativen Gammaglobulin-Molekülen
praktisch 100 % ist, so daß die antikomplementäre Wirksamkeit völlig unterdrückt
ist und das.Globulin zur intravenösen Anwendung bedenkenlos geeignet ist. Auch soll
die Lagerfähigkeit des neuen Produktes wesentlich gegenüber solchen Produkten erhöht
sein, die einen geringeren Anteil an nativen Gammaglobulinen enthalten.
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Diese Aufgabe wird gelöst durch ein Verfahren gemäß Erfindung, bei
dem der Gammaglobulin-Rohniederschlag in einer wäßrigen Lösung aufgenommen wird,
in der als wasserlösliches Polymer Humanalbumin in einer Konzentration von 0,3 bis
3 Gew.-% in der Lösung vorliegt, die einen pH-Bereich von 4,0 bis 8,0 aufweist.
Aus dieser Lösung wir der antikomplemetäre Anteil ausgefällt.
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Das eingesetzte Albumin dient zur Trennung von denaturierten Molekülen
von solchen, die gewonnen werden sollen. Es bewirkt einen Schutz der nicht-aggregierten
Gammaglobulin-Moleküle vor Au llung. Durch Zugabe des Albumins ist die nachfolgende,
an sich bekannte Fällung des nativen Gammaglobulin in der genauen Selektierung wesentlich
verbessert.
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Die Lösung des Gammaglobulin-Rohniederschlages in der gepufferten
Albumin-Lösung enthält demnach ausfällbare und
nicht ausfällbare
Bestandteile. Sie wird in einem nachfolgenden fraktionierten Fällungsverfahren,
beispielsweise mit Polyäthylenglykol, von den ausfällbaren (antikomplementären)
Bestandteilen befreit. Hierzu wird vorzugsweise der Albumin-Lösung mit dem Rohniederschlag
in einem ersten Schritt 10 % Polyäthylenglykol zugegeben. Dabei werden die antikomplementären
Bestandteile zusammen mit Albumin ausgefällt und anschliessend zentrifugiert. Der
verbleibende Überstand wird bei pH 7,0 - 7,2 mit 20 % Polyäthylenglykol versetzt
und erneut zentrifugiert. Der jetzt gewonnene Niederschlag enthält praktisch völlig
z eines Gammaglobulin. Es'wird zweckmäßigerweise in einer physiologischen Kochsalzlösung
gelöst und auf eine Konzentration von 5 % Eiweiß gebracht. Nach Sterilfiltration
steht die Lösung zur therapeutischen, insbesondere intravenösen, Anwendung zur Verfügung.
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Vorzugsweise wird der Gammaglobulin-Rohniederschlag in einer gepufferten
Albumin-Lösung aufgenommen, die einen pH-Bereich zwischen 4,4 und 4,9 bzw. 6,6 und
7,2 aufweist.
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Die einzelnen Verfahrensschritte werden anhand eines Beispieles erläutert:
1. Herstellung des Gammaglobulin-Rohniederschlages Es wird ausgegangen von einem
gesmmmelten Humanblut-Plasma.
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Dieses wird zur Auslösung einer Fällungsreaktion mit 8 Gew.-t Äthanol
bei einem pH-Wert von 7,2 bei -30c versetzt. Aus dem
Plasma wird
die sog. Fraktion I nach C0HN ausgeschieden. Die aufstehende Flüssigkeit wird anschließend
bei -5 0C und einem .pH-Wert von 5,8 mit 19 % Äthanol versetzt. Es scheidet sich
die sog. Fraktion II-III aus, die aus Gamma-Globulinen besteht.
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Der Niederschlag wird wieder aufgelöst und bei pH 5 und 8% Äthanol
erneut gefällt. Der verbleibende überstand wird dann mit 25 % Äthanol bei pH 7,2
erneut gefällt. Der hierbei entstehende Rohniederschlag (= Fraktion II) besteht
aus mindestens 90 % Gammaglobulin.
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2. Herabsetzung der antikomplementären Wirksamkeit Um den Gammaglobulin-Rohniederschlag
weiter zu reinigen, wird dieser in einer gepufferten, wäßrigen Lösung mit einem
pH-Wert von 6,7 in einer Konzentration von 6 % erneut gelöst. In dieser wäßrigen
Lösung sind weiterhin etwa 0,6 Gew.-% Humanalbumin (Zugabe einer entsprechenden
Menge eines Präparates "Albumin human 5 %, Hersteller Blutspendedienst des DRK,
Institut Hagen) gelöst. Das Albumin führt selbst nicht zu einer Fällungsreaktion,
sondern ermöglicht die Trennung der erwünschten und nicht erwünschten Gammaglobulin-Anteile.
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Die eingentliche Fällung erfolgt in an sich bekannter Weise.
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Der Lösung des Rohniederschlages werden 10 Gew.-% Polyäthylenglykol
zugeführt. Es scheiden sich die antikomplementären Bestandteile des Gammaglobulins
durch Bildung unlöslicher Komplexe aus. Das Gemisch wird zentrifugiert. Der verbleibende
Überstand, der das reine Gammaglobulin enthält, wird nochmals bei pH 7,2 mit 20
Gew.-% Polyäthylenglykol versetzt. Es scheidet Sicih ein Niederschlag des reinen
Gammaglobulins ab. Dieser
wird zentrifugiert und erneut in einer
physiologischen Kochsalzlösung aufgenommen und auf eine Konzentration von 5,2 %
Eiweiß gebracht und anschließend sterilfiltriert. Hiernach steht er zur therapeutischen
Anwendung bereit. Das Präparat enthält hochreines Gammaglobulin, das zur intravenösen
Anwendung geeignet ist.
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Das vorstehende Beispiel kann dadurch variiert werden, daß der pH-Bereich
der gepufferten Albumin-Lösung zwischen 4,0 und 8,0, vorzugsweise zwischen 4,4 und,9
bzw. 6,6 und 7,2 lieg Es haben sich die beiden letztgenannten Bereiche als günstig
erwiesen.
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Der Gehalt an Albumin beträgt vorzugsweise 0,8 - 1,5 Gramm pro 100
ml Lösung, wobei sich ein Optimum der Wirksamkeit dann ergibt, wenn der Anteil des
Gammaglobulin-Rohniederschlages in der Lösung 5 Gew.-% bei einem Gehalt von etwa
1,0 Gew.-% Albumin beträgt.
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Das nach dem neuen Verfahren gewonnene Gammaglobulin ist praktisch
zu 100 % rein und entspricht dem Gammaglobulin des ursprünglichen Blutserums vollständig.
Durch die Verwendung von Albumin ist auf jeden Fall die physiologische Verträglichkeit
gesichert. Die Gammaglobulin-Moleküle sind nicht modifiziert oder chemisch verändert.
Aus diesen Eigenschaften resultieren auch die in Versuchen überprüften weiteren
vorteilhaften Eigenschaften des Gammaglobulins gemäß dem neuen Verfahren, nämlich
seine sichere Intravenösverträglichkeit.