DE2732454A1

DE2732454A1 - Peptidderivate und deren herstellung

Info

Publication number: DE2732454A1
Application number: DE19772732454
Authority: DE
Inventors: Frank Ratcliffe Atherton; Michael John Hall; Cedric Herbert Hassall; Robert Wilson Lambert; Peter Stuart Ringrose; Hertfordshire Welwyn
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 1976-07-21
Filing date: 1977-07-18
Publication date: 1978-01-26
Also published as: IL52528A; ATA524477A; AT353993B; AU513583B2; LU77807A1; NL7708069A; BE856973A; FR2359154A1; AU2710777A; IL52528A0; IT1080693B; ZA774240B; SE7708379L; US4143134A; FR2359154B1; DK330077A; GB1585275A; NZ184653A; JPS5312810A; CA1106395A

Description

Peptldderivate und deren Herstellung

Die vorliegende Erfindung betrifft neue Peptidderivate, ein Verfahren zu deren Herstellung und diese Verbindungen enthaltende pharmazeutische Präparate.

Die erfindungsgemässen Peptidderivate sind solche der allgemeinen Formel I

R³ R² R¹ O

H₀N CH CO

(a)

-NH CH CO-

(b)

-NH CH P R

(C) η

OH (I)

η 12 3

worin/o, 1, 2 oder 3 bedeutet; R , R und R die Reste normalerweise in Proteinen vorkommender α-Aminosäuren oder Halogenmethyl darstellen,

1 2

wobei jedoch mindestens einer der Reste R , R

3 4

und R eine Halogenmethylgruppe bedeutet; R Hydroxy oder Methyl ist und die Konfigurationen an den Kohlenstoffatomen (a) und (b) L oder D,L

3 2
sind (sofern R bzw. R φ H) und die

Mez/27.6.1977

Konfiguration am Kohlenstoffatom (c) R ist ^ H), und physi

709884/09/»

(sofern R φ H), und physiologisch verträgLiche

Salze dieser Verbindungen.

Der Ausdruck "Rest einer normalerweise in Proteinen vorkommenden α-Aminosäure soll den Rest R einer natürlichen a-Aminosäure der allgemeinen Formel

HN CH COOH

wie sie normalerweise in Proteinen vorkommt, bezeichnen. Wenn beispielsweise die Aminosäure Glycin ist, dann stellt R ein Wasserstoffatom dar und wenn die Aminosäure Alanin ist, stellt R eine Methylgruppe dar. Für Leucin ist R die Isobutylgruppe, für Phenylalanin die Benzylgruppe und für Glutaminsäure die 2-Carboxyäthylgruppe. R kann aber auch zusätzlich an das Stickstoffatom der a-Aminogruppe gebunden und somit Teil eines stickstoffhaltigen Ringes sein, wie beispielsweise im Prolin. Der Ausdruck Halogen umfasst Fluor, Chlor, Brom und Jod.

Wenn in Formel I η 2 oder 3 bedeutet, kann der Substituent R gleiche oder verschiedene a-Aminosäurereste darstellen.

Wenn R in Formel I ^ Wasserstoff, dann ist die Konfiguration am Kohlenstoffatom (c) R, das ist die Konfiguration, die erhalten wird durch Ersatz der Carboxylgruppe einer natürlichen L-a-Aminosäure durch einen Phosphorrest.

Bevorzugte Verbindungen der Formel I sind solche, in 4
denen R eine Hydroxygruppe darstellt. Ebenfalls bevorzugt sind

Verbindungen der Formel I in denen mindestens einer der Reste

12 3
R , R und R eine Fluormethyl- oder Chlormethylgruppe darstellt. Schliesslich sind Verbindungen der Formel I in denen η 0 oder 1 bedeutet, bevorzugt.

Beispiele von erfindungsgemässen Verbindungen der Formel I sind (D,L-3-Fluoralanylamino)-methylphosphonsäure und

709884/0944

* 2732A5A

(IR)-1-(L-3-Fluoralanylamino)-äthylphosphonsäure.

Die erfindungsgemässen Peptidderivate der Formel I und deren physiologisch verträgliche Salze können dadurch hergestellt werden, dass man
a) die Schutzgruppe(n) einer Verbindung der allgemeinen Formel

_D30 _R20 R¹⁰

κ ,

R⁵ NH CH CO-

(a)

-NH CH CO-

(b)

-NH CH P

^(c) I V.40

(ID

worin η und die Konfigurationen an den Kohlenstoffatomen (a), (b) und (c) wie vorstehend definiert sind; R , R und R zu R , R und R analoge Bedeutungen haben mit dem Zusatz, dass allfällig vorhandene Amino- sowie andere funktioneile Gruppen gegebenenfalls in geschützter Form

40 41 41

vorliegen; R Methyl oder R ; R Hydroxy oder eine Niederalkoxy-Schutzgruppe und R

ein Wasserstoffatom oder eine Schutzgruppe darstellen,
in an sich bekannter Weise abspaltet oder

b) aus einer R,S-diastereomeren Verbindung der Formel I, das R-Diastereomere in an sich bekannter Weise isoliert und gegebenenfalls eine erhaltene Verbindung der Formel I in ein physiologisch verträgliches Salz überführt.

Eine oder mehrere in den Resten R , R und R einer Verbindung der Formel II anwesende Aminoschutzgruppe(n) kann (können) in geschützter Form vorliegen, wobei die aus der Peptidchemie bekannten Aminoschutzgruppen in Frage kommen.. Besonders geeignete Aminoschutzgruppen sind Aralkoxycarbonylgruppen, insbesondere die Benzyloxycarbonyl- und die tert.-

709884/09U

Butoxycarbonylgruppe. Als Aminoschutzgruppen kommen aber auch der Formyl-, der Trityl- oder der Trifluoracetylrest in Frage. Eine in den Resten R , R und R einer Verbindung der Formel II anwesende Carboxy- oder Hydroxygruppe kann durch eine der üblichen Carboxyl- oder Hydroxylschutzgruppen geschützt sein. EineCarboxylgruppe kann beispielsweise durch Ueberführung in eine Alkylester- oder Aralkylesterfunktion, beispielsweise einen tert.-Butylester oder einen Benzylester, geschützt sein. Eine Hydroxygruppe kann beispielsweise mittels eines Aralkoxycarbonylrestes, z.B. des Benzyloxycarbonylrestes, eines Alkanoylrestes, z.B. des Acetyl- oder Propionylrestes, eines Aroylrestes, z.B. des Benzoylrestes, eines Alkylrestes, z.B. des tert.-Butylrestes, oder eines Aralkylrestes, z.B. des Benzylrestes, geschützt werden. Der Schutz weiterer funktioneller Gruppen,

die Teile der Substituenten R , R und R sein können, kann in an sich bekannter Weise erfolgen. Bei der durch den Rest R~ in der allgemeinen Formel II genannten Schutzgruppe kann es sich um eine beliebige, in Verbindung mit den Resten R , R und R vorstehend bereits genannte Aminoschutzgruppe handeln.

Die Abspaltung der Schutzgruppen einer Verbindung der Formel II kann in an sich bekannter Weise durchgeführt werden, d.h. nach Verfahren, die für die Schutzgruppenabspaltung zur Zeit tatsächlich angewandt oder in der Literatur beschrieben werden. Demzufolge kann beispielsweise ein Aralkoxycarbonylrest, z.B. die Benzyloxycarbonyl- oder die tert.-Butoxycarbonylgruppe, hydrolytisch abgespalten werden, beispielsweise durch Behandeln mit einem Gemisch von Bromwasserstoff und Eisessig. Ein Aralkoxycarbonylrest, z.B. der Benzyloxycarbonylrest, kann auch durch Hydrierung, z.B. in Gegenwart von Palladium auf Holzkohle oder Palladiumoxid, abgespalten werden. Des weiteren kann die tert.-Butoxycarbonylgruppe mittels Chlorwasserstoff in

40 41

Dioxan abgespalten werden. Eine als Rest R und/oder R vorhandene niedere Alkoxygruppe die grad- oder verzweigkettig sein kann und vorzugsweise 1-6 Kohlenstoffatome enthält, kann durch Behandlung mit einem Gemisch von Bromwasserstoff in Eisessig oder mittels Trimethylchlorsilan und anschliessende wässrige

709884/0944

Hydrolyse in eine Hydroxygruppe umgewandelt werden. Es versteht sich, dass, je nach Erfordernissen, die Abspaltung der Schutzgruppen in einer einzigen Reaktionsstufe oder in mehreren Stufen erfolgen kann.

Die Auftrennung einer (R,S)-diastereomeren Verbindung der allgemeinen Formel I in ihre Diastereomeren und die Gewinnung des (R)-Diastereomeren kann nach an sich bekannten Verfahren durchgeführt werden, z.B. durch fraktionierte Kristallisation oder durch Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie.

Die Peptidderivate der Formel I sind amphotere Verbindungen und bilden Salze mit physiologisch verträglichen starken Säuren (z.B. Methansulfonsäure, p-Toluolsulfonsäure, Salzsäure, Bromwasserstoffsäure, Schwefelsäure) und mit physiologisch verträglichen Basen (z.B. Natriumhydroxid).

Das Ausgangsmaterial der Formel II kann beispielsweise dadurch hergestellt werden, dass man eine Verbindung der allgemeinen Formel III

H-

-NH-

20

-CH-(b)

-CO-

-NH-

R¹⁰ 0

-CH-(C)

41

-R

40

(III)

mit einer Verbindung der allgemeinen Formel IV

-NH CH-

(a)

-CO-

-NH-

,20

-CH-(b)

-CO-

-OH

(IV)

oder einem reaktionsfähigen Derivat einer solchen Verbindung

709884/0944

2732A5A

kondensiert, wobei R⁵, R¹⁰, R²⁰, R³⁰, R⁴⁰ und R⁴¹ sowie die Konfigurationen an den Kohlenstoffatomen (a), (b) und (c) wie vorstehend definiert sind und worin 1 und m 0, 1, 2 oder 3 bedeuten, mit der Einschränkung, dass die Summe von 1 und m nicht grosser als 3 ist. So kann eine Verbindung der Formel III mit 1=0, mit einer geeigneten Verbindung der Formel IV, mit m = 0, oder einem reaktionsfähigen Derivat einer solchen Verbindung zu einer Verbindung der Formel II mit η = 0 oder mit einer geeigneten Verbindung der Formel IV mit m = 1 oder einem reaktionsfähigen Derivat einer solchen Verbindung, zu einer Verbindung der Formel II mit η = 1 oder mit einer geeigneten Verbindung der Formel IV mit m = 2 oder einem reaktionsfähigen Derivat einer solchen Verbindung zu einer Verbindung der Formel II mit η = 2 oder mit einer geeigneten Verbindung der Formel IV mit m = 3 oder einem reaktionsfähigen Derivat einer solchen Verbindung zu einer Verbindung der Formel II mit η = 3 kondensiert werden.

Andererseits kann eine Verbindung der Formel III mit 1=1 mit einer geeigneten Verbindung der Formel IV mit m =

!0 0 oder einem reaktionsfähigen Derivat einer solchen Verbindung zu einer Verbindung der Formel II mit η = 1 oder mit einer geeigneten Verbindung der Formel IV mit m = 1 oder einem reaktionsfähigen Derivat einer solchen Verbindung zu einer Verbindung der Formel II mit η = 2 oder mit einer geeigneten

!5 Verbindung der Formel IV mit m = 2 oder einem reaktionsfähigen Derivat einer solchen Verbindung zu einer Verbindung der Formel II mit η = 3 kondensiert werden.

Eine Verbindung der Formel III mit 1=2 kann aber auch mit einer geeigneten Verbindung der Formel IV mit m = 0 oder einem reaktionsfähigen Derivat einer solchen Verbindung zu einer Verbindung der Formel II mit η = 2 oder mit einer geeigneten Verbindung der Formel IV mit m = 1 oder einem reaktionsfähigen Derivat einer solchen Verbindung zu einer Verbindung der Formel II mit η = 3 kondensiert werden.

709884/09U

2732A5A

Schliesslich kann eine Verbindung der Formel III mit 1 = 3 mit einer geeigneten Verbindung der Formel IV mit m = 0 oder einem reaktionsfähigen Derivat einer solchen Verbindung zu einer Verbindung der Formel II mit η = 3 kondensiert werden.

Andererseits kann man die Verbindung der Formel II dadurch herstellen, dass man die vorstehend beschriebenen Kondensationen unter Verwendung einer R,S-Verbindung der Formel III durchführt und die R-Verbindung aus dem erhaltenen R,S-Produkt in an sich bekannter Weise isoliert, beispielsweise durch Kristallisation, Chromatographie oder fraktionierte Kristallisation unter Verwendung einer geeigneten Base wie Benzylamin.

Die vorstehend genannten Kondensationen können nach Methoden durchgeführt werden, die in der Peptidchemie wohlbekannt sind, beispielsweise nach der Methode der gemischten Anhydride, der aktivierten Ester, der Azid- oder der Säurechlorid-Methode .

Nach einer dieser Methoden kann eine geeignete Verbindung der Formel III mit einer in geeigneter Weise geschützten Verbindung der Formel IV kondensiert werden, wobei die endständige Carboxylgruppe Teil eines gemischten Anhydrids mit einer organischen oder anorganischen Säure ist. Zweckmässigerweise wird eine Verbindung der Formel IV mit freier Carboxylgruppe mit einer tertiären Base, wie einem Tri-(niederalkyl)-amin, z.B. Triäthylamin, oder mit N-Aethylmorpholin in einem organischen Lösungsmittel (z.B. Tetrahydrofuran, 1,2-Dimethoxyäthan, Dichlormethan, Toluol, Petroläther oder einem Gemisch dieser Lösungsmittel) behandelt und das erhaltene Salz mit einem Chlorameisensäureester, z.B. dem Aethyl- oder Isobutylester, bei niedriger Temperatur umgesetzt. Das erhaltene gemischte Anhydrid wird dann zweckmässigerweise in situ mit der Verbindung der Formel III kondensiert.

Nach einer anderen Methode kann eine geeignete Verbindung der Formel III mit einer geeigneten Verbindung der

709884/09U

Formel IV, deren endständige Carboxylgruppe in Form einer Säureazidgruppe vorliegt, kondensiert werden. Diese Kondensation wird vorzugsweise in einem inerten organischen Lösungsmittel, wie Dimethylformamid oder Aethylacetat, bei niedriger Temperatur durchgeführt.

Nach einer weiteren Methode kann eine geeignete Verbindung der Formel III mit einer geeigneten Verbindung der Formel IV, deren endständige Carboxylgruppe in Form einer aktiven Estergruppe, z.B. einer p-Nitrophenyl-, 2,4,5,-Trichlorphenyl- oder Succinimidoestergruppe vorliegt, kondensiert werden. Diese Kondensation wird zweckmassigerweise in einem inerten organischen Lösungsmittel wie Dimethylformamid, wässrigem Dimethylformamid oder in einem wässrigen Alkohol, z.B. in wässrigem Aethanol, durchgeführt.

Nach einer weiteren Methode kann eine geeignete Verbindung der Formel III mit einer geeigneten Verbindung der Formel IV, in der die endständige Carboxylgruppe in Form eines Säurechlorids vorliegt, kondensiert werden. Diese Kondensation wird vorzugsweise in Gegenwart einer Base und bei niedriger Temperatur durchgeführt.

Die Peptidderivate der vorliegenden Erfindung besitzen antibakterielle Aktivität gegen gram-positive und gram-negative Organismen wie Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Serratia marcescens, Klebsiella aerogenes, Enterobacter sp., 5 Streptococcus faecalis, Haemophilus influenzae und Salmonella typhimurium. In der folgenden Tabelle werden die minimalen Hemmkonzentration (M.I.C.) in Mg/ml einer repräsentativen Verbindung der vorliegenden Erfindung, nämlich von (IR)-1-(L-3-Fluoralanylamino)-äthylphosphonsaure, in vitro gegen verschiedene Krankheitserreger angegeben.

709884/09U

ft

Tabelle

	coli NCTC	10418 P.S	M.i.e. (Mg/ml)
Escherichia	coli NCIB	8879 P.S.	0.25
Escherichia	aerogenes	Type 3 3 Ba	0.5
Klebsieila	aerogenes	0-G KAI	1.0
Klebsiella	coli Cl.	5 P.R.	4.0
Escherichia		influenzae NCTC 4560	4.0
Haemophilias	8.0

Die Peptidderivate der vorliegenden Erfindung potenzieren aber auch die Aktivität von Antibiotika der Penicillin- und Cephalosporin-Reihe sowie von D-Cycloserin. Von den durch die erfindungsgemässen Peptidderivate potenzierten Antibiotika sind besonders zu erwähnen: Amoxycillin, Cephradin, Cephalothin, Cephalexin, Carbencillin, Ampicillin, Penicillin G, Sulbenicillin, Cephazolin, Cefoxitin, Rifampicin, [(R)-1-(2-Furoyloxy)-3-methylbutyl]-penicillin, (6R)-6- /[Hexahydro-lH-azepin-1-yl)-methylen]-amino/ -penicillansäure, (6R)-6-^[Hexa-hydro-lH-azepin-1-yl)-methylen]-aminoy -penicillansäure-pivaloyloxymethylester, Cephamandol, Cephaloridin, Cephaloglycin, Pheneticillin, Methicillin, Propicillin, Ticarcillin, Amoxycillinargininsalz, Phosphonomycin, Vancomycin oder Kanamycin.

Die erfindungsgemässen Verbindungen können daher allein oder in Verbindung mit Antibiotika, insbesondere den vorstehend genannten, in pharmazeutischen Präparaten mit direkter oder verzögerter Freigabe des Wirkstoffes, in Mischung mit für die enterale (z.B. orale) oder parenterale Applikation geeigneten, nicht toxischen, inerten, festen oder flüssigen Trägern, wie z.B. Wasser, Gelatine, Gummi arabicum , Milchzucker, Stärke, Magnesiumstearat, Talk, pflanzlichen Oelen, Polyalkylenglykolen, Vaseline, usw. verwendet werden. Die pharmazeutischen Präparate können in fester Form, z.B. als Tabletten, Dragees,

709884/0944

2732A5A

Suppositorien, Kapseln, oder in flüssiger Form, z.B. als Lösungen, Suspensionen oder Emulsionen, vorliegen. Gegebenenfalls sind sie sterilisiert und bzw. oder enthalten weitere Hilfsstoffe wie Konservierungs-, Stabilisierungs-, Netz- oder Emulgiermittel, Mittel zur geschmacklichen Verbesserung, Salze zur Veränderung des osmotischen Druckes oder Puffersubstanzen. Die Herstellung der pharmazeutischen Präparate kann in der jedem Fachmann geläufigen Weise erfolgen.

Enthalten die pharmazeutischen Präparate neben dem

LO Peptidderivat ein Antibiotikum, so kann das Gewichtsverhältnis der beiden aktiven Bestandteile innerhalb weiter Grenzen variiert werden. Im allgemeinen beträgt das Gewichtsverhältnis von Peptidderivat zu Antibiotikum 1:1000 bis 1000:1, vorzugsweise 1:64 bis 64:1. Besonders bevorzugt ist ein Gewichts-Verhältnis von 1:16 bis 16:1.

Die tägliche Dosis des zu verabreichenden Peptidderivats alleine oder in Kombination mit einem Antibiotikum kann innerhalb weiter Grenzen variiert werden und hängt von Faktoren ab wie der Art des spezifischen Peptidderivates, dem spezifischen Antibiotikum, dem Applikationsweg und der zu bekämpfenden Infektion. Die tägliche Dosis eines Peptidderivates allein kann beispielsweise bei oraler Verabreichung 2OOO bis 4000 mg und bei parenteraler Verabreichung 800 bis 2000 mg betragen; die tägliche Dosis eines Peptidderivates in Kombination mit einem Antibiotikum kann beispielsweise bei oraler Verabreichung 750 bis 1500 mg und bei parenteraler Verabreichung 200 bis 2000 mg betragen. Die täglich einzunehmende Menge kann in Form einer Einzeldosis oder aber auch in Form mehrerer Teildosen genommen werden, je nach den individuellen Erfordernissen und den Anweisungen des Arztes.

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung.

709884/0944

Beispiel 1

Etwa 40mg (N-Benzyloxycarbonyl-D,L-3-fluoralanylamino)-methylphosphonsäure-benzylaminsalz, in einem minimalen Volumen 2 N Ammoniumhydroxid gelöst, wurden über eine Säule von 5 g eines sulfonierten Polystyrol-Kationaustauscherharzes (Zerolit 225; frisch regeneriert) gegeben. Es wurde mit Wasser eluiert. Dem sauren Eluat (ca. 50 ml) wurden 0.1 g eines 5%igen Pd/C-Katalysators, 50 ml Methanol und ein Tropfen Eisessig zugesetzt. Das Gemisch wurde über Nacht bei Raumtemperatur und unter Normaldruck hydriert. Der Katalysator wurde abfiltriert und das Filtrat eingeengt. Der gummiartige Rückstand wurde 2 Stunden bei 60° über Phosphorpentoxid getrocknet und zerrieben und lieferte (D,L-3-Fluoralanylamino)-methylphosphonsäure, F. ca. 150 C (Zers.). Die Struktur wurde durch das NMR-

Spektrum bestätigt.

Das Ausgangsmaterial wurde folgendermassen erhalten: (a) Eine Lösung von 0.535 g D,L-3-Fluoralanin in 1.25 ml 4 N Natriumhydroxid wurde unter Rühren bei 5 abwechselnd mit insgesamt 0.935 g Chlorameisensäurebenzylester und 1.5 ml 4 N Natriumhydroxid versetzt und zwar so, dass die Temperatur unterhalb von 10 C und der pH Wert grosser als 11 blieb. Das Gemisch wurde 1 Stunde bei O⁰C gerührt, auf Raumtemperatur erwärmt und über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Dann wurden 2 ml Aether zugesetzt und nochmals 1 Stunde bei Raumtemperatur gerührt. Die organische Phase wurde abgetrennt und die wässrige Phase mit 5 ml Aether extrahiert. Die wässrige Phase wurde dann auf 10 C gekühlt und tropfenweise mit 1.2 ml 5 N Salzsäure versetzt, bis die Lösung Kongorot-sauer reagierte. Während des weiteren Rührens bei 10°C trat Kristallisation ein. Es wurde abfiltriert, der Rückstand mit einer minimalen Menge eiskaltem Wasser gewaschen, in 10 ml Aether aufgelöst und die Lösung zweimal mit 10 ml kaltem Wasser gewaschen. Die ätherische Lösung wurde über Natriumsulfat getrocknet und eingedampft und der Rückstand mit Petroläther verrieben. Nach Filtration und Trocknen wurden 0.6 g eines Rohproduktes vom Schmelzpunkt

709884/0944

2732A5A

108-110° (Zers.) erhalten. Umkristallisation von 0.1 g dieses Produkts aus einem Gemisch von 0.5 ml Aether und 0.5 ml Petroläther lieferte ca. 60 mg N-Benzyloxycarbonyl-D,L-3-fluoralanin, F. 112-114°C (Zers.)

(b) 0.58 g N-Benzyloxycarbonyl-D,L-3-fluoralanin wurden in 10 ml Dimethoxyäthan bei 0°C gerührt und nacheinander mit 0.276 g N-Hydroxysuccinimid und 0.49 g Dicyclohexylcarbodiimid versetzt. Das erhaltene Gemisch wurde 24 Stunden bei 0°C gerührt und weitere 16 Stunden bei 0°C stehengelassen. Der Rückstand wurde abfiltriert und mit Dimethoxyäthan gewaschen, während das mit der Waschlösung vereinigte Filtrat abgedampft und nach Aufnahme mit Aether nochmals zur Trockne eingeengt wurde. Umkristallisation des Rückstandes aus 10 ml Isopropanol lieferte 0.51 g N-Benzyloxycarbonyl-D,L-3-fluoralaninsuccinimidoester, F. 119-12O°C (Zers.).

von (c) Eine auf 5°C abgekühlte Lösung/etwa 0.5 g N-Benzyloxycarbonyl-D,L-3-fluoralaninsuccinimidoester in 10 ml Aethanol wurde unter Rühren zu einer ebenfalls auf 5 C gekühlten Lösung von 0.67 g Aminomethylphosphonsäure in einem Gemisch aus 12 ml Wasser, 6 ml Aethanol und 1.12 g Natriumbicarbonat gegeben. Nach einstündigem Rühren und Erwärmen auf Raumtemperatur wurde 60 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Das noch immer heterogene Gemisch wurde zur Trockene eingeengt, der Rückstand in 50 ml Wasser gelöst und die Lösung zunächst mit 50 ml Chloroform, dann noch zwei mal mit 25 ml Chloroform extrahiert. Die wässrige Phase wurde mit 2 N Salzsäure auf pH 2 angesäuert, einmal mit 50 ml und zweimal mit 25 ml Aether, sowie einmal mit 50 ml und zweimal mit 25 ml Chloroform extrahiert und zur Trockene eingeengt. Der Rückstand wurde mit einer minimalen Menge Wasser aufgenommen und über eine Säule aus 50 g eines sulfonierten Polystyrol-Kationaustauscherharzes (Zerolit 225; frisch regeneriert) gegeben. Elution mit 3 50 ml-Portionen Wasser lieferte drei saure Fraktionen, von denen nur die erste das gewünschte Produkt enthielt. Diese Fraktion wurde zur Trockene eingeengt und zwecks Entfernung der Salzsäure nach

70988W09U

Aufnahme mit Wasser nochmals zur Trockene eingeengt. Der erhaltene gummiartige Rückstand wurde in Wasser gelöst und mit 1 M wässriger Benzylaminlösung auf pH 4,5 titriert. Dann wurde eingedampft, aus 3 ml Wasser umkristallisiert, der Niederschlag abfiltriert, mit Wasser chloridfrei gewaschen und mit Aethanol sowie Aether nachgewaschen. Es wurden 0.030 g (N-Benzyloxycarbonyl-D,L-3-f luoralanylaminoj-methylphosphonsäurebenzylaminsalz erhalten. Aufarbeitung der Mutterlaugen lieferte weitere 10 mg dieser Verbindung.

Beispiel 2

Etwa 0.3 g (IR)-1-(N-Benzyloxycarbonyl-L-3-fluoralanylamino)-äthylphosphonsäure-benzylaminsalz wurden in einer minimalen Menge 2 N Ammoniumhydroxid gelöst und über eine Säule aus 15 g eines sulfonierten Polystyrol-Kationaustauscherharzes (Zerolit 225; frisch regeneriert) gegeben. Es wurde mit Methanol/Wasser (1:1), v/v) eluiert. Dem sauren Eluat (ca. 100 ml) wurden 0.3 g eines 10%igen Pd/C-Katalysators, 100 ml Methanol und 3 Tropfen Eisessig zugegeben. Es wurde 60 Stunden bei Raumtemperatur und unter Normaldruck hydriert, abfiltriert, eingedampft und noch zweimal mit n-Propanol sowie einmal mit Aether aufgenommen und jeweils zur Trockene eingedampft. Der Rückstand lieferte nach Umkristallisation aus einem Gemisch von 1.5 ml Wasser und 4.5 ml Aethanol 30 mg (IR)-1-(L-3-Fluoralanylamino)-äthylphosphonsäure, F. 245 C (Zers.); [a]_n ⁼

-30,4° (c = 0.22% in Wasser).

Das Ausgangsmaterial wurde folgendermassen hergestellt:

(a) In zu Beispiel 1 analoger Weise wurden aus 2,9 g L-3-Fluoralanin und 5.1 g Chlorameisensäurebenzylester 4.4 N-Benzyloxycarbonyl-L-3-fluoralanin, F. 110-116°C (Zers.); [α] = + 5.4° (c = 0.5% in Eisessig);"hergestellt.

(b) In zu Beispiel 1 analoger Weise wurden aus 3.6 g N-Benzyloxycarbonyl-L-3-fluoralanin, 1.7 g N-Hydroxysuccinimid

709884/0944

und 3.4 g Dicyclohexylcarbodiimid 5.0 g N-Benzyloxycarbonyl-L-3-fluoralanin-succinimidoester, F. 134-138 C (Zers.), hergestellt. Umkristallisation von 0.5 g dieser Verbindung aus 12 ml Isopropanol lieferte 0.4 g reinen Succinimidoester, F. 138-139°C (Zers.); M^⁰ = -37.5° (c = 0.5 in Aethanol) .

(c) Zu einem Gemisch aus 1.7 g (IR)-1-Aminoäthylphosphonsäure, 13 ml Wasser, 26 ml Dimethylformamid und 3.7 ml Triäthylamin wurden unter Rühren bei 0 4.5g N-Benzyloxycarbonyl-L-3-fluoralanin-succinimidoester gegeben. Das Gemisch wurde zwei Stunden bei 0° und über Nacht bei Raumtemperatur gerührt und anschliessend filtriert. Das Filtrat wurde unter Oelpumpenvakuum zur Trockene gebracht, der gummiartige Rückstand in einer minimalen Menge (ca. 50 ml) Aethanol/Wasser (1:1, v/v) gelöst und die Lösung über eine Säule aus 50 g eines sulfonierten

.5 Polystyrol-Kationaustauscherharzes (Zerolit 225; frisch regeneriert) gegeben. Elution mit Aethanol/Wasser (1:1, v/v) lieferte ca. 200 ml eines sauren Eluates, das eingeengt wurde. Der erhaltene Rückstand wurde zwischen 100 ml Wasser und 100 ml Aether verteilt, die wässrige Schicht wurde mit 50 ml Aether

!0 extrahiert und die Aetherphase wiederum mit Wasser extrahiert. Die vereinigten wässrigen Extrakte wurden mit 4 M wässrigem Benzylamin auf pH 4.5 titriert und die erhaltene Lösung wurde zur Trockene eingeengt. Der Rückstand wurde noch zweimal mit Aethanol aufgenommen und jeweils zur Trockene eingeengt.

>5 Umkristallisation aus einem Gemisch von 10 ml Wasser, 18 ml Methanol und 8 ml Aether lieferte ca. 0.3 g (IR)-1-(N-Benzyloxycarbonyl-L-3-fluoralanylamino)-äthylphosphonsäure-benzylaminsalz, F. 2O5-215°C (Zers.). Aufarbeitung der Mutterlaugen lieferte weitere 0.75 g des Benzylaminsalzes.

Das folgende Beispiel illustriert ein typisches pharmazeutisches Präparat mit einem Gehalt in einer erfindungsgemässen Verbindung:

709884/0944

Beispiel 3

Es wurden 1000 ml einer Injektionslösung der folgenden Zusammensetzung hergestellt:

pro 1000 ml	g
100,0	g
1,0	g
1,2
4,5	ml
1000

Peptidderivat

Chlorkresol

Eisessig

Natriumhydroxidloung (0,1 N) q.s. ad pH Wasser für Injektionslösungen ad

Herstellung: Das Peptidderivat wurde in 5OO ml Wasser für Injektionen suspendiert. Dieser Lösung wurde eine Lösung des Chlorkresols in 200 ml Wasser für Injektionen zugesetzt. Dann wurde unter Rühren die Essigsäure zugesetzt, sowie die 0,1 N Natriumhydrcxidlösung bis zu einem pH von 4,5. Schliesslich wurde mit Wasser auf 1000 ml aufgefüllt, durch ein steriles Membranfilter (0,22 ΐημ) filtriert und in Ampullen abgefüllt. Die Ampullen wurden geschlossen und im Autoklaven 20 Minuten bei 121° sterilisiert.

709884/0944

Claims

Patentansprüche

worin η O, 1, 2 oder 3 bedeutet; R , R und R die Reste normalerweise in Proteinen vorkommender α-Aminosäuren oder Halogenmethyl darstellen, wobei jedoch mindestens einer der Reste R , R

3 4

und R eine Halogenmethylgruppe bedeutet; R Hydroxy oder Methyl ist und die Konfigurationen

an den Kohlenstoffatomen (a) sind (sofern R³ bzw. R² φ H)

a)
Formel

und (b) L oder D,L und die

Konfiguration am Kohlenstoffatom (c) R ist (sofern R ^H), und von physiologisch verträglichen Salzen dieser Verbindung, dadurch gekennzeichnet, dass man
die Schutzgruppe(n) einer Verbindung der allgemeinen

30

20

-NH-

-CH-(a)

-CO-

-NH-

-CH-(b)

-CO—

-NH-

10

-CH-

(C)

R (ID

worin η und die Konfigurationen an den Kohlenstoffatomen (a), (b) und (c) wie vorstehend definiert sind; R , R und

R³⁰ zu R¹,

3
R und R analoge Bedeutungen

haben mit dem Zusatz, dass allfällig vor-

709884/09U

ORIGINAL INSPECTED

handene Amino- sowie andere funktioneile Gruppen gegebenenfalls in geschützter Form

40 41 41

vorliegen; R Methyl oder R ; R Hydroxy oder eine Niederalkoxy-Schutzgruppe und R ein Wasserstoffatom oder eine Schutzgruppe

darstellen,
in an sich bekannter Weise abspaltet oder

b) aus einer R,S-diastereomeren Verbindung der Formel I, das R-Diastereomere in an sich bekannter Weise isoliert und gegebenenfalls eine erhaltene Verbindung der Formel I in ein physiologisch verträgliches Salz überführt.
2. Verfahren gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass

4 man ein Peptidderivat der Formel I herstellt, in dem R eine

Hydroxygruppe darstellt.
3. Verfahren gemäss Anspruch 1 oder Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass man ein Peptidderivat herstellt, indem mindestens einer der Reste R
Chlormethylgruppe darstellt.

12 3 mindestens einer der Reste R , R und R eine Fluormethyl oder

4. Verfahren gemäss einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass man ein Peptidderivat der Formel I herstellt, in dem η 0 oder 1 ist.

5. Verfahren gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass (D,L-3-Fluoralanylamino)-methylphosphonsäure hergestellt wird.

6. Verfahren gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,

dass (IR)-1-(L-3-Fluoralanylamino)-äthylphosphonsäure hergestellt wird.

709884/0944

2737454

7. Vorfahren zur Herstellung pharmazeutischer Präparate, dadurch gekennzeichnet, dass man eine Verbindung der Formel I aus Anspruch 1 oder ein physiologisch verträgliches Salz einer solchen Verbindung als aktiven Bestandteil, mit zur therapeutischen Verabreichung geeigneten nichttoxischen inerten an sich in solchen Präparaten üblichen festen oder flüssigen Trägern vermischt und die erhaltene Mischung in eine geeignete galenische Form bringt.

8. Verfahren zur Herstellung pharmazeutischer Präparate, dadurch gekennzeichnet, dass man eine Verbindung der Formel I aus Anspruch 1 oder ein physiologisch verträgliches Salz einer solchen Verbindung und ein Antibiotikum aus der Gruppe Amoxycillin, Cephradin, Cephalothin, Cephalexin, Carbenicillin, Ampicillin, Penicillin G, Sulbenicillin, Cephazolin, Cefoxitin, Rifampicin, [(R)-I-(2-Furoyloxy)-3-methylbutyl]-penicillin, (6R)-6- / [Hexahydro-lH-azepin-1-yl)-methylen]aminoT -penicillinsäure, (6R)-6- / [Hexahydro-lH-azepin-1-yl)-methylen]amino7 penicillansäure-pivaloyloxymethylester, Cephamandol, Cephaloridin, Cephaloglycin, Phenethicillin, Methicillin, Propicillin, Ticarcillin, Amoxycillin-argininsalz, Phosphonomycin, Vancomycin und Kanamycin als aktive Bestandteile, mit zur therapeutischen Verabreichung geeigneten, nicht-toxischen, inerten, an sich in solchen Präparaten üblichen, festen oder flüssigen Trägern vermischt und das erhaltene Gemisch in eine geeignete galenische Form bringt.

7 0 9 R R Ul Π 9 U 4

9. Pharmazeutische Präparate, gekennzeichnet durch einen Gehalt an einem Peptidderivat der Formel I aus Anspruch 1 und einem zur therapeutischen Verabreichung geeigneten, nicht toxischen, inerten, an sich in solchen Präparaten üblichen, festen oder flüssigen Träger.

10. Pharmazeutische Präparate, gekennzeichnet durch einen Gehalt an einem Peptidderivat der Formel I aus Anspruch 1 und einem Antibiotikum.

11. Pharmazeutische Präparate gemäss Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass das Antibiotikum Amoxicillin, Cephradin, Cephalothin, Cephalexin, Carbenicillin, Ampicillin, Penicillin G, Sulbenicillin, Cephazolin, Cefoxitin, Rifampicin, [(R)-l-(2-Furoyloxy)-3-mothylbutyl]-penicillin, (6R)-6- / [Hexahydro-IH-azepin-1-yl)-methylen]-amino / -penicillansäure, (6R)-6-/ [Hexahydro-lH-azepin-1-yl)-methylen]-amino 7-penicillansäure-pivaloyloxymethylester, Cephamandol, Cephaloridin, Cephaloglycin, Phenethicillin, Methicillin, Propicillin, Ticarcillin, Amoxycillin-argininsalz, Phosphonomycin, Vancomycin oder Kanamycin ist.

12. Pharmazeutische Präparate gemäss Anspruch 10 oder Anspruch 11» dadurch gekennzeichnet, dass das Verhältnis von Peptidderivat zu Antibiotikum 1:100 bis 100:1 beträgt.

13. Pharmazeutische Präparate gemäss Anspruch 10 oder Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass das Gewichtsverhältnis von Peptidderivat zu Antibiotikum 1:64 bis 64:1 beträgt.

14. Pharmazeutische Präparate gemäss Anspruch 10 oder Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass das Gewichtsverhältnis von Peptidderivat zu Antibiotikum 1:16 bis 16:1 beträgt.

709884/0944

- -ae -

Peptidderivate der allgemeinen Formel I R³ R²

-CH-(a)

-CO-

-NH-

-CH-(b)

-CO—

-NH-

-CH-(C)

OH

12 3 worin η 0, 1, 2 oder 3 bedeutet; R , R und R die Reste normalerweise in Proteinen vorkommender α-Aminosäuren oder Halogenmethyl darstellen,

1 2 wobei jedoch mindestens einer der Reste R , R

3 4

und R eine Halogenmethylgruppe bedeuten; R Hydroxy oder Methyl ist und die Konfigurationen an den Kohlenstoffatomen (a) und (b) L oder D,L
3 2
sind (sofern R bzw. R ^ H) und die Konfiguration am Kohlenstoffatom (c) R ist (sofern R ^H), und physiologisch verträgliche Salze dieser Verbindungen.

16. Peptidderivate gemäss Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet,

4
dass R eine Hydroxygruppe darstellt.

17. Peptidderivate gemäss Anspruch 15 oder Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens eine der Gruppen R , R und R Fluormethyl oder Chlormethyl darstellt.

18. Peptidderivate gemäss einem der Ansprüche 15 bis 17, dadurch gekennzeichnet, dass η 0 oder 1 ist.

19. (D,L-3-Fluoralanylamino)-methylphosphonsäure.

20. (IR)-1-(L-3-Fluoralanylamino)-äthylphosphonsäure,

709884/0944