DE2721267C2

DE2721267C2 - Antikörpergel

Info

Publication number: DE2721267C2
Application number: DE2721267A
Authority: DE
Inventors: Hans A. Dipl.-Chem. Dr. 8000 München Thoma
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1977-05-11
Filing date: 1977-05-11
Publication date: 1985-05-02
Also published as: NL7804466A; GR64474B; JPS5417116A; GB1603772A; CH637218A5; ZA782358B; BR7802600A; AU519148B2; FR2390731A1; SE7804801L; US4235867A; DK181478A; IL54558A0; DE2721267A1; BE866491A; AT364856B; IL54558A; LU79535A1; AU3536478A; NZ187071A

Description

Die Erfindung bezieht sich auf ein Antikörpergel zur immunologischen Bestimmung von Hormonen, Pharmaka und Vitaminen, wobei die Antikörper in ein Acrylamid-Copojymerisat eingeschlossen sind.

Bei der radioimmunologischen Bestimmung von Hormonen oder Pharmaka erfolgt eine Reaktion der Hormone oder Pharmaka mit einem Antikörper. Die Spezifität der Reaktion ist abhängig von der immunologischen Komplementarität d. h„ es kann eine Kreuzreaktivität mit Substanzen bestehen, die eine ähnliche chemische Konfiguration aufweisen. Bei einem ösiriöl-Ce-Könjugai liegt das östriol in einer imniurideterniinaieri Konfiguration vor, in der fast alle wichtigen funktionellen Gruppen des östriols dem Bindungsbereich des Antikörpers exponiert sind. Trotzdem werden östriol-Konjugate, deren Sulfat- oder Glucuronidrest die Position an phenolischen C3 einnehmen, vom Antikörper in beträchtlichem Maße gebunden. Dies ist für die Bestimmung der freien Steroide besonders dann nachteilig, wenn die Konjugat-Konzentration der Proben die Steroidkonzentration um Zehnerpotenzen übersteigt, wie es bei den östrogenen im Schwangeren-Serum der Fall ist

Aus vorstehenden Gründen wurden bisher im wesentlichen Verfahren angewandt bei denen die Spezifität durch Lösungsmittelextraktionen vor dem Radioimmunoassay sichergestellt wurde. Lösungsmittelextraktionen stehen aber einer seriellen und maschinellen Probenbearbeitung im Wege.

Um die radioimmunologische Bestimmung von Hormonen und Pharmaka zu vereinfachen, sind Antikörpergele entwickelt worden, bei denen die Antikörper an verschiedene Matrices, kovalent gebunden oder darin eingeschlossen sind, z. B. Agarose, Zellulose, Glaspartikeln oder Polyamide. Die Vorteile der in einer Matrix eingeschlossenen Antikörper liegen im Ausschluß von störenden Molekülen höheren Molekulargewichts, der Einsparung von Pipettier- und Zentrifugierschritten und der langen Haltbarkeit des immobilisierten Antikörpers bei Raumtemperatur.

Auch ist ein derartiges Gel bekannt, bei dem die Matrix durch eine Acrylverbindung gebildet wird, die mit einer Divinylverbindung, wie Ν,Ν'-Methylen-bis-acrylamid copolymerisiert ist, wobei letzteres als Vernetzungsmittel fungiert (DE-OS 25 46 379). Als Acrylverbindungen werden dabei z. B. Acrylamid, Methacrylamid, N-Hydroxyethylaryl- und methacrylamid und Acrylsäure verwendet

Es hat sich jedoch gezeigt, daß die Bindungsspezifität des Antikörpers, wenn er in einer dieser Matrices immobilisiert wird, nicht den gewünschten Anforderungen entspricht.

Aufgabe der Erfindung ist es daher, ein Antikörpergel zu schaffen, mit der die Bindungsspezifität des eingeschlossenen Antikörpers erhöht und unerwünschte Kreuzreaktionen verhindert werden können.

Überraschenderweise hat sich gezeigt, daß eine Variation und Erhöhung der Bindungsspezifität des Antikör-♦5 pers durch ein Copolymerisat aus Acrylamid und einer oder mehrerer der Verbindungen Acrylsäure, Methacrylsäure, Methacrylamid, Salzen und Estern der Acrylsäure und der Methacrylsäure, am Stickstoffatom substituierte Methacrylamide und Acrylamide sowie Ν,Ν'-Diallylweinsäureamide erzielt werden kann.

Durch die Copolymerisation des Acrylamide mit damit copolymerisierbaren Verbindungen kann die Mikroumgebung der Polymermatrix beeinflußt werden. Die Wirkung beruht im wesentlichen auf hydrophoben und hydrophilen sowie elektrostatischen Effekten.

Durch die Variation der Polymermatrix mittels Copolymerisation ist eine wesentliche Erhöhung der Bindungsspezifität des Antikörpers und eine Unterdrückung unerwünschter Kreuzreaktivitäten möglich. Die Polymermatrix wird durch geeignete Copolymerisation variiert, um einerseits eine spezifische Reaktion der Heptene mit dem immobilisierten Antikörper zu gewährleisten und andererseits kreuzreagierende Haptene abzuhalten.
Aufgrund der erhöhten Spezifität gestattet es das Antikörpergel gemäß der Erfindung, direkt im nicht-extrahierten Serum zu messen.

Mit Hilfe des erfindungsgemäßen Antikörpergels ist eine sehr genaue radioimmunologische Bestimmung von Hormonen und Pharmaka möglich, da die Schwankung der Bestimmungswerte aufgrund von unspezifischen Bindungen zwischen den Steroidmolekülen und der Matrix durch die Copolymerisation minimiert wird.
Der Anteil des Acrylamids im Copolymerisat kann zwischen 1 und 99 Mol-%, vorzugsweise 5 bis 95 Mol-%

und insbesondere 20 bis 80 Mol-%, betragen. $

Besonders geeignet sind Copolymerisate aus Acrylamid und Methacrylsäure und insbesondere solche, bei y

denen der Methacrylsäureanteil 20—60 Mol-% ausmacht. Die Methacrylsäure hydrophobiert einerseits die j»

Matrix und führt andererseits zu einem Ladungseffekt, wodurch unspezifische Bindungen der zu bestimmenden M

Substanzen weitgehend ausgeschaltet werden können.

Durch den erfindungsgemäßen Einsatz von Copolymerisaten, die Acrylsäure oder Methacrylsäure oder deren ■ j

Salze enthalten, läßt sich ferner ein Neutralisationseffekt oder eine Pufferwirkung für saure bzw. alkalische Lösungen erzielen. Dies ist für zahlreiche Bestimmungen von wesentlichem Vorteil.

Als Salze der Acrylsäure bzw. Methacrylsäure werden die Alkali- und/oder Erdalkalisalze bevorzugt. Insbesondere kommen Natrium- oder Kalziumsalze in Betracht.

Als Ester der Acrylsäure und Methacrylsäure kommen insbesondere deren Ester, beispielsweise die Methyl- und Äthylester, in Betracht.

Ein am Stickstoff substituiertes Methacrylamid oder Acrylamid ist z. B. N-Hydroxymethylmethacrylamid bzw. N- Hydroxymethylacrylamid.

Die Immobilisierung des Antikörpers erfolgt durch Einschluß in der Polymermatrix und/oder durch kovalente Fixierung an der Polymermatrix.

Eine ausführliche Beschreibung des Radioimmunoassays findet sich beispielsweise in Clinical Chemistry, Bd. 19, Nr.2, 1973. S. 145. In Clinical Chemistry, Vol. 19, Nr. 12, 1973, S. 1339, und Clinical Chemistry, Vol.21, Nr. 7,1975, S. 829, sind radioimmunologische Techniken beschrieben, bei denen ein immobilisierter Antikörper verwendet wird.

Das erfindungsgemäße Antikörpergel eignet sich zur Bestimmung der verschiedenen Hormone und Pharmaka, die im Serum oazr Plasma zum Teil an spezifische oder niehtspezifische Bindungsproteine gebunden vorliegen. In Betracht kommen die Schilddrüsenhormone, insbesondere Thyroxin und Trijodthyronin, die Steroidhormone wie Cortisol, Testosteron, Progesteron, östron, Östradiol und Östriol und die Herzglycoside, wie Digitoxin und Digoxin. Ferner können bestimmt werden Vitamine, besonders Vitamin B12 und Folsäure, sowie Pharmaka mit starker Proteinbindung, wie beispielsweise Antikoagulantien, Dicumarol, Analgetika und Salicylate.

Neben der racivoimmunologischen Bestimmung kommen gegebenenfalls auch alternative Bestimmungsmethoden, wie die nuoroimmunoiogische Bestimmung oder die Bestimmung mittels enzymatischer Markierung, in Betracht

Die Synthese der Antigene, die Gewinnung von Antiseren, beispielsweise durch Immunisierung von Kaninchen und die Isolierung sowie Immobilisierung der Antikörper sind bekannt (vgl. beispielsweise Clinical Chemistry, Bd. 19, Nr. 2,1973, S. 146 ff.).

Die Herstellung des erfindungsgemäßen Antikörpergels mit dem immobilisierten Antikörper kann beispielsweise in der Art erfolgen, daß eine Lösung des Antikörpers dem Monomergemisch zugegeben wird. Der Ansatz wird beispielsweise radikalisch polymerisiert und das erhaltene Polymerisat zerkleinert, gewaschen und getrocknet.

Die Auswahl und die Mengenanteile der dem Acrylamid zugesetzten Copolymere richtet sich nach den gewünschten Eigc.ischaften der Polymermatrix bezüglich der Spezifität. Die Spezifität kann durch Änderung der Hydrophobizität und de·· Laaur« der Matrix in weiten Grenzen beeinflußt werden. Der Zusatz von Methacrylamid erhöht die Hydrophobizität Durch den Einsatz von Acrylsäure oder Methacrylsäure oder deren Salzen wird die Ladung der Matrix variiert ^Vrs besteht sowohl die Möglichkeit, die Salze der Acrylsäure oder Methacrylsäure direkt dem Monomergemisch zuzusetzen oder altenativ können die Säuren polymerisiert werden und anschließend durch Ionenaustausch die Salze in der Polymermatrix gebildet werden.

Zur Erzielung einer geeigneten Porengröße der Polymermatrix wird die Monomerkonzentration variiert. Eine Monomerkonzentration im Bereich von etwa 20% führt zu einer Porengröße von etwa 7 bis 10 A.

Ein vorteilhaftes Copoiymerisat besteht beispielsweise aus Acrylamid und 20 bis 60 Mol-% Acrylsäure und/oder Methacrylsäure, hergestellt aus einer etwa 20%igen Monomerlösung, wobei zumindest, ein Teil der Säuregruppen in die entsprechende Alkali- oder Erdalkalisalze überführt ist.

In dem nachstehenden Beispiel 1 und dem Vergleichsbeispiel ist der Einfluß der Polymermatrix auf die Kreuzreaktivität (K) von Östriol-3-Glucuronid und Östriol-3-SuIfat gezeigt.

Die Kreuzreaktivität K berechnet sich aus der hundertfachen Menge der benötigten Masse des kreuzreagierenden Haptens für y = 50 geteilt durch die benötigte Masse des kreuzreagierenden Haptens für y = 50. Die Werte sind auf der Basis von ID50 berechnet.

Der für das Beispiel und das Vergleichsbeispiel ausgewählte Antiöstriolantikörper zeigte eine hohe Kreuzreaktivität der 3-Glucuronid-Konjugate bzw. der 3-Sulfat-Konjugate.

Vergleichsbeispiel

Der Polymerisationsansatz wurde so eingestellt, daß die totaL Monomerkonzentration 2,9 Mol/l betrug. Für den Ansatz wurden 5 g Acrylamid und 1,25 g Ν,Ν'-Methylenbisacrylamid in einem Becherglas in 24 ml Phosphatpuffer mit einem pH-Wert von 7,2 gelöst. Nach Zumischen des Antikörpers in 1 ml Phosphatpuffer wurde die Reaktion mit 0,15 mg Riboflavin und 0,10 ml Ν,Ν,Ν',Ν'-Tetramethyläthylendiamin gestartet und mit UV-Licht bestrahlt. Während der Bestrahlungszeit von 45 min wurde die Temperatur unter 50°C gehalten. Der Gelblock wurde anschließend zerkleinert, mit destilliertem Wasser gewaschen und getrocknet. Das trockene Antiöstriolantikörpergel wurde eingewogen, und es wurden 0,150 ml Inkubationslösung aufgezogen. Diese Inkubationslösung enthielt ³H-Östriol und nicht markiertes Hapten (östriol, Östriol-3-Glucuronid oder östriol-3-Sulfat). Die Reaktionstemperatur wurde bei 0° konstant gehalten, Nach 30 min Inkubationszeit erfolgte die Trennung des freien vom antikörpergebundenen Haptens durch Elution mit albuminhaltigem Phosphatpuffer. Das Eluat wurde in Szintillationsgläschen aufgefangen, mit 15 ml Szintillationsflüssigkeit versetzt und die Radioaktivität im Flüssigkeitsszintillator gemessen. Aus den Impulsen wurde die Konzentration des freien Indikatorhaptens ³H-östriol errechnet.

Die Kreuzreaktivität der Bestimmungen im wäßrigen System und unter Verwendung dieser Polymermatrix aus Acrylamid, das mit Ν,Ν'-Methylenbisacrylamid netzt ist, ist in der nachstehenden Tabelle in der Spalte »Acrylamid« abgegeben.

Beispiel 1

Das Vergleichsbeispiel wurde wiederholt, außer daß im Polymerisationsansatz das Acrylamid durch ein Gemisch aus dem Natriumsalz der Acrylsäure und Acrylamid im Verhältnis 10 :90, 30 :70 und 50 :50 sowie 5 durch ein Gemisch aus dem Natriumsalz der Methacrylsäure und Acrylamid im Verhältnis 20 :80,40:60 und 60 :40 ersetzt wurde.

Die Ergebnisse zeigen, daß mit den Copolymerisaten aus Acrylamid und den Salzen der Acryl- bzw. Methacrylsäure gegenüber wäßrigen Systemen und einem Acrylamidpolymerisat, der lediglich mit N,N'-Methylenbisacrylamid versetzt ist, eine bedeutende Erhöhung der Bindungsspezifität erzielt wird. Durch geeignete Auswahl ίο des Copolymerisats kann eine Erhöhung der Spezifität um den Faktor 15 gegenüber wäßrigen Systemen und um den Faktor 7 gegenüber einem lediglich mit Ν,Ν'-Methylenbisacrylamid vernetzten Acrylamidpolymeren erzielt werden. Dies zeigt ein Vergleich der Werte der Spalten »wäßriges System« und »Acrylamid« der Tabelle mit einem 40/60 Copolymerisat aus dem Natriumsalz der Methacrylsäure und Acrylamid.

19	10	14	14	4	21
30	12	24	27	6	23
Beispiel	2

Wäßriges Acrylamid Natriumsalz der Natriumsalz der

i| System 100 Acrylsäure/Acrylamid Methacrylsäure/Acrylamid

H 10:90 30:70 50:50 20:80 40:60 60:40

r_; 20 Östriol-3- 61 29

^ Glucurcnid

H Östr:ol-3- 47 33

& Sulfat

lij 25

'i Dieses Beispiel zeigt den Einsatz des erfindungsgemäßen Gels bei der Gesamtbestimmung von Thyroxin

,■·■; durch enzymatische Hydrolyse mit Pepsin.

Die Polymermatrix des Antikörpergels bestand aus einem Copolymerisat aus Acrylamid und 40 Mol-% des '■■ 30 Natriumsalzes der Methacrylsäure, hergestellt aus einer 20%igen Monomerlösung.

Es wurden 10 μΐ Serum mit einem Gehalt von 18 μg Thyroxin je 100 ml mit 160 μΙ einer Enzymiösung versetzt, die aus 2 mg/ml Pepsin gelöst in 0,1 η Salzsäure bestand.

Die Reaktion mit dem Enzym wurde bei Raumtemperatur 30 min durchgeführt

Zu diesen 170 μΐ wurden anschließend 150 μΐ Tracerlösung mit einem Gehalt von 5,2 ng/ml radioaktiv mar-35 kiertem Thyroxin zugegeben.

Die gesamte Lösung wurde danach auf 60 mg Antikörpergel aufgebracht. Die Inkubationszeit betrug 30 min, die Temperatur 22° C.

Die Auswertung zeigte eine außerordentlich hohe Wiederfindung von 98%.

Claims

Patentansprüche:

1. Antikörpergel zur immunologischen Bestimmung von Hormonen, Pharmaka und Vitaminen, wobei die Antikörper in ein Acrylamid-Copolymerisat eingeschlossen sind, dadurch gekennzeichnet, daß das Acrylamid-Copolymerisat ein Copolymerisat aus Acrylamid und einer oder mehrerer der Verbindungen Acrylsäure, Methacrylsäure, Methacrylamid, Salzen und Estern der Acrylsäure und der Methacrylsäure, am Stickstoffatom substituierte Methacrylamide und Acrylamide sowie N,N'-Diallylweinsäureamid ist

2. Antikörpergei nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Copoiymerisat aus Acrylamid und 20 bis 60 Mol-% Methacrylsäure, bezogen auf Acrylamid, besteht

3. Antikörpergel nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet daß das Copolymerisat aus Acrylamid und einem Alkali- oder Erdalkalimetallsalz der Acrylsäure oder der Methacrylsäure besteht