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DE2716061C2 - Guajaconsäure A, Verfahren zu ihrer Herstellung und die Verwendung dieser Substanz als diagnostische Mittel - Google Patents

Guajaconsäure A, Verfahren zu ihrer Herstellung und die Verwendung dieser Substanz als diagnostische Mittel

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Publication number
DE2716061C2
DE2716061C2 DE2716061A DE2716061A DE2716061C2 DE 2716061 C2 DE2716061 C2 DE 2716061C2 DE 2716061 A DE2716061 A DE 2716061A DE 2716061 A DE2716061 A DE 2716061A DE 2716061 C2 DE2716061 C2 DE 2716061C2
Authority
DE
Germany
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acid
toluene
guaiaconic
acetone
guaiaconic acid
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired
Application number
DE2716061A
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DE2716061A1 (de
Inventor
Werner Dr.rer.nat. Güthlein
Walter Dr.Rer.Nat. Rittersdorf
Wolfgang Dr.Rer.Nat. 6800 Mannheim Werner
Hans Dr.Phil. Wielinger
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Roche Diagnostics GmbH
Original Assignee
Boehringer Mannheim GmbH
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Publication date
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Priority to CA300,004A priority patent/CA1115724A/en
Priority to US05/892,359 priority patent/US4219336A/en
Priority to FI781014A priority patent/FI781014A/fi
Priority to AR271683A priority patent/AR216788A1/es
Priority to GB13291/78A priority patent/GB1571362A/en
Priority to CH367178A priority patent/CH636625A5/de
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Description

Gegenstand der Erfindung ist Guajaconsäure A, ein Verfahren zu ihrer Herstellung sowie ihre Verwendung als diagnostisches Mittel zum Nachweis von occultem Blut im Stuhl, zusammen mit Wasserstoffperoxid, Chromogen und den üblichen Hilfsmitteln und einem zusätzlichen Stabilisator.
Der Nachweis von occultem Blut im Stuhl ist wichtig für die Diagnose von Erkrankungen der Verdauungsorgane, die bon Blutungen begleitet sind. Blutungen im Magen-Darm-Kanal werden meist verursacht durch Geschwüre, Polypen und insbesondere Tumoren. Der Nachweis von Blut im Stuhl ist also ein wichtiger Beitrag zur Frühdiagnose von Carcinomen der Verdauungsorgane.
Für diesen Nachweis wird bereits seit langer Zeit die Guajak-Probe angewendet, wobei man sich der Katalyse der peroxidatisch wirksamen Blutbestandteile bedient. Der aus dem Wasserstoffperoxid freigesetzte Sauerstoff wird hierbei auf ein Chromogen übertragen, welches zu einem Farbstoff oxidiert wird, und so die Anwesenheit der peroxidatisch wirksamen Substanz anzeigt.
J
Ar-NH-NH-CO-NH2 (1)
in der
Ar einen gegebenenfalls durch Alkyl, Alkoxy oder Halogen substituierten Arylrest
bedeutet, darstellt
55
b0 Die Gitajak-Probe ist in mehreren Modifikationen bekannt. Im allgemeinen wird sie wie folgt durchgeführt: Zu einer Stuhlaufschlämmung wird Wasserstoffperoxid und eine alkoholische Lösung von Guajakharz gegeben. Eine Blaufärbung weist auf die Anwesenheit von Blut hin. Seit neuerer Zeit existiert auch ein Schnelldiagnosticum zum Nachweis von Blut im Stuhl. Hierbei ist das Guajakharz auf ein Filterpapier imprägniert Dieses Filterpapier wird mit einer Probe von Stuhl bestrichen; zum Entwickeln wird die Rückseite mit einer alkoholischen Lösung von Wasserstoffperoxid betropft. Bei Anwesenheit von Blut bildet sich ein blauer Ring.
Die Verwendung von Guajakharz zum Nachweis von Blut im Stuhl ist jedoch nicht unproblematisch. Bei der Reagenzglasprobe findet man sehr häufig falsch positive Resultate, während beim Schnelltest die Nachweisgrenze sehr stark von anderen Inhaltsstoffen der Stuhlprobe abhängL Dies ist aus der Natur des Guajakharzes zu erklären.
Das Kernholz der tropischen Bäume Guajacum officinale L. und Guajacum sanctum L. enthält etwa 15—25% eines Harzes, das u.a. durch Extraktion mit Äthanol gewonnen wird. Dies als Guajak-Harz bekannte Produkt besteht aus einer Vielzahl von Komponenten, die in drei Hauptfraktionen isoliert werden können. Den überweigenden Anteil (ca. 70%) bildet hierbei ein durch Äther-Extraktion gewonnenes Produkt. Dieses wird als »Guajaconsäure« bezeichnet (vgl. hierzu H. Auterhoff et al. Arch. Pharmaz. 299, 618 [1966] und 302, 545 [1969]) und bewirkt ebenfalls eine Blaufärbung durch Wasserstoffperoxid bei Anwesenheit peroxidatisch wirkender Substanzen, wie Blut und Peroxidase. Eine dünnschichtchromatographische Auftrennung dieses Produktes ergab drei Hauptkomponenten, deren Isolierung große Schwierigkeiten bereitet, so daß deren Konstitution noch nicht gesichert ist.
Auf der Suche nach den für die Färbung durch Oxidation verantwortlichen Komponenten im Guajak-Harz wurde von Kratochvil et al. (Phytochemistry, 1971, Vol. 10, pp. 2529) eine Einzelsubstanz in sehr geringer Ausbeute isoliert, die als «-Guajaconsäure bezeichnet wurde.
Neben einigen weiteren in geringer Menge vorkommenden Verbindungen, die sich ebenfalls oxidieren lassen, gibt es noch eine größere Anzahl von Inhaltsstoffen, die die Indikatorreaktion nicht beeinflussen, gegebenenfalls sogar hemmen. Es sind dies z. B. Guajaretsäure, Dihydroguaretsäure, Guajacinsäure, Vanillin u. a. m.
Es liegt in der Natur der Sache, daß in einem Naturprodukt nicht immer alle Komponenten im gleichen Verhältnis vorkommen, so daß auch das natürlich vorkommende Guajak-Harz bei jedem Isolierungsvorgang eine unterschiedliche Zusammensetzung aufweist. Desweiteren ist es auch ohne weiteres verständlich, daß sich bei dem Imprägnierungsprozeß mit Guajak-Harz die instabilen Komponenten des Gemisches zersetzen können und daher wiederum ein Komponentengemisch unterschiedlicher Zusammensetzung bilden können.
Bei Schnelldiagnostica, die in neuerer Zeit sehr große Bedeutung erlangt haben, ist nun eine der Hcuptvoraussetzungen für ihre praktikable Anwendung, daß sie exakt — und jederzeit reproduzierbar — herstellbar sind. Diese Voraussetzung war bei den bisher beschriebenen Schnelldiagnostica nicht gegeben.
Es bestand daher die Aufgabe, durch Verwendung
definierter und hinlänglich reiner Reagenzien ein Schnelldiagnosticum zum Nachweis von occultem Blut im Stuhl zu entwickeln, das sich exakt und reproduzierbar herstellen und analytisch überprüfen läßt sowie hinreichend stabil ist
Überraschenderweise wurde nun gefunden, daß man durch Änderung des bekannten Extraktionsverfahrens zur Isolierung von Hauptfraktionen aus dem Guajak-Harz eine einzige Hauptkomponente erhält, welche die obengenannten erforderlichen Eigenschaften besitzt und darüber eine definierte praktische Nachweisgrenze hat, so daß sie als Chromogen in einem Schnelldiagnosticum zur Bestimmung von occultem Blut verwendet werden kann.
Wie bereits oben aufgeführt, besteht das Guajak-Harz im wesentlichen aus zwei farbbildenden Hauptkomponenten, dem Furoguajacin und der »Guajaconsäure«, wobei die Struktur des Furoguajacins durch die Synthese eindeutig aufgeklärt ist. Versuche haben nun gezeigt, daß Furoguajacin als Chromogen für ein Schnelldiagnosticum von Blut im Stuhl nicht brauchbar ist, weil es Testpapiere liefert, die viel zu empfindlich und außerdem zu instabil sind.
Die Isolierung der anderen Hauptkomponenten, der »Guajaconsäure«, war bisher laut Literatur nur durch präparative Dünnschichtchromotographie möglich, wobei die Substanz in so geringer Menge anfiel, daß sie als Chromogen für Schnelldiagnostica praktisch nicht in Frage kam.
Es sind zwar in der Literatur verschiedentlich Versuche zur Isolierung von größeren Mengen »Guajoconsäure« beschrieben worden, jedoch sind die Ergebnisse wenig befriedigend. So wurde u. a. in der Dissertation J. Kühl, TH Braunschweig, 1961, S. 21 beschrieben, daß eine säulenchromatographische Trennung des Guajaconharzes mit Kieselgel nicht möglich ist.
Überraschenderweise wurde nun gefunden, daß es trotz dieses Vorurteils möglich ist, natürliches Guajak-Harz säulenchromatographisch mit Kieselgel aufzutrennen und eine Komponente in fast reiner Form zu erhalten, die ohne weitere Reinigung für Diagnostica zur Bestimmung von Blut im Stuhl verwendet werden kann.
Diese Komponente, die als Guajaconsäure A bezeichnet wurde, ist nicht identisch mit den an den eingangs erwähnten Literaturstellen enthaltenen Fraktionen. So zeigt z. B. die Guajaconsäure A in einer Dünnschichtchromatogramm, das unter den in der Auterhoff-Publikation angegebenen Bedingungen aufgenommen wurde, im Gegensatz zu dem dort abgebildeten Dünnschichtchromatogramm nur einen einzigen Hauptfleck bei Rf- 0,5.
Gegenstand der Erfindung ist daher zunächst Guajaconsäure (zur Abgrenzung gegenüber dem Stand der Technik als Guajaconsäure A bezeichnet), die durch eine spezifische Extinktion E |^°m von mindestens 200, bestimmt nach der Reaktion mit Peroxidase und Wasserstoffperoxid, durch Irt-Banden 1600 cm1 (m); 1505 cm-1 (v.s.); 1260cm-' (s; b); 1200cm-· (s; b); 1115cm-1 (m); 1025cm-' (m) und den RF-Wert: 0,45 (Toluol/Dioxan/Eisessig 90 :45 :10) gekennzeichnet ist und die durch säulenchromatographische Auftrennung an mit Säure vorbehandeltem, neutralem Kieselgel mit einem geeigneten Elutionsmittel wie z. B. n-Heptan/Essigester- oder Toluol/Aceton-Gemisch, unter Schutzgas erhalten wird. Wie oben bereits aufgeführt, ist die so erhältliche Guajaconsäure A dünnschichtchromatographisch nicht ganz einheitlich, d. h. sie enthält außer der Hauptkomponenten, d.'e sich am Licht oder mit Peroxidase und Wasserstoffperoxid blau färbt noch Verunreinigungen, die jedoch wegen der geringen Konzentration für ihre Verwendung als Chromogen in einem diagnostischen Mittel vernachlässigbar sind. Die erfindungsgemäße Guajaconsäure A ist amorph und kann, wie oben angegeben, durch Banden des IR-Spektrums, sowie die spezifische Extinktion und den
ίο RF-Wert im Dünnschichtchromatogramm charakterisiert werden (vgl. Beispiel 1).
Die Angabe der spezifischen Extinktion zur Charakterisierung hat sich als zweckmäßig erwiesen, da die erwähnten Verunreinigungen sowie eventuelle Lösungsmittelreste die normalen Analysemethoden wie UV- und NMR-Spektren erheblich stören. Unter der spezifischen Extinktion versteht man die Extinktion, die durch Ig Guajaconsäure A in 100 ml Lösung durch Peroxidase und Wasserstoffperoxid erzeugt wird, wobei in einer 1 cm langen Küvette bei 600 nm gemessen wird
Die in Beispiel 1 angegebene ausführliche Beschreibung der Isolierung von Guajaconsäure A ist nur eine bevorzugte Variante des erfindungsgemäßen Verfahrens. Eine Abtrennung von Begleitstoffen des natürlichen Guajakharzes durch die Aceton/Toluol-Fällung is; selbstverständlich auch auf anderem Wege möglich, z. B. durch Äthanol/Toluol-Fällung; durch Lösung in Eisessig und Verdünnung mit Wasser auf 30%ige Essigsäure, Aufnahme des Niederschlags in Aceton/Toluol (1 :5) oder Lösung in Methylisobutylketon, Extraktion mit einem Natriumhydroxid/Phosphat-Puffer vom pH 13, Einengen der organischen Phase und Verdünnung mit Toluol. Des weiteren sind auch Lösungsmittelgemische wie z. B. Xylol/Aceion und Methylisobutylketon/Toluol als Elutionsmittel ohne weiteres anwendbar, wobei die Mengenverhältnisse variieren können. Ferner ist der Durchsatz an eingesetztem Guajakharz und Elutionsmittel variabel. Als Schutzgas kommen vorzugsweise Stickstoff und Kohlendioxid in Frage.
Weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein verbessertes diagnostisches Mittel zum Nachweis von occultem Blut im Stuhl analog den bekannten Guajak-Tests, in denen anstelle des natürlichen Guajakharzes als
4> Chromogen die Guajaconsäure A mit einer spezifischen Extinktion E \""m von mindestens 200, bestimmt nach der Reaktion mit Peroxidase und Wasserstoffperoxid, verwendet wird.
Versuche hatten überraschenderweise gezeigt, daß Testpapiere, die analog dem bekannten Guajak-Test hergestellt wurden, jedoch als Chromogen Guajaconsäure A enthielten, mit »künstlichem Stuhl« (Blut in Wasser) genauso empfindlich reagierten wie handelsübliche Testpapiere auf Basis von ungereinigtem Guajakharz. Im natürlichen Stuhl, dem etwa 1—3% Blut zugesetzt war, hingegen reagierten die erfindungsgemäßen Papiere positiv, während das handelsübliche Testpapier schwankende Ergebnisse liefert, wobei die Empfindlichkeitsgrenze je nach Stuhl von 1—7% und mehr Blut schwankt.
Wie bereits oben beschrieben, wird die erfindungsgemäße Guajaconsäure A durch ihre spezifische Extinktion charakterisiert. Da bei den Verfahren zur Isolierung der Guajaconsäure die Reinheit der Guajaconsäure A von dem eingesetzten Guajakharz und den jeweiligen Verfahrensbedingungen abhängt, ist auch die spezifische Extinktion der erhaltenen Guajaconsäure A unterschiedlich. Es hat sich erwiesen, daß die Präpara-
tionen von Guajaconsäure A in dem diagnostischen Mittel besonders gut geeignet sind, deren spezifische Extinktion den Wert von 200 übersteigt Rohes Guajakharz besitzt einen Wert von ca. 100, der durch wechselnde Mengen an Guajaconsäure A, Furoguajacin und den übrigen unbekannten oxidierbaren Bestandteilen bewirkt wird.
Die Guajaconsäure A wird in dem diagnostischen Mittel in Mengen von 40—250 mg, vorzugsweise 50—150 mg pro 100 ml Imprägnierlösung eingesetzt, und zv; sr bei einer spezifischen Extinktion von 250. Bei anderen spezifischen Extinktionen werden die Werte entsprechend korrigiert
In den letzten Jahren haben sich in der ärztlichen Praxis und im klinischen Labor als diagnostische Hilfsmittel mehr und mehr sogenannte Schnellteste durchgesetzt Dies sind in der Regel saugfähige Träger, meist Papiere, die mit den für die Nachweisreaktion nötigen Reagenzien imprägniert sind und nach dem Eintauchen in die zu untersuchende Flüssigkeit eine Farbreaktion zeigen. Der Nachweis oder die halbquantitative Bestimmung von pathologischen Körperinhaltsstoffen kann hiermit schnell und auch sicher von ungeschultem Personal, wie medizinischem Hilfspersonal, durchgeführt werden.
Testpapiere dieser Art enthalten außer den eigentlichen Reaktionskomponenten gegebenenfalls eine Reihe von Zusatzstoffen wie z. B. Puffer, Netzmittel, Verdikkungsmittel, Schutzkolloid, Komplexbildner und Stabilisator, die je nach eingesetztem Indikator und Verwendungszweck des Tests erforderlich sind.
Gegenstand der Erfindung sind auch Testpapiers zum Nachweis von occultem Blut im Stuhl, die als Chromogen Guajaconsäure A der spezifischen Extinktion E |""m von mindestens 200, bestimmt nach der Reaktion mit Peroxidase und Wasserstoffperoxid, enthalten. Um zu verhindern, daß sich die Papiere, die mit der Guajaconsäure A getränkt sind, durch Licht und/oder Luft blaufärben, ist es nötig, einen geeigneten Stabilisator hinzuzufügen. Dabei wurde gefunden, daß bisher noch nicht bekannte Stabilisatoren aus der Gruppe der Arylsemicarbazide diese Blaufärbung nicht auftreten lassen. Ferner hat sich gezeigt, daß man innerhalb gewisser Grenzen durch die Zugabe dieses Arylsemicarbazids die Empfindlichkeit elastisch modifizieren kann.
Die neuen Stabilisatoren für Oxidationsindikatoren sowie ihre Verwendung sind in der deutschen Anmeldung P (uns. int. Nr. 2133) beschrieben, wobei unter Arylsemicarbaziden Verbindungen der allgemeinen Formel I
Ar-NH-NH-CO-NH2 (I)
in der
Ar einen gegebenenfalls durch Alkyl, Alkoxy oder Halogen substituierten Arylrest
bedeutet, zu verstehen sind.
Der Arylrest der Formel I soll vorzugsweise Phenyl oder Naphthyl bedeuten, die Alkyl- und Alkoxygruppen enthalten 1—4 Kohlenstoffatome, vorzugsweise den Methyl- oder Alkylrest und Halogen bedeutet vorzugsweise Fluor, Chlor und Brom.
Weiterhin ist es vorteilhaft, die Testpapiere mit einem Komplexbildner zu imprägnieren, um die in den meisten Papieren enthaltenen Metallionen komplex zu binden. Als besonders geeignet haben sich hierfür die Salze der Äthylendiamintetraessigsäure gezeigt, insbesondere das Kaliumsalz,'zumal sie gleichzeitig als Puffer verwendet werden können.
Da die Testpapiere aufgrund der relativ großen Mengen wasserlöslicher Substanzen zum Ausbluten neigen können, ist es praktisch, der Rezeptur Verdikkungsmittel wie Methylcellulose, Gelatine und Polyvinylpyrrolidon zuzusetzen, wobei diese auch als Schutzkolloid wirken können.
Als Netzmittel können u.a. langkettige organische
ι ο Sulfate oder Sulfonate verwendet werden.
Der Herstellung der erfindungsgemäßen Testpapiere werden saugfähige Träger wie z. B. Filterpapier, Cellulose oder Kunstfaservliese mit Lösungen imprägniert die die Bestandteile zweckmäßigerweise in Mischungen von Wasser und niederen Alkoholen bzw. Aceton enthalten, und anschließend die Papiere trocknet.
Man kann aber auch beispielsweise den Komplexbildner zuerst aus Wasser vorimprägnieren und dann die
2ü übrigen Bestandteile aus organischen Lösungen nachimprägnieren. Von diesen Papieren zeigen verschiedene Herstellungschargen das gleiche Ergebnis. Im Gegensatz dazu zeigen Chargen von Papieren, die mit ungereinigtem Guajakharz imprägniert sind, naturgemaß starke Schwankungen in ihrer Empfindlichkeit.
Im Gegensatz zu üblichen Teststreifen sind beim erfindungsgemäßen Test nicht alle Reaktionskomponenten auf den Träger imprägniert. So hat sich aus Stabilitätsgründen erwiesen, daß die Zugabe von
jn Wasserstoffperoxid erst erfolgen soll, wenn eine sofortige Auswertung der Färbung gewährleistet ist.
Zu diesem Zweck wird der Nachweis von occultem Blut im Stuhl wie folgt durchgeführt:
Ein Teststreifen, dessen Herstellung in den unten
Ji aufgeführten Beispielen beschrieben ist, wird zunächst mit einer Probe des zu untersuchenden Stuhls bestrichen. Nach dem Trocknen der Probe wird diese von der Rückseite des Trägers mit einer Lösung von Wasserstoffperoxid in Alkohol betropft, wobei bei
Ao Anwesenheit von Blut eine Blaufärbung eintritt.
In den folgenden Beispielen soll die Erfindung näher erläutert werden:
Beispiel 1
Herstellung von Guajaconsäure A
200 g gemahlenes Guajakharz werden mit 500 ml Aceton angerührt, wobei das Harz bis auf einen kleinen Anteil in Lösung geht. Nun tropft man unter Rühren 3
so Liter Toluol zu, saugt nach ca. 30 Minuten das ausgefällte Material (ca. 60 g) ab und verwirft diesen Rückstand. Das Filtrat wird im Vakuum eingeengt, wobei man ca. 160 g eines dunkelbraunen, glasigen Rückstandes erhält. Dieser wird in 500 ml eines n-Heptan-Essigestergemisches 2 :5 unter Erwärmen gelöst und nach dem Erkalten auf eine Kieselgelsäule (3,1 kg Kieselgel, Korngröße 0,063-0,2 mesh) von 80 cm Durchmesser und 1,65 m Höhe gegeben. Das Kieselgel wird vorher mit 2 N HCi eisenfrei, mit dest.
H2O neutral gewaschen und vakuumgetrocknet. Die Trennung erfolgt mit 7,5 Liter n-Heptan-Essigestergemisch 2:5 unter CO2 als Schutzgas. Es werden 150 Fraktionen ä 50 ml gesammelt. Die Fraktionen 115—145 ergeben nach Einengen ca. 16,5 g eines
b5 üeigefarbenen glasigen Materials, aus dem durch Umkristallisieren aus 150 ml Xylol ca. 12 g Guajaconsäure A gewonnen wird. Es ist zweckmäßig die Einzelfraktionen dünnschichtchromatographisch zu un-
tersuchen, da unter Umständen Verschiebungen der Elution des gewünschten Materials vorkommen können.
Dünnschichtchromatographie
Kieselgel-Fertigplatten 60 F-254
Laufmittel: Toluol, Dioxan, Eisessig (90:25:10); R1-Wert 0,45
Sprühlösungen:
Mit 0,05% Peroxidase und 0.5% H2O2 in Wasser färbt sich die Guajaconsäure A blau. Mit 6% Formalin und 26% Schwefelsäure in Wasser und 5minütigem Erhitzen färben sich Guajaconsäure A braunviolett und die Verunreinigungen rot bis violett.
Bestimmung der spezifischen Extinktion
Man löst 4,0 mg Guajaconsäure A in 400 ml 50%igem wäßrigem Alkohol.
1,0 ml dieser Lösung,
0,5 ml einer 3%igen Lösung von Polyvinylpyrrolidon K 90 in dest. Wasser.
1,0 ml einer 0,1 molaren wäßrigen H2G2-Lösung, und
0,1 ml einer l%igen Lösung von Meerrettich-Peroxidase (1—2 103 U/mg) in dest. Wasser, werden ■ mit dest. Wasser auf 10 ml aufgefüllt.
Die gut durchmischte Lösung wird nach 5—10 Minuten in einer 1-cm-Küvette bei 600 nm gemessen. Spez. Extinktion = gemessene Extinktion · 1000.
IR-Banden (KBR): 1600cm-' (m); 1505cm-' (v.s); 1260 cm-' (s; b); 1115cm' (m); 1025 cm-' (m); 1200 cm - '(s:b).
Beispiel 2
Testpapier zum Nachweis von occultem Blut im
Stuhl
Filterpapier 597 NF-Ind. wird mit folgender Lösung imprägniert und bei 50° getrocknet:
Guajaconsäure A; E !"','„ = 270
1 -Phenylseinicarbazid
Polyvinylpyrrolidon K 25
Kalium-EDTA-Puffer, pH 5,5*)
Aceton
Wasser
ad
120 mg
65 mg
300 mg
10 ml
50 ml
100 ml
*) 10 g EDTA + 4,75 KOH in 100 ml Wasser
EDTA = Äthylendiamimetraessigsäure
Zu 30 Stühlen verschiedener Probanden wurden steigende Mengen Blut zugemischt und homogenisiert, unter standardisierten Bedingungen immer gleiche Mengen auf die Testpapiere aufgebracht und nach dem Trocknen auf der Rückseite mit 2 Tropfen einer Mischung von HmI Perhydrol und 100 Äthanol versehen.
Den Prozentsatz negativer und positiver Reaktionen im Vergleich zu einem handelsüblichen Testpapier zeigt nachstehende Tabelle:
Zugegebene lirilndungsgeniaiSer lest Hanuelsproiiukl pos. Reaktion
Menge Blut neg. Reaktion pns. Reaktion neg. Reaktion 20
1% 25 75 80 18
2\ 10 90 72 43
3% 8 92 57 50
4% U 100 50 60
5% 0 100 40 60
6% 0 100 40
Die Tabelle zeigt, daß die praktische Nachweisgrenze (das ist diejenige Konzentration des nachzuweisenden Stoffes, bei der in 90 von 100 Fällen eine positive Reaktion gegeben ist) bei den erfindungsgemäßen Testpapieren bei einer Zugabe von 2% Blut liegt. Eine praktische Nachweisgrenze für das Handelsprodukt kann nicht angegeben werden, was auch vom Hersteller in seinen Informationsschriften bestätigt wird.
Mit wäßrigen Blut-Lösungen reagieren beide Testpapiere gleichermaßen ab einer Verdünnung von 1 :5000 positiv.
Beispiel 3
Testpapier zum Nachweis von occultem Blut im Stuhl
60 mg Guajaconsäure A; E j "ζ, = 300 werden in Äthanol gelöst
Mit dieser Lösung wird Filterpapier Whatman Nr. 1 getränkt Nach dem Trocknen bei 50" C erhält man ein
60 Testpapier, welches praktisch die gleichen Eigenschaften hat, wie das unter Beispiel 2 Beschriebene.
Beispiel 4
140 mg Guajaconsäure A; £!°°m = 240 und 70 mg eines 1-Arylsemicarbazids gemäß unten stehender Tabelle werden in 100 ml Methanol gelöst. Mit dieser Lösung wird Filterpapier imprägniert, das vorher mit einem 0,4 m Puffer aus EDTA und Natronlauge von pH 5,5 vorimprägniert wurde. Nach dem Trocknen bei 50° C erhält man Testpapiere, die praktisch gleiche Eigenschaften haben, wie im Beispiel 2 beschriebenen.
1 -Phenylsemicarbazid
1 -(o-ToIyl)-semicarbazid
1 -{m-Tolyl)-semicarbazid
1 -{o-Methoxyphenyl)-semicarbazid
1 -(p-Methoxyphenyl)-semicarbazid
1 -(m-Chlorphenyl)-semicarbazid
1 -(a-Naphthyl)-semicarbazid

Claims (3)

10 15 Patentansprüche:
1. Guajaconsäure A, die eine spezifische Extinktion E 1^n, von mindestens 200, bestimmt nach der Reaktion mit Peroxidase und Wasserstoffperoxid, durch die IR-Banden 1600 cm-' (m); 1505 cm-' (v.s.); 1260cm-' (s; b); 1115cm-1 (m); 1025cm-' (m); 1200 cm-' (s; b) sowie einen RF-Wert von 0,45 (Toluol/Dioxan/Eisessig 90 :25 :10) aufweist, erhältlich aus natürlichen Guajakharz durch säulenchromatographische Auftrennung an mit Säure vorbehandelten, neutralen Kieselgel mit einem n-Heptan/ Essigester- oder Toluol/Aceton-Gemisch unter Schutz mit einem inerten Gas.
2. Verfahren zur Herstellung von Guajaconsäure A gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man natürliches Guajakharz in Aceton löst, den durch Zugabe von Toluol erhaltenen Niederschlag entfernt, das Filtrat zur Trockene eindampft, den Rückstand in n-Heptan/Essigester oder Toluol/Aceton auflöst, die Lösung über eine mit vorbehandeltem, neutralem Kieselgel beschichtete Säule säulenchromatographisch mit n-Heptan/Essigester oder Toluol/Aceton trennt, die erhaltenen Fraktionen mit RF = 0,45 (Toluol/Dioxan/Eisessig 90 : 25 :10) sammelt und den eingedampften Rückstand aus Xylol umkristallisiert.
3. Verwendung der nach den Ansprüchen 1 und 2 erhaltenen Guajaconsäure A als diagnostisches jo Mittel zum Nachweis von occultem Blut im Stuhl, zusammen mit Wasserstoffperoxid, Chromogen und den üblichen Hilfsmitteln und einem zusätzlichen Stabilisator, der eine Substanz der allgemeinen Formel 1
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