DE2740614A1

DE2740614A1 - Verfahren zur gewinnung des coenzyms q

Info

Publication number: DE2740614A1
Application number: DE19772740614
Authority: DE
Inventors: Satoshi Ideguchi; Hajime Kawaharada; Masahiro Ogura; Masahiko Shimada; Kiyoshi Watanabe
Original assignee: Kanegafuchi Chemical Industry Co Ltd
Current assignee: Kanegafuchi Chemical Industry Co Ltd
Priority date: 1976-09-14
Filing date: 1977-09-09
Publication date: 1978-03-16
Also published as: JPS5338690A; US4447362A; JPS5933354B2

Description

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51 111 - Dr. T₅ Anmelder: Kanegafuchi Ragaku Kogyo Kahushiki Kaisha

3-3 Chome, Nakanoshirna, Kita-ku, Osaka, Japan

Verfahren zur Gewinnung des Coen%,yins Q

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Beschreibung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung des Coenzyms Q (nachfolgend abgekürzt mit "Co Q") aus es enthaltenden tierischen und pflanzlichen Geweben oder Mikroben—ZeI] en in hoher Ausbeute. Die Erfindung ist anwendbar auf alle Arten von Co Q-Homologen (Co Q^-Co Q-J₀)* ^⁰ ^ⁿ ^^en Quellen enthalten sind.

Co Q kommt in den Mitochondrien von Tieren- und Pflanzengeveben und Mikroben-Zellen vor und es spielt bekamrßlich eine wichtige Rolle in Organismen als wesentlicher Faktor in dem termineilen Elektronentransportsystem. Es liegen bereits viele Berichte über die pharmakologiscben und klinischen Wirkungen "von Co Q vor und es wurden bemerkenswerte Effekte auf des Konge st ion s-Herzver sagen, die Coronau'nsuffizien?., die durch Fehlernährung verursachte Muskeldystrophie und Anämien nachgewiesen. Sein V/ert als Arzneimittel ist daher in jüngster Zeit gestiegen.

Es sind bereits zwei Verfahren zum Extrahieren von Co Q aus natürlichen Queller bekannt. Bei einem Verfahren handelt es eich um das direkte Verseif längsverfahren, bei dem Co Q enthaltende Materialien mit einem alkoholischen Alkalihydroxid in Gegenwart eines Antioxydationsmittels, wie Pyrogallol, direkt verseift werden, wonach das Co Q mit einem hydrophoben Lösungsmittel, wie η-Hexan, extrahiert und durch Säulenchromatographie gereinigt wird. Bei dem anderen Verfahren werden die Materialien zuerst mit einem organischen Lösungsmittel, wie η-Hexan, Isooctan, Aceton und Äthanol, extrahiert, dann wird der Extrakt oder das Konzentrat durch Säulenchromato-

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graphie gereinigt oder mit einem alkoholischen Alkalihydroxid in Gegenwart eines Antioxydationsmittels, wie Pyrogallol, verseift und danach wird das Co Q mit einem hydrophoben Lösungsmittel extrahiert und gereinigt (japanische Patentschrift 4O⁷-!- 804). Das direkte Verseifungsverfahren hat jedoch Nachteile, z.B. den, daß zu seiner Durchführung teure Chemikalien und die Verwendung großer Mengen Lösungsmittel erforderlich ist. Andererseits werden in dem zuletzt genannten Verfahren die verseifbaren Substanzen, wie Neutralfette und Phospholipide, zusammen mit dem Co Q extrahiei't und diese Verunreinigungen müssen durch Verseifung des Extrakts in Gegenwart eines Antioxydationsmittels oder durch komplizierte Reinigungsverfahren entfernt werden. Dieses Verfahren hat deshalb auch Nachteile in bezug auf hohe Reinigungskosten und niedrige Ausbeuten wegen der Verwendung eines Antioxydationsmittels und wegen der Anwendung komplizierter Vorfahren.

Nach umfangreichen Untersuchungen ist es nun gelungen, die bekennten Verfahren zu verbessern durch ein neues Verfahren, mit dessen Hilfe es möglich ist, Co Q in hoher Ausbeute und mit geringen Kosten herzustellen. Es wurde gefunden, daß Co Q gegenüber einem Alkali in Wasser beständig ist, wie nachfolgend näher beschrieben. Es wurde ferner gefunden, daß nicht-verseifbare Lipide, die Co Q enthalten, in hoher Ausbeute erhalten werden durch Flüssig-Flüssig-Extraktion mit Lösungsmitteln, die von Wasser abgetrennt werden können, nachdem tierische und pflanzliche Gewebe oder Mikroben-Zellen, die Co Q enthalten, mit einem Alkali oder mit einer Säure und dann mit einem Alkali behandelt worden sind, wobei die Behandlung zur Hydrolyse der verseifbaren Substanzen, wie der Neutralfette und Phospholipide, und zum Aufbrechen der Gewebe oder Zellen führt, so daß das Co Q leicht extrahierbar wird.

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Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren werden tierische und pflanzliche Gewebe oder Mikroben-Zellen, welche Co Q enthalten, mit einem Alkali behandelt, die behandelte Suspension wird mit mindestens einem mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittel extrahiert und dann wird das Co Q aus dem Extrakt gewonnen. Die wässrige Suspension kann vor der Alkalibehandlung mit einer Säure behandelt werden.

Bei den bekannten Verfahren zum Extrahieren von Co Q werden die verseifbaren Lipide in einem alkoholischen Alkalihydroxid hydrolysiert und dabei ist die Anwesenheit eires Antioxydationsmittels, wie Pyrogallol, wesentlich. Bei dem erfindungsgemäßen Verfaliren ist andererseits keine Zerstörung von Co Q festzustellen trotz der Abwesenheit eines Antioxydationsmittels. Der Grund für die Stabilität des Co Q in dem erfin-dungsgemäßen Verfahren ist vermutlich der, daß der Kontakt des Co Q mit einem Alkali verhindert wird, weil die Verseifung in wässriger Suspension in Abwesenheit von Lösungsmitteln durchgeführt wird, welche Co Q lösen, so daß die Zerstörung des Co Q nicht fortschreitet.

Als natürliche Quellen, die Co Q enthalten, v/erden tierische oder pflanzliche Gewebe oder Hefezellen, Schimmelpilze oder Bakterien verwendet und die Konzentration derselben in wässriger Suspension kann 10 bis 250 g (bezogen auf das Trockengewicht)/! betragen, sie beträgt jedoch vom wirtschaftlichen Standpunkt aus betrachtet vorzugsweise 100 bis 200 g/l. Die Säurebehandlung vor aer Alkalibehandlung ist nicht immer erforderlich, dadurch werden jedoch häufig die Extraktionsausbeuten des Co Q erhöht durch Aufbrechen der Gewebe oder Zellen in Abhängigkeit von der Art der Quellen. Als Säure können Schwefelsäure, Chlorwasserstoffsäure und Salpetersäure ver-

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wendet werden und die Säurebehandlung wird in der Regel bei einer Temperatur von 60 bis 15O⁰C für einen Zeitraum von 0,5 bis 10 Stunden bei einem pH-Wert von nicht mehr eis 2, vorzugsweise bei einer Temperatur von 80 bis 120°C für einen Zeitraum von 2 bis 6 Stunden bei einem pH-Wert von nicht mehr als -1 durchgeführt. Die Alkalibehandlung erfolgt durch Verwendung eines Alkali, wie eines Alkalimetall- oder Ei^delkalimetallhydroxids oder -carbonate oder eines Alkalitiietallbiccjrbonats, wie z. B. Natrium- oder Kaliumhydroxid, Natrium- oder Kaliumcarbonat, Calcium- oder Magnesiumhydroxid, Calcium- oder Magnesiumcarbonat und Natrium- oder Kaliumbicarbonat. Die Alkalibehandlung wird vorzugsweise bei einer Temperatur von 60 bis 150⁰C für einen Zeitraum von 10 Minuten bis 10 Stunden bei einem pH-Wert von nicht weniger als 10, insbesondere bei einer Temperatur von 80 bis 120 C für einen Zeitraum von'1 bis 5 Stunden bei einem pH-Wert von nicht weniger als 13.,durchgeführt. Zum Extrahieren des Co Q nach dem Verseifen kann mindestens ein mit Wasser nicht mischbares Lösungsmittel, wie η-Hexan, Isooctan, Petrcläthei-, Dichlorätheji, Methylisobutylkcton, Butanol und Äthylacetat, verwendet werden. Gelegentlich kann mindestens ein mit Wasser mischbares Lösungsmittel, wie Methanol, Äthanol, Isopropsnol und Aceton, dem mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittel in einer solchen Menge zugesetzt v/erden, daß ersteres die Trennung des letzteren von der verseiften Flüssigkeit nicht verhindert. Der Extrakt wird mit Wasser gewaschen, getrocknet und unter vermindertem Druck eingeengt. Das Konzentrat wird in einer geringen Menge eines hydrophoben Lösungsmittels, wie η-Hexan, Pctroläther und Chloroform, gelöst und die beim Abkühlen ausfallenden Sterine (Sterole) werden entfernt. Das Co Q wird aus der überstehenden Flüssigkeit isoliert, beispielsweise durch Aufgeben derselben auf eine mit Silicagel, Aluminiumoxid,

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Florisil und dergleichen gefüllte Kolonne. Bei diesem Verfahren werden als Nebenprodukte leicht Sterine, wie Ergosterin, erhalten.

Wie oben angegeben, ist des erfindungsgemäße Verfahren zum Extrahieren und Reinigen von Co Q einfach und es ist nicht mehr erforderlich, teure Antioxydationsmittel, wie Pyrogallol, zu verwenden, außerdem stellt es ein vorteilhaftes Verfahren zur Gewinnung von Co Q in hoher Ausbeute dar.

Die Erfindung wird durch die folgenden. Bei spiele näher erläutert», ohne jedoch darauf beschränkt au sein.

Beispiel 1

Rhodotorula/nucilaginosa AHU 394-6 wurde in einem Medium mit 30 g Glucose, 4 g KH₂FO₄, 5 g (KH^)₂SO₄₁ 0,6 g Μβ30₄«7Η₂0, 10 mg ZnSO₄*7H₂O, 100 mg PeKO₄'7H₂O, 1 g Hefeextrakt und 1 1 Leitungswasser (pH-Wert eingestellt auf 5,0) 62 »Stunden lang in einer Kolben-Fermentiervorrichtung aerob kultiviert, die Zellen wurden durch Zentrifugieren abgetrennt und mit Wasser gewaschen. Zu 4 1 der Zellsuspension (Trockenzellengewicht: 480 g, Co Q-Gehalt: 137 tag) wurden 40 ml konzentrierter HpSO^ zugegeben. Die Mischung wurde 3 Stunden lang auf 100⁰C erhitzt, abkühlen gelassen und nach der Zugabe von 220 g NaOH erneut 1 Stunde lang auf 100°C erhitzt. Nach dem Abkühlen wurde die Reaktionsmischung mit einem Lösungsmittelgemisch aus 4In-Hexan und 400 ml Isopropanol extrahiert und die n-Hexanschicht wurde abgetrennt. Dieses Verfahren wurde einmal wiederholt, die n-Hexanschichten wurden miteinander vereinigt

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und mit 10 1 Wasser dreimal gewaschen, über wasserfreiem NaoSO^ getrocknet und unter vermindertem Druck eingeengt. Die Ausbeute an Co Q in dieser Stufe betrug 0,992«, Das Konzentrat wurde in einer geringen Menge η-Hexan gelöst, die Lösung wurde auf 4-0⁰C abgekühlt, die ausgefallenen Sterine wurden entfernt. Die überstehende Flüssigkeit wurde auf eine mit 5 g Silicagel gefüllte Kolonne aufgegeben und es wurde mit n-Hexan/Isopropanol (1000/1) eluiert. Die Co Q enthaltenden Fraktionen wurden miteinander vereinigt und unter vermindertem Druck eingeengt. Das Konzentrat wurde in einer geringen Menge Äthanol gelöst, die Lösung wurde abkühlen gelassen, wobei man 128 mg orangerote Kristalle (Ausbeute 0,934) erhielt* Das ProcUikt wurde als Co Q^₀ durch den Schmelzpunkt (F.), Papierchromatographie und Elementaranalyse identifiziert.

Candida novellus ATCC 20275 wurde in der gleichen Weise wie in Beispiel 1 kultiviert, die erhaltenen Zellen wurden abgetrennt und mit Wasser gewaschen. Zu 4- 1 der Zellsuspension (Trockenzeilgewicht: 550 g, Oo Q-Gehelt: 140 mg) wurden 4Ό0 ml einer 4-8 Gew./Vol.%igen NaOH-Lösung zugegeben und die Mischung wurde 3 Stunden lang auf 100⁰C erhitzt, dann auf die gleiche Weise wie in Beispiel 1 behandelt und man erhielt 108 mg Kristalle (Ausbeute 0,77), Das Produkt wurde durch Papierchromatogra.phie und Elementeranalyce als Co Qq identifiziert.

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Beispiel 3

Candida utilis IAH 4200 wurde auf die gleiche Weise wie in Beispiel 1'kultiviert. Aus 4 1 dex* Zellsuspension (Trockenzellgewicht: 90 g» Co Q-Gehs.lt: 23 mg) wurde das Co Q extrahiert und auf die gleiche Weise wie in Beispiel 1 gereinigt» wobei man 19 mg Kristalle erhielt. Das Produkt wurde durch Papierchromatographie als Co Q₁-, identifiziert.

Beispiel 4-

Aus 4 1 der Zellsuspension von 600 g gepreßten Bäckerhefen (Co-Q-Gehalt 90 mg) wurden 82 mg Co Q-Kristalle erhalten, wobei die Extraktion und die Reinigung wie in Beispiel 1 durchgeführt wurde. Das Produkt wurde durch Papierchromatogrcphie als Co Qr identifiziert.

Beispie] 5

2 kg Muskeln eines frischen Ochsenherzens, die 140 mg Co Q enthielten, wurden nach der Entfernung der Fette und der Blutgefäße zerkleinert und mit einem Waring-Γίϊscher homogenisiert. Das Homogenat wurde mit Wasser auf ein Gesamtvolumen von 4 1 aufgefüllt. Aus dem Homogenat wurden 93 mg Co Q-Kristalle auf die gleiche Weise wie in Beispiel 1 gewonnen. Das Produkt wurde durch den Schmelzpunkt (F.) und Papierchromatographie als Co Q,|₀ identifiziert.

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Beispiel 6

Agrobacterium tumefaciens IAM 1037 wurde in einem -Medium mit 30 g Glucose, H- g KlI₂PO₄, 5 S (BlI₄ ^SO₄, 0,6 β MgSO₄-7H₂O> mg ZnSO₄-VH₂O₁ 100 mg PeSO₄-7H₂O, 10 g Hefeextrakt und 1 1 Leitungswasser (pH-Wert eingestellt auf 6,0) unter den gleichen Kuütivierungsbedingungen wie in Beispiel 1 kultiviert. Aus 4 1 der Zellsuspension (Trockenzellgewicht 120 g, Co Q--Gehalt 51 mg) wurde Co Q auf die gleiche V/eise wie in Beispiel 1 extrahiert und gereinigt, wobei diesmal jedoch die Säurebehandlung weggelassen wxirde; auf diese Weise erhielt man 26 mg Co Q-Kristalle (Ausbeute 0,84). Da« Produkt wurde durch Papierchromatographie als Co Qxjq identifiziert.

ORIGINAL INSPECTED

Claims

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Patentansprüche

erfahren zur Gewinnung des Coenzyms Q aus es enthaltenden tierischen und pflanzlichen Geweben oder Mikroben-Zellen, dadurch gekennzeichnet , daß eine wässrige Suspension dieser Materialien mit einem Alkali behandelt, die mit Alkali behandelte Suspension mit mindestens einem mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittel extrahiert und das Coenzym Q aus dem Extrakt isoliert wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die wässrige Suspension vor der Alkalibehandlung mit einer Säure behandelt wird.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Alkali ausgewählt wird aus der Gruppe Alkalimetall- und Erdalkalimetallhydroxid, Alkalimetall- und Erdalkalimetallcarbonat und Alkalimetallbicarboriat.
4-, Verfahren nach Anspruch 2 oder 3» dadurch gekennzeichnet, daß die Säure ausgewählt wird aus der Gruppe Schwefelsäure, Chlorwasserstoffsäure und Salpetersäure.
5. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 4-, dadurch gekenn-r zeichnet, daß die Alkalibehandlung bei einer Temperatur von 60 bis 150°C für einen Zeitraum von 10 Minuten bis 10 Stunden bei einem pH-Wert von nicht weniger als 10 durchgeführt wird.
6. Verfahren nach Anspruch 5» dadurch gekennzeichnet, daß die Alkalibehandlung bei einer Temperatur von 80 bis 120⁰C für einen Zeitraum von 1 bis 5 Stunden bei einem pH-Wert von

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nicht weniger als 13 durchgeführt wird.
7. Verfahren nach den Ansprüchen 2 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Säurebehandlung bei einer Temperatur von 60 bis 15O°C für einen Zeitraum von 0,5 bis 10 Stunden bei einem pH-Wert von nicht mehr als 2 durchgeführt wird.
8. Verfahren nach Anspruch 7> dadurch gekennzeichnet, daß die Säurebehandlung bei einer Temperatur von 80 bis 120⁰C für einen Zeitraum von 2 bis 6 Stunden bei einem pH-Wert von nicht mehr als 1 durchgeführt wird.
9· Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß das mit Wasser nicht mischbare Lösungsmittel ausgewählt wird aus der Gruppe η-Hexan, Isooctan, Petroläther, Dichloräthan, Methylisobutylketon, Butanol und Äthylacetat.
10. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß dem mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittel mindestens ein mit Wasser mischbares Lösungsmittel in einer solchen Menge zugesetzt wird, daß letzteres die Trennung des ersteren von dem Wasser nicht verhindert.
11. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß der Extrakt eingeengt wird, daß das Konzentrat in einer geringen Menge eines hydrophoben Lösungsmittels gelöst wird, daß die beim Abkühlen ausfallenden Sterine entfernt werden und daß das Coenzym Q aus der überstehenden Flüssigkeit isoliert wird.
12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß die Isolierung des Coenzyme Q durch Säulenchromatographie erfolgt.