DE2849183C3

DE2849183C3 - Verfahren zur Herstellung von Polysaccharid

Info

Publication number: DE2849183C3
Application number: DE19782849183
Authority: DE
Inventors: Ian Davidson; Renton Clive Righelato
Original assignee: Tate and Lyle PLC
Current assignee: Kelco Biospecialties Ltd
Priority date: 1977-11-16
Filing date: 1978-11-13
Publication date: 1981-04-16
Also published as: DE2849183A1; DE2849183B2; FR2409309B1; FR2409309A1; JPS5646794B2; JPS54145291A

Description

Die Erfindung betrifft die Herstellung von Polysacchariden durch Mikroorganismen vom Genus Xanthomonas.

Die Polysaccharide, die von der Galtung Xanthomonas gebildet werden und die im allgemeinen als Xanthanharze beschrieben werden, werden zunehmend für verschiedene Zwecke in der Praxis verwendet. Die besonderen reologischen Eigenschaften von wäßrigen Lösungen von Xanthanharzen machen sie besonders Interessant auf dem Gebiet der Nahrungsmittel, der Dentaltechnik und beim ölbohren.

Die Herstellung erfolgt im allgemeinen im absatzwei- «en Verfahren, indem man einen Xanthomas-Stamm Unter Bedingungen kultiviert, die für die Polysaccharidfeildung optimal sind und hinsichtlich des als Substrat verwendeten Kohlehydrats die größte Wirtschaftlichkeit zeigen. Wie bei allen Fermentationsverfahren wäre eine kontinuierliche Fermentation sehr wünschenswert im Hinblick auf die Vorteile einer gleichmäßigen Produkten, geringerer Ausrüstungen und Erleichterung der Überwachung.

Eine Reihe von kontinuierlichen Fermentationsverfahren zur Bildung von Xanthanharzen sind schon bekannt. Aus US-PS 33 28 262 ist ein mehrstufiges !kontinuierliches Verfahren bekannt, bei dem in der ersten Stufe das Wachstum in einem Medium erfolgt, das in dem Kohlehydratsubstrat nicht vorkommt. Diese erste Stufe war offensichtlich erforderlich, um eine stabile kontinuierliche Harzproduktion zu ermöglichen, in dieser ersten Stufe erfolgt jedoch keine oder nur eine geringe Xanthanharzbildung und die Harzbildung erfolgt erst in den späteren Stufen, wenn ein Oberschuß an Zucker zu dem Medium zugegeben wird. Es wird in der Patentschrift dargelegt, daß zur Bildung eines Polysaccharids durch bakterielle Fermentation ein reichlicher Überschuß an Kohlehydratsubstrat (im allgemeinen Sucrose oder Glucose) für erforderlich gehalten wird. Aufgrund dieser ersten Stufe bei dem Verfahren der US-PS 33 28 262 mußte man annehmen, daß ein Kohlehydratmangel bei der Herstellung eines Polysaccharids nicht vorliegen darf.

Beispielsweise wird in der US-PS 34 85 719 und in einem Aufsatz von Silman und Rogovin (Biotechnology and Bioengineering, 12, 75-83, 1970) ein einstufiges kontinuierliches Fermentationsverfahren beschrieben, bei dem die begrenzende Komponente in dem Medium die Stickstoffquelle ist und etwa ein Viertel des Kohlehydrats in dem Medium unverändert bleibt. Dabei ist klar, daß bei kontinuierlichen Fermentationsbedingungen nach Erreichen des stationären Zustandes das System auf die Zufuhr eines der erforderlichen Substrate angewiesen ist Eine Erhöhung der menge dieses zugeführten Substrats verändert sofort den stationären Zustand der Fermentation, entweder bis das Substrat auf das neuen Niveau wiederum limitierend wird oder bis d^e Zufuhr eines anderen wesentlichen Substrates eine Begrenzung ergibt

ίο Überraschenderweise wurde nun gefunden, daß in dem Fall, wo die Kohlenstoffquelle das wachstumslimitierende Substrat bei einer kontinuierlichen Fermentation dieser Art ist die Wirksamkeit der Umwandlung der Kohlenstoffquelle in ein Polysaccharid tatsächlich erhöht werden kann und daß weiterhin der Abfluß aus dieser Fermentation im wesentlichen kein Kohlehydrat enthält

Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung eines Polysaccharids gezeigt, in dem ein polysaccharidbildender Stamm der Gattung Xanthomonas in einer kontinuierlichen Fermentation, in welcher die Kohlehydrat-Kohlenstoffquelle das wachstumslimitierende Substrat ist, kultiviert wird.
Eine Erhöhung der Umwandlungseffizienz macht das Verfahren wirtschaftlicher, aber dies ist nicht der einzige Vorteil. Enthält der Abfluß aus dem Verfahren erhebliche Mengen an Kohlehydraten, so treten Probleme hinsichtlich der Umweltverschmutzung auf und deswegen ist es wünschenswert, daß der Abfluß einen möglichst niedrigen BOD (biologischer Sauerstoffbedarf) hat. Die Wahl des Kohlehydrats als begrenzendes Substrat bedeutet jedoch, daß das Abwasser aus dem Verfahren im wesentlichen frei von Kohlehydrat ist und somit einen sehr niedrigen BOD hat

Das bei der Fermentation verwendete Medium kann jedes Medium sein, das für die Bildung eines Polysaccharids durch die Gattung Xanlhomonas geeignet ist. Es enthält im allgemeinen zusätzlich zu der Kohlehydratquelle Quellen für Stickstoff, Phosphor, Magnesium, Kalium und Spurenelemente. Meistens werden die verschiedenen Substrate oder Nährstoffe in Form von anorganischen Salzen und reiner Glucose zugeführt, um eine genaue Überwachung der relativen Konzentrationen im Medium zu ermöglichen, jedoch können auch andere organische Substrate, wie Hefeextrakt, Sojamehl und dergleichen verwendet werden.

Der polysaccharidbildende Vertreter von Xanthomonas, der im erfindungsgemäßen Verfahren verwendet wird, kann jeder geeignete Vertreter sein, insbesondere ein solcher, der in die campestris-Gruppe fällt, wie sie in »Bergeys Manual of Determinative Bacteriology«, 7. Auflage, beschrieben wird. So kann man beispielsweise Stämme von Xanthomonas campestris oder andere Vertreter dieser campestris-Gruppe verwenden. Xanthomonas-Bakterien werden, nach Bergeys Manual of Determinative Bacteriology wie folgt erkannt:

Einzelzellen, gerade Stäbchen. Dimensionen gleich 0,2 bis 0,8 χ 0,6 bis 2,0 μπι, im allgemeinen etwa 0,4 bis 1,0 μΐη. Motil mittels eines polaren Flagellum. Bildet keine Hüllen. Kein Ruhestadium bekannt. Gram-negativ.

Wachstum auf Agarmedium im allgemeinen gelb. Chemoorganotroph, respiratorischer Metabolismus, niemals fermentativ, molekularer Sauerstoff ist der Elektronenakzeptor. Oxidasereaktion negativ oder schwach. Catalase positiv.

In einem schwach gepufferten Medium wird Säure in geringen Mengen aus vielen Kohlehydraten gebildet, jedoch nicht aus Rhamnose, Inulin, Adonit, Dulcit, Inosit oder Saücin und selten aus Sorbit. Es wird keine Säure in Bromothymol-Purpurmilch gebildet Acetat, Citrat, Malat, Propionat und Succinat werden verbraucht, aber im allgemeinen nicht Benzoat, Oxalat oder Tartrat Gluconat wird nach einer Verzögerung verbraucht Die meisten Spezies hydrolysieren Stärke und Tween 80 schnelL

Nitrate werden nicht reduziert Schwefelwasserstoff wird aus Cystein von den meisten Spezies aus Thiosulfat und Pepton gebildet Acetoin und Indol werden nicht gebildet, Natriumhippurat wird nicht hydrolysiert

Die Minimumwachstumserfordernisse sind komplex und schließen im allgemeinen Methionin, Glutaminsäure und Nikotinsäure in verschiedenen Kombinationen ein. Asparagin wird nicht als einzige Quelle für Konlenstoff und Stickstoff verbraucht Wachstum auf Nähragar wird durch 0,1% und gewöhnlich schon durch 0,02% Triphenyltetrazoliumchlorid inhibiert.

Aerobes Wachstum

Temperaturoptimum 25 bis 27° C; kein Wachstum bei 5°C, häufig Wachstum bei 7°C, jedoch in einigen Fällen unfähig unter 9° C zu wachsen. Alle wachsen bei 3O⁰C. keines wächst bei 40° C.

Der G + C-Gehalt von DNA der 29er-Reihe aus der Xanthomonas campeslris-Gruppe liegt im Bereich von 63,5 bis 69,2 MoI.-% (meistens T_n,).

Es wurde gefunden, daß mit besonderem Vorteil ein Stamm von Xanthomonas campestris verwendet werden kann, der in der American Type Culture Collection unter der Hinter'egungsnummer ATCC 13 951 hinterlegt wurde. Dieser Stamm zeigt die vorher aufgezeigten Eigenschaften für X. campestris im allgemeinen und ist besonders wirksam in der Bildung von brauchbarem Polysaccharid.

Abgesehen von der Tatsache, daß die Fermentation kontinuierlich in einem stationären Zustand durchgeführt werden soll, kann jede geeignete Methode für das Verfahren angewendet werden. Der Verdünnungsgrad wird jedoch vorzugsweise überwacht, so daß das Kulturvolumen alle 7 bis 70 Stunden erneuert wird (ein Verdünnungsgrad von 0,143 bis 0,0143/h), vorzugsweise alle 10 bis 50 Stunden, beispielsweise alle 20 bis 30 Stunden (ein Verdünnungsgrad von 0,05 bis 0,034/h).

Das Polysaccharid kann in üblicher Weise durch Ausfällung mit Alkohol gewonnen werden und der Abfluß enthält im wesentlichen keine Glucose.

Die Konzentration des Polysaccharids in dem aus dem Fermentationsgefäß abgezogenen Medium hängt natürlich von der Konzentration an Glukose und anderen Kohlehydratquellen, die in dem Medium gebraucht wurden, ab. Geeignete Glukosekonzentrationen in dem Medium liegen im Bereich von 5 bis 50 g/l, jedoch können auch Konzentrationen außerhalb dieses Bereiches verwendet werden.

Die folgenden Beispiele beschreiben die Erfindung.

Beispiel 1

Ein Laboratoriumsvorrat von Xanthomonas campestris (erhalten von ATCC 13 951) wurde kontinuierlich in einem gerührten Tankfermentator mit 5 1 Kapazität gezüchtet. Die Fermentationsparameter waren die folgenden: pH = 7,0; Temperatur = 3O⁰C; Rührgeschwindigkeit 850 Upm; Rührerdurchmesser 8,4 cm (Geschwungener Blattrührer, bei dem sich die Blätter von der Drehrichtung nach hinten verjüngen); Luftstrom 2,0 l/min. Falls erforderlich, wurde das Schäumen durch Zugabe von Polypropylenglykol (MoL-Gewicht 2025) kontrolliert Die Zusammensetzung des Kulturmediums wird in Tabelle 1 angegeben.

Tabelle 1

Glucose (wasserfrei)

KH₂PO₄
MgSO₄ · 7 H₂O
Zitronensäure · H₂O
Mischung von Spurenelementen*)

*) Mischung \ -n Spurenelementen
konzentrierte HCl 13,00 ml

CaCO₃ 2,00 g

ZnO 0,40 g

FeCl₃ · 6 H₂O 5,40 g

MnCl₂ · 2 H₂O 1,00 g

CuCl₂-2 H₂O 0,17 g

CoCl₂ · 6 H₂O 0,24 g

H₃BO₃ 0,06 g

aufgefüllt mit destilliertem Wasser auf 1 1

15,00 g/l 2,67 g/l 1,00 g/l 0,20 g/l 2,10 g/l

10 ml/1

Das Arbeitsvolumen wurde mittels eines Überlaufs auf 2,9 1 mit nichtbeimpftem Medium eingestellt aber auf 3,6 1 erhöht mit zunehmender Viskosität der Kultur. Elektroden wurden in das Gefäß durch zwei Seitenöffnungen eingeführt. Das Rühren wurde durch zwei geschwungene Blattrührer, die 8,4 cm auseinander waren, bewirkt Der kleinere Rührer wurde am niedrigsten Punkt der Rührwelle angebracht. Luft wurde unterhalb des niedrigsten Rührers eingeführt.

Das Mischen wurde durch vier Prallbleche unterstützt, die längs an der Innenwand des Kulturgefäßes angebracht waren.

Das Fermentiergefäß war mit einer automatischen pH-Überwachung ausgerüstet, durch welche Im KOH zur Aufrechterhaltung des pH-Wertes auf 7,0 zudosiert wurde, und mit einer Sauerstoffelektrode. Das Gefäß wurde in üblicher Weise vor der Zugabe des Mediums sterilisiert.

Zu dem Medium in dem Kulturgefäß wurden 100 ml einer Kultur zugegeben, die in MYGP-Brühe in Schüttelflaschen gewachsen war (g/l: Malzextrakt 3,0; Hefeextrakt 3,0; Glucose 10,0; Pepton 5,0; pH nicht eingestellt). Die Kultur wurde in einem Ansatz 36 Stunden unter den angegebenen Bedingungen wachsen gelassen. Dann wurde kontinuierlich das Medium mit einem Verdünnungsgrad von 0,05/h (180 ml/h) zugeführt. Die Kultur wurde überwacht durch Messung von (a) pH; (b) gelösten Sauerstoff; (c) Sauerstoff aufnahme unter Verwendung eines OrAnalysegerätes und CO₂-Entwicklung in der abfließenden Luft (unter Verwendung eines lnfrarot-CO2-Ana!ysegerätes); (d) Gesamtmenge an mit Isopropanol ausfällbarem Stoff (TPM) (Niederschlag mit 1,5 Volumen Isopropanol wurde durch Filtrieren gesammelt und im Vakuum bei 45°C während 24 Stunden getrocknet); (e) optische Messung der Zellendichte bei 540 nm; (f) Messung des Reststickstoffs durch Mikro-Kjeldahl-Bestimmung; (g) Bestimmung der Restglucose durch eine Glucose-Oxidase-Methode; (h) Viskositätsmessung in der Kulturbrühe unter

Verwendung eines Kegel-und-Platten-Viskosimeters (0,8° Kegel) bei 25° C.

Man ließ die Kultur einen stationären Zustand erreichen. Eine abgemessene Probe wurde mit destillier-

tem Wasser auf 1/10 verdünnt und gründlich damit vermischt Die Probe wurde 90 Minuten mit 23 000 G zentrifugiert und die überfließende Flüssigkeit wurde dekantiert Die Zellen wurden in Wasser gewaschen und 12 Stunden bei 105⁰C getrocknet und dann gewogen. Das Polysaccharid wurde aus der überstehenden Lösung mit 1,5 Volumen Isopropanol ausgefällt Der Niederschlag wurde durch Filtrieren gesammelt und gefriergetrocknet

Die scheinbaren Viskositäten in den Kulturbrühen wurden in einem Bereich von Scheer-Graden mit einem Kegei-und-Platten-Viskosimeter (0,8° Kegel) bei 25° C gemessen. Die Logarithmen der scheinbaren Viskosität wurden gegenüber den Logarithmen des Scheer-Grades aufgetragen und zur Bestimmung des Konsistenzindex K wurde extrapoliert Die Daten für eine typische kohlenstofflLmitierte Kultur werden in Tabelle 2 gezeigt

Nach Erreichen des stationären Zustandes wurden in das Fermentationsgefäß 200 ml einer 60%igen (Gew./ Vol.) Glucoselösung gegeben. Die Sauerstoffaufnahme und CO2-Entwicklung nahm praktisch sofort zu, was anzeigte, daß die Kultur kohlenstofflimitiert war (Tabelle 3). Man beobachtete ein Ansteigen der Zellkonzentration nach der Zugabe und zwar durch ein Ansteigen der Trübung.

Tabelle 2

Verdünnungsgrad	0,05 h-^!
Glucosemenge im Medium	15,0 g/l
E540 (1/10 Verdünnung, gewichts	0,45
bezogen)
TPM	13,6 g/l
Ausbeute (=TPM/Glucose-Menge)	91%
Zellfreies Polysaccharid, Trocken	9,5 g/l
gewicht
Zeil-Trockengewicht	3,7 g/l
02-Aufnahme	5,13 mmol/l/h
CO2- Entwicklung	5,96 mmol/l/h
Zeil: Polymer-Verhältnis	1 :2,6
Konsistenzindex der Kulturbrühe (K)	12 000cps

Tabelle 3

kohlenstoff- 30 Min. nach 2 h nach

begrenzt Zugabe von Zugabe von

zusätzlicher zusätzlicher

Glucose Glucose

O₂-Aufnahme 5,13 8,45 9,96

(mmol/l/h)

CO₂-EnIWiCk- 5,96 8,58 10,19

lung (mmol/l/h)

Die Reinigung des Polymeren unter Verwendung des Cetyltrimethylammoniumbromid-Ausfällungsverfahrens zeigte, daß das Polymer Glucose und Mannose im Verhältnis von 1,1 bis 2,1 :1 enthielt. Das durch Ausfällen mit Isopropaml t>us der Kulturbrühe erhaltene rohe Polysaccharid enthielt Glucose und Mannose im gleichen Verhältnis und es wurden keine wesentlichen Mengen an anderen neutralen Zuckern festgestellt.

Beispiel 2

Das Verfahren gemäß Beispiel 1 wurde wiederholt, mit der Ausnahme, daß 25 g/l Glucose anstelle von 15 g/l Glucose im Kulturmedium verwendet wurden und daß der Verdünnungsgrad auf 0,034/h eingestellt wurde. Die folgenden Tabellen 4 und 5 zeigen die Ergebnisse dieser Versuche.

Tabelle 4

Verdünnungsgrad	kohlenstoff	0,034 h-¹
Glucosemenge im Medium	begrenzt	25,0 g/l
E540 (1/10 Verdünnung, gewichts		0,45
bezogen)	O₂-Aufnahme 4,53
TPM	(mmol/l/h)	23,2 g/l
Ausbeute (=TPM/Glucose-Menge)	CO₂-Entwicklung 4,95	92,8%
zellfreies Polysaccharid, Trocken	(mmol/l/h)	15,3 g/l
gewicht
Zeil-Trockengewicht	4,4 g/l
02-Aufnahme	4,53 mmol/l/h
CO₂-Entwicklung '	4,95 mmol/l/h
Zeil: Polymer-Verhältnis	1:3,5
Konsistenzindex der Kulturbrühe (K)	12 000cps
Tabelle 5
2 h nach Zugabe
von zusätzlicher
Glucose
9,50

9,53

Beispiel 3

Das Verfahren von Beispiel 1 wurde wiederholt mit der Ausnahme, daß X. campestris ATCC13 951 in einem 1000 ml Chemostat kontinuierlich wachsen gelassen wurde. Die Fermentationsparameter waren die folgenden: pH = 7,0; Temperatur 30⁰C; Rührgeschwindigkeit 500 Upm; Luftstrom 0,65 l/min. Die Zusammensetzung des Mediums war ähnlich der bereits in Beispiel 1 beschriebenen mit der Ausnahme, daß 5,0 g/l Glucose und 2,0 g/l (NtU)₂SO-I verwendet wurden.

Das Arbeitsvolumen wurde auf 300 ml eingestellt. Das Mischen wurde durch einen magnetisch gekuppelten, mehrschauf eligen Rührer vorgenommen.

Zu dem Medium in dem Gefäß wurden 45 ml einer in Nährbrühe enthaltenen Schüttelflasche 48 Stunden gewachsenen Kultur gegeben.

Die Versuchsergebnisse werden in Tabelle 6 gezeigt

Tabelle 6

Verdünnungsgrad 0,050 h-'

Glucosemenge im Medium 5,0 g/l

E540 (1/10 Verdünnung) 0,24

TPM ca. 4,0

Ausbeute (=TPM/Glucose-Menge) ca. 80%
zellfreies Polysaccharid, Trockengewicht 2,70 g/l

Zeil-Trockengewicht 1,10 g/l

Zeil: Polymer-Verhältnis 1 :2,45

Zum Vergleich wird festgehalten, daß in US-PS 34 85 719, bei der stickstofflimitierende Bedingungen angewendet wurden, eine Ausbeute (TPM/Glucose-Menge) von 62% erreicht wird.

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Herstellung eines Polysaccharids durch Kultivierung eines polysaccharidbildenden Stammes vom Gerus Xanthomonas mittels kontinuierlicher Fermentation, dadurch gekennzeichnet, daß das wachstumslimitierende Substrat die Kohlehydrat-Kohlenstoffquelle ist

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß ein Stamm von Xanthomonas campestris oder ein anderer Stamm der campestris-Gruppe, wie sie in Bergeys Manual of Determinative Bateriology, 7. Auflage, beschrieben wird, kultiviert wird.

3. Verfahren nach Ansprüchen I oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Verdünnungsgrad 0,143 bis 0,0143/h beträgt